UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
ATIVIDADE FUNGITÓXICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia sidoides
Cham. E DE Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. NO CONTROLE DE
FITOPATÓGENOS DO FEIJOEIRO COMUM.
ANDRÉ HENRIQUE GONÇALVES
2012
Trabalho realizado junto ao Mestrado em Produção Vegetal da Universidade Federal do
Tocantins, sob orientação do Professor Dr.Luiz Gustavo de Lima Guimarães.
BANCA EXAMINADORA:
___________________________________________
Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães
Universidade Federal do Tocantins
(Orientador)
___________________________________________
Prof. Dr. Gil Rodrigues dos Santos
Universidade Federal do Tocantins
(Co-orientador)
__________________________________________
Dra. Dione Pereira Cardoso
Bolsista de Prodoc da Capes
(Avaliadora)
__________________________________________
Prof. Dr. Ildon Rodrigues do Nascimento
Universidade Federal do Tocantins
(Avaliador)
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
ATIVIDADE FUNGITÓXICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia sidoides
Cham. E DE Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. NO CONTROLE DE
FITOPATÓGENOS DO FEIJOEIRO COMUM.
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Tocantins, como parte das
exigências do Programa de PósGraduação em Produção Vegetal, para
obtenção do título de “Mestre”.
GURUPI
TOCANTINS - BRASIL
2012
ANDRÉ HENRIQUE GONÇALVES
ATIVIDADE FUNGITÓXICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia sidoides
Cham. E DE Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. NO CONTROLE DE
FITOPATÓGENOS DO FEIJOEIRO COMUM.
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Tocantins, como parte das
exigências do Programa de PósGraduação em Produção Vegetal, para
obtenção do título de “Mestre”.
Aprovada em: 06 de Julho de 2012.
Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães
(Orientador)
GURUPI
TOCANTINS - BRASIL
2012
Aos meus pais Amarildo e Tuca,
Fonte inesgotável de dedicação
De família e de amor.
Amo vocês.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me abençoado com o dom da vida, iluminando meus passos e
guiando meu caminho.
Ao Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães pela orientação, profissionalismo
e paciência durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos membros da banca examinadora pelas críticas e sugestões.
Aos meus irmãos Taisa (Ta), Amarildo Filho (2) e Bruna (Nega), se tivesse mil
oportunidades de escolher quem seriam meus irmão, 1001 escolheria vocês.
Aos meus avós Luiza Lacerda Gonçalves e João Pedro Gonçalves (in
memorian) e Derenice Vilarinho (in memorian) e Valter Vilarinho, sempre preocupados
com a minha formação acadêmica e moral.
Aos demais membros da minha família.
A todos os meus amigos da Republica Tapera Véia: André Froes, Carlos
Cardon, Gustavo Gonçalves, Ícaro Cavalcante e Leonardo Lopes, companheiros
inseparáveis. Obrigado pela amizade.
Agradeço aos amigos de trabalho: Valdere e Michel por todo o apoio.
A minha linda Anielli, meu porto seguro, responsável por grande parte desse
trabalho, sempre me incentivando. Obrigado pela paciência, companheirismo e amor.
A todos aqui não mencionados que, de certa forma, contribuíram para a
concretização deste trabalho.
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................... 9
ABSTRACT .............................................................................................................. 10
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 11
2.1. A cultura do feijoeiro ......................................................................................... 13
2.1.1. Classificação .................................................................................................... 15
2.1.2. Pragas e doenças que afetam a planta do feijoeiro. ........................................ 16
2.1.3. Mela e podridão radicular do feijoeiro comum causadas pelo fungo
Rhizoctonia solani ...................................................................................................... 17
2.1.4. Podridão do colo do feijoeiro comum causada pelo fungo Sclerotium rolfsii 18
2.1.5. Controle de pragas e doenças .......................................................................... 19
2.2. Óleos essenciais ................................................................................................... 20
2.2.1. Atividades biológicas dos óleos essenciais ....................................................... 22
2.2.2. Alecrim pimenta (Lippia sidoides Cham.) ....................................................... 24
2.2.3. Capim-limão (Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. .......................................... 26
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 27
CAPITULO II ........................................................................................................... 43
Extração e caracterização química dos óleos essenciais de Lippia sidoides Cham. e
Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. ............................................................................ 43
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 44
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 44
2.1. Obtenção do material vegetal e extração dos óleos essenciais .......................... 44
2.2. Análises cromatográficas dos óleos essenciais ................................................... 45
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 46
4. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 50
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 50
7
CAPÍTULO III.......................................................................................................... 56
Potencial fungitóxico dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus, de Lippia
sidoides e de seus componentes majoritários sobre o crescimento micelial de
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. ..................................................................... 56
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 57
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 58
2.1. Obtenção dos óleos essenciais ............................................................................ 58
2.2. Avaliação das Atividades fungitóxicas............................................................... 59
2.3. Obtenção dos isolados ........................................................................................ 59
2.4. Ensaio de inibição do crescimento micelial ....................................................... 59
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 62
4. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 72
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 72
CAPÍTULO IV .......................................................................................................... 81
Avaliação da fitotoxicidez dos óleos essenciais Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf e
de Lippia sidoides Cham. sobre plantas de feijoeiro comum. .................................. 81
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 82
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 82
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 85
4. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 88
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 88
8
RESUMO
ATIVIDADE FUNGITÓXICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia sidoides Cham.
E DE Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. NO CONTROLE DE FITOPATÓGENOS
DO FEIJOEIRO COMUM.
André Henrique Gonçalves1, Luiz Gustavo L. Guimarães2 ( 1Mestrando em Produção
Vegetal, 2Professor adjunto, Universidade Federal do Tocantins).
As potencialidades de utilização de métodos alternativos no controle de doenças de
plantas são incessantemente estudadas e avaliadas por vários pesquisadores no mundo
inteiro. Na pesquisa e desenvolvimento deste trabalho são avaliados os óleos essenciais
de duas espécies de plantas, capim limão (Cymbopogon citratus) e alecrim-pimenta
(Lippia sidoides), citadas em diversos trabalhos com propriedades diversas, incluído
desde o uso medicinal até o controle de pragas e doenças. O feijão é citado como uma
das culturas mais consumidas pela população brasileira e também uma das culturas mais
acometidas por doenças. Diante do exposto este trabalho deve como objetivo, avaliar a
atividade fungitóxica dos óleos essenciais de C. citratus e de L. sidoides, bem como de
seus constituintes majoritários, sobre o crescimento micelial dos fitopatógenos de de
solo Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii), importantes causadores de doenças e
perdas na produção desta cultura.. Foram realizadas a caracterização química dos óleos
essenciais, bem como a analise quantitativa de seus constituítes.. Os óleos essenciais e
seus constituintes foram testados “in vitro” no controle do crescimento micelial dos
microrganismos citados, e submetidos a calibrações de dosagens e avaliações de
possíveis inibições no crescimento micelial. Testes de fitotoxicidade na semente
também foram realizados, com dosagens distintas, analisando o percentual de
emergência de plântulas encontrando resultados satisfatórios em relação à utilização
destes óleos junto ao tratamento de sementes, pois não causou inibição do
desenvolvimento das plântulas. Resultados promissores foram obtidos com os óleos
essenciais de C. citratus e L. sidoides na inibição do crescimento micelial de
(Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii). Resultados das porcentagens dos constituintes
químicos dos óleos essenciais divergiram dos citados em literatura, com destaque para o
óleo essencial de L. sidoides. Os testes “in vivo” de fitotoxicidade, não apresentaram
nenhum sinal de danos ou lesões para as plantas de feijão em nenhuma das dosagens
avaliadas. Trabalhos “in vivo” devem ser realizados, analisando os óleos para efeito
fungitóxico nos microrganismos testados, possibilitando a possível concretização de que
os óleos essenciais de C. citratus e L.sidoides podem ser utilizados como fungicidas
alternativos no controle de Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris L., R. solani, S. rolfsii, Controle alternativo.
9
ABSTRACT
FUNGITOXICITY OF ESSENTIAL OILS OF Lippia sidoides Cham. AND
Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. IN THE CONTROL OF PATHOGENS OF
COMMON BEAN.
André Henrique Gonçalves1, Luiz Gustavo L. Guimarães2 ( 1Mestrando em Produção
Vegetal, 2Professor adjunto, Universidade Federal do Tocantins).
The potential for using alternative methods of plants diseases control are continually
researched and evaluated by various researchers worldwide. In research and
development of this work are evaluated essential oils of two species of plants, lemon
grass (Cymbopogon citratus) and rosemary-pepper (Lippia sidoides), cited in several
studies with different properties, including from the medical use to control pests and
diseases. Beans are quoted with a crop most used by the Brazilian population and also
one of the crops most affected by disease, compared to this was added the possibility to
control two of soil borne pathogens (Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii) reported
as important causes of disease and losses in the production of this crop, with the
potential of essential oils (C. citratus) and (L. sidoides) to assess the behavior of this
microorganism in the presence of these essential oils. Was performed to characterize the
chemistry of essential oils, as well as the analysis of its major constituents. Essential
oils and their constituents have been tested "in vitro" in control of the microorganisms
mentioned above, and subjected to incessant calibrations measurements and evaluations
of possible inhibitions on mycelial growth. Phytotoxicity tests were also conducted in
the seed, with strengths, analyzing the percentage of seedling emergence finding
satisfactory results regarding the use of these oils from the seed treatment, because it
caused inhibition of seedling development. Promising results were obtained with
essential oils (C. citratus) and (L. sidoides) on mycelial growth inhibition (Rhizoctonia
solani and Sclerotium rolfsii). Results of the percentages of chemical constituents of
essential oils differed cited in the literature, with emphasis on the essential oil (L.
sidoides). Tests "in vivo" phytotoxicity, showed no sign of damage or injury to bean
plants in any of the dosages. Work "in vivo" should be performed, analyzing the oils
antifungal effect in microorganisms, allowing the possible realization of the essential
oils (C. citratus) and (L. sidoides) can be used as alternative fungicides to control
(Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii).
Keywords: Phaseolus vulgaris L., R. solani, S. rolfsii, Alternative control.
10
1. INTRODUÇÃO
O seguimento agrícola mundial tem se modernizado constantemente, com
inserção de novas tecnologias, manejo e aplicabilidade da produção. O produtor rural
tem buscado técnicas que viabilizem a sua produção, visando a diminuição nos custos,
ou seja, incrementar a produtividade, sem onerar a produção.
Danos causados por pragas e doenças já são considerados um prejuízo
recorrente, uma vez que todas as culturas são susceptíveis a estes ataques. Auxiliando o
produtor nesta jornada do agronegócio empresas de agrotóxicos lançam no mercado
vários produtos agrícolas paras serem utilizados no manejo das culturas e manter o
controle fitossanitário, garantindo assim ao produtor uma produção satisfatória e que
permita a qualidade do seu produto final.
