VI Simpósio de Pós-Graduação e Pesquisa em Nutrição e Produção Animal – VNP – FMVZ – USP – 2012
IDENTIFICAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS (MALDI/TOF) DE
ESPÉCIES DE CORYNEBACTERIUM ISOLADAS DO LEITE BOVINO
Juliano Leonel Gonçalves1,Tiago Tomazi1; Juliana Regina Barreiro1; Patrícia Aparecida
Campos Braga2; Marcos Nogueira Eberlin3; João Pessoa de Araújo Júnior4,
Marcos Veiga dos Santos5
1
Pós-graduandos do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ/USP.
Pós-doutoranda do departamento de Química Orgânica – UNICAMP, Campinas –SP.
3
Professor Doutor do Departamento de Química Orgânica – UNICAMP, Campinas-SP.
4
Professor Doutor do Instituto de Biociências – UNESP, Botucatu - SP.
5
Professor Doutor do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ/USP.
2
INTRODUÇÃO
A mastite é uma inflamação da glândula mamária cuja causa mais comum são as
infecções bacterianas. É considerada a doença de maiores prejuízos e prevalência em
vacas leiteiras. A forma subclínica da mastite é o tipo mais predominante de infecção
intramamária (IIM), sendo Corynebacterium spp. um dos micro-organismos mais
frequentemente isolados (BARKEMA et al., 1997; BENITES; MELVILLE; COSTA,
2003; BRITO et al., 1999; HALTIA et al., 2006; SCHEPERS et al., 1997; SCHUKKEN
et al., 2009). Não existem métodos simples para identificação das espécies de
Corynebacterium. Além disso, existem 30% de erro de identificação das espécies de
Corynebacterium pela metodologia fenotípica por microbiologia padrão (COYLE;
LIPSKY, 1990; WATTS et al., 2000). Desta forma, os diagnósticos microbiológicos de
Corynebacterium são apresentados somente com a identificação de gênero. A
espectrometria de massas por matriz assistida por laser com ionização/dessorção
(MALDI/TOF-MS) é uma técnica inovadora, de rápido diagnóstico e sensível para
identificação de bactérias (BARREIRO et al., 2010; THEEL et al., 2012). O objetivo do
presente estudo foi avaliar a técnica MALDI/TOF/MS para identificação das espécies
de Corynebacterium spp. a partir de amostras de leite.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados 21 rebanhos leiteiros comerciais (n=1.242 animais) da região
de Pirassununga, São Paulo, nos quais foram selecionadas vacas em lactação
previamente identificadas com IIM causada por Corynebacterium spp. (n=285). Em
seguida, amostras de leite (n=1.141) foram coletadas de quartos mamários, os quais
foram submetidos ao isolamento pela metodologia convencional, de acordo com as
recomendações do National Mastitis Council, NMC (1999). As cepas positivas para
Corynebacterium spp. (n=222) foram criopreservadas com o propósito de serem
submetidas à análise por MALDI/TOF/MS.
As bactérias foram descongeladas e cultivadas por 48 horas em meio TSB e
posteriormente centrifugadas (todas as centrifugações ocorreram a 13.000 x g por 2
min). O sedimento bacteriano obtido após a centrifugação foi inativado em 1,2 ml de
etanol 75%, em seguida centrifugados novamente, e o sobrenadante foi removido
cuidadosamente. Uma solução de 70% de ácido fórmico foi adicionada para lisar as
células bacterianas. Esta etapa foi seguida pela adição do mesmo volume de acetonitrila
a 100%. Para a etapa final foi realizada nova centrifugação para separar os sedimentos
de células bacterianas a partir do sobrenadante. O volume de 1μL do sobrenadante foi
depositado em uma placa metálica (Waters Manchester, UK) e recoberta com 1μL de
solução de matriz, composta de ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico diluída em
acetonitrila 50% e de ácido trifluoroacético 2,5%. A identificação e classificação dos
micro-organismos foram realizadas por meio da leitura de fingerprints medidos por
meio de um espectrômetro de massas Autoflex III (Bruker Daltonics, EUA). A
expressão proteica dos micro-organismos foi caracterizada pelo software MALDI
BioTyperTM (Bruker Daltonics, EUA) que possibilita a identificação das cepas por meio
da comparação com a expressão proteica de cepas padrão contidas no banco de dados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Do total de 1.242 vacas amostradas, 285 foram diagnosticadas com IIM causada
por Corynebacterium spp. na primeira etapa de coleta. Para a segunda etapa, amostras
de leite (n=1.141) foram coletadas de quartos mamários, os quais 32% apresentaram
identificação como Corineformes pela cultura microbiológica, e deste percentual,
Corynebacterium spp. (n=222) foram identificados em nível de espécie pela técnica de
MALDI/TOF/MS.
