Métodos Físicos de Análise
- ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Prof. Dr. Leonardo Lucchetti
Mestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ
Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – Fiocruz
Docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade
em Saúde – Fiocruz
Docente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica
– Farmanguinhos – Fiocruz
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Métodos Físicos de Análise
Princípio
da EM: elementos
identificados por suas massas
diferentes
podem
ser
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Métodos Físicos de Análise
O que é a espectrometria de massas?
•
Ferramenta analítica utilizada para medir o peso molecular de uma amostra
e obter informação qualitativa estrutural e quantitativa
•
São necessárias apenas concentrações picomolares
•
Acurácia de 0.01% do peso total da amostra e 5ppm para moléculas
orgânicas pequenas
•
Para um peso de 40 kDa, um erro de 4 Da
•
Útil na determinação de fragmentos de
amostras e no sequenciamento de
biomoléculas e na identificação de
substâncias específicas em misturas
complexas
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1
Métodos
AULA 3 Físicos de Análise
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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Métodos Físicos de Análise
Espectrometria de massas
•
Visão geral
• Espetrometria de massas é a geração, separação e caracterização de ions em
fase gasosa de acordo com suas massas relativas em função da carga
• Previamente, o requerimento era que a amostra fosse passível de vaporização
(limitação semelhante à CG), porém técnicas de ionização modernas permitem o
estudo de moléculas não voláteis (como proteínas e nucleotídeos)
• A técnica é uma poderosa ferramenta qualitativa e quantitativa; as análises de
rotina são realizadas em escala de femtogramas (10-15 g) level, podendo chegar
até zeptomoles (10-21 mol) para proteínas
• Dentre todas as técnicas de espectroscopia orgânica, é usada para os mais
diferentes fins: metalurgia, biologia molecular, semicondutores, geologia,
arqueologia etc mais que nenhuma outra
• Encontrar um caminho para “carregar” um átomo ou molécula (ionização)
• Colocar o átomo ou molécula em um campo magnético ou submeter a um campo
elétrico e medir sua velocidade ou raio de curvatura relativamente à sua razão
massa-carga
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Espectro de massas típico
•
Caracterizado por sinais finos
•
Eixo x indica a razão m/z para os ions (para aqueles com carga simples,
corresponde à massa do ion)
•
Altura do sinal indica a abundância relativa de do ion (não confiável para
quantificação)
•
Intensidade do sinal indica a capacidade do ion de ser dessorvido ou
“voar” (alguns voam melhor que outros)
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Espectro de massas
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Usos da espectrometria de massas
• Descoberta de isótopos
• Determinação de pesos moleculares
• Caracterização de novos elementos
• Análises quantitativas (metabólitos)
• Identificação de sequências
• Marcação isotópica
• Identificação de elementos-traço, poluentes e drogas
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Limitações
● As substâncias não podem ser caracterizadas se as amostras não
estiverem limpas
● A técnica não tem grande condição de garantir análise seletiva e
sensível de misturas complexas
● Para moléculas grandes, os espectros são bastante complexos e de
difícil interpretação
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Princípios da EM: o espectrômetro
amostra
+
_
ionizador
detector
analisador de
massas
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Como funciona um espectrômetro?
