POLIMORFISMO DO MTDNA EM DUAS POPULAÇÕES AFRO-BRASILEIRAS DA
AMAZÔNIA: PACOVAL E TROMBETAS.
Carvalho, B. M. (PIBIC/CNPq) & Ribeiro-dos-Santos, A. K. C. Laboratório de
Genética Humana e Médica, Universidade Federal do Pará. [email protected].
Abstract
Historically, the Amazonian populations present singular processes of
formation and expansion. In these processes, three ethnic groups, African, Amerindian and
European interacted biological and socially, resulting in an expressive genetical diversity.
Through the mtDNA, we investigated variability in two Afro-Brazilian populations of the
Amazon region: 92 and 33 individuals from Pacoval-PA (PCV) and Trombetas-PA (TRB),
respectively. To analyse the mtDNA, we used four RFLPs systems: 663 – Hae III, 13.259 –
Hinc II, 5.176 - Alu I and 3.592 - Hpa I; presence or absence of the CoII/tRNAlys intergenic
9-pb deletion and sequencing of the first hypervariable segment of control region. This
methodology revealed the presence of three different mtDNA lineages: African lineages
(39.2%/PCV and 48.5%/TRB); Amerindians lineages (59.8%/PCV and 51.5%/TRB); and
European lineages (1% only in Pacoval). The present study provided the rescue of
information about the ethnic-social interactions mechanisms, which happened during the
formation and expansion process of the Afro-Brazilian populations. With this information,
we evidenced that the Amerindian contribution is larger than the African contribution in these
populations.
Resumo
As populações da Amazônia apresentam uma expressiva diversidade genética em
conseqüência do complexo processo de formação e expansão populacionais ocorridos na
região. A partir deste fato, desenvolvemos a presente investigação em populações Afrobrasileiras, onde esperamos uma contribuição significativa de seqüencias mitocondriais
africanas (mtDNA). Com objetivo de mensurar essa contribuição, investigamos 92 indivíduos
da comunidade de PACOVAL-PA (PCV) e 33 de TROMBETAS-PA (TRB), através do
mtDNA, utilizando-se 4 sistemas de RFLPs (marcadores para haplogrupos indígenas - A-D);
o sítio de restrição para a enzima Hpa I - 3.592 (presente em alguns grupos africanos);
deleção de 9pb da região V e o seqüenciamento direto da 1ª região hipervariável do mtDNA.
Esta metodologia demonstrou a presença de linhagens de mtDNA africanas (39,2%/PCV e
48,5%/TRB), linhagens ameríndias (59,8%/PCV e 51,5%/TRB), e européias (1% somente em
Pacoval). O presente estudo possibilitou, do ponto de vista biolológico, o resgate de
informações sobre os mecanismos de interações étnico-sociais que ocorreram durante o
processo de formação e expansão das populações Afro-brasileiras em estudo. Deste resgate,
evidenciamos uma forte contribuição indígena, mesmo tratando-se de duas populações de
origem africana.
Endereço para correspondência:
Ândrea Kely C. Ribeiro-dos-Santos, Departamento de Patologia,
Centro de Ciências Biológicas Universidade Federal do Pará, Caixa
Postal 8615, 66.075-970, Belém Pará, Brasil.
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1. Introdução
A Amazônia compreende uma região de extensa planície coberta prevalentemente
por floresta tropical. Supõe-se que o seu processo de ocupação iniciou-se entre 10 a 11 mil
anos antes do presente com a chegada dos paleoíndios, caçadores-coletores, oriundos do norte
e oeste do continente americano (Rosevelt, 1992). Depois de um longo tempo de ocupação
somente pelos indígenas, povos europeus passam a colonizar a Amazônia, na segunda metade
do século XVI, representados principalmente por portugueses e espanhóis.
Na mesma época, trazido pelo colonizador português, o elemento africano é
introduzido no Brasil para o trabalho escravo. E em 18 de março de 1662 os primeiros negros
chegam no estado do Pará (Sales, 1988). Porém, somente na segunda metade do século XVIII
o escravo africano entra na Amazônia de forma compulsória. O número estimado foi de
53.000 entre os anos de 1755 e 1820 (Sales, 1971).