Um total de 222 amostras foram identificadas pela MALDI/TOF/MS como
Corynebacterium spp. Destas, Corynebacetium bovis foi o mais frequentemente isolado
(n=208). Espécies não-lipofíficas representaram 4,5% do total de isolados (n=10),
destes C. auriscanis (n=3), C. xerosis (n=3), C. amycolatum (n=1), C. casei (n=1), C.
efficiens (n=1), C. pseudotuberculosis (n=1). Apenas quatro amostras (1,8%) não foram
identificadas ao nível de espécie, Corynebacterium spp (Tabela 1).
Tabela 1. Identificação de espécies de Corynebacterium por MALDI/TOF/MS.
Nível de identificação*
Micro-organismos
Identificação por gênero
Identificação espécie(entre 1.7 e 1.99)**
Específica (>2,0)
C. bovis
208
199
C. auriscanis
3
-
C. xerosis
3
3
C. amycolatum
1
-
C. casei
1
1
C. efficiens
1
-
C. pseudotuberculosis
1
-
Corynebacterium spp.
4
3
Total
222 (100%)***
2062,8%)
*Algoritmo (1 a 3) emitido pelo software BioTyperTM 3.0.**Segundo Theel et al. (2012) escores acima de
1,7 já são suficientes para identificação de espécies de Corynebacterium. ***5 destas amostras tiveram
escore > 1,9.
Do total de cepas de Corynebacterium identificados pela MALDI/TOF/MS,
206/222 (92,8%) demonstraram identificação do gênero com provável identificação da
espécie e 16/222 (7,2%) demonstraram provável identificação do gênero.
Dentre as vantagens da MALDI/TOF/MS, pode ser destacado a rapidez na
conclusão de diagnósticos e o baixo custo por análise realizada, quando não levado em
conta o preço de custo do equipamento. Além disso, a técnica tem sido utilizada devido
à sua capacidade de analisar moléculas de massas elevadas, misturas complexas de
biomoléculas, e ainda por apresentar alta sensibilidade mesmo em reduzida quantidade
de amostra. A espectrometria de massas MALDI/TOF foi eficaz, quanto ao escore de
identificação, para o diagnóstico microbiológico das espécies de Corynebacterium
isoladas de casos de mastite bovina subclínica.
CONCLUSÃO
A espécie C. bovis foi a mais frequentemente isolada em quartos mamários de
vacas em rebanhos leiteiros do Estado de São Paulo. A técnica de MALDI/TOF/MS foi
aplicada com sucesso para a identificação de espécies de Corynebacterium isoladas de
casos de mastite bovina subclínica.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BARKEMA, H. W. et al. Estimation of interdependence among quarters of the bovine udder with subclinical mastitis
and implications for analysis. Journal of dairy science, v. 80, n. 8, p. 1592-9, ago. 1997.
BARREIRO, J. R. et al. Short communication: Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Journal of dairy science, v. 93, n. 12, p. 56617, dez. 2010.
BENITES, N. R.; MELVILLE, P. A; COSTA, E. O. Evaluation of the microbiological status of milk and various
structures in mammary glands from naturally infected dairy cows. Tropical animal health and production, v. 35, n.
4, p. 301-7, ago. 2003.
BRITO, M. A. V. P. et al. Padrão de infecção intramamária em rebanhos leiteiros: exame de todos os quartos
mamários das vacas em lactação. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 51, n. 2, p. 129-135,
abr. 1999.
COYLE, M. B.; LIPSKY, B. A. Coryneform bacteria in infectious diseases: Clinical and laboratory aspects. Clinical
microbiology reviews, n. 3, p. 227-246, 1990.
HALTIA, L. et al. A study of bovine mastitis, milking procedures and management practices on 25 Estonian dairy
herds. Acta veterinaria Scandinavica, v. 48, p. 22, jan. 2006.
SCHEPERS, A J. et al. Estimation of variance components for somatic cell counts to determine thresholds for
uninfected quarters. Journal of dairy science, v. 80, n. 8, p. 1833-40, ago. 1997.
SCHUKKEN, Y. H. et al. CNS mastitis: nothing to worry about? Veterinary microbiology, v. 134, n. 1-2, p. 9-14,
16 mar. 2009.
THEEL, E. S. . et al. Formic Acid-Based Direct, On-Plate Testing of Yeast and Corynebacterium Species by Bruker
Biotyper Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry. Journal of clinical
microbiology, v. 50, n. 9, p. 3093-3095, 2012.
WATTS, J. L. et al. Identification of corynebacterium bovis and other coryneforms isolated from bovine mammary
glands. Journal of dairy science, v. 83, n. 10, p. 2373-9, out. 2000.