Apesar das recomendações agronômicas e dosagens dos fabricantes, muitos
agrotóxicos são utilizados de forma desordenada, com dosagens acima das permitidas
e/ou sua utilização em culturas não recomendadas. Como consequência desse fato, o
impacto ambiental através da contaminação da fauna e flora por esses produtos
agrícolas são frequentemente relatados.
Frente a isso, pesquisadores têm estudado os efeitos de extratos e de óleos
essenciais de diversas plantas como controle alternativo de pragas e doenças que
acometem as plantações. Com o intuito de desenvolver produtos derivados de plantas
que auxiliem a produção agrícola.
Baseado neste contexto, embasado por dados que demonstram o consumo
mundial de feijão comum e as dificuldades de produção, o presente trabalho teve como
objetivo caracterizar quimicamente, e avaliar o efeito dos óleos essenciais de Lippia
11
sidoides Cham. e de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf no controle de Rhizoctonia.
solani e Sclerotium. rolfsii, fitopatógenos de solo que acometem o feijoeiro comum.
12
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A cultura do feijoeiro
A origem evolutiva do gênero Phaseolus e sua diversificação primária
ocorreram nas Américas (VAVILOV, 1931 apud DEBOUCK, 1991), mas o local exato
onde isto se deu é ainda motivo de controvérsia (GEPTS; DEBOUCK, 1991).
Populações selvagens de feijão crescem, desde o Norte do México até o Norte da
Argentina, em altitudes entre 500 e 2.000 m, porém não são encontradas no Brasil
(DEBOUCK, 1986).
Existem diversas hipóteses para explicar a origem e domesticação do feijoeiro.
Pois os tipos selvagens eram similares a variedades nativas e encontrados no México, e
sua domesticação é relatada cerca de 7.000 a.C. na América Central, surgindo a hipótese
de que o feijoeiro teria sido domesticado nesta região e disseminado, posteriormente, na
América do Sul. Por outro lado, foram encontrados achados arqueológicos mais antigos,
cerca de 10.000 a.C., de feijões domesticados na América do Sul (sítio de Guitarrero, no
Peru) e que dão indícios de que o feijoeiro teria sido domesticado na América do Sul e
transportado para a América do Norte (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2007).
Por apresentar um papel relevante na alimentação do brasileiro, o feijão é um
dos produtos agrícolas de maior importância econômico-social, principalmente devido à
mão-de-obra utilizada durante o ciclo da cultura. No Brasil o feijão comum (Phaseolus
vulgaris L.) é um dos alimentos mais consumidos, uma vez que o mesmo possui
propriedades nutricionais e funcionais capazes de atender muitas necessidades básicas
de alimentação da população, destacando-se principalmente, como fonte proteica. A sua
importância social se prende ao fato de ser uma cultura com grande capacidade de
absorver mão de obra no seu sistema de cultivo (FERREIRA et al., 2006).
13
Na última década, constatou-se grande evolução na cultura do feijão (P. vulgaris
L.) graças ao desempenho de diversas pesquisas, as quais têm propiciado aos
produtores, técnicas compatíveis aos vários sistemas de produção, destacando-se a
obtenção de cultivares com elevado potencial produtivo e adaptados aos locais de
cultivos (JUNIOR; LEMOS; SILVA, 2005).
Dados da Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação –
(FAO) indicam que a Índia é o maior produtor mundial de feijão. Sua produção em
2010 foi de 4.870.000 mil toneladas, correspondendo a 17,2% do total produzido no
mundo. O Brasil aparece em 2º lugar, respondendo por 16,2% da produção mundial,
com uma produção de 3.202.150 mil toneladas em 2010 (FAO, 2012). A produção
brasileira na safra de 2011 foi de 3.500.373 t, com produtividade média de 4.299 kg ha1
, já para o ano de 2012 os valores da previsão são de 3.144.009 t com produtividade de
4.332 kg ha-1, considerando as 3 safras ocorridas (IBGE, 2012).
O Tocantins se destaca nacionalmente na produção de sementes de feijão em
várzeas tropicais. Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE a
previsão na safra de 2012 é de um aumento de 34,34% em relação à de 2011, com a
produção passando de 34.004 t para 47.043 t. Este aumento se deve, principalmente, ao
aumento da área plantada na 2ª safra que passa de 21.650 para 31.990 ha de 2011 para
2012, respectivamente.
A produção de sementes de feijão, cultivada nas várzeas tropicais no Tocantins,
possui suas peculiaridades por apresentar alta qualidade sanitária e produtiva do grão.
As várzeas no Estado estão localizadas nos municípios de Formoso do Araguaia, Pium,
Dueré, Cristalândia e Lagoa da Confusão. Cerca de 80% dessa produção de sementes
são exportados para os estados de Minas Gerais, Bahia, Pará, Santa Catarina, São Paulo
e Distrito Federal. O feijão é cultivado em três grupos com variedades diferentes, o
14
carioca, preto (grupo Phaseolus) e o caupi (Vigna unguiculata), no período de junho a
setembro. (SEAGRO, 2009).
A cultura do feijão tem sido tradicionalmente, caracterizada como segmento
atrasado do setor agrícola brasileiro. A atividade está comumente associada ao pequeno
produtor, ao emprego de pouca tecnologia e a grandes oscilações na produção e na
produtividade. No entanto, essa situação vem se alterando nos últimos anos, já se
percebendo nova dinâmica na produção, que vem influenciando a rentabilidade da
atividade. Consequentemente, o feijão está deixando de ser lavoura de subsistência para
se transformar em cultura tecnificada (CUNHA; TEIXEIRA; VIEIRA, 2005).
O risco de perdas parece ser um dos principais fatores desestimuladores da
exploração do feijão por grandes produtores. O feijão comum apresenta sérios
problemas fitossanitários que resultam no baixo rendimento nacional, sendo as pragas e
doenças os motivos mais importantes para a queda na produção de feijão no Brasil
(GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2007).
2.1.1. Classificação
De acordo com Vilhordo e Mikusinski (1996), o feijoeiro é classificado da
seguinte forma:
Ordem: Rosales
Família: Fabaceae (Leguminosae);
Subfamília: Faboideae (Papilionoideae);
Tribo: Phaseoleae;
Gênero: Phaseolus;
Espécie: Phaseolus vulgaris L.
15
O gênero Phaseolus possui aproximadamente 55 espécies, das quais apenas
cinco são cultivadas sendo elas: o feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris); o feijão de
lima (Phaseolus lunatus); o feijão Ayocote (Phaseolus coccineus); o feijão tepari
(Phaseolus acutifolius); e o Phaseolus polyanthus (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO,
2007).
2.1.2. Pragas e doenças que afetam a planta do feijoeiro.
Vários fatores influenciam a produtividade do feijão, dentre estes, podem ser
citadas diversas pragas e doenças. Entre as pragas de ocorrência na cultura do feijão
estão cigarrinha-verde (Empoasca kraemeri), vaquinha (Diabrotica speciosa), mosca
minadora (Liriomyza sativae) e o ácaro branco (Polyphagotarsonemus latus), que
podem comprometer muito a produtividade do feijoeiro (LIMA; GEREMIAS; PARRA,
2009; SEFFRIN et al., 2008; SILVEIRA et al., 2005). Porém, a mosca-branca (Bemisia
tabaci), que prejudica a planta pela transmissão do vírus do mosaico dourado do
feijoeiro, é considerada a mais importante da cultura, limitando a produção em algumas
áreas (ALMEIDA et al., 2008; PEIXOTO et al., 2011).
Das 60 doenças que atacam o feijoeiro 31 são causadas por fungos, sendo 10
consideradas importantes, justificando-se a aplicação de fungicidas específicos como
componente da estratégia de controle dessas doenças (GARCIA; JUSTINO; RAMOS,
2002).
A murcha de fusário causada pelo fungo Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli J.B.
Kendr. & W.C. Snyder, a podridão do colo causada por Sclerotium rolfsii, e a podridãoradicular, causada pelo fungo Rhizoctonia solani Kühn, encontram-se entre as mais
importantes doenças do feijoeiro comum causadas por fungos habitantes de solo. Estes
patógenos estão presentes nos solos de diversas regiões produtoras de feijão. Além
16
destas, podemos destacar a antracnose, causada pelo fungo
Colletotrichum
lindemuthianum, a mancha angular, causada pelo fungo Phaeoisariopsis griseola (Sacc.
Ferraris), a podridão-radicular-seca causada pelo fungo Fusarium solani, o mofobranco, causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum, o oídio, causado pelo fungo
Erysiphe polygoni DC e a mela causada pelo fungo Rhizoctonia solani (BORÉM;
CARNEIRO,
1998; COSTA;
ZIMMERMANN,
1988; PASTOR-CORRALES;
ABAWI, 1987; RESENDE; ZAMBOLIM, 1987; GOULART, 1988; SALA; ITO;
CARBONELL., 2006).
2.1.3. Mela e podridão radicular do feijoeiro comum causadas pelo fungo
Rhizoctonia solani
O fungo habitante do solo Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk [fase
anamórfica = Rhizoctonia solani Kühn] é um basidiomicota que ocorre mundialmente
causando doenças economicamente importantes em uma grande variedade de plantas
cultivadas (ANDERSON,1982; ADAMS, 1988; VILGALYS, 1988).
Segundo Papavizas e Davey (1961) e Cubeta e Vilgalys (1997) e R.solani é um
patógeno habitante de solo, geneticamente heterogêneo, com ampla gama de
hospedeiros, grande capacidade competitiva saprofítica e que sobrevive colonizando
restos de cultura ou mediante estruturas de resistência.
A maioria dos isolados deste patógeno não se reproduz sexuadamente e são
conhecidos apenas por seu estágio assexuado (fase anamórfica). Esse fungo representa
um grupo economicamente importante e geneticamente diverso de patógenos de solo
que ocorrem em várias espécies de plantas em todo o mundo (VILGALYS, 1988;
CUBETA, 1994).
17
Os sintomas de uma das doenças causadas no feijoeiro por este fungo (mela) são
observados inicialmente nas folhas próximas ao solo com manchas de formato irregular
que coalescem causando uma necrose, posterior desfolha das plantas e a adesão das
folhas da planta pela teia micelial do fungo. Os sinais são as teias miceliais e os
microescleródios formados nos tecidos vegetais (NECHET; HALFELD-VIEIRA,
2006). Como esse patógeno tem propensão a atacar tecidos jovens, também pode causar
tombamento de plântulas na pré ou pós-emergência e pode ser introduzido em solos ou
substratos em qualquer etapa do plantio, tanto via sementes como por meio de
substratos contaminados (LUCON et al., 2009).
Para o controle do tombamento há um conjunto de práticas recomendadas, mas o
tratamento de sementes com fungicidas eficientes tem sido a principal medida adotada,
sendo a opção mais econômica para minimizar os efeitos negativos da doença
(GOULART, 2002). Porém, o controle químico pode-se tornar inviável, em razão dos
efeitos deletérios no solo, além de favorecer a seleção de formas mais resistentes desse
fungo (CARDOSO, 1990).
