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Estudo Teórico de Enzimas Multinucleares de Cobre para Proposta de
Materiais Biomiméticos
Ximenes, M.T.1; Alves, W. A.1; Oliveira Junior, V. X.1; Fiorito, P.A.1; Honório, K. M.1,2; Homem-de-Mello, P.1
1
Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC (UFABC), Rua Santa Adélia, 166, Bairro Bangu,
09210-170, Santo André, SP, Brazil.
2
Escola de Artes, Ciências e Humanidades, Universidade de São Paulo (USP), Av. Arlindo Bettio, 1000, 03828-000, São Paulo,
SP, Brazil
Foram estudadas três lacases e uma ascorbato oxidase, as quais possuem íons metálicos em suas estruturas e são capazes de realizar
a redução do oxigênio à água, em um ciclo envolvendo quatro elétrons. Os polipeptídios foram analisados de forma que fosse possível
correlacionar a estrutura protéica do sítio ativo com o potencial de oxi-redução. Cálculos teóricos foram realizados de forma a
identificar os aminoácidos mais relevantes para que a reação ocorresse, sendo possível gerar uma sequência de aminoácidos
importantes para o processo.
Palavras Chave — Ascorbato Oxidase, Lacase, DFT, Biomimético, Oxirredução.
I. INTRODUÇÃO
M
ATERIAIS BIOMIMÉTICOS são compostos criados e
sintetizados em laboratório mas que possuem uma ação
análoga à de compostos naturais. Neste trabalho foram
estudadas proteínas multinucleares de cobre com o objetivo de
propor compostos biomiméticos que poderiam ser utilizados,
por exemplo, em células a combustível.
As enzimas multinucleares são estruturas peptídicas que
possuem em sua estrutura um ou mais íons metálicos. Aqui
foram estudadas lacases e uma ascorbato oxidase que contêm
íons de cobre, que podem ser diferenciados de acordo com
suas características como tipo 1, 2 ou 3. O cobre tipo 1 (Cu(I)
ou T1) apresenta características espectroscópicas muito
distintas, exibindo uma intensa coloração azul associada a uma
grande banda de absorção na faixa de 600nm sendo esse íon é
coordenado por uma Cisteína, duas Histidinas e uma
Metionina axial, com um número de coordenação 3 e
geometria trigonal-planar, atuando na transferência de elétrons
no interior da molécula. O cobre tipo 2 (Cu(II); T2) não
apresenta características de EPR distintas do Cu2+ nem bandas
de absorção de luz intensas, possui número de coordenação 4
ou 5, coordenado por três histidinas, com geometria piramidal
ou quadrada planar. Esse íon T2 atua na catálise e reatividade
redox da proteína. O cobre tipo 3 (Cu(III); T3) se apresenta
como um sitio binuclear, ou seja, é composto por dois íons
cobre, apresentando uma distinta banda de absorção próxima à
330 nm e um espectro luminescente característico, sendo
coordenado por três histidinas cada íon com número de
coordenação 3 e geometria trigonal planar, sendo uma de suas
funções a ativação de O2 para transporte e oxigenação. A
combinação entre os tipos T2 e T3 cria um sítio trinuclear
(T2/T3)[1].
As lacases são produzidas por várias espécies de fungos e
alguns tipos de vegetais. Consiste de uma única cadeia
polipeptídica com aproximadamente 500 resíduos de
aminoácidos. As lacases de fungos são enzimas extracelulares
que desempenham atividade na degradação da lignina.
Ascorbato oxidases são proteínas presentes em alguns
vegetais. A nível celular, a enzima é mais abundante na parede
celular e no citoplasma, mas seu papel nos organismos vivos
ainda não é bem entendido, mas pode estar envolvido no
crescimento vegetal e é mais abundante no fracionamento da
parede celular[2].
Figura 1 – Representação da proteína 1GYC exibindo os íons cobre.
II. METODOLOGIA
Seleção das proteínas
1) Pesquisa bibliográfica
A pesquisa bibliográfica foi focada em proteínas que
possuíssem sua estrutura cristalográfica disponível no PDB
(Protein Data Bank) e, concomitantemente, dados de
potenciais de oxi-redução na literatura. Os polipeptídios
selecionados são três lacases, 1GYC[3] contendo quatro íons
cobre, proveniente de Trametes versicolor, 1HFU[4] contendo
três íons cobre, proveniente de Coprinus cinereus, 1A65[5]
2
com três íon metálicos, proveniente também de Coprinus
cinereus e de uma ascorbato oxidase 1AOZ [6] proveniente de
Zucchini, a qual se apresenta na forma de um dímero, contém
três íons cobre em cada monômero e um entre os monômeros.