Segundo Vergolino-Henry & Figueiredo, 1990; os negros introduzidos na Amazônia
são nativos das seguintes regiões : Guiné Portuguesa, atualmente Guiné Bissau e Cachéu;
ilhas de Cabo Verde, correspondente a república do Cabo Verde; Reinos de Angola, Luanda e
Benguela, os quais compõe hoje a República Popular de Angola; Costa Oriental da África,
equivalente à República do Quênia; Norte e Sul do Rio Rovuna, atuais República da
Tanzânia e República Popular de Moçambique; Reino de Mazagão e Guiana Francesa,
atualmente correspondente a República Dominicana.
Já do ponto de vista do tráfico interno, foram introduzidos na região amazônica
escravos africanos oriundos dos portos de Pernambuco, Maranhão, Bahia e Rio de janeiro
(Vergolino-Henry & Figueiredo 1990)
Muitos africanos, durante o período escravocrata, fugiram de grandes fazendas para
a floresta, devido aos maus tratos e humilhações aos quais eram constantemente submetidos.
Como resultado destas fugas, comunidades rurais afro-brasileiras, denominadas de
Quilombos, foram formadas durante os séculos XIX e XX. Muitos destes quilombos
permaneceram, em parte, isolados na floresta preservando suas identidades sociais, culturais e
genéticas.
Observa-se então, que durante os últimos três séculos de ocupação da região
amazônica, três etnias: o africano, o ameríndio e o europeu, diferentes do ponto de vista
biológico e cultural, interagiram entre si em resposta as demandas ambientais e sociais.
Destas interações, as comunidades afro-brasileiras do passado deram origem atualmente a
populações quilombolas na Amazônia.
As conseqüências genéticas de todo um processo de formação e expansão destas
populações tem sido alvo de intensas investigações através de vários níveis biológicos
(polimorfismos clássicos, mtDNA e nuclear). Para contribuir com estas investigações desejase mensurar qual a real contribuição de genes africanos em duas comunidades: Pacoval e
Trombetas, assim como investigar a presença ou não de outros genes que demonstrem a
participação de outros grupo étnicos na composição destas.
Com este objetivo, o presente trabalho investigou a variabilidade e diversidade em
92 indivíduos da população de Pacoval e 33 indivíduos da população de Trombetas, ambas
localizadas no estado do Pará, em relação ao DNA mitocondrial (mtDNA) o qual é um
sistema uniparental de herança exclusivamente materna.
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2. Material e Métodos
2.1. Caracterização das amostras
As amostras investigadas pertencem a duas comunidades afro-brasileiras da
Amazônia: Pacoval e Trombetas. Da primeira comunidade, Pacoval (localizada nas
proximidades do município de Alenquer, às margens do rio Curuá, afluente esquerdo do rio
Amazonas), foram selecionadas 92 amostras. E de Trombetas ( localizada as margens do rio
Trombetas : 108’-1o 46’S; 55o 51’-57o W ) foram selecionadas 33 amostras. Em ambas
populações as amostras investigadas não são relacionadas pelo lado materno.
2.2. Obtenção das amostras
Do sangue periférico foram colhidas 10ml de cada indivíduo, usando-se EDTA
como substância anti-coagulante(sistema de coleta à vácuo). Armazenadas em isopor com
gelo, as amostras de sangue foram transportadas para o Laboratório de Genética Humana e
Médica da Universidade Federal do Pará. No laboratório foram realizadas as tipagens
sangüíneas, da hemoglobina e das enzimas eritrocitárias. Após as tipagens, o sangue restante
foi centrifugado a 2.000 rpm (rotações por minuto) durante 10 minutos para a separação total
da hemácias e leucócitos. Em seguida foi retirada uma alíquota de plasma e congelado a –20o
C. O restante do sangue foi utilizado para a extração do DNA.
2.3. Extração do material biológico
As amostras de DNA foram obtidas a partir de leucócitos, através do método
convencional de extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol (Sambrook et al.,
1989). Posteriormente a quantificação do DNA foi efetuada no aparelho Gene-Quant
(Pharmacia – Biotech).