•
3 partes fundamentais: a fonte de ionização, o analisador e o detector
•
Separação no analisador de acordo com a razão massa/carga (m/z)
•
Detecção dos ions separados e suas abundâncias relativas
•
Sinais enviados ao sistema de dados e formatados num espectro m/z
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O espectrômetro de massas (esquema geral)
►Geração de ions – as moléculas da amostra são submetidas à
fontes que convertem parte delas a ions
► Separação de ions – à medida em que são aceleradas em um
campo elétrico, são separadas de acordo com suas razões massacarga (m/z)
► Detecção de ions – à medida em que cada população separada de
ions é gerada, o instrumento precisa qualificá-las e quantificá-las
As diferenças nos modelos de espectrômetros baseiam-se nas formas
diferentes de realizar estas três funções
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Esquema de um espectrômetro
ALTO
VÁCUO
ALTO
VÁCUO
BOMBAS
ENTRADA
Inlet
DA
AMOSTRA
Sample
Inlet de Plate
gás
Target
Probe de
HPLC
sólidos
GC
CG probe
Solids
CLAE
Ion DE
FONTE
IONS
Source
Mass
FILTRO
DE
Filter
MASSAS
MALDI
ESI
IonSpray
FAB
LSIMS
EI/CI
TOF
Quadrupolo
Ion Trap
Setor magnético
FTMS
Detector
DETECTOR
SISTEMA
Data
DE
System
DADOS
Placa de microcanais
Multiplicador de
eletrons
PC
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Introdução da amostra
•
•
•
•
•
•
Inlet de gás
Probe de sólidos
CG
CLAE
Cromatógrafo de líquido supercrítico
Eletroforese capilar
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•
GC-MS (CG-EM) – Cromatografia com fase gasosa acoplada à
espectrometria de massas
– separa componentes voláteis na coluna e identifica por massas
•
LC-MS (CL-EM)- Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de
massas
– separa compostos mais lábeis por CLAE e identifica por massas
•
MS-MS (EM-EM) - Tandem Mass Spectrometry
– separa fragmentos de compostos por campo magnético e identifica
por massas
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Cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
Configuração mais comum: ionização por impacto de eletrons e filtro de massas quadrupolo
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Ionização
ALTO
VÁCUO
ALTO
VÁCUO
BOMBAS
ENTRADA
Inlet
DA
AMOSTRA
Sample
Inlet de Plate
gás
Target
Probe de
HPLC
sólidos
GC
CG probe
Solids
CLAE
FONTE
Ion DE
IONS
Source
Mass
FILTRO
DE
Filter
MASSAS
MALDI
ESI
IonSpray
FAB
LSIMS
EI/CI
TOF
Quadrupolo
Ion Trap
Setor magnético
FTMS
Detector
DETECTOR
SISTEMA
Data
DE
System
DADOS
Placa de microcanais
Multiplicador de
eletrons
PC
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A fonte de ions depende da amostra…
Amostra sólida
transforma em sólido?
Amostra líquida
prepara solução?
Propriedades
químicas do
analito na
solução?
MALDI
ESI
Amostra gasosa
vaporiza?
Propriedades
químicas do
analito no gás?
CI
EI
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Modos de ionização
•
Impacto de eletrons (EI – método drástico)
– Moléculas pequenas (1-1000 Daltons): estrutura
•
Ionização química (CI – método brando)
– Moléculas pequenas (1-1000 Daltons): ion molecular, grandes fragmentos
•
Fast Atom Bombardment (FAB – “semi-drástico”)
– Peptídeos, açúcares (até 6000 Daltons)
•
Eletrospray (ESI – “semi-drástico”)
– Peptídeos, proteínas (até 200.000 Daltons)
•
Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI - branda)
– Peptídeos, proteínas, DNA (até 500kD)
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Ionização por eletrospray
•
A amostra é dissolvida em tampão polar volátil (sem sais) e bombeado
através de um capilar de aço inoxidável (70-150mm) num fluxo de 10100 mL/min
•
Alta voltagem (3-4kV) é aplicada no fluxo de gás nebulizado, fazendo
com que a amostra também se nebulize (ou se torne um aerossol)
•
•
O aerossol é direcionado através de regiões de alto vácuo até que as
gotículas evaporem até quase o tamanho atômico
Pode ser modificada a “nanospray” com fluxo < 1mL/min
•
Técnica muito sensível: requem menos que um picomol de material
•
Bastante afetada por sais e detergentes
•
Medição via modos positivo ou negativo [(M + H) por adição de ácido
fórmico ao solvente; (M - H) por adição de amônia ao solvente]
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Taylor Cone
Processo em três etapas
1) Formação da gota
2) Encolhimento da gota
3) Formação de ions gasosos
O processo de eletrospray não ioniza as amostras!
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Por que eletrospray?
•
Maioria das amostras são líquidas.
