Universidade Federal de Ouro Preto
Escola de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - CiPharma
NANOPARTICULAS BIOADESIVAS PARA ADMINISTRAÇÃO
INTRAMAMÁRIA: DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO FISICOQUÍMICA, CINÉTICA DE LIBERAÇÃO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA EX VIVO
Raquel Gomes Castanheira
Ouro Preto
2012
Universidade Federal de Ouro Preto
Escola de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - CiPharma
NANOPARTICULAS BIOADESIVAS PARA ADMINISTRAÇÃO
INTRAMAMÁRIA: DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO FISICOQUÍMICA, CINÉTICA DE LIBERAÇÃO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA EX VIVO
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas da
Escola de Farmácia da Universidade Federal de
Ouro Preto, como requisito essencial à obtenção
do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Orientadora: Profa. Dra. Vanessa Carla F.
Mosqueira
Co-orientador: Dr. Humberto de Melo Brandão
Ouro Preto
2012
Este trabalho contou com a colaboração de:
Dra. Margareth Spangler de Andrade
Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC - MG
Dr. José Mario Carneiro Vilela
Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC – MG
iii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais e minhas irmãs, pelo amor, amizade e por orientarem
minhas decisões e sempre me apoiarem nos caminhos que decidi trilhar.
Ao Alan, pelo imenso amor, dedicação e apoio.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço à professora Vanessa pela orientação inteligente e consciente e por estar sempre
disposta e paciente para sanar minhas dúvidas. Obrigada pela confiança em meu trabalho e pela
amizade.
À Escola de Farmácia de Ouro Preto pelo ensino gratuito e de qualidade e aos professores
do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela contribuição em minha formação.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG pela bolsa
concedida para a realização deste trabalho e à Rede NANOBIOMG/FAPEMIG pelo apoio
financeiro.
Ao Humberto de Mello Brandão, da Embrapa-Gado de Leite, pela orientação, auxilio na
realização de experimentos e fornecimento de materiais para execução deste trabalho.
À Dra. Margareth Spangler, pela possibilidade de realização dos experimentos de
microscopia de força atômica (MFA) no Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC) e aos Dr.
José Mário Vilela, pela grande colaboração na execução e análise das imagens obtidas por MFA.
Ao laboratório de Farmacotécnica da UFMG, aos professores Lucas Antônio Miranda
Ferreira e Mônica Cristina de Oliveira e ao aluno de doutorado Guilherme Carneiro, pela permissão
e auxílio no uso do equipamento Zetasizer.
Aos professores Ieso e Rogélio e à Zezé do LBCM, que tiveram a gentileza de fornecer
parte do nitrogênio líquido deste trabalho.
Aos colegas do laboratório, Bruno, Renata, Carina e Alessandra com quem vivi muitos
momentos de alegria e amizade.
Em especial agradeço às amigas e colegas de laboratório Giani e Líliam, pela grande
amizade construída nesses dois anos e por me divertirem mesmo nos momentos mais difíceis,
fazendo tudo parecer possível. Agradeço também à Líliam pela constante orientação em meus
experimentos, sempre contribuindo significativamente em meus resultados – sem seu auxílio eu não
teria finalizado meu trabalho.
Às alunas de iniciação científica Larissa, Carol e Mari, pelo auxílio nos experimentos.
À Raquel Araújo, pela amizade a auxilio na orientação dos meus experimentos, me
auxiliando a dar continuidade ao trabalho iniciado por ela.
Aos funcionários do CiPharma, porteiros, moças da limpeza e à Mirela e Fátima,
secretárias muito importantes na nossa pós-graduação.
Agradeço às minhas grandes amigas, de muitos anos: Ana Flávia, Carlinha, Cacá, Fafá,
Neca e Nath, pelo carinho, amizade e momentos divertidos.
v
Às minhas amigas da graduação Nilda, Monique e Marcela, pela grande amizade
construída, pelo apoio e carinho mesmo quando estão distantes.
À minha amiga de longa data Gersiane, por estar ao meu lado há tantos anos, tornando a
vida mais leve e bonita.
Aos amigos Luciene e Jaspion e aos seus lindos filhos Maria Clara e André, que deram um
novo sentido aos meus dias nesses últimos dois anos, me alegrando em muitos momentos difíceis.