2.4. Loci investigados
Foram investigados seis sítios polimórficos do mtDNA que definem os diferentes
grupos étnicos presentes na região amazônica (africanos, ameríndios e europeus):
1) A análise da deleção de 9 pares de base localizada entre os genes da COII /
tRNALys (Cann & Wilson, 1983), após amplificação por PCR e eletroforese
vertical em gel de poliacrilamida a 7% ;
2) Análise através do RFLP para quatro segmentos, 663; 5.176; 13.259 e 3.592.
Cada segmento foi amplificado com os iniciadores previamente descritos por
Stone e Stoneking, 1993 e Chen et al., 1995. Em seguida estes foram submetidos
a ação de endonucleases Hae III, Alu I, Hinc II e Hpa I, respectivamente, e
eletroforese em gel de poliacrilamida a 7%;
3) Realização do seqüenciamento automático da 1a região hipervariável do mtDNA
(HVI) no aparelho ABI prism 377 (A. Biosystem), utilizando-se os iniciadores
previamente descritos por Horai et al., 1993.
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3. Resultado e Discussão
3.1. Deleção de 9 pb e RFLP
Foram investigados 125 indivíduos das populações de Pacoval e Trombetas em
relação aos sistemas uniparentais do mtDNA: i) presença ou ausência da deleção de 9 pb na
região V, em amostras de origem africanas e ameríndias; ii) quatro segmentos por RFLP os
quais estão presentes em 97% das linhagens mitocondriais ameríndias atuais; iii) o sítio
polimórfico Hpa I – 3.592, que está presente em 70% das linhagens mitocondriais (Macro haplogrupo L) de populações africanas (Chen et al., 1995; Watson et al., 1997), foi analisado
em todas as amostras para diferenciar linhagens ameríndias das de origem africana.
Desta etapa obtivemos os seguintes resultados:
1. Pacoval
53,3 % (49 indivíduos) possuem mtDNA de origem ameríndia, distribuídas em:
15,2% (14 indivíduos) são do haplogrupo A;
12,0% (11 indivíduos) são do haplgrupo B;
3,3% (3 indivíduos) são do haplogrupo C;
21,8% (21 indivíduos) são do haplogrupo D.
10,9% (10 indivíduos) possuem linhagens de mtDNA africanas do macrohaplogrupo L.
E em 35,8% das amostras (33 indivíduos) não foi possível identificar a origem das
linhagens mitocondriais através do sistema RFLP.
2.Trombetas
51,5% (17 indivíduos) possuem mtDNA de origem ameríndia, sendo que:
21,2% (7 indivíduos) são do haplogrupo A;
3,0% (1 indivíduos) são do haplgrupo B;
12,2% (4 indivíduos) são do haplogrupo C;
15,1% (6 indivíduos) são do haplogrupo D.
18,2% (10 indivíduos) possuem linhagens de mtDNA africanas do macrohaplogrupo L.
Em 30,3% das amostras (10 indivíduos) não foi possível identificar as linhagens
mitocondriais atravé de RFLP
3.2. Sequenciamento
O sequenciamento direto, da 1a região hipervariável, foi realizado em 43 amostras as
quais não pudemos identificar a linhagem do mtDNA por RFLP. Logo em seguida as
amostras foram comparadas com a seqüência do mtDNA descrita por Anderson et al., 1994.
Como resultado, observamos 29 diferentes haplótipos definidos por 56 pontos polimórficos.
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3.3. Análise Conjunta
A análise dos resultados por RFLP e sequenciamento revelou a presença de
linhagens africanas, indígenas e européias na população de Pacoval e em Trombetas a
ausência de linhagens européias.
A contribuição africana na comunidade quilombola de Trombetas é mais expressiva,
48,5%, do que em Pacoval 39,2%, porém não mais significativa. O elemento indígena
encontra-se em maior frequência em ambas as populações, sendo a contribuição em Pacoval
de 59,8%, enquanto a de Trombetas é 51,5%. A observação de linhagens mitocondriais
ameríndias nas populações remanescentes de quilombos já era esperada, visto que a história
de ocupação dessa área, a Amazônia, foi produto de um mecanismo de interações étnicosociais, principalmente com sociedades indígenas que já estavam estabelecidos na área,
resultando em grupos miscigenados. Se este fato ocorreu durante um período de tempo
relativamente longo, é de se esperar que estas populações apresentem, hoje, dissimilaridades
profundas em relação ao DNA materno herdado.