– CG requer aquecimento da amostra para gerar evaporação
– Ionização ocorre por impacto de eletrons ou reações químicas
– Nem todos os analitos são termicamente estáveis
•
Eletrospray foi desenvolvido para garantir uma forma branda de
geração de ions gasosos
•
Pode ser facilmente interfaceado com cromatógrafo a líquido
•
Sinais absolutos do eletrospray são mais facilmente reproduzidos
garantindo, assim, melhor quantificação
•
Acurácia de massa é considerada melhor
•
Carregamento múltiplo é mais comum que em MALDI
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MALDI: Matriz Assisted Laser Desorption Ionization
•
Diferente da ESI, MALDI gera espectros que apresentam apenas um ion
carregado simples
•
Modo positivo gera ions de (M+H) e modo negativo gera ions de (M-H)
•
Geralmente mais robusto que ESI (tolera sais e compostos não voláteis)
•
Maior facilidade de uso e manutenção, capaz de maior escala de trabalho
•
•
Requer amostra de 10 mL de 1 pmol/mL
A amostra é ionizada pelo seu bombardeamento com luz laser
•
A amostra é misturada a uma matriz que absorve no UV (ácido sinapínico para
proteínas, ácido 4-hidroxicinâmico para peptídeos, por exemplo)
•
O comprimento de onda iguala ao de máxima absorbância da matriz, fazendo
com que ela transfira parte de sua energia ao analito (levando à pulverização
dos ions)
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MALDI
O analito é co-depositado com a matriz
O laser excita a matriz que, por sua vez, transfere energia para o analito
Produz espécies com apenas uma carga
Tipicamente usada para biomacromoléculas/polímeros
MALDI é comumente combinada com TOF
Moléculas da amostra (M) são ionizadas por transferência de protons:
XH+ + M MH+ + X
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A matriz
•
Não pode ser volátil (a maioria é sólida em temperatura ambiente)
•
Precisa absorver o comprimento de onda em uso (337nm na maioria dos
casos)
•
Preferencialmente solúvel no mesmo solvente da amostra
•
As matrizes são, tipicamente, ácidas: geralmente, um ácido aromático
forte que absorve fortemente o laser de N2 em 335nm e cristaliza
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Por que MALDI?
•
Menos sensível a sais
•
Menores limites de detecção (na prática)
•
Espectros de interpretação mais fácil (menor número de cargas múltiplas)
•
Rápido e fácil
•
Detecção de massas mais altas
•
Maior rendimento (>1000 amostras por hora)
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Impacto de eletrons
•
•
•
•
Amostra de interesse é vaporizada no equipamento
A energia suficiente para ionização e fragmentação das moléculas do
analito é adquirida pela interação com eletrons provenientes de
filamento aquecido
70 eV são comumente usados
A fonte de eletrons é um fio fino de rênio aquecido eletricamente a
uma temperatura na qual emite eletrons livres
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Impacto de eletrons
•
•
•
•
Amostra introduzida no instrumento por aquecimento, até a evaporação
A amostra em fase gasosa é bombardeada com eletrons provenientes
de filamentos de rênio ou tungstênio (70 eV)
A molécula é estilhaçada em fragmentos (70 eV >> 5 eV ligações)
Os fragmentos são enviados ao analisador de massas
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Impacto de eletrons
Uma partícula carregada passando por um campo magnético é defletida
através de uma trajetória circular, com um raio proporcional à sua
relação massa/carga.
Num espectrômetro de impacto de eletrons, um feixe de eletrons de alta
energia é usado para deslocar um eletron da molécula orgânica para
formar um cation radical, conhecido como ion molecular. Se ele for
instável, pode ser então fragmentado em outros ions menores.
A coleção de ions é então focalizada em um feixe e acelerada para o
campo magnético e defletida nas trajetórias circulares de acordo com
as massas dos ions. Ao ajustar o campo magnético, os ions podem
ser focalizados no detector e registrados
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Métodos Físicos de Análise
Impacto de eletrons
e-
e-
e-
M
M(g) + e- M+(g) + 2eM+(g) A+frag 1 (g) + Bfrag 2 (g)
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Impacto de eletrons
Exemplo: fragmentação por IE de CH3OH
CH3OH
CH3OH+
CH3OH
CH2O=H+
CH3OH
+
CH2O=H+
+ H
CH3 + OH
CHO=H+ + H
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Impacto de eletrons
EM/IE CH3OH
Molecular ion
Quebra da molécula de maneiras previsíveis
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Impacto de eletrons
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Espectro de massas gerado por impacto de elétrons:
formação dos fragmentos
Exemplo: Formação do m/z = 57.
Exemplo: Formação do m/z = 43 (íon base= 100%).
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EXEMPLO: cocaína por EI
•
•
Fragmentação extensa
Ion molecular é fraco em m/z 303
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Algumas considerações...
Espectrômetros comerciais detectam íons com carga positiva (M+ ou M+.)
Em rotina, os aparelhos não detectam grupos neutros e nem os carregados
negativamente (exigem outras condições).