Obrigada Lu pelo apoio e pelas conversas e por me permitir amar uma família tão especial.
Às minhas primas-irmãs Alice e Elisa, pela grande amizade e união.
Aos meus avós, Alarico, Selvita e Maria Sylvia, pelo amor e confiança. E ao meu avô
Paulo, a quem enxergo através do meu pai, por guiar meus passos e olhar por mim há tantos anos.
Aos meus pais e minhas irmãs pelo amor, paciência, dedicação, generosidade e apoio em
absolutamente tudo que eu já fiz e ainda quero fazer na vida. Ao minha mãe, pelo amor sem limites,
meu pai pelo exemplo de força e caráter. À minha irmã Laura, pelo exemplo profissional e pela
generosidade.
À minha irmã Luciana e meu querido cunhado Duavesso, pelo apoio, amizade, carinho e
pelos ótimos momentos vividos.
Ao Alan, uma bênção que recebi em minha vida, meu grande amor, pela amizade, carinho,
cumplicidade, dedicação e por estar ao meu lado em qualquer situação.
A toda minha família, pela grande união e amor que nos envolve e por saber que posso
contar sempre com vocês. Em especial aos tios João e Natércia, grandes amigos.
Aos meus padrinhos tio Ricardo e tia Fatinha, pelo amor, preocupação e amizade e por
acreditarem na minha capacidade e aos seus filhos, em especial à Carol, pela amizade. Em especial
agradeço à tia Fatinha pelo exemplo de garra, força, fé e superação.
A todas as demais pessoas que participaram dessa importante etapa da minha vida.
E acima de tudo, agradeço a Deus e a nossa senhora auxiliadora por terem me ajudado a
seguir em frente nos momentos mais difíceis.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................. X
LISTA DE TABELAS ..............................................................................................................XIV
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................XVI
RESUMO .............................................................................................................................. XVIII
ABSTRACT ................................................................................................................................. 22
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 24
INTRODUÇÃO GERAL .............................................................................................................. 2
REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................................... 5
1 - SISTEMAS VETORIZADOS ...................................................................................................... 5
2 - POLÍMEROS UTILIZADOS NO PREPARO DE NANOPARTÍCULAS ............................................. 9
2.1 - Poli-ε-caprolactona..................................................................................................... 9
2.2 - Quitosana .................................................................................................................. 10
3 - MASTITE E APLICABILIDADE DE NANOPARTÍCULAS EM VETERINÁRIA ............................. 12
4 - CLOXACILINA BENZATINA .................................................................................................. 15
5 - LIOFILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS ................................................................................ 17
6 - CRIOPROTETORES ............................................................................................................... 19
OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 21
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................... 21
CAPÍTULO I ............................................................................................................................... 22
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCÁPSULAS E
NANOESFERAS BIOADESIVAS ................................................................................................. 22
1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................................... 23
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................ 23
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................... 24
3.1 MATERIAIS ......................................................................................................................... 24
3.2 PREPARO DAS NANOPARTÍCULAS ...................................................................................... 24
3.3 DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DE CLOXB EM DIFERENTES MEIOS .......................... 26
3.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOPARTÍCULAS .......................................... 26
vii
3.4.1 Distribuição de tamanho .......................................................................................... 26
3.4.2 Potencial Zeta (ζ) ..................................................................................................... 28
3.4.3 Análise morfológica das nanopartículas .................................................................. 29
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS ................................................................................... 30
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 31
3.1 PREPARO DAS NANOPARTÍCULAS ...................................................................................... 31
3.2 DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DE CLOXB EM DIFERENTES MEIOS .......................... 31
3.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOPARTÍCULAS............................................ 32
3.3.1 Distribuição de tamanho .......................................................................................... 32
3.3.2 Potencial Zeta (ζ) ..................................................................................................... 40
3.3.3 Análise morfológica das nanopartículas .................................................................. 41
CAPÍTULO II - PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCÁPSULAS E
NANOESFERAS CONTENDO CLOXACILINA BENZATINA E ESTUDO EM MODELO