A Tabela 1 apresenta os potenciais de oxi-redução obtidos
experimentalmente para as enzimas em estudo.
Tabela1-Potenciais das proteínas estudadas
Enzima (ID PDB)
Resolução (Å)
Potencial (mV) [1]
1A65
1GYC
1HFU
1AOZ
2.23
1.90
1.68
1.90
540
780-800
550
344
2) Análise do Cobre tipo I
Uma vez que não é possível ainda tratar por métodos ab
initio enzimas como um todo, optou-se por estudar
inicialmente a região que inclui o cobre do tipo I (Cu(I))
presente no sítio ativo, para clusters obtidos a partir do recorte
ao redor do Cu(I) com raios iguais a 5, 6 e 7Å, analisando os
aminoácidos presentes nos cortes. A seguir, foram realizados
cálculos single point utilizando a Teoria de Funcional de
Densidade (DFT) com os funcionais B3LYP e BHandH. Os
cálculos realizados visam fornecer as propriedades eletrônicas
dos íons cobre tipo 1, como as energias de HOMO (Highest
Occupied Molecular Orbital) e LUMO (Lowest Unoccupied
Molecular Orbital). As energias dos orbitais de fronteira
(HOMO e LUMO) e a diferença entre elas (Gap) são
indicativas da característica mais elétron-aceitadora ou
doadora da molécula.
3) Análise do Sítio Ativo
Na continuidade do estudo, foram analisados novos cortes
das enzimas, de forma que todo o sítio ativo, onde estão os
íons cobre, pudesse ser estudado. Os cortes envolviam os
átomos metálicos, os aminoácidos presentes em um raio de 4Å
em torno dos mesmos e os resíduos que, eventualmente,
realizassem uma ligação entre os diferentes sítios.
Após os resultados terem sido obtidos, foram selecionadas
duas das proteínas estudadas, de forma a realizar uma
simulação do processo redox, onde foram realizados cálculos
de HOMO e LUMO variando a carga total do sítio ativo,
considerando todos os íons na forma oxidada (+2 por átomo
de cobre) até os íons na forma reduzida (+1 por íon metálico),
assim como cálculos de carga ESP e de Spin eletrônico.
III. RESULTADOS
Os cálculos de energia de HOMO e LUMO realizados para
os cortes em torno do Cu(I), utilizando o funcional B3LYP,
resultaram nos valores expressos na Tabela 2.
A Figura 2 representa os orbitais HOMO e LUMO dos
cortes de 5 Å em torno do cobre do tipo I de cada proteína,
com o funcional B3LYP.
Tabela 2 - Propriedades eletrônicas dos clusters de Cu(I)
estudados – B3LYP
Raio
EHOMO
ELUMO
Gap
Enzima
ET (a.u)
(Å)
(a.u)
(a.u)
(kcal.mol-1)
5
-4801.8
-0.2800
-0.2741
-3.7
1A65
6
-7197.7
-0.3597
-0.3498
-6.2
7
-8762.6
-0.2156
-0.2119
-2.3
5
-4989.8
-0.3342
-0.3257
-5.3
1GYC
6
-7508.9
-0.2785
-0.2698
-5.4
7
-9236.1
-0.2609
-0.2521
-5.6
5
-4876.7
-0.3309
-0.3192
-7.3
1HFU
6
-7567.7
-0.2847
-0.2784
-3.9
7
-9243.1
-0.2518
-0.2459
-3.7
5
-4987.3
-0.3588
-0.3473
-7.2
1AOZ
6
-7933.0
-0.3316
-0.3235
-5.1
7
-9600.0
-0.3329 -0.32266
-6.4
1A65
HOMO
1HFU
LUMO
HOMO
LUMO
HOMO
1GYC
HOMO
LUMO
1AOZ
LUMO
Figura 2 – Representação dos orbitais HOMO e LUMO.
Os resultados dos cálculos de HOMO e LUMO, com o
funcional B3LYP, para o sítio ativo estão representados na
Tabela 3.
Tabela3- Propriedades eletrônicas dos clusters que incluem todos
os átomos metálicos ligados por uma ponte de aminoácidos das
enzimas estudadas – B3LYP
Enzima
ET (a.u)
EHOMO (a.u)
ELUMO (a.u)
Gap
(kcal.mol-1)
1A65
-12271.0
-0.532
-0.523
-5,6
1GYC
-10709.1
-0.7535
-0.7476
-3.7
1HFU
-9800.6
-0.5938
-0.5856
-5.1
1AOZ
-16880.3
-0.2977
-0.2935
-2.6
A Figura 3 representa os orbitais de HOMO e LUMO do
síto ativo das proteínas 1GYC e 1HFU.
1GYC
HOMO
1HFU
LUMO
HOMO
LUMO
Figura 3 – Representação dos orbitais HOMO e LUMO.