Ao sofrer um impacto de 70eV, a substância perde um elétron e fica
instável, o que ocasiona a perda de fragmentos até uma maior estabilidade. A
análise dos fragmentos gerados permite inferir sobre a estrutura. Grande parte das
substâncias gera íons moleculares estáveis, o que permite o conhecimento do peso
molecular.
Quanto maior for a capacidade de uma molécula em estabilizar o produto
formado a partir do impacto com 70eV, maior será a chance deste chegar ao
detector e ser identificado.
Nem todas as substâncias podem ser analisadas com a técnica de impacto
de elétrons, já que não se ionizam com esta energia ou não podem ser volatilizadas
na câmara de ionização ou geram produtos muito instáveis para serem analisados.
Assim, existem outras técnicas para transferir energia para a substância para que
esta possa se ionizar, como a ionização química.
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Ionização química
• Usada para confirmar o peso molecular
• Reconhecida como uma técnica de ionização branda
• Difere do impacto pois, alternativamente, as moléculas são
ionizadas por interação ou colisão com ions do gás
reagente mais do que com eletrons
• Os gases reagentes mais comumente usados são metano,
isobutano e amônia
• O gás reagente é bombeado diretamente na câmara de
ionização e os eletrons do filamento o ionizam
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Ionização química
• 1º - ionização eletrônica do CH4:
– CH4 + e- → CH4+ + 2e• Formas fragmentadas: CH3+, CH2+, CH+
• 2º - reações ion-molécula criam ions
reagentes estáveis:
– CH4+ + CH4 → CH3 + CH5+
– CH3+ + CH4 → H2 + C2H5+
• CH5+ e C2H5+ são os ions reagentes dominantes do
metano
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Ionização química
•
•
•
•
Forma ions pseudomoleculares (M+1)
– CH5+ + M → CH4 + MH+
– Ions M+1 podem gerar fragmentações posteriores
para produzir um espectro complexo
Forma adutos
– C2H5+ + M → [M + C2H5]+ (aduto M+29)
– C3H5+ + M → [M + C3H5]+ (aduto M+41)
Ion molecular por transferência de carga
– CH4+ + M → M+ + CH4
Abstração de hidreto (M-1)
– C3H5+ + M → C3H6 + [M-H]+
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EXEMPLO: cocaína por CI
•
•
Fragmentação limitada
Ion molecular é fraco em m/z 303
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Ionização em fase gasosa
•EI e CI são técnicas de ionização em
fase gasosa
•Amostra é aquecida para volatilizar
•A molécula deve ter peso molecular
baixo e polaridade suficientes para que:
Tvap< Ttermodecomp
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Ions reagentes do metano (CI)
– Ions em m/z 17, 29 e 41 são originários do metano;
• H3O+ também se forma pelo vapor d´água no sistema de vácuo
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Cocaína (CI – metano)
Ions pseudomolecular e fragmentos
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Métodos Físicos de Análise
Cocaína (CI – isobutano)
Menor fragmentação
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Métodos de ionização (resumo)
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Métodos Físicos de Análise
Quando usar EI e CI?
CI
EI
• Quando é necessário o
“fingerprint” para identificação
por comparação em bases de
dados
• Análise de traços
• Forense
• Ambiental
• Desconhecidos totais (ex.
produtos naturais)
• Homologia de fragmentação em
uma série (ex. produtos naturais)
• Quando é necessária a identificação
confiável do ion molecular
• LC-MS
• Acompanhamento de uma rota
sintética, identificação de impurezas
• Amostras biológicas ou outras frágeis
ou sensíveis à decomposição (ex.
drogas e metabólitos)
• Minimizar a fragmentação, ganhando
maior intensidade no ion molecular
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Métodos Físicos de Análise
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Métodos Físicos de Análise
Filtros de massa/analisadores/separadores de ions
ALTO
VÁCUO
ALTO
VÁCUO
BOMBAS
ENTRADA
Inlet
DA
AMOSTRA
Sample
Inlet de Plate
gás
Target
Probe de
HPLC
sólidos
GC
CG probe
Solids
CLAE
FONTE
Ion DE
IONS
Source
Mass
FILTRO
DE
Filter
MASSAS
MALDI
ESI
IonSpray
FAB
LSIMS
EI/CI
TOF
Quadrupolo
Ion Trap
Setor magnético
FTMS
Detector
DETECTOR
SISTEMA
Data
DE
System
DADOS
Placa de microcanais
Multiplicador de
eletrons
PC
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Métodos Físicos de Análise
Modo positivo ou negativo?