2.1.4. Podridão do colo do feijoeiro comum causada pelo fungo Sclerotium rolfsii
O fungo fitopatogênico Sclerotium rolfsii Sacc., habitante do solo, polífago,
pode causar podridão em raízes, colo de plantas jovens, em sementes, danos em
plântulas, folhas e frutos (FARR et al., 1989; BEDENDO, 1995). Apresenta extensa
gama de hospedeiros, cerca de 500 espécies botânicas, incluindo dicotiledôneas e
monocotiledôneas, distribuindo-se em todas as regiões agrícolas, com predominância
nas zonas tropical e subtropical, onde predominam condições de alta umidade e
temperatura elevada (AYCOCK, 1966; PUNJA; JENKINS, 1984; PUNJA, 1985;
PUNJA; RAHE, 1992). O fungo produz estruturas de resistência chamadas de
18
escleródios, sendo globosos, pequenos, de 0,5-1,5 mm de diâmetro. Os escleródios são
produzidos na ausência de hospedeiros e/ou condições climáticas desfavoráveis
(BIANCHINI; MARINGONI; CARNEIRO, 1997). A presença destas estruturas pode
durar por períodos de um a três anos no solo e dificulta o controle do patógeno. Entre os
fatores físicos que exercem efeito no crescimento e na formação esclerodial, destaca-se
a luz. Segundo Punja (1985), há melhor desenvolvimento de S. rolfsii, em condições de
luminosidade continua, sugerindo que a produção abundante de escleródios na
superfície do solo seja em resposta à presença de luz. Essa observação foi também
relatada por outros pesquisadores, como McClellan et al., (1955) que verificaram maior
produção de escleródios em culturas expostas a luz.
A podridão do colo, frequentemente observada em áreas quentes, sub-tropicais e
tropicais onde se cultiva o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), foi relatada em vários
países como Brasil, Bolívia, Equador, Colômbia, Venezuela, Costa Rica, México e
EUA (ABAWI; PASTOR-CORRALES, 1990); Austrália, Japão, Ceilão, Cuba, Havaí e
Filipinas (WEBER, 1931). A utilização de cultivares resistentes é a melhor opção de
controle, principalmente para fungos fitopatogênicos habitantes do solo. No entanto, há
culturas que ainda não têm cultivares resistentes a determinados fungos de solo e,
mesmo em culturas que têm cultivares resistentes, essas estão sujeitas à quebra de
resistência, devido à variabilidade genética destes fitopatógenos (FARIA, 2009).
2.1.5. Controle de pragas e doenças
Para o controle das pragas e doenças normalmente são utilizados produtos
químicos, sendo necessárias pulverizações preventivas de inseticidas e fungicidas para a
diminuição destes problemas fitossanitários. Porém, o uso indiscriminado desses
produtos vem causando impactos em inimigos naturais e promovendo resistência dos
19
insetos e dos microrganismos, o que vem aumentando as populações destes indivíduos e
diminuindo a eficiência dos produtos utilizados (BASTOS; ALBUQUERQUE, 2004;
LIMA; GEREMIAS; PARRA, 2009; ALMEIDA et al., 2008).
Além disso, o uso indiscriminado de defensivos agrícolas pode causar sérios
riscos à saúde humana e contaminação do meio ambiente. Desta forma, torna-se
necessário a busca por métodos alternativos de controle de pragas e doenças que causem
menos impacto ao meio ambiente e seja eficiente no manejo fitossanitário (GHINI e
KIMATI, 2000).
2.2. Óleos essenciais
Os primeiros relatos históricos importantes da utilização de óleos essenciais de
plantas provêm do Oriente, especialmente do Egito, onde os óleos essenciais eram
usados para embalsamar múmias e para fazer oferendas nas cerimônias religiosas e,
muitas vezes, eram colocados em recipientes com detalhes em ouro que seguiam juntos
para os túmulos dos grandes faraós. (BIOMIST, 2006).
Óleos essenciais são constituídos por uma mistura de compostos naturais,
complexos, voláteis, caracterizados por um odor forte, extraídos de plantas através da
técnica de arraste a vapor, na grande maioria das vezes, e também pela prensagem do
pericarpo de frutos cítricos. São constituídos por compostos originários do metabolismo
secundários, geralmente monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanoides, podem ser
encontrados nas flores, folhas, cascas, rizomas e frutos (CRAVEIRO, QUEIROZ 1993;
BIZZO, 2009; ABDOLAHI et al., 2010).
Os constituintes químicos desses óleos aromáticos variam desde hidrocarbonetos
terpênicos, álcoois simples, fenóis, aldeídos, éteres, ácidos orgânicos, ésteres, cetonas,
lactonas, cumarinas, até compostos contendo nitrogênio e enxofre. Podem ser utilizados
20
para a síntese de vitaminas, hormônios, antibióticos e anti-sépticos (SIMÕES et al.,
2004). A composição do óleo essencial de uma planta é determinada geneticamente,
sendo geralmente específica para um determinado órgão e característica para o seu
estágio de desenvolvimento, entretanto, fatores ambientais, tais como temperatura,
umidade relativa, duração total de exposição ao sol, regimes de ventos, grau de
hidratação do terreno e presença de micronutrientes neste terreno, podem influenciar a
composição dos óleos essenciais. A investigação da composição química de óleos
essenciais foi iniciada no século XIX e levou à descoberta de alguns hidrocarbonetos
isoméricos de fórmula C10H16, os quais foram chamados terpenos (MORAIS; BRAZFILHO, 2007).
Metabólitos secundários de plantas formam um grupo de diversas moléculas que
estão envolvidas na adaptação das mesmas ao ambiente, mas não fazem parte dos
caminhos bioquímicos primários do crescimento e da reprodução celular. A maioria dos
metabólitos secundários é formada no metabolismo da glicose, em que a glicose é
convertida em moléculas de ácido pirúvico, que podem seguir vias diferentes originando
diversos compostos (OOTANI, 2010).
Os monoterpenos e sesquiterpenos são constituintes dos óleos voláteis, sendo
que os primeiros atuam na atração de polinizadores. Os sesquiterpenos, em geral,
apresentam funções protetoras contra fungos e bactérias. Os sesquiterpenos são, em
geral, menos voláteis que os monoterpenos, mas podem influenciar sensivelmente o
odor dos óleos onde ocorrem (CASTRO et al., 2007; OOTANI, 2010). Segundo Simões
et al. (2004) os constituintes químicos dos óleos essenciais variam desde
hidrocarbonetos terpênicos, alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis,
ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até
compostos com enxofre. Na mistura, tais compostos apresentam-se em diferentes
21
concentrações, onde um ou mais deles são compostos majoritário, existindo outros em
menores concentrações e alguns em baixíssimas quantidades (traços).
Os óleos essenciais são compostos destinados, principalmente, à aplicação em
produtos de perfumaria, cosmética, alimentos e como coadjuvantes em medicamentos,
sendo empregados como aromas, fragrâncias, fixadores de fragrâncias, em composições
farmacêuticas e orais. (SILVA SANTOS et al., 2006).
O Brasil ocupa lugar de destaque na produção de óleos essenciais e está entre os
principais fornecedores de óleos cítricos para a União Eropéia e EUA, encontrando-se
entre os grandes exportadores internacionais. Porém, problemas crônicos como falta de
manutenção do padrão de qualidade, baixa representatividade nacional e baixos
investimentos governamentais no setor, levam a produção a um quadro estacionário
(BIZZO, 2009).
O desempenho do comércio exterior brasileiro de exportação de óleos essenciais
decresceu tanto em relação ao volume quanto à receita, no período de 2003 a 2005,
passando de 69.521 t para 59.745 t e de US$ 1.649.640,00 para US$ 1.275.720,00
(FERNANDES, 2005). Dentre os principais óleos exportados pelo Brasil, em 2007,
destacam-se os óleos cítricos, pau-rosa, eucalipto e candeia sendo o principal produtor
do óleo essencial de eucalipto o Estado do Sergipe e do pau rosa o Estado do
Amazonas. As importações brasileiras de óleos essenciais mostraram uma tendência de
crescimento nesses últimos anos. O ano de 2007 fechou com aproximadamente US$ 51
milhões, sendo os principais óleos importados pelo Brasil o de limão siciliano e de
menta (MATTOSO, 2007).
2.2.1. Atividades biológicas dos óleos essenciais
São conhecidos cerca de 3.000 óleos essenciais, dos quais 300 são
comercialmente importantes (BAKKALI et al., 2008). Devido à diversidade de
22
substâncias ativas em plantas medicinais, vários estudos vêm sendo desenvolvidos para
avaliar a ação antimicrobiana de extratos e de óleos essenciais, e os resultados
alcançados nessa linha de pesquisa têm-se mostrado promissores para uma utilização
prática no controle de fitopatógenos em diversas culturas, porém a atividade dos óleos
depende do tipo de microrganismo, do tipo do óleo e de sua concentração. Existem
relatos da atividade direta de extratos e óleos essenciais de plantas sobre insetos, fungos,
bactérias, e efeito alelopáticos, ou indireta, ativando mecanismos de defesa das plantas
aos patógenos (ABDOLAHI et al., 2010; BASTOS;ALBUQUERQUE, 2004;
CARNELOSSI et al., 2009, OOTANI, 2010).
Embora sua maior utilização ocorra nas áreas de alimentos (condimentos e
aromatizantes de alimentos e bebidas), cosméticos (perfumes e produtos de higiene) e
também na indústria farmacêutica, muitas drogas vegetais ricas em óleos essenciais são
empregadas in natura para a preparação de infusões e/ou sob a forma de outras
preparações simples (DEBA et al., 2008; DIKBAS et al., 2008).
A ação de compostos de plantas no controle de fitopatógenos pode ser tanto por
sua ação direta, inibindo o crescimento do microrganismo e a germinação de esporos,
quanto pela capacidade de induzir o acúmulo de fitoalexinas, indicando a presença de
moléculas com característica elicitora (moléculas de origem biótica ou abiótica capazes
de estimular qualquer resposta de defesa da planta) (BONALDO, 2004; CARLOS et al.,
2010).
Muitas investigações são feitas para confirmar a atividade antimicrobiana de
óleos essenciais através de métodos que produzam resultados confiáveis, podendo ser
reproduzidos e validados. Porém, várias são as dificuldades encontradas pelas
características peculiares que os óleos apresentam como volatilidade, insolubilidade em
água e complexidade, que interferem significativamente nos resultados. Assim, ao fazer
23
os testes devem ser levados em consideração a técnica usada, o meio de cultura, o(s)
microrganismo(s) e o óleo testado (NASCIMENTO; SIDRIM; ROCHA, 2007).
Trabalhos desenvolvidos com óleos essenciais, obtidos a partir de plantas
medicinais têm indicado o potencial das mesmas no controle de vários fitopatógenos
como Alternaria solani, Colletotrichum gloeosporioides, Penicilium digitatum,
Colletotricum musae, Corynespora cassiicola, dentre outros (BAUTISTA-BAÑOS et
al., 2003; BALBI-PEÑA et al., 2006; ALMEIDA et al., 2008, ABDOLAHI et al., 2010;
CARLOS et al., 2010).