DE PERFUSÃO DE ÚBERE BOVINO ISOLADO...................................................................... 48
1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 49
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................. 49
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................... 50
3.1 MATERIAIS ......................................................................................................................... 50
3.2 PREPARO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOPARTÍCULAS ......................... 50
3.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FÁRMACO ENCAPSULADO .................................................. 51
3.3.1 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação ............................................................ 51
3.4
ANÁLISE VISUAL E FOTOMICROGRAFIA DE NANOPARTÍCULAS .................................... 53
3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS NANOPARTÍCULAS .............................................................. 53
3.6 SOLUBILIDADE DA CLOXB EM PBS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE LEITE.............. 53
3.7 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE LIBERAÇÃO IN VITRO ................................................... 54
3.8 INTERAÇÃO DE NANOCÁPSULAS COM A GLÂNDULA MAMÁRIA EM MODELO DE PERFUSÃO
DE ÚBERE BOVINO ISOLADO
.......................................................................................................... 56
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 58
4.1 PREPARO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOPARTÍCULAS ......................... 58
4.2 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FÁRMACO ENCAPSULADO .................................................. 62
4.2.1 Porcentagem e Eficiência de encapsulação ............................................................. 62
4.3 ANÁLISE VISUAL E DE MICROSCOPIA ÓPTICA DAS NANOPARTÍCULAS .............................. 65
viii
4.4 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS NANOPARTÍCULAS .............................................................. 68
4.5 SOLUBILIDADE DA CLOXB EM PBS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE LEITE.............. 74
4.6 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE LIBERAÇÃO IN VITRO ................................................... 75
CAPÍTULO III - LIOFILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS ............................................. 83
1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 84
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................. 84
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................... 85
3.1 MATERIAIS ......................................................................................................................... 85
3.2 PREPARO DE NANOPARTÍCULAS ......................................................................................... 85
3.5 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FÁRMACO ENCAPSULADO .................................................. 87
3.6 ANÁLISE MORFOLÓGICA DE FORMULAÇÕES LIOFILIZADAS ............................................. 87
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 88
4.1 LIOFILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS ................................................................................ 88
4.1.1 Tamanho médio de nanopartículas liofilizadas ....................................................... 88
4.1.2 Determinação do teor de fármaco encapsulado ...................................................... 94
4.1.3 Análise morfológica de nanopartículas liofilizadas ................................................. 98
CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 107
ANEXO I .................................................................................................................................... 110
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 114
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática de nanocápsulas (NC) e nanoesferas (NS) poliméricas: a)
fármaco dissolvido no núcleo oleoso das NC; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC; c)
fármaco retido na matriz polimérica das NS; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na
matriz polimérica das NS (adaptado de Schaffazick et al., 2003a). ... Erro! Indicador não definido.
Figura 2: Representação esquemática do polímero poli-ε-caprolactona (PCL)Erro! Indicador não
definido.
Figura 3: Representação esquemática do polímero quitosana (QUI) . Erro! Indicador não definido.
Figura 4: Representação esquemática das junções oclusivas.............. Erro! Indicador não definido.
Figura 5: Esquema da glândula mamária bovina (Sandholm et al., 1995)Erro!
Indicador
não
definido.
Figura 6: Estrutura química da Cloxacilina Benzatina (CloxB) ......... Erro! Indicador não definido.
Figura 7: Representação esquemática de um liofilizador e do processo de secagem (adaptado de
Araújo,2009). ...................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 8: Estrutura química da sacarose (a) e da glicose (b) .............. Erro! Indicador não definido.
Figura 9: Etapas do Preparo de Nanocápsulas e Nanoesferas. 1) A solução orgânica é vertida na
solução aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por 10 minutos; 3) O solvente e o
excesso de água são evaporados.*No preparo de nanoesferas não são adicionados óleo e tensoativo
hidrofóbico. ......................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 10: Esquema representativo da dupla camada elétrica ............ Erro! Indicador não definido.
Figura 11: Representação esquemática da constituição de nanoesferas (a) e nanocápsulas
bioadesivas (b). ................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 12: Representação esquemática da organização do tween 80 entre as fases aquosa e orgânica
(a). Adaptado de Baldursdottir et al, 2011. Estrutura química do tween 80 (b).Erro! Indicador não
definido.