•
Se a amostra contém grupos funcionais que sejam bons aceptores H+
(como amida e grupos amino presentes em peptídeos e proteínas) então
a detecção positiva é usada
•
Se a amostra apresenta grupos funcionais que percam protons
facilmente (como ácidos carboxílicos e hidroxilas, como as encontradas
em ácidos nucleicos ou açúcares), então a detecção negativa é usada
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Métodos Físicos de Análise
Analisadores de massas
•
Setor magnético (MSA)
– Alta resolução, massa exata (é o analisador original)
•
Quadrupolo (Q)
– Baixa resolução (1 u.m.a.), rápido, barato
•
Tempo-de-voo (Time-of-Flight - TOF)
– Sem limite de m/z, alto rendimento
•
Ion Trap
– Boa resolução, analisador “all-in-one”
•
Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR)
– Mais alta resolução, massa exata, caro
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Métodos Físicos de Análise
•
Tempo-de-voo (TOF, TOF-MALDI)
– Mede o tempo requerido para os ions voarem pela extensão da câmara
– Comumente combinado com MALDI
•
Tandem MS - MS/MS - MSn
– Separação e identificação de componentes em misturas complexas
– Induz fragmentação e analisa os fragmentos
– Usa dois ou mais analisadores/filtros separados por uma célula de
colisão
•
Diferentes configurações de MS-MS
– Quadrupolo - quadrupolo (baixa energia)
– Setor magnético - quadrupolo (alta energia)
– Quadrupolo - tempo-de-voo (baixa energia)
– Tempo-de-voo – tempo-de-voo (baixa energia)
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Métodos Físicos de Análise
LC/LC-MS/MS-Tandem LC, Tandem MS
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Métodos Físicos de Análise
Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)
•
A ideia é fragmentar ions a partir de ions-pai para obter informação
estrutural sobre uma molécula
•
Permite ainda separação de massa e identificação em misturas
complexas
•
Usa dois ou mais analisadores/filtros separados por uma célula de
colisão preenchida com argônio ou xenônio
•
A célula de colusão é onde os ions selecionados são direcionados para
posterior fragmentação
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Métodos Físicos de Análise
Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)
O primeiro (MS1) é usado para SELECIONAR, nos ions primários, aquele(s) com um valor de
m/z para passar na região de fragmentação. O ion selecionado é o ion-pai e pode ser o ion
molecular resultante da fragmentação primária. A DISSOCIAÇÃO ocorre na região de
fragmentação. Os ions filhos são analisados num segundo espectrômetro (MS2). Na verdade, o
MS1 pode ser visto como fonte de ions para MS2.
MS1
MS2
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Métodos Físicos de Análise
Por que Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)?
•
•
•
Identificação de desconhecidos
Potencialmente dois compostos de interesse têm a mesma massa (e o
mesmo tempo de retenção)
Melhorias quantitativas (redução do ruído)
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Métodos Físicos de Análise
Setor magnético
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Métodos Físicos de Análise
Setor magnético
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Métodos Físicos de Análise
Setor magnético
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Métodos Físicos de Análise
Quadrupolo
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Métodos Físicos de Análise
Quadrupolo
•
Consiste de quatro hastes metálicas paralelas com diferentes cargas
•
Duas hastes opostas apresentam potencial positivo e as outras duas
apresentam potencial negativo
•
As voltagens aplicadas afetam a trajetória dos ions que migram ao longo
do trajeto de voo
•
Para determinadas voltagens de correntes alternada ou contínua,
somente ions com razões massa-carga específicas passam pelo
quadrupolo e todos os demais ions são ejetados de sua trajetória
original
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Métodos Físicos de Análise
Quadrupolo
Quatro magnetos hiperbólicos em seção cruzada,
são arranjados; em um par é aplicada corrente
alternada; no outro, aplica-se corrente contínua
Somente um ion em particular consegue
“ressonar” adequadamente e atingir o detector
A vantagem é o
tamanho compacto
do instrumento –
cada haste tem o
tamanho
aproximada de
uma caneta
esferográfica
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Métodos Físicos de Análise
Quadrupolo
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Métodos Físicos de Análise
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Métodos Físicos de Análise
Quadrupolos
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Métodos Físicos de Análise
Quadrupolo