Estudando a ação antimicrobiana da planta medicinal Achillea millefolium no
desenvolvimento in vitro de Corynespora cassicola, Carlos et al. (2010) obtiveram
inibição de até 63% no crescimento micelial, 100% na esporulação e 98% na
germinação do fungo, utilizando uma alíquota de 200 µL de óleo essencial.
Algumas plantas, por apresentarem uma diversidade de substâncias em sua
composição devem ser estudadas para serem utilizadas diretamente pelo produtor, bem
como servir de matéria-prima para síntese de novos produtos (CELOTO et al., 2008),
ou ainda serem utilizadas na indução de resistência às plantas (STANGARLIN, 2007).
Alguns autores relatam essas atividades dos óleos essências de plantas e seus
constituintes majoritários. Guimarães et al. (2011) verificaram que o óleo essencial de
capim-limão e o citral (constituinte majoritário deste óleo essencial) tiveram efeito
inibidor em Fusarium oxysporum cubense, Colletotrichum gloeosporioides, Bipolaris
sp. e Alternaria alternata.
2.2.2. Alecrim pimenta (Lippia sidoides Cham.)
O gênero Lippia está presente nas regiões tropicais subtropicais de todo o mundo
(FONTENELLE, 2008), pertence à família botânica Verbenaceae, a qual existe
24
aproximadamente 120 espécies de ocorrência no Brasil (MENDONÇA, 1997), e tem
como característica serem ervas eretas, procumbentes ou receptantes, subarbustos ou
mesmos arbustos. As espécies desse gênero são em sua maioria aromática e ornamentais
(FONTENELLE, 2008).
A espécie Lippia sidoides Cham. é popularmente conhecida como alecrimpimenta, sendo uma planta bastante aromática (FONTENELLE, 2008) que ocorre
principalmente na vegetação nordestina. É um arbusto caducifólio, ereto, muito
ramificado e quebradiço, que mede 2-3 m de altura. Suas folhas apresentam forte cheiro
picante e as flores são pequenas, esbranquiçadas, reunidas em espigas de eixo curto nas
axilas das folhas. É propagada por estaquia utilizando, de preferência, os ramos mais
finos (MATOS, 2000; MATOS, 2002; LORENZI; MATOS, 2002). As folhas e flores
constituem a parte medicinal desta planta. Seu óleo essencial possui elevado valor
comercial, pois contém timol ou uma mistura de timol e carvacrol, dois
fenilpropanoides com fortíssimas propriedades antimicrobianas e antisséptica (MATOS,
2000).
Esta espécie apresenta altos rendimentos de óleo essencial, tendo relato de até
6% e como constituinte principal o timol (MENDONÇA, 1997; FONTENELLE et al.,
2007), que é o principal responsável pelo poder antisséptico de suas folhas
(FONTENELLE, 2008), tendo outros constituintes importantes como o E-cariofileno, ρcimeno , ρ-felandreno, mirceno e carvacrol (FONTENELLE et al., 2007; SOUSA et al.,
2004). A utilização de seu óleo essencial se dá em diversas atividades, como agricultura,
veterinária, indústria de alimentos, farmacêutica, cosmética e perfumes. Uma vez que o
mesmo
apresenta
efeito
bactericida
(BOTELHO
et
al.,
2007),
fungicida
(FONTENELLE et al., 2007; SILVA et al., 2011), larvicida (CARVALHO et al., 2003;
25
SOUZA et al., 2011; FURTADO et al., 2005), antimicrobiana (SILVA et al., 2008) e
também na composição de fitodefensivos agrícolas (NAGAO et al., 2002).
2.2.3. Capim-limão (Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf.
O Capim-limão (Cymbopogon citratus) é pertencente à família botânica
Poaceae, que engloba cerca de 500 gêneros e 8.000 espécies, denominadas
genericamente de gramíneas. O gênero Cymbopogon inclui cerca de 30 espécies de
gramíneas perenes aromáticas, sendo, em sua maioria, nativas da região tropical do
Velho Mundo (VIEIRA, 2006).
Geralmente apresenta como constituintes majoritários o citral (mistura isomérica
de neral e geranial) e o mirceno, sendo ambos monoterpenos (GUIMARÃES et al.,
2011). É conhecido popularmente como capim-limão, capim-santo, capim-cidreira,
capim-cheiroso e capim-de-cheiro (BLANK et al., 2007).
Seu óleo essencial possui forte odor de limão e é largamente empregado como
aromatizante em perfumaria e cosmética, na preparação de colônias, sabonetes e
desodorantes, porém, seu maior emprego tem sido na indústria farmacêutica, servindo
de material de partida para síntese de importantes compostos, como iononas, metiliononas e vitamina A (CARVALHO et al., 2005). Vários estudos têm atribuído diversas
atividades biológicas para o óleo essencial de capim-limão. Tais como
inseticida
(LIMA et al., 2008), antimicrobiana (SANTOS et al., 2009), antibacteriana (PEREIRA
et al., 2004), antifúngica (LIMA; FARIAS, 1999), entre outras. O citral, constituinte
majoritário do óleo de C. citratus, é citado como sendo o responsável pelas atividades
atribuídas ao seu óleo essencial, tais como germicidas, repelentes de insetos, aplicações
na indústria farmacêutica, entre outras. Dessa maneira, há uma grande importância em
26
avaliar o seu teor no óleo essencial, que nas plantações brasileiras está em torno de 75 a
86%, valor bastante satisfatório para o mercado internacional (MARTINS et al., 2002).
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42
CAPITULO II
Extração e caracterização química dos óleos essenciais de Lippia sidoides Cham. e
Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf.
43
1. INTRODUÇÃO
Lippia sidoides Cham é uma planta aromática muito utilizada na medicina
popular por possuir propriedades antissépticas (LACOSTE et al., 1996; LEMOS et
al.,1990; MENDONÇA, 1997). Esta espécie de planta se destaca pelos elevados
rendimentos de seu óleo essencial, de até 6%, (MENDONÇA, 1997), sendo este rico em
timol (43,5%), que é o responsável pelo alto poder antisséptico de suas folhas.
O óleo essencial de Cymbopogon. citratus possui uma grande importância
econômica, pois é largamente utilizado na indústria de alimentos, cosmética e química
(COSTA et al,2005). Este óleo essencial tem como principal componente o citral
(composto pela mistura dos isômeros geranial e neral (65-80%)) (LEAL et al., 2003b),
além de limoneno, citronelal, mirceno e geraniol. (GUERRA et al., 2000). O citral é
utilizado como matéria prima de importantes compostos químicos denominados
iononas, que são utilizadas na perfumaria e na síntese da vitamina A (MARTINS et al.,
2004).
Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi extrair e caracterizar
quimicamente os óleos essenciais de Lippia sidoides Cham. e de Cymbopogon citratus
(D.C) Stapf.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Obtenção do material vegetal e extração dos óleos essenciais
As folhas de Lippia sidoides Cham. e de Cymbopogon citratus (D.C) Stapf
foram coletadas no mês de janeiro 2011, no período da manhã, no município de
Itumirim, Minas Gerais/Brasil. O material coletado foi encaminhado para o Laboratório
44
de Química Orgânica do Departamento de Química da Universidade Federal de Lavras
(UFLA) – Lavras/MG, para a extração dos óleos essenciais.
A extração dos óleos essenciais foi realizada pelo método de hidrodestilação,
utilizando-se um aparelho de Clevenger modificado. As folhas frescas de cada espécie
vegetal estudada foram picadas e colocadas em um balão de fundo redondo de 4 litros
de capacidade, recobertas com água, sendo o processo de extração realizado em um
período de 2 horas, mantendo a solução em ebulição (GUIMARÃES et al., 2008). O
hidrolato coletado foi centrifugado em centrífuga de cruzeta horizontal a 900 x g por
cinco minutos; posteriormente, o óleo essencial foi retirado com o auxílio de uma pipeta
de Pasteur e acondicionado em frasco de vidro âmbar em baixa temperatura e ao abrigo
da luz.
2.2. Análises cromatográficas dos óleos essenciais
As análises qualitativas e quantitativas dos óleos essenciais foram realizadas no
Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal do Pará (UFPA) –
Belém – PA. As análises qualitativas foram realizadas por cromatografia em fase gasosa
acoplada à espectrometria de massa CG-EM. O cromatógrafo utilizado foi o modelo
Thermo DSQ II, sendo o equipamento operado nas seguintes condições: coluna capilar
de sílica fundida DB-5 ms (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm de espessura de filme) (Folsom,
CA, USA); com a seguinte programação da temperatura na coluna: 60 – 240 ºC (3
ºC/min); ; temperartura do injetor: 250 ºC; gás carreador hélio, com velocidade linear
ajustada de 32 cm/s (medida a 100 ºC); injeção splitless com volume injetado de 2 µL
de uma solução 1:1000 em hexano, com uma vazão de split ajustada para resultar em
uma taxa de 20:1; fluxo constante de varredura do septo de 10 mL/min. Para o
espectrômetro de massas (EM), foram utilizadas as seguintes condições: energia de
45
impacto de 70 eV; temperatura da fonte de íons e da interface: 200 ºC. Foi injetada, nas
mesmas condições das amostras, uma série homóloga de n-alcanos (C9H20 ....... C26H54).
Os espectros obtidos foram comparados com o banco de dados da biblioteca Wiley 229
e o índice de retenção, calculado para cada constituinte, foi comparado com o tabelado,
de acordo com Adams (2007).
As análises quantitativas foram realizadas por normalização interna (expressas
em porcentagens relativas das áreas dos picos correspondentes a cada constituinte,
assumindo o mesmo fator de resposta do detector para todos os constituintes). Essas
análises foram realizadas utilizando um cromatógrafo gasoso Focus equipado com um
detector de ionização de chamas (DIC), operado em condições similares aquelas do CGEM, exceto o gás de arraste, sendo utilizado o nitrogênio.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os constituintes químicos dos óleos essenciais obtidos das folhas frescas de L.
sidoides e de C. citratus, seguidos pelos seus tempos de retenção, índices de retenção
calculados e tabelados e os seus teores expressos em porcentagem (calculados por
normalização de áreas) encontram-se na Tabela 1.
Na analise da composição química do óleo de L. sidoides, observa-se uma
predominância de fenilpropanoides (37,93%), acompanhada de monoterpenos
oxigenados (30,94%) e hidrocarbonetos monoterpênicos (15,28%). Comparativamente
para o óleo de C. citratus revela-se uma proporção elevada de monoterpenos
oxigenados (83,58%) e uma taxa menor de hidrocarbonetos monoterpênicos (13,20%).