Como a contribuição ameríndia é elevada, as populações quilombolas tornam-se
fontes informativas no que concerne a investigação da variabilidade genética indígena, a qual
foi fortemente reduzida devido a depopulação ocorrida no momento da entrada de grupos
europeus, principalmente portugueses, no continente americano.
O resgate desta variabilidade genética é comprovado quando, através do
sequenciamento automático, identificamos em Pacoval um haplótipo de linhagem ameríndia
o qual possui transições C → T nos pontos 16.223 e 16.278, característico do haplogrupo X
ou quinto haplogrupo, que estaria presente entre os primeiros colonizadores do continente
americano (Brown et al., 1998 e Ribeiro-dos-Santos et al., 1996b), mas que, até o momento,
só foram reconhecidos em grupos contemporâneos ameríndios na América do Norte (Foster
et al., 1996).
Quando comparamos os dados da contribuição ameríndia nas comunidades Afrobrasileiras de Pacoval (59,8%) e Trombetas (51,5%), observamos que estes são mais elevados
do que os observados em Curiaú - AP (47,0%), outra população remanescente de quilombo
da região amazônica (Ribeiro-dos-Santos et al., 2002). Ao compararmos os mesmos
resultados com as populações trihíbridas de Belém (58,0%, Santos et al., 1999) e Santarém
(82,0%, Santos et al., 2000) observamos que apenas em Santarém a contribuição foi mais
significativa.
A frequência elevada da contribuição ameríndia em populações trihíbridas é
resultado de uma política de ocupação do território brasileiro, em que, segundo dados
históricos, a metrópole portuguesa estimulava a união entre o colonizador português e a
mulher indígena (Cruz, 1973; Sales, 1988). Em Belém, particulamente, a entrada da mulher
européia ocorreu em maior escala do que em Santarém, o que pode ter diminuido a
contribuição da mulher ameríndia para a formação desta.
Assim como a variabilidade genética ameríndia, a contribuição africana para Pacoval
e Trombetas é relevante. Entre os três principais haplogrupos L1, L2, e L3, descritos por
Watson et al., 1997; Randon et al., 1998 e Chen et al., 2000; somente Trombetas não
apresentou o haplogrupo L2. A falta deste pode ser resultado de um tráfico negreiro externo e
interno a partir de localidades africanas isoladas, nas quais não havia a presença deste
haplogrupo.
De acordo com Ribeiro-dos-Santos et al., 2002, o valor da contribuição africana em
Curiaú (53%) e variabilidade haplotípica, apresentam-se maior do que em Pacoval (39,2%) e
Trombetas (48,5%). Devido a sua localização, a comunidade de Curiaú é formada por
estoques africanos trazidos da África, e de países como Guiana, Guiana Francesa e Suriname,
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além do tráfico interno. A diversidade desses estoques pode ter aumentado variabilidade a
genética e a contribuição africana nesta população.
Em Pacoval, particularmente, encontramos um indíviduo com linhagem mitocondrial
européia pertencente ao haplogrupo T (16. 093-T → C; 16.126-T → C; 16.271- T → C;
16.294- C → T; 16.298- C → T; 16.304- T → C) o qual pode ser resultado de uma mistura
interétnica recente.
3.4. Análise Filogenética
Analisando-se em conjunto as frequências dos resultados de RFLP e sequenciamento
automático, podemos inferir sobre as relações filogenéticas de Pacoval e Trombetas com
outras populações. Através do método estatístico, UPGMA, baseado no programa DNASIS,
observamos que a árvore possui duas grandes divisões (Figura 1).
As duas comunidades remanescentes de quilombos, investigadas no presente
trabalho, dividem um mesmo grupo, assim como outras populações Afro-brasileiras e Afrovenezuelana da região amazônica como Curiaú, Cametá e Sotillo (Ribeiro-dos-Santos et al.,
2002; Bortoline et al., 1999) e uma população trihíbrida, Santarém (Santos et al., 2000).