• O tamanho compacto e a velocidade destes instrumentos propiciam que eles sejam eficientes
e poderosos como detectores para CG: uma vez que os compostos já se encontram
vaporizados, somente o gás carreador precisa ser eliminar para que o processo ocorra
•Pequeno: as moléculas são facilmente defletidas de suas trajetórias e são ejetadas pelo
vácuo; os ions mais pesados, como maiores momenta, tendem a permanecer no centro do jato
e são enviados ao detector
interface GC-MS: uma
bomba é usada para evacuar
a interface
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Métodos Físicos de Análise
Quadrupolo
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Métodos Físicos de Análise
Tempo-de-voo (TOF)
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Métodos Físicos de Análise
Tempo-de-voo (TOF)
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Métodos Físicos de Análise
Tempo-de-voo (TOF)
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Métodos Físicos de Análise
Tempo-de-voo (TOF)
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Métodos Físicos de Análise
TOF
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Métodos Físicos de Análise
Ion Trap
São dispositivos que fazem uso de campos de quadrupolos tridimensionais
para capturar e analisar as massas dos ions com bom poder de resolução
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Métodos Físicos de Análise
Ion Trap
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Métodos Físicos de Análise
Ion traps
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Métodos Físicos de Análise
ION TRAPS
x
QUADRUPOLOS
Separação de massa no
tempo
Separação de massa no
espaço
Alta sensibilidade –
varredura total
Baixa sensibilidade –
varredura total
Estágios múltiplos de
detecção de massas
(MSn)
Não há estágios múltiplos
Alta resolução
Perda da varredura de
espécies neutras
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Métodos Físicos de Análise
FT-Ion Cyclotron
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Métodos Físicos de Análise
Ion cyclotron resonance - FT
•
Usa um magneto poderoso (5-10 Tesla) para criar um ciclotron em
miniatura
•
Abordagem por FT permite a determinação simultâne de muitas massas
de ions - EFICIÊNCIA
•
Apresenta resolução mais alta que qualquer outro analisador de massas
disponível
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Métodos Físicos de Análise
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Métodos Físicos de Análise
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Métodos Físicos de Análise
Espectrômetro de massas
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Métodos Físicos de Análise
Espectrômetro de massas
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Métodos Físicos de Análise
Detecção
ALTO VÁCUO
ALTO VÁCUO
BOMBAS
ENTRADA
Inlet
DA
AMOSTRA
Sample
Inlet de Plate
gás
Target
Probe de
HPLC
sólidos
GC
CG probe
Solids
CLAE
FONTE
Ion DE
IONS
Source
Mass
FILTRO
DE
Filter
MASSAS
MALDI
ESI
IonSpray
FAB
LSIMS
EI/CI
TOF
Quadrupolo
Ion Trap
Setor magnético
FTMS
DETECTOR
Detector
SISTEMA
Data
DE
System
DADOS
Placa de microcanais
Multiplicador de
eletrons
PC
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Métodos Físicos de Análise
Detectores
•
•
•
•
•
•
Os primeiros usavam filmes fotográficos
Hoje, produzem sinais eletrônicos quando atingidos por ions
Mecanismos de tempo integram estes sinais com voltagens em
varredura que permitem ao instrumento registrar a m/z que atinge o
detector
Necessitam de calibragem constante e regular
Monitoram a corrente de ions, amplificam e transmitem o sinal para o
sistema de dados
Mais comuns:
• Fotomultiplicador
• Multiplicador eletrônico
• Placa de microcanais
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Métodos Físicos de Análise
O espectro de massas
–
Apresentação: abundância relativa x razão m/z (massa) – o ion mais abundante
formado durante a ionização gera o sinal mais alto no espectro = pico-base
pico-base, m/z 43
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Métodos Físicos de Análise
O espectro de massas
–
–
Todos os demais picos são relativos ao pico-base e expressos como
porcentagem
Se a molécula perde somente um eletron no processo de ionização, o ion
molecular é observado e fornece seu peso molecular – designado como M+ no
espectro
M+, m/e 114
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29
Métodos Físicos de Análise
O espectro de massas
–
–
Na maioria dos casos, quando a molécula perde um eletron de valência, as
ligações são quebradas ou o ion formado rapidamente se fragmenta gerando
ions de mais baixa energia
As massas dos ions carregados são registrados como fragmentos iônicos –
fragmentos neutros não são registrados!