As quantidades de hidrocarbonetos monoterpênicos monstraram-se similares a 15,28%
para L. sidoides e 13,20% para C. citratus. No óleo essencial de L. sidoides foram
encontrados como constituinte majoritários o 1,8-cineol (24,41%) e o carvacrol
46
(33,27%). Muitas espécies de Lippia contém monoterpenos como constituintes
majoritários de seus óleos essenciais. Muitos dos óleos essenciais de espécies
pertencentes a este gênero exibem diversas atividades biológicas, sendo o timol, o
carvacrol, o citral e o p-cimeno os compostos mais freqüentemente encontrados e
responsáveis pelas atividades biológicas observadas (VERAS 2011). Outros
constituintes comumente encontrados nos óleos essenciais de espécies pertencentes ao
gênero Lippia são: α- felandreno, β-cariofileno, α-cimeno, mirceno e carvacrol
(SOUSA et al.,
2004). Diversos estudos demonstram as propriedades bactericida,
fungicida, moluscicida e larvicida para o timol e o carvacrol (MATOS, 1996;
BOTELHO et al., 2007; KORDALI et al., 2008).
Tabela 1. Constituintes químicos dos óleos essenciais e os respectivos teores expressos
em porcentagem.
Compostos
α-pineno
Sabineno
β-pineno
Mirceno
α-felandreno
α-terpineno
orto-cimeno
1,8-cineol
Z- β-ocimeno
γ-terpineno
cis-sabineno hidratado
Terpinoleno
6,7-epoximirceno
trans-sabineno hidratado
Linalol
Cis-para-met-2-en-1-ol
Ipsdienol
Citronelal
E-isocitral
Umbelulona
terpinen-4-ol
Z-isocitral
α-terpineol
Trans-carveol
Verbenona
Cis-carveol
Citronelol
TRa
RICb
RITc
5,80
6,88
7,28
7,31
7,93
8,25
8,55
8,81
9,25
9,71
10,18
10,89
10,94
11,33
11,26
12,28
12,98
13,38
13,79
14,14
14,59
14,59
15,21
15,74
15,76
16,17
16,52
935
974
989
992
1006
1018
1026
1033
1045
1058
1070
1090
1091
1102
1100
1124
1141
1151
1161
1169
1180
1180
1194
1207
1207
1217
1220
932
969
974
988
1002
1014
1022
1026
1032
1054
1065
1086
1090
1098
1095
1118
1140
1148
1177
1167
1174
1160
1186
1215
1204
1226
1223
47
Lippia
sidoides
t
t
t
0,11
7,70
1,82
24,41
5,28
1,43
0,37
0,92
2,95
0,83
0,22
t
Cymbopogon
citratus
12,90
0,30
t
1,09
t
t
0,91
1,01
t
1,67
t
0,23
0,25
Metil-éter-timol
16,64
1228
1232
3,45
Metil-éter-carvacrol
17,02
1237
1241
t
Neral
17,09
1238
1235
31,28
Geraniol
17,52
1248
1249
t
Geraniale
18,42
1269
1264
0,18
46,32
Timol
19,24
1288
1289
0,40
2-undecanona
19,27
1291
1293
0,39
Carvacrol
19,72
1299
1298
33,27
timol acetato
21,55
1364
1355
0,22
Carvacrol acetato
22,35
1361
1365
0,59
α-copaeno
22.78
1371
1374
t
Geranil acetato
22,97
1376
1379
0,43
β-bourboneno
23,12
1379
1387
t
β-elemeno
23.38
1386
1389
0,55
E-cariofileno
24,58
1414
1417
2,73
Trans-α-bergamoteno
25,18
1429
1432
t
α-humuleno
26,03
1450
1452
1,89
allo-aromadendrano
26,20
1454
1458
t
γ-muuroleno
26.83
1469
1478
t
germacreno D
27,06
1475
1484
0,83
Butil hidroxi anisol
27,21
1481
1488
t
Epi-cubenol
27,66
1490
1493
0,71
2-tridecanona
27,76
1492
1495
t
γ-cadineno
28,35
1507
1513
t
Cubebol
28,45
1509
1514
0,61
Hedicariol
29,75
1543
1546
0,25
0,15
Spatulenol
30,79
1569
1577
1,94
Óxido de cariofileno
30,99
1574
1582
0,13
Ledol
31,84
1596
1602
t
II epóxido humuleno
32,06
1602
1608
0,91
Cariofila-4(12),8(13)-dien-5-alfa-ol
33,08
1629
1639
1,08
α-cadinol
33,77
1648
1652
0,81
Germacra-4(15),5,10(14)-trien-1-alfa-ol 34,82
1676
1685
0,20
Grupos de compostos
Hidrocarbonetos monoterpêncicos
15,28
13,20
Monoterpenos oxigenados
30,94
83,58
Hidrocarbonetos sesquiterpênicos
6,64
Sequiterpenos oxigenados
6,00
0,15
Fenilpropanoides
37.93
96,79
96,93
Total identificado
a
TR = Tempo de retenção (minutos); bRIC = índice de retenção calculado em relação a n-alcanos de C9C17 em uma coluna DB-5; cRIT = índice de retenção tabelado (Adams 2007); t = trace (<0.10%); Um
traço (–) indica não detectado.
Leal et al. (2003a) analisando a tintura de L. sidoides produzidas em diferentes
estágios de desenvolvimento da planta, relata o timol como constituinte majoritário de
seu óleo essencial, uma vez que, os teores deste composto no mesmo variaram de 34,2
a 95,1%. No óleo essencial de L. sidoides foi observado uma porcentagem elevada de
48
fenilpropanoides (37,93%), entretanto, no óleo essencial de C. citratus não foi
encontrado a presença de compostos pretencentes à esta classe. Embora os
fenilpropanoides não sejam constituintes comuns de óleos essenciais de plantas, os
óleos essenciais de certas espécies contêm proporções abundantes ou significativas de
tais compostos. Quando ocorrem, sua natureza e suas propriedades alteram
significativamente as características sensoriais do óleo (SANGWAN et al., 2001). São
exemplos desta classe de compostos: o eugenol, obtido do óleo volátil dos botões florais
de Syzygium aromaticum (L.) Merrill & Perry, popularmente conhecido como cravo-daíndia (SRIVASTAVA; SRIVASTAVA; SYAMSUNDAR et al., 2004), o trans-anetol e
o estragol, presentes no óleo de Foeniculum vulgare Mill., popularmente conhecido
como funcho (POLITEO; JUKI; MILO et al., 2006), o metil-eugenol, presente no óleo
de Melaleuca bracteata F. Muell., e a miristicina, presente no óleo dos frutos de
Myristica fragrans Houtt. (ADAMS, 2007). Fenilpropanoides são comumente
encontrados nos óleos essenciais de espécies pertencentes às famílias Apiaceae,
Lamiaceae, Myrtaceae e Rutaceae (BAKKALI et al., 2008).
Observa-se no de óleo essencial C. citratus altos teores dos isômeros, geranial
(46,32%) e neral (31,28%), sendo a mistura destes dois isômeros denominada de citral.
O citral é amplamente encontrado na natureza, e aparece em alta concentração em
algumas espécies vegetais, como na Litsea cubeba (70 a 80%), L. citrata (aprox. 90%),
na verbena e no óleo de limão, em teores menores (SBQ, 2012). Leal et al., (2003b)
analisando o óleo essencial extraído de C. citratus encontrou como constituintes
majoritários geranial e neral (65-80%) . Valores semelhantes aos encontrados no óleo
essencial de C. citratus foram encontrados por Sacchetti et al. (2005), que relatou a
presença de 65 a 86% de citral no óleo essencial desta espécie. Guimarães et al., (2008)
49
também encontrou resultados semelhantes, encontrando como constituintes majoritários
neral (31,89%), geranial (37,42%) e mirceno (23,77%).
Os constituintes majoritários encontrados no óleo essencial de L. sidoides foram
o carvacrol (33,27%) seguido pelo 1,8-cineol (24,41%). Divergindo dos resultados
encontrados por Chaves et al. (2008) que relata a presença de timol (76,9%) como
constituinte majoritário do óleo essencial de L. sidoides.
Os óleos essenciais vegetais são compostos basicamente por: terpenos e
fenilpropanóides, os quais apresentam propriedades antifúngicas e microbianas
comprovadas (ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al., 2006; NUNES et al 2006).
4. CONCLUSÃO
O óleo essencial de Cymbopogon citratus apresentou como constituintes
majoritários o citral (77,60%), constituído pela mistura isomérica de geranial (46,32%)
e neral (31,28%).
No óleo essencial de Lippia sidoides foram encontrados como constituintes
majoritários carvacrol (33,27%) seguido pelo 1,8-cineol (24,41%).
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Cariri, Crato-CE, 2011.
55
CAPÍTULO III
Potencial fungitóxico dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus, de Lippia
sidoides e de seus componentes majoritários sobre o crescimento micelial de
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.
56
1. INTRODUÇÃO
O cultivo do feijão comum (Phaseolus vulgaris) tem grande importância
econômica e social para o Brasil. O país é o maior produtor mundial do grão que é
cultivado predominantemente nas pequenas propriedades rurais. Além disso, o feijão
destaca-se como fonte alimentar, pela presença de proteínas, carboidratos, vitaminas,
minerais e fibras (ANTUNES; SILVEIRA, 2000). Um dos problemas enfrentados pelos
produtores é o grande número de doenças que atacam o feijoeiro, dentre as principais
encontram-se a mela e a podridão radicular que são causadas pelo Rhizoctonia solani e a
podridão do colo, causada pelo Sclerotium rolfsii. Os métodos de manejo mais
utilizados no controle de fitopatógenos empregam fungicidas, que propiciam a planta
uma defesa ou uma cura para os danos causados pelo ataque de determinado patógeno.
Pesquisas têm buscado métodos de controle alternativos sobre diversos
fitopatógenos, que sejam saudáveis para os consumidores e ambientalmente corretos,
possibilitando a produção de alimentos com a ausência de agrotóxicos. Neste sentido,
encontram-se muitos trabalhos que avaliam a eficácia de produtos de origem natural,
principalmente de origem vegetal.
Várias são as medidas alternativas de manejo, visando uma agricultura mais
limpa, por meio de insumos naturais contra fitopatógenos (COSTA et al., 2000;
CAMPANHOLA; BETTIOL, 2003; LOPES et al., 2005). Dentre as práticas de controle
estudadas, extratos de sementes (KHURMA; SINGH, 1997; DIAS et al., 2000),
exsudatos vegetais (ROCHA; CAMPOS, 2004) e óleos essenciais (LORIMER et al.,
1996; OKA et al., 2000; LOPES et al., 2005) têm sido frequentemente relatados. Muitos
estudos têm demonstrado as atividades fungitóxicas de diversos óleos essenciais.
Estudos têm comprovado o efeito de compostos isolados, extraídos de óleos essenciais
57
de plantas, que atuam como fungicidas naturais (ABDELGALEIL et al., 2008; CHANG
et al., 2008; KORDALI et al., 2008).