Figura 13: Estrutura química do Span 80............................................ Erro! Indicador não definido.
Figura 14: Estrutura química do Epikuron 170® ................................ Erro! Indicador não definido.
Figura 15: Imagens de MFA de nanoesferas brancas, altura (a) e fase (b). Escaneamento de 5 μm x
5 μm. Z range: 200nm. É demonstrada a estrutura esférica das nanoesferas, com superfície irregular.
............................................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 16: Imagens de fase de MFA de nanoesferas brancas. Escaneamento de 5 x 5 μm. É possível
visualizar a forma esférica das partículas e sua superfície irregular. .. Erro! Indicador não definido.
x
Figura 17: Imagens de MFA de nanoesferas brancas em zoom, altura (a), fase (b) e amplitude (c).
Escaneamento de 1.2 μm x 1,2 μm. Z range: 200 nm. É destacada a superfície irregular da
nanoesfera. .......................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 18: Imagem de MFA de nanoesferas brancas (a) e perfil topográfico (b) demonstrando altura
das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis). Relação d/h= 4,9.Erro! Indicador não
definido.
Figura 19: Imagem de MFA de nanocápsulas brancas, altura (a) e imagem de fase (b).
Escaneamento de 3 μm x 3 μm. Z range: 200 nm. .............................. Erro! Indicador não definido.
Figura 20: Imagem em 3D de nanocápsulas brancas analisadas por MFA. Escaneamento de 5 x 5
μm. Z range: 200nm. ........................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 21: Imagem de MFA de nanocápsulas brancas, imagem de fase (a) e amplitude (b) de
amostras preparadas em superfície de parafilm. Escaneamento 5 μm x 5 μm.Erro! Indicador não
definido.
Figura 22: Imagem de MFA de nanoesferas brancas (a) e perfil topográfico (b) demonstrando altura
das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis). Relação d/h = 7,1.Erro! Indicador não
definido.
Figura 23: Representação esquemática das dosagens de CloxB nas formulações de NC e NS para
determinação de porcentagem e eficiência de encapsulação. ............. Erro! Indicador não definido.
Figura 24: Representação esquemática da extração de CloxB em amostras de leite.Erro! Indicador
não definido.
Figura 25: Estabilidade no armazenamento referente ao diâmetro médio de NS recém-preparadas e
após 90 dias (4ºC). Volume final das formulações: 5 mL. *Aumento significativo de tamanho após 2
meses (p<0,05) utilizando teste ANOVA............................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 26: Estabilidade no armazenamento referente ao diâmetro médio de NC recém-preparadas e
após 90 dias (4ºC). Volume final das formulações: 5 mL. *Aumento significativo de tamanho após 2
meses (p<0,05) utilizando teste ANOVA............................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 27: Fotografia de nanoesferas, com destaque para a formação de precipitado provocado pelo
aumento da concentração de fármaco à formulação. (a) NsC (1,0 mg/mL de CloxB) e (b) NsG (7,0
mg/mL de CloxB). .............................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 28: Fotografia de duas nanoesferas, comparando duas formulações com a mesma
composição, mas com diferentes concentrações de fármaco. (a) NsC contendo 1,0 mg/mL de
CloxB, sem precipitado aparente e (b) NsF contendo 5,0 mg/mL de CloxB, com precipitado
aparente. .............................................................................................. Erro! Indicador não definido.
xi
Figura 29: Fotografia de nanocápsulas, com destaque para a formação de precipitado provocado
pelo aumento da concentração de fármaco à formulação. (a) NcC (1,0 mg/mL de CloxB), (b) NcG
(7,0 mg/mL de CloxB) e (c) NcI (10,0 mg/mL de CloxB). ................ Erro! Indicador não definido.
Figura 30: Fotomicrografia de nanoesferas, em que é possível comparar uma NsC em que não há
formação de precipitado (a) e uma NsG em que há formação de precipitado (b). Destaca-se a
visualização de agregados, atribuídos às nanopartículas e ao fármaco, na imagem b. ................ Erro!
Indicador não definido.