fragmentos
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Métodos Físicos de Análise
O espectro de massas
–
–
–
–
Quando um pico M+ é observado, ele fornece a massa molecuar – considerando
que cada átomo se encontra em sua forma isotópica mais abundante
Lembrar que o carbono é uma mistura de 98,9% de 12C, 1,1% de 13C e menos
que 0,1% de 14C – na tabela periódica, a massa de 12,011 é a média
Por sua natureza, o espectrômetro de massas vê um sinal de massa 12 como
carbono e um pico M+1 em 13, que apresentará 1,1% da altura do primeiro
Determinação da massa molecular
•
Algumas moléculas são altamente frágeis e os picos M+ não são
observados – um método usado para confirmar a presença de um pico M+ é
reduzir a voltagem de ionização – ions de energia mais baixa não
fragmentam facilmente
•
Três fatos são aplicáveis ao pico do ion molecular:
–
O pico deve corresponder ao ion de massa mais alta no espectro,
excluindo os picos de isótopos
–
O ion deve ter número ímpar de eletrons – geralmente, um cation
radical
–
O ion deve ser capaz de gerar outros fragmentos no espectro pela
perda lógica de fragmentos neutros
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Métodos Físicos de Análise
Determinando padrões isotópicos no espectro de massas
•Espectrômetros de massas são capazes de separar e detectar ions
individuais, mesmo que suas diferenças sejam de apenas uma unidade de
massa
•Como resultado, moléculas que contenham isótopos diferentes podem ser
distinguidos
•Isto é mais claro quando átomos tais como bromo ou cloro estão
presentes (79Br:81Br, intensidade 1:1; 35Cl:37Cl, intensidade 3:1) quando
picos em "M" e "M+2" puderem ser obtidos
•A razão das intensidades nos padrões dos isótopos são devidas às
abundâncias naturais dos isótopos
•Picos de "M+1“ são vistos devido à presença de 13C na amostra
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Métodos Físicos de Análise
Espectro de Massas gerado por impacto de elétrons:
presença de M+2 em
substâncias contendo cloro (M+2 1/3 do M+) e bromo (M+2 = M+)
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Métodos Físicos de Análise
EM/IE CH3Br
Isótopos podem ajudar na identificação de compostos
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Métodos Físicos de Análise
EM x RMN
•
•
•
•
•
•
Picos em EM são mais finos que em RMN
EM é muito mais sensível (104 x) que RMN (está entre as ferramentas
analíticas mais sensíveis)
Com EM é possível analisar moléculas muito maiores (>50 kD)
Amostras para EM são mais difíceis de serem preparadas
EM não é propriamente quantitativa
Espectrômetros de massas custam um pouco menos que os de RMN
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Métodos Físicos de Análise
A “regra do nitrogênio”
• Moléculas contendo átomos limitados a C, H, O, N, S, X e P de massa molecular
par contêm número par ou não contêm nitrogênio (também se aplica a radicais) –
serve para confirmar a presença de um ion molecular
• Não se aplica a cations radicais
• No caso da ionização química, onde se observa [M+H]+, subtrair de 1 e então
aplicar a regra
• Exemplo: se uma substância não contém nitrogênio e gera um ion em m/z 201,
então este pico não pode ser o do ion molecular
• Se a molécula contém número par de nitrogênios ou não contém este elemento,
o ion molecular apresentará relação massa/carga par; por outro lado, se a
molécula contém número ímpar de nitrogênios, o ion molecular terá massa ímpar
• Se a molécula contém cloro ou bromo, cada qual com dois isótopos comuns, a
determinação do M+ pode ser simplificada ou dificultada!...
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Métodos Físicos de Análise
A “regra dos 13” e a predição da fórmula
1. Tome o peso do ion e divida por 13
2. Esta resposta é o “n”, para (CH)N e qualquer sobra é adicionada como H
Ex. 92
92/13 = 7 com sobra de 1; C7H8 pesa 92. Este é a fórmula candidata
Pode-se avaliar outras alternativas que possuam heteroátomos. Para cada membro
da lista abaixo, substitua o número indicado de CHs na resposta abaixo
Hetero
substituição
CH substituição
Hetero
substituição
CH substituição
C 2H 7
O
CH4
P
N
CH2
S
C 2H 8
O+N
C 2H 6
O+S
C4
F
CH7
I
C10H7
Si
C 2H 4
Cl,Br
(usar isótopos)
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Métodos Físicos de Análise
Rearranjo de McLafferty
Cations radicais localizados no oxigênio da forma ceto podem ser β-clivados
O mecanismo se limita à fragmentação por impacto de eletrons
É necessário um H em um carbono γ de hibridação sp3
Cetonas, ésteres, ácidos carboxílicos geram produtos por este rearranjo
H
+
O •
R1
R2
H
O
R1
+
R2
+
•
••
• O H
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Métodos Físicos de Análise
Clivagem α de C=O
+
+
:O +
:O .