Tendo em vista, a importância de se buscar alternativas de controle ecologicamente
corretas e que no futuro possam ajudar no manejo sustentável de doenças, o presente
trabalho teve como objetivo avaliar a atividade fungitóxica in vitro dos óleos essenciais
de Cymbopogon citratus, Lippia sidoides e de seus componentes majoritários, sobre o
crescimento micelial de R. solani e S. rolfsii.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Obtenção dos óleos essenciais
As folhas de L. sidoides. e de C. citratus foram coletadas no mês de janeiro
2011, no período da manhã, no município de Itumirim, Minas Gerais/Brasil. Os óleos
essenciais foram extraídos no Laboratório de Química Orgânica do Departamento de
Química da Universidade Federal de Lavras (UFLA) – Lavras/MG. A extração foi
realizada utilizando o método de hidrodestilação, por meio de aparelho de Clevenger
modificado. As folhas frescas de cada espécie vegetal estudada foram picadas e
colocadas em um balão de fundo redondo de 4 litros de capacidade, recobertas com
água, sendo o processo de extração realizado em um período de 2 horas, mantendo a
solução em ebulição (GUIMARÃES et al., 2008). O hidrolato coletado foi centrifugado
em centrífuga de cruzeta horizontal a 900 x g por cinco minutos; posteriormente, o óleo
essencial foi retirado com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e acondicionado em frasco
de vidro âmbar em baixa temperatura e ao abrigo da luz.
58
2.2. Avaliação das Atividades fungitóxicas
As avaliações das atividades fungitóxicas foram realizadas no Laboratório de
Fitopatologia da Universidade Federal do Tocantins, Campus de Gurupi.
2.3. Obtenção dos isolados
Os isolados de R. solani e S. rolfsii utilizados foram obtidos de folhas e hastes de
feijão (P. vulgaris) com sintomas das doenças causadas por estes fungos, provenientes
de campos da região do sul do Estado do Tocantins. Pequenos fragmentos de folhas e
hastes lesionadas foram previamente imersos em soluções de álcool (50%) por 30
segundos e de hipoclorito de sódio (1,0%) por 40 segundos, e posteriormente lavados
em água destilada estéril por três vezes e transferidos para placas de Petri contendo
meio BDA (batata, dextrose e ágar). As placas de Petri foram incubadas a 22 ± 3ºC e
fotoperíodo de 12 horas, sob luz fluorescente. Após crescimento micelial, retirou-se um
disco de BDA com aproximadamente 6 mm de diâmetro contendo os micélios de cada
fungo. O mesmo foi transferido para outra placa de Petri contendo BDA, sendo
incubando novamente nas mesmas condições descritas anteriormente. Os fungos foram
identificados por microscopia óptica por meio da caracterização de suas estruturas
vegetativas e inoculados novamente em plantas de feijão para confirmar sua
patogenicidade e completar os postulados de Koch.
2.4. Ensaio de inibição do crescimento micelial
O método utilizado foi o bioanalítico in vitro, por meio do qual avaliaram-se os
efeitos dos óleos essenciais de L. sidoides e C. citratus; dos compostos 1,8-cineol e
59
carvacrol (constituintes majoritários do óleo essencial de L. sidoides) e do citral
(constituinte majoritário do óleo essencial de C. citratus, e que é constituído pela
mistura dos aldeídos monoterpênicos isoméricos, neral e geranial); e dos fungicidas
comerciais
Vitavax®
[(carboxina,
200g/L)
e
(tiram,
200g/L)]
e
Opera®
[(piraclostrobina, 133 g/L) e (epoxiconazol, 50 g/L)] em diferentes concentrações, sobre
o crescimento e/ou inibição micelial das culturas fúngicas.
Para determinação das concentrações dos compostos utilizados sobre cada
microrganismo, foram realizados diversos ensaios de modo a encontrar uma faixa de
concentrações, partindo de uma concentração inicial que apresentasse efeito sobre o
crescimento/inibição do fitopatógeno até uma concentração que inibisse totalmente o
crescimento do mesmo.
Para tal, os óleos essenciais e seus constituintes majoritários foram diluídos em
éter etílico em uma capela asséptica de fluxo laminar. Em seguida foram solubilizados
em água destilada contendo leite em pó (10 mg mL -1) como emulsificante.
Posteriormente a solução resultante foi incorporada ao meio de cultura BDA,
previamente esterilizado e fundido a uma temperatura entre 45-50ºC, obtendo as
concentrações adequadas para cada microrganismo (JUNQUEIRA et al., 2004). Depois,
transferiu-se 20 mL desta mistura (composto, leite em pó e BDA) para placas de Petri
de 9 cm de diâmetro, previamente esterilizadas.
Após a solidificação, discos de
aproximadamente 6 mm de diâmetros contendo micélios dos fungos (retirados de
culturas com 7 dias em BDA) foram repicados para o centro das placas, as quais foram
vedadas com filme plástico e incubadas à temperatura de 22 ± 3 ºC e fotoperíodo de 12
horas, durante um período de 96 horas. Esta metodologia foi utilizada para
determinação das faixas de concentrações a serem utilizadas para cada composto, bem
como para as concentrações já estabelecidas para cada microrganismo. Paralelamente
60
prepararam-se duas testemunhas; uma composta apenas do fitopatógeno e do meio de
cultura (testemunha absoluta) e outra contendo BDA, éter etílico e leite em pó
(testemunha relativa).
Desta forma as concentrações utilizadas sobre o fitopatógeno, Rhizoctonia solani
foram de 25, 100, 200, 300, 400 μg mL-1 para o óleo essencial de L. sidoides; de 50, 75,
100, 150, 200 μg mL-1 para o carvacrol; de 50, 250, 500, 750, 1000 μg mL -1 para o 1,8cineol; 100, 200, 300, 400, 600 μg mL-1 para o óleo essencial de C. citratus e de 25, 50,
100, 150, 200 μg mL-1 para o citral. Sobre o fitopatógeno Sclerotium rolfsii foram
utilizadas as concentrações de 25, 100, 200, 300, 400 μg mL-1 para o óleo essencial de
L. sidoides; de 25, 75, 125, 175, 200 μg mL-1 para o carvacrol; de 50, 250, 500, 750,
1000 μg mL-1 para o 1,8-cineol; 50, 100, 200, 275, 300 μg mL-1 para o óleo essencial de
C. citratus e de 150, 175, 200, 225, 250 μg mL-1 para o citral.
Para a avaliação dos fungicidas comerciais, empregou-se a mesma metodologia,
porém os mesmos foram diluídos apenas em água destilada, sendo a solução adicionada
ao meio de cultura, de forma a obter as concentrações utilizadas, que foram de 1, 10, 25,
50, 100 μg mL-1 para o Opera®, sobre os dois fitopatógenos; de 0,1, 1,0, 5,0, 10,0, 15,0
μg mL-1 do Vitavax® sobre Sclerotium rolfsii e de 1, 5, 10, 15, 25 μg mL-1 deste mesmo
composto sobre R. solani.
As medidas do crescimento micelial das culturas dos respectivos fungos foram
realizadas quando as colônias fúngicas da testemunha absoluta atingiram toda a
superfície do meio. Para tal, foram traçadas duas retas cruzadas pela placa de Petri
passando pelo centro do disco de 6 mm. As leituras foram realizadas pelas medidas do
diâmetro de crescimento das colônias. Para o cálculo dos percentuais de inibição do
crescimento (PIC) micelial utilizou-se a seguinte fórmula de acordo com Bastos (1997);
61
PIC= ((cresc. Testemunha – cresc. Tratamento) /cresc. Testemunha) x 100
Os tratamentos foram dispostos de forma inteiramente casualizada, com três
repetições e em esquema fatorial com arranjo de 7 x 5, sendo sete compostos e cinco
concentrações.
Foi feita a análise de variância para verificação dos efeitos dos
tratamentos, utilizando a análise de regressão para avaliar a porcentagem de inibição do
crescimento micelial dos fitopatógenos em relação à concentração, utilizando o
programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2000).
A partir das equações de regressão foram calculados valores de IC50
(concentração pra inibir 50% do crescimento micelial). Também foram determinados
valores de CMI (concentração mínima para inibir o crescimento micelial).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As atividades fungitóxicas do óleo essencial de C. citratus e do citral, seu
constitunte majoritário, sobre a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos R.
solani e S. rolfsii estão apresentadas na Figura 1.
Observou-se diferença significativa para as diferentes concentrações de óleo
essencial sobre a inibição do crescimento micelial dos microrganismos estudados. Em
relação à testemunha relativa de cada microrganismo não houve diferença significativa
entre seus crescimentos miceliais e os apresentado pelas testemunhas absolutas.
De acordo com as análises estatísticas de regressão, as inibições dos
crescimentos miceliais dos fitopatógenos R. solani e S. rolfsii, diante das concentrações
do óleo essencial de C. citratus e do citral, apresentaram um comportamento linear
(Figura 1). Em relação ao R. solani, observou-se que o óleo essencial de C. citratus
inibiu 100% de seu crescimento micelial na concentração a partir de 400 μg mL-1,
62
enquanto que, para o citral esta mesma inibição foi observada na concentração de 200
μg mL-1. Já sobre o S. rolfsii, o óleo essencial e o citral causaram 100% inibição de seu
crescimento micelial nas concentrações de 300 e 225 μg mL-1, respectivamente.
Porcentagem de Inibição (%)
R. solani
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Cymbopogon citratus
Citral
0
50
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650
-1
Concentação (µg mL )
Cymbopogon citratus : y = 0,213159x** - 10,533694
R² = 0,854
Citral: y = 0,461431x** + 12,586423
R² = 0,9341
Porcentagem de Inibição (%)
S. rolfsii
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Cymbopogon citratus
Citral
0
50
100
150
200
250
300
350
-1
Concentação (µg mL )
Cymbopogon citratus : y = 0,325301x** - 10,725363
R2 = 0,8628
Citral: y = 1,077400x** - 179,236000
R2 = 0,8655
FIGURA 1. Efeito do óleo essencial de Capim limão (Cymbopogon citratus) sobre
odesenvolvimento micelial de R. solani e S. rolfsii.
63
Os efeitos do óleo essencial de L. sidoides e de seu constituinte majoritário,
carvacrol sobre a inibição micelial destes mesmos fitopatógenos encontram-se na Figura
2.
Porcentagem de Inibição (%)
R. solani
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Lippia sidoides
Carvacrol
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
-1
Concentação (µg mL )
Lippia sidoides : y = 0,260517x** + 1,870769
R2 = 0,9651
Carvacrol: y = 0,661602x** - 27,392931
R2 = 0,9839
Porcentagem de Inibição (%)
S. rolfsii
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Lippia sidoides
Carvacrol
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
-1
Concentação (µg mL )
Lippia sidoides : y = 0,242320x** - 13,839024
R2 = 0,8708
Carvacrol: y = 0,003059x 2** - 0,355373x + 19,212000
R2 = 0,9328
FIGURA 2. Efeito do óleo essencial de Alecrim pimenta (Lippia sidoides) sobre o
desenvolvimento micelial de R. solani e S. rolfsii.