Considerando as populações remanescentes de quilombos deste grupo, observamos
uma contribuição efetiva de linhagens ameríndias, variando de 47% a 60%. Esta contribuição
elevada, pelo lado materno, pode decorrer do fato dessas populações dividirem a mesma
região geográfica, a Amazônia, e possuírem processos históricos de formação e expansão
semelhantes.
Cajueiro
Panaquire
Paredão
Porto Alegre
Ribeirão Preto
Curiepe
Birongo
Salvador
Santarem
Pacoval*
Curiaú
Trombetas*
Cametá
Sotillo
FIGURA 1. Relações Filogenéticas entre Pacoval e Trombetas e 12 Populações da
Amazônia.
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4. Conclusão
As comunidades de Pacoval e Trombetas representam dois semi-isolados africanos
da Amazônia brasileira. Após investigação com base no DNA mitocondrial, o qual representa
uma herança unicamente materna, observou-se que as comunidades apresentaram uma
expressiva contribuição de genes africanos de 39,2%, a menor, e 48,5%, a maior,
respectivamente. Porém, a contribuição mais relevante foi a de genes ameríndios onde
observamos um fluxo gênico de 59,8% para Pacoval e 51,5% para Trombetas.
Esse fato revela que as populações Afro-brasileiras da Amazônia apresentam na sua
constituição genética importantes contribuições de diferentes grupos étincos. Pois além de
linhagens mitocondriais africanas, encontramos em Pacoval:
-
A linhagem representante do haplogrupo X (quinto haplogrupo), o qual está subrepresentado nas populações ameríndias contemporâneas.
-
A linhagem mitocondrial do haplogrupo T, representativa de grupos europeus.
Através da investigação do mtDNA, os resultados do presente trabalho sugerem que
durante a formação e expansão de comunidades africanas na Amazônia houve uma interação
(biológica, social e genética) entre as três etnias: a africana, a indígena e a européia. Do ponto
vista histórico, este tipo de interação étnica é pouco relatada devido a carência de registros,
fazendo com que se tenha uma idéia distorcida da formação destas.
Este resultado reflete, do ponto de vista biológico, interações sociais que ocorreram
no passado e demostra a importância da interdisciplinaridade para o resgate da verdadeira
história de formação desses povos.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. ANDERSON, S., BANKIER, A.T., BARRELL, B.G., DE BRUIJN, M.H.L., COULSON,
A.R., DROUIN, J., EPERON, I.C., NIERLICH, D.P., ROSE, B.A., SANGER, F.,
SCHREIER, P.H., SMITH, A.J.H., STADEN, R., YOUNG, I.G. Sequence and
organization of the human mitochondrial genome. Nature 290:457-467, 1981.
2. BORTOLINI, M.C., SILVA Jr., W.A., GUERRA, D.C., REMONATTO, G.,
MIRANDOLA, R., HUTZ, M.H., WEIMER, T.A., SILVA, M.C.B.O., ZAGO, M.A.,
SALZANO, F.M. African-derived South American Populations: A History of
Symmetrical and Asymmetrical Matings According to Sex Revealed by Bi- and Uniparental Genetics Markers. Am. J. Hum. Biol., 11:551-563, 1999.
3. BROWN, M. D., HOSSEINI, S. H., TORRONI, ª, BANDELT, H-J., ALLEN, J. C.,
SCHURR, T. G., SCOZZARI, R. mtDNA Haplogroup X: an Ancient Link Between
Europe/western Asia and North America? Am J Hum Genet 63: 1852-1861. 1998.
4. CANN, R.L. and WILSON, A.C. Length Mutations in Human Mitochondrial DNA.
Genetics 104:699-711. 1983.
5. CHEN, Y.S., TORRONI, A., EXCOFFIER, L., SANTACHIARA-BENERECETTI, A. S.
and WALLACE, D. C. Analysis of mtDNA Variation in Africa Population Reveals the
Most Ancient of all Human Continent-Specific Haplogroups. Am. J. Hum. Genet., 57:
133-149. 1995.