3
Como proteína 1GYC é a enzima que, segundo a literatura,
possui o maior valor de potencial de oxi-redução, o sítio ativo
da mesma foi submetida à cálculos com diferentes cargas,
visando simular o processo redox. O mesmo processo foi
utilizado para a proteína 1AOZ, de forma que seja possível a
comparação entre os aminoácidos constituintes dos sítios
ativos.
Os cálculos para o processo redox consistiram em cálculos
de carga ESP (Tabela 4) e de cálculos de Spin eletrônico.
Tabela 4 – Carga ESP por tipo de cobre do sítio ativo da enzima
1GYC.
Carga
T1
T2
T3 (I)
T3 (II)
Total
8
0,41
0,48
0,28
0,64
7
0,40
0,04
0,23
0,40
6
0,31
0,03
0,19
0,42
5
0,26
-0,01
0,18
0,37
4
0,25
-0,12
0,15
0,29
Variação
-0,16
-0,60
-0,13
-0,35
total
Os valores indicam qual dos átomos metálicos estão mais
envolvidos no processo de redução, sendo o Cu(II) o que mais
sofre variação de carga (-0,6), seguido por um dos íons cobre
do tipo 3 (-0,35).
Uma estrutura polipeptídica foi proposta por membros do
grupo, onde os aminoácidos constituintes são baseados na
proteína 1GYC que tem o maior potencial redox. A sequência
proposta se constitui de NH2-DHHDACK(H)HIHGGHCOOH, onde D representa o aminoácido o Aspartato, H
Histidina, A Alanina, C Cisteína, K Lisina, I Isoleucina e G
Glicina. A sequência ‘K(H)H’ representa que a lisina possui
ligações com duas histidinas, sendo uma delas em uma cadeia
lateral, de forma que a cadeia não fosse inteiramente linear,
mas com uma histidina lateral, para que existisse um sítio de
ligação para o átomo de cobre, como na proteína 1GYC.
O próximo passo em relação a essa proteína foi a
otimização de sua estrutura, ainda sem os átomos de cobre,
para avaliar se sua estrutura seria deformada a ponto de não
ser possível a alocar os íons de cobre na estrutura sintetizada.
Outra frente tomada em relação à criação de uma estrutura
com a sequência acima proposta foi a criação do polipeptídio
inicialmente em torno de um íon de cobre, realizar sua
otimização estrutural, adicionar outros aminoácidos, e
novamente otimizar sua estrutura, prosseguindo dessa forma,
até que a estrutura estivesse completa. Desta forma não é
possível analisar como seria a conformação estrutural ao ser
sintetizada, uma vez que os íons cobre seriam alocados nas
proteínas após sua síntese, no entanto nos permitirá avaliar os
resultados de orbitais de fronteira (HOMO e LUMO), e
possivelmente comparar seus resultados com as proteínas
estudadas.
Figura 4 – Representação gráfica da estrutura proposta
Figura 5 – Representação gráfica da estrutura contendo 3 histidinas e um
átomo de cobre, antes da otimização.
IV. CONCLUSÕES
Os cálculos nos permitiram avaliar o mecanismo do
processo de redução que ocorre no sítio ativo e propor alguns
peptídeos. Após otimização dessas novas estruturas, as
propriedades eletrônicas serão calculadas de forma a verificar
se são semelhantes àquelas da proteína que se deseja
mimetizar. Serão então avaliadas novas estruturas e aquelas
mais promissoras serão sintetizadas.
AGRADECIMENTOS: FAPESP, CNPQ E PIBIC-UFABC.
REFERÊNCIAS
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
Shleev, S. et al. Direct electron transfer between copper-containing
proteins and electrodes. Biosensors & Bioelectronics [S.I.], v. 20, n. 12,
p. 2517-2554, 2005.
Bertini, I.; Sigel, A.; Sigel, H., Handbook on Metalloproteins, New
York, NY. 2001, 1108p.
Piontek, K. et al. Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes
versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers
J.Biol.Chem. v. 277, p. 37663-37669, 2002.
Ducros, V. et al. Structure of the laccase from Coprinus cinereus at 1.68
Å resolution: evidence for different 'type 2 Cu-depleted' isoforms. Acta
Crystallogr.,Sect.D v.57, p. 333-336, 2001.
Ducros, V. et al. Crystal structure of the type-2 Cu depleted laccase from
Coprinus cinereus at 2.2 Å resolution. Nat.Struct.Biol. v.5, p.310-316,
1998.
Messerschmidt, A. et al. Refined crystal structure of ascorbate oxidase at
1.9 Å resolution. J.Mol.Biol. v.224, p.179-205, 1992.