64
Em relação ao 1,8-cineol, composto que também é um dos constituintes majoritários do
óleo essencial de L. sidoides, não foram observadas atividades fungitóxicas sobre a
inibição micelial dos fitopatógenos estudados, uma vez que, a mesma foi igual a zero
para ambos os fitopatógenos em todas as concentrações avaliadas.
Tendo em vista as análises de regressão realizadas para a inibição dos
crescimentos miceliais de R. solani e de S. rolfsii em relação as concentrações do óleo
essencial de L. sidoides e do carvacrol, observa-se que a inibição micelial causada por
estes dois compostos sobre R. solani segue uma equação linear. No entanto, a inibição
do crescimento micelial do S. rolfsii segue uma equação linear apenas em relação às
concentrações do óleo essencial, enquanto que, as inibições causadas pelas
concentrações de carvacrol seguem uma equação de 2º grau. O óleo essencial de L.
sidoides quando na concentração de 400 μg mL-1 causou uma inibição de 100 % sobre o
crescimento micelial dos dois fitopatógenos estudados. O carvacrol se mostrou mais
ativo, sendo capaz de causar esta mesma inibição quando presente nas concentrações de
200 e de 225 μg mL-1 sobre R. solani e S. rolfsii, respectivamente.
As inibições miceliais dos fungicidas Vitavax® e Opera®, que foram avaliadas
como referências para as atividades apresentadas pelos óleos essenciais e seus
constituintes majoritários perante os dois fitopatógenos, estão apresentadas na Figura 3.
Tendo em vista as análises de regressão realizadas para as inibições dos
crescimentos miceliais dos dois fitopatógenos em relação às concentrações dos
fungicidas comerciais, observa-se que as inibições sobre ambos fitopatógenos causadas
pelo fungicida Opera® seguem equações de 2º grau. Enquanto que, as inibições dos
crescimentos miceliais, também para ambos os microrganismos, causadas pelo
Vitavax®, obedecem a equações lineares.
65
Porcentagem de Inibição (%)
R. solani
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Opera
Vitavax
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
100
110
-1
Concentação (µg mL )
Opera: y = -0,012255x 2** + 1,830944x + 37,557629
R2= 0,8673
Vitavax: y = 3,817328x** + 13,865260
R2 = 0,8801
Porcentagem de Inibição (%)
S. rolfsii
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
Opera
Vitavax
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
-1
Concentação (µg mL )
Opera: y = -0,013766x 2** + 1,933187x + 43,314704
R2 = 0,9526
Vitavax: y = 6,677648x** + 17,412149
R2 = 0,8161
FIGURA 3. Efeito dos funcicidas Opera® e Vitavax® sobre o desenvolvimento
micelial de R. solani e S. rolfsii.
66
O R. solani teve seu crescimento micelial inibido em 100% pelo Vitavax® na
concentração de 25 μg mL-1, enquanto que em relação ao Opera®, houve inibição
próxima a 90% na concentração de 50 μg mL -1 do mesmo. Sobre o S. rolfsii, o
Vitavax® quando presente na concentração de 10 μg mL -1 foi capaz de inibir 100% de
seu crescimento, e o Opera® na concentração de 50 μg mL -1 causou inibição próxima a
100%.
Os valores de IC50 de todos os compostos avaliados em relação aos dois
microrganismos encontram-se na Figura 4.
S. rolfsii
300
R. solani
250
IC50
200
150
100
50
0
Cymbopogon
citratus
Citral
Lippia
sidoides
Carvacrol
Opera
Vitavax
FIGURA 4. Valores de IC50 para os compostos avaliados.
Os valores de IC50 evidenciam a ação dos constituintes majoritários em relação
aos seus óleos essenciais, tais atividades demonstram que estes constituintes são
responsáveis pelo efeito fungitóxico em relação aos microrganismos testados neste
trabalho. Observa-se um baixo valor de IC50 para o citral, constituinte majoritário do
óleo de C. citratus em relação ao microrganismo R. solani, demonstrando que tal
67
composto é mais efetivo na inibição do crescimento micelial deste fitopatógeno, quando
comparado à inibição do crescimento micelial de S. rolfsii.. O carvacrol constituinte
majoritário do óleo essencial de L. sidoides obteve um menor valor de IC50 para S.
rolfsii,comparado ao IC50 encontrado para o citral sobre o mesmo fitopatógeno. Os
fungicidas Vitavax® e Opera® utilizados como parâmetros na pesquisa, apresentaram
os menores valores de IC50 quando comparados aos óleos essenciais
e aos seus
constituintes majoritários.
Verifica-se que o carvacrol, constituinte majoritário do óleo essencial de L.
sidoides afetou mais o desenvolvimento do fitopatógeno S. rolfsii, uma vez que os
valores da CMI e do IC50 deste composto sobre a inibição do crescimento micelial
deste fitopatógeno, foram menores que aqueles encontrados para os óleos essenciais de
L. sidoides, C. citratus e do Citral. Por outro lado, o fitopatógeno R. solani foi mais
sensível ao citral, tendo em vista que os valores de CMI e de IC50 apresentados por este
composto sobre a inibição do crescimento micelial deste microrganismo foram menores
que os encontrados para os óleos essenciais e o carvacrol.
O óleo essencial de C. citratus causou maior inibição sobre o crescimento
micelial do S. rolfsii, causando a total inibição emuma dosagem menor que a encontrada
para o óleo essencial de L. sidoides capaz de causar o mesmo efeito sobre o crescimento
micelial deste microrganismo. , No entanto, em relação ao R. solani, os dois óleos
essenciais apresentaram 100% de inibição do crescimento micelial nas mesmas
concentrações.
Estudos mostram que a atividade antibacteriana do óleo volátil de Cymbopogon
citratus está diretamente relacionada ao citral (DEGLMANN, 2002). Neste resultado a
atividade antifúngica está relacionada diretamente com o citral. Comprovando a eficácia
do óleo de C. citratus no controle antifúngico de R. solani e S. rolfsii tais atividades
68
antifúngicas também foram observadas em alguns estudos com fungos filamentosos,
como Aspergillus flavus (PARANAGAMA et al., 2003). Alves et al. (2002) relataram à
eficiência dos óleos essenciais das plantas C. citratus, Cymbopogon nardus (L.) Rendle.
e Eucalyptus citriodora Hook. no controle in vitro, da germinação de conídios e do
crescimento micelial de Colletotrichum musae.
Segundo Carriconde et al. (1996), o óleo essencial do C. citratus tem como
propriedades terapêuticas ação antifúngica e antibacteriana, e que o principal
componente do óleo essencial do C. citratus é o citral. Com isso, percebesse a eficácia
do óleo essencial C. citratus em efeito in vitro sobre importantes patógenos de plantas,
como no caso do Colletotrichum gloeosporioides, em que obteve 100% de inibição na
sua germinação. O óleo essencial de C. citratus inibiu completamente a germinação de
esporos e o crescimento micelial do fungo Dydimella bryoniae, causador de danos às
folhas e frutos de melão (FIORI et al., 2000). Segundo Rozwalka, Lima e Mio (2008), o
óleo essencial de C. citratus inibiu totalmente o fungo Colletotrichum gloeosporioides
isolado de goiaba. Estes resultados concordam com os encontrados neste trabalho e
demonstram a fungitoxicidade de C. citratus em relação ao R. solani e S. rolfsii.
Lemos et al. (1990) verificou que o óleo essencial de L. sidoides exibiu grande
atividade contra os microrganismos Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus flavus e
Cryptococcus neoformans. Foram descritas também atividades bactericidas e fungicidas
contra diferentes espécies microbianas, bem como larvicida (BOTELHO et al., 2007;
KORDALI et al., 2008). Segundo Pessoa, Oliveira e Innecco (1996), o óleo essencial de
L. sidoides a 10%, em teste in vitro, inibiu o crescimento micelial de Macrophomina
phaseolina, Fusarium oxysporum, Colletotrichum gloeosporioides e Rhizopus sp. Estes
resultados se assemelham aos deste trabalho, que obteve 100% de inibição de R. solani
e S. rolfsii com uma dosagem de 400 mg/L. Oliveira, Pessoa e Pinheiro (1998)
69
avaliaram a ação antifúngica deL. sidoides sobre C. gloeosporioides in vitro e obteve
reduções de ate 96,8% no diâmetro das colônias.
Segundo Bertini et al. (2005), o principal constituinte do óleo essencial de L.
sidoides é o timol que tem uma forte atividade contra bactérias e fungos e que a eficácia
dessa planta foi demonstrada pelo óleo essencial das folhas, que contém timol e
carvacrol como principais constituintes com teores de timol variando de 43,5% a 59,5%
(COSTA et al., 2005; FONTENELLE et al., 2007) representando 1,5% da matéria seca
das folhas desta espécie (NUNES et al., 2005).
De acordo com Fontenelle et al. (2007) os principais constituintes de óleos
essenciais extraídos de plantas que exercem atividade antifúngica importante são
compostos fenólicos como o timol, carvacrol ou eugenol. A forte ação fungitóxica
exercida pelo óleo essencial de L. sidoides sobre o desenvolvimento micelial de R.
solani e S. rolfsii ocorreu devido a presença do carvacrol.
Não se constatou neste trabalho a inibição dos fungos pelo 1,8-cineol, em
nenhuma das dosagens apresentadas. Raros são os trabalhos testando o 1,8-cineol como
antifúngico, alguns autores avaliando este composto na área da saúde encontraram
resultados similares aos encontrados neste trabalho. Cimanga et al. (2002) admitiram
não haver correlação entre a concentração dos componentes majoritários como 1,8cineol, α-pineno, ρ-cimeno, entre outros com a atividade antibacteriana observada no
estudo de algumas espécies de eucalipto, sugerindo que esta atividade está relacionada a
presença de algumas classes como álcoois, aldeídos, alcenos, ésteres e éteres. Os
efeitos farmacológicos do 1,8-cineol foram estudados por Santos (2002) em
camundongos e concluiu que esta substância apresenta baixo potencial tóxico, redução
dos danos gástricos, possui propriedades sedativa, anticonvulsivante e anti-inflamatória.
70
Com relação aos fungicidas utilizados, ambos controlaram os dois fungos em
dosagens menores do que as dos óleos essenciais e de seus constituintes majoritários,
resultado este que já era esperado, uma vez que fungicidas utilizam substâncias
sintéticas, especificas e pré-estabelecidas para o patógeno alvo. Quando se utilizou os
fungicidas no controle de R. solani (Figura 3) observou-se que o fungicida Vitavax®,
obteve um melhor controle com menor dosagem, quando comparada a do fungicida
Opera®, tal fato se deve que o Vitavax® é recomendado para a cultura do feijoeiro no
controle de R. solani no tratamento de sementes, sendo a sua dosagem recomendada de
250 ml/100 kg de sementes, , enquanto que o Opera® é recomendado para o controle da
mela na cultura da soja
(Glycine max), que é causada pelo R. solani, sendo a
recomendação técnica de 600 ml/ ha. Tais resultados também foram observados para S.
rolfsii, apesar destes fungicidas utilizados não serem recomendados para controle deste
fitopatógeno, entretanto os resultados encontrados se assemelharam aos encontrados
para oR. solani, conforme Figura 3.