Revista Científica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 3, março 2002
6. CHEN, Y.S., OLCKERS, A., SCHURR, T.G., KOGELNIK, A.M., HOUPONEN, K. &
WALLACE, D.C. mtDNA variation in the south African Kung and Khwe- and their
genetic relationships to other African populations. Am J Hum Genet 66:1362-1383. 2000.
7. CRUZ, E. História do Pará. Belém. Governo do Estado do Pará. 1973.
8. FOSTER, P., HARDING, R., TORRONI, A., BANDELT, H.J., Origin and evolution of
native american mtDNA variation: a reappraisal. Am J Hum Genet 59:935-945, 1996.
9. HORAI, S., KONDO, R., NAKAGAWA-HATTORI, Y., HAYASHI, S., SONODA, S.,
TAJIMA, K. Peopling of the Americas, founded by four major linhages of mitochondrial
DNA. Mol Biol Evol 10:23-47, 1993.
10. RANDO, J.C., PINTO, F., GONZÁLEZ, A.M., HERNÁNDEZ, M., LARRUGA, J.M.,
CABRERA, V.M., BANDELT, H-J. Mitochondrial DNA analysis of northwest African
populations reveals genetic exchanges with european, near-eastern, and sub-Saharan
populations, Ann Hum Genet 62:531-550, 1998.
11. RIBEIRO-DOS-SANTOS,
A.K.C.,
SANTOS,
S.E.B.,
MACHADO,
A.L.,
GUAPINDAIA, V., ZAGO, M.A. Heterogeneity of mitochondrial DNA haplotypes in
pre-Columbian natives of the Amazon region. Am. J. Phys. Anthropol., 101:29-37, 1996b.
12. RIBEIRO-DOS-SANTOS, A.K.C., PEREIRA, J. M., LOBATO, M. R. F., CARVALHO,
B. M., GUERREIRO, J. F., SANTOS, S.E.B. Dissimilarities in the Process of Formation
of Curiaú, a Semi-Isolated Afro-Brazilian Population of the Amazon Region. American
Journal of Human Biology (in-press). 2002.
13. ROOSEVELT, A. Arqueologia Amazônica. Histórias dos Índios no Brasil. São Paulo,
Companhia das Letras, Secretaria Municipal de Cultura, p. 53. 1992.
14. SALLES, V. O Negro no Pará: Sob o Regime da Escravidão. Rio de Janeiro, Coleção
Amazônica. p. 336. 1973.
15. SALLES, V. O negro no Pará sob o regime de escravidão. Belém, SECULT, p. 342.
1988.
16. SANTOS, S. E. B.; RODRIGUES, J. D., RIBEIRO-DOS-SANTOS, A. K. C. and ZAGO,
M. A. Differential Contribution of Indigenous Men and Women to the Formation of an
Urban Population in the Amazon Region as Revealed by mtDNA and Y-DNA. Am. J.
Phys. Anthropol. 109: 175-180. 1999
17. SANTOS, S. E. B.; FREITAS PAULO, T.; FEIO-DOS-SANTOS, A. C.; CARVALHO,
B. M.; RIBEIRO-DOS-SANTOS, A. K. C. & ZAGO, M. A. Cruzamentos Direcionados
em uma População Urbana da Amazônia: Santarém – Pará. Genetics and Molecular
Biology, v. 23, n. 3 (supplement), p. 581 (GH68). 2000.
18. SAMBROOK, J. FRITSH, E. F. & MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
Revista Científica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 3, março 2002
19. STONE, A.C. & STONEKING, M. Ancient DNA from a pré-Columbian amerindian
population. Am. J. Phys Anthropol 92:463-471. 1993.
20. VERGOLINO HENRY, A. & FIGUEIREDO, N. A Presença Africana na Amazônia
Colonial: Uma Notícia Histórica. Arquivo Público do Pará. 1: 27-66. 1990.
21. WATSON, E., FORSTER, P., RICHARDS, M., BANDELT, H.J. Mitochondrial
footprints of human expansions in Africa. Am J Hum Genet 61:691-701. 1997.
Revista Científica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 3, março 2002