neutro
:O
+
CH3C=O+
m/z=43
:
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Métodos Físicos de Análise
Clivagem α em heteroátomos (O, N)
R
+
R
•
neutro
: O. :
:O.
+
+
Clivagem heterolítica
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Métodos Físicos de Análise
Rearranjos e fragmentações que geram bons carbocations
C H 2+
C+
H
Cation benzílico (estabilizado como tropílio) m/z=91
CH 2
+
H C
CH 2
CH+
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Métodos Físicos de Análise
Aminas
N
-R•
+
R
Aminas cíclicas perderão H• adjacentes formando ion imínio
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Métodos Físicos de Análise
A clivagem “retro Diels-Alder”
Cicloexenos com estado de transição de 6
membros favorável; pode incluir
heteroátomos (N,O)
+
+
•
•
+
+
•
+
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Métodos Físicos de Análise
QUESTÕES DE CONCURSOS
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Métodos Físicos de Análise
O espectrômetro de massas é um equipamento que fornece dados para a
identificação de compostos. Ele pode ser acoplado a um cromatógrafo de
modo a permitir a identificação de vários compostos presentes em uma
mesma amostra. O espectro de massas é produzido quando:
a) a molécula do analito é fragmentada por ação de forças magnéticas;
b) a molécula do analito é excitada por um feixe de luz e a luz emitida pela
molécula é captada pelo detector;
c) a molécula do analito absorve energia proveniente de radiação
eletromagnética sofrendo vários tipos de excitação;
d) dois protons adjacentes quimicamente diferentes, alinham-se em relação a
um campo magnético externo;
e) a molécula do analito é bombardeada em fase gasosa por um feixe de
elétrons.
(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF)
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Métodos Físicos de Análise
Ao selecionar o monitoramento seletivo de íons na análise por espectrometria de
massas, devemos utilizar algum critério para garantir que estamos identificando
corretamente o composto. O critério considerado de maior segurança é quando
a identificação pode ser concluída se o analito possuir:
a) o íon de maior intensidade do composto padrão de comparação;
b) pelo menos 3 íons característicos do composto padrão de comparação;
c) o mesmo tempo de retenção no cromatograma, ainda que os íons sejam
diferentes do composto padrão de comparação;
d) pelo menos 2 íons característicos do composto padrão de comparação;
e) pelo menos alguns íons característicos, ainda que ainda que o tempo de
retenção no cromatograma seja diferente do composto padrão de comparação.
(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF)
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Métodos Físicos de Análise
45 – Julgue as afirmações abaixo, sobre a espectrometria de massas:
I – Um espectro de massa é o registro do que acontece com as moléculas quantos estas são
bombardeadas em fase gasosa por um feixe de elétrons, em um instrumento chamado espectrômetro
de massas.
II – As moléculas são destruídas em pedaços. Usualmente é possível deduzir do estudo dos fragmentos a
estrutura da molécula original.
III – Os espectros de massa podem ser também usados para determinar a extensão e localização da
incorporação de isótopos.
IV – Durante a interação entre a molécula e o elétron de alta energia há transferência de energia para a
molécula. Uma das maneiras pelas quais as moléculas excitada pode dissipar a energia em excesso é
pela ejeção de um elétron, ficando positivamente carregada.
V – Geralmente a pressão da amostra de espectrômetro e massa não ultrapassa 10-5 mm Hg. Nesta baixa
pressão podem ocorrer os fragmentos e rearranjos intramoleculares, mas a probabilidade de ração
intermoleculares entre ions ou moléculas neutras é baixa.
São verdadeiras:
a) I,II,IV e V
b) I,II e III
c) II,III e V
d) Todas as afirmações
(PERITO – PF 1993 – ENG.QUÍMICA/FARMÁCIA/QUÍMICA/C.BIOLÓGICAS/BIOQUÍMICA)
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