Porém a grande diferença são os modos dos espectros de ação dos ingredientes
ativos dos produtos, Vitavax® possui em sua formulação um duplo espectro de ação,
sendo composto pela carboxina e pelo tiram, mais típico e apropriado para o tratamento
de sementes, enquanto que Opera® apresenta duplo modo de ação, atuando através do
ingrediente ativo epoxiconazol como inibidor da bio-síntese do ergosterol, o qual é um
constituinte da membrana celular dos fungos e por meio do ingrediente ativo
piraclostrobina como inibidor do transporte de elétrons nas mitocôndrias das células dos
fungos, inibindo a formação de ATP, essencial nos processos metabólicos dos fungos,
estes processos propiciam um efeito protetivo e de ação sistêmica.
A constante evolução técnico-científica dos fungicidas agrícolas permitiu o
desenvolvimento de produtos com diversos modos de ação nas plantas e nas diferentes
71
fases do processo infeccioso (AGRIOS, 2005; RUSSEL, 2005). Segundo Azevedo
(2007); Reis, Reis e Forcelini (2007) os fungicidas sistêmicos são aqueles que podem se
movimentar na planta através de vasos condutores podendo atingir locais distantes do
local depositado, enquanto que os translaminares distribuem-se de forma limitada nos
tecidos. Caso que ocorrem nos fungicidas Opera® e Vitavax®, respectivamente.
4. CONCLUSÃO
O óleo essencial de Lippia sidoides e seu constituinte majoritário, carvacrol,
assim como o óleo de Cymbopogon citratus e o citral, constituinte majoritário deste
óleo essencial, demonstraram efeito fungitóxico perante a inibição no crescimento
micelial de Rhizoctonia solanie Sclerotium rolfsii.
Rhizoctonia solani sofreu maior inibição pelo óleo de Lippia sidoides e seu de
seu composto majoritário (carvacrol).
Sclerotium rolfsii teve maior inibição pelo óleo de Cymbopogon citratus e de seu
constituinte majoritário (citral).
O composto 1,8-cineol não apresentou efeito fungitóxico sobre os fitopatógenos
estudados.
Os fungicidas testados causaram inibição no desenvolvimento micelial de ambos
os fitopatógenos.
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80
CAPÍTULO IV
Avaliação da fitotoxicidez dos óleos essenciais Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf e
de Lippia sidoides Cham. sobre plantas de feijoeiro comum.
81
1. INTRODUÇÃO
O feijoeiro é cultivado por pequenos a grandes produtores, em diversificados
sistemas de produção e em todas as regiões brasileiras. O grão de feijão tem grande
importância econômica e social, por ser um alimento amplamente consumido e de
grande valor nutricional (WANDER, 2007).
Pesquisas desenvolvidas com extratos brutos ou óleos essenciais obtidos de
plantas medicinais têm indicado o potencial das mesmas no controle de fitopatógenos,
tanto por sua ação fungitóxica direta quanto pela indução de resistência, indicando a
presença de compostos com características de eliciadores (STANGARLIN et al.,1999;
SCHWAN-ESTRADA; STANGARLIN, 2005).
Na literatura é possível encontrar um grande número de trabalhos que citam as
propriedades antimicrobianas dos compostos secundários de plantas medicinais para o
controle de fitopatógenos. Nesses trabalhos, observam-se efeitos fungitóxicos em
experimentos realizados in vitro e in vivo, utilizando extratos brutos ou os óleos
essenciais de plantas medicinais.
A utilização de extratos e óleos oriundos de plantas medicinais tem mostrado
resultados promissores no controle de patógenos de plantas, neste contexto, o presente
trabalho teve como objetivo verificar o efeito fitotóxico dos óleos essenciais de
Cymbopogon citratus e de Lippia sidoides no feijoeiro comum.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em casa de vegetação na Universidade Federal do
Tocantins, Campus de Gurupi. As coordenadas geográficas da estação experimental
82
correspondente a 11º43’45’’S e 49º04’07’’W, com altitude média de 287 metros. Na
Tabela 1 verifica-se a caracterização química do solo utilizado como substrato.
Tabela 1. Análise química do solo utilizado nos vasos neste experimento em casa de
vegetação.
Profundidade
Cm
0-20
pH
H2O
5,6
P
K
mg dm-3
1,5
27,6
Al3+ H + Al Ca2+ Mg2+ SB T
----------------cmolc dm-3----------------0,0 3,1
0,5
0,2
0,8 0,8
V
%
19,6
MO
g dm-3
0,0
Atributos químicos da profundidade de 0-20 cm; pH em água - Relação 1:2,5; P e K – extrator Mehich 1;
Al3+, Ca2+ e Mg2+ – Extrator KCl (1 mol L-1); H + Al – Extrator SMP; SB = Soma de Bases Trocáveis;
(T) = Capacidade de Troca Catiônica a pH 7,0; V – Índice de Saturação de Bases; e MO = matéria
orgânica (oxidação: Na2Cr2O7 4N + H2SO4 10 N.
A semeadura foi realizada em solo acrescido de esterco bovino e areia, na
proporção de 1/1/1 (1 fração de solo, 1 de esterco e 1 areia). As sementes de feijão
comum (P. vulgaris) foram semeadas em vasos de polietileno furados com capacidade
para 3 Kg, preenchidos com Latossolo Amarelo. O solo foi previamente corrigido com
calcário Filler, para V% de 70, na dosagem de 605 Kg ha 1. Em seguida, fez-se a
adubação de plantio utilizando 1,875 g de P2O5, 1,5 g K2O e 0,3 g de N por vaso. Os
cálculos para adubação foram realizados considerando-se o volume de solo contido no
vaso e relacionando com o volume de solo de um hectare, considerando, uma camada de
0,20 m. O desbaste foi realizado aos 5 dias após a emergência das plântulas, deixando
três plantas por vaso.
O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados em esquema
fatorial 2 x 7, (2 óleos x 7 dosagens) com quatro repetições. Os tratamentos utilizados
estão descritos na Tabela 2.
83
Tabela 2. Relação dos tratamentos avaliados e doses em μg mL -1 dos óleos
Cymbopogon citratus e de Lippia sidoides.
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
1
Tratamentos
Testemunha absoluta
Testemunha relativa (água + leite em pó)
Óleo essencial
Óleo essencial
Óleo essencial
Óleo essencial
Óleo essencial
Doses (mL ha-1)1
50
300
400
500
1000
Pulverização foliar, as plantas encontravam-se no o estádio V4.
Decorridos 30 dias após a emergência das plântulas (DAE), durante o estádio
vegetativo V4, foi feita a aplicação de forma isolada dos óleos nas dosagens descritas na
Tabela 2. O experimento foi avaliado em cinco épocas de amostragem (2, 4, 6, 8 e 10
dias após a aplicação dos óleos). Para avaliação de fitotoxicidez utilizou-se uma escala
de notas adaptada de FRANS e CROWLEY (1986), conforme Tabela 3, em que 0
corresponde a nenhuma dano ou efeito a planta, e 100 corresponde a planta totalmente
afetada ou lesionada.
Tabela 3. “Escala percentual de fitotoxicidez”.
%
0
10
20
Descrição das categorias
principais
Sem efeito
Efeito leve
30
40
50
60
70
80
90
100
Efeito moderado
Efeito severo
Efeito total
Descrição detalhada da fitotoxicidez na cultura
Sem injúria ou redução
Leve descoloração ou injúria
Alguma descoloração ou atrofia, ou perda por
atrofia.
Injúria mais pronunciada, mas não duradoura.
Injúria moderada, mas normalmente com
recuperação.
Injúria mais duradoura, recuperação duvidosa.
Injúria duradoura, sem recuperação.
Injúria pesada, redução de estande.
Cultura próxima da destruição - poucas plantas
sobreviventes
Raramente restam algumas plantas
Destruição completa da cultura
Adaptada de FRANS e CROWLEY (1986).
Durante a condução do experimento, foram realizados todos os tratamentos
fitossanitários necessários á cultura. As plantas foram irrigadas duas vezes por dia, para
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manter o solo sempre úmido. Esse procedimento garantiu a disponibilidade hídrica
necessária durante todo o experimento, evitando a restrição ou o excesso de água ás
mesmas.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve fitotoxidez provocadas pelos óleos em nenhuma concentração testada
(Figuras 1 a, b e c).
FIGURA 1.a Teste de fitotoxicidez dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus e de
Lippia sidoides sobre o feijoeiro comum.
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FIGURA 1.b Planta de feijão tratada com a dosagem de 1000 μg mL-1 do óleo essencial
de Lippia sidoides.
FIGURA 1.c Planta de feijão tratada com a dosagem de 1000 μg mL-1 do óleo essencial
Cymbopogon citratus.
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Tais resultados concordam com os trabalhos de outros autores que testaram a
fitotoxidez de óleos essenciais em diferças plantas, como o controle da requeima
(Phytophthora infestans) em batata pelo extrato de cavalinha (Equisetum sp.) (KEQIANG; BRUGGEN, 2001); do oídio (Oidium lycopersici) em tomateiro por extratos e
óleo de Azadirachta indica (CARNEIRO, 2003), da mancha marrom (Bipolaris
sorokiniana) em trigo usando extrato aquoso de Artemisia camphorata (cânfora)
(FRANZENER et al., 2003), e da pinta preta (Alternaria solani) em tomateiro por
extrato de cúrcuma (Curcuma longa) e curcumina (componente do óleo essencial de C.
longa) (BALBI-PEÑA et al., 2006a, 2006b).
Araújo Filho et al. (2005) e Barretos (2010) ao avaliarem diluições de extrato de
agaves em plantas de algodoeiro colorido observaram que o extrato na proporção de
57% da calda de aplicação provocou 100% de plantas afetadas. Discordando dos
resultados encontrados neste trabalho, onde se obteve 100% de plantas não afetadas
pelos óleos de óleos C. citratus e de L. sidoides. Pinheiro e Quintela (2004) observaram
que doses maiores que 2% de óleo de nim (Azadirachta indica) causam fitotoxidade às
folhas primárias do feijoeiro. Dequech et al. (2008) observaram que extrato aquoso de
pó-de-fumo a 10% p/v e DalNeem (produto comercial, à base de frutos maduros de nim,
com aproximadamente 3.000 ppm de principio ativo) a 10% v/v causam fitotoxicidade
às plantas de feijão-de-vagem cultivadas em estufa plástica.
Durante as avaliações as plantas tratadas com os óleos apresentaram um verde
mais intenso do que as testemunhas, tal fato pode ser devido a melhor sanidade
provocada pelos óleos.
87
4. CONCLUSÃO
Os óleos essenciais de C. citratus e de L. sidoides não causaram fitotoxidez no
feijoeiro comum (P. vulgaris L.) em nenhuma das dosagens avaliadas.
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