Figura 31: Fotomicrografia de nanocápsulas, em que é possível observar cristais, atribuídos à
precipitação da CloxB. (a) NcG e (b) NcI. ......................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 32: Imagem de MFA de nanoesferas, altura (a) e imagem de fase (b). Escaneamento 10 μm x
10 μm. Z range: 200 nm. Observa-se grande número de partículas com tamanhos variados. ..... Erro!
Indicador não definido.
Figura 33: Imagem de altura de MFA de nanoesferas contendo 0,5 mg/mL de CloxB (a) e perfil
topográfico (b) demonstrando altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis e
verdes).Relação d/h = 5,1.................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 34: Imagem tridimensional de nanocápsulas contendo 0,5 mg/mL de CloxB analisadas por
MFA. Escaneamento de 5 x 5 μm. Z range: 200nm. .......................... Erro! Indicador não definido.
Figura 35: Imagens de MFA de fase de NS destacando escurecimento das NP com a passagem
sucessiva da sonda (a, b,c,d). Escaneamento 10 μm x 10 μm. Z range: 341 nm.Erro! Indicador não
definido.
Figura 36: Imagem MFA de NS, fase, destacando a superfície irregulares da NS com 0,5 mg/mL de
CloxB e seu escurecimento pela passagem sucessiva da sonda (a, b, c). Escaneamento 1,5 μm x 1,5
μm. Z range: 341 nm. .......................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 37: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NC com 1,0 mg/mL de CloxB, destacando
escurecimento das NP com a passagem sucessiva da sonda (a, b,c,d). Escaneamento 10 μm x 10
μm. Z range: 400 nm. .......................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 38: Imagem de MFA de NC contendo 1,0 mg/mL de CloxB (a) e perfil topográfico (b)
demonstrando altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis e verdes). Relação
d/h = 7,5. ............................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 39: Perfil de liberação in vitro de NP (NS 1,0mg/mL e NC 1,0mg/mL) a 37ºC em PBS em
condições sink (2,5% da solubilidade máxima de CloxB em PBS). Gráfico maior = tempos de 0 a
2880 minutos; Gráfico menor= tempos de 0 a 180minutos. ............... Erro! Indicador não definido.
Figura 40: Perfil de liberação in vitro de NP (NS 1,0mg/mL e NC 1,0mg/mL) a 37ºC em PBS+ 70%
leite em condições sink (2,5% da solubilidade máxima de CloxB em PBS+leite). Gráfico maior =
xii
tempos de 0 a 2880 minutos; Gráfico menor= tempos de 0 a 180minutos.Erro!
Indicador
não
definido.
Figura 41: Interação de NC em modelo de perfusão de úbere bovino. Glândula mamária fixada em
suporte de metal para experimento ex vivo (a), cortes histológicos representativos de tecido
mamário em microscopia de campo brilhante (b1 e c1) e de fluorescência (b2 e c2). Corte de tecido
controle (sem NC) (b1 e b2) e cortes de tecido da glândula mamária a 5, 10 e 15 cm da base do teto
após 6 horas de administração intramamária de NC de quitosana contendo CloxB (c1 e c2). As setas
vermelhas indicam os ductos galactóforos. Destaca-se a fluorescência visualizada em todos os
cortes de 5, 10 e 15 cm, demonstrando presença de NC nas regiões tanto proximais quanto distais
da base do teto. Barra = 0,15mm. ....................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 42: Imagens de MFA de altura (a e c) e fase (b e d) de NS com 1,0 mg/mL de CloxB.
Destaque para as estruturas esféricas tanto antes (a e b) quanto após a liofilização (c e d).
Escaneamento 20 μm x 20 μm (a e b) e 10 μm x 10μm (c e d). Z range: 500 nm (a e b) e 1000nm (c
e d)....................................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 43: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NS liofilizadas e ressuspendidas em água,
destacando manchas claras, atribuídas ao crioprotetor sacarose, sobre as quais estão depositadas
algumas NS . Escaneamento 30 x 30 μm. Z range: 1000 nm. ............ Erro! Indicador não definido.
Figura 44: Imagens de MFA de altura de NS liofilizadas, após ressupensão em água, destacando
manchas claras, atribuídas ao crioprotetor sacarose. Escaneamento 30 x 30 μm. Z range: 1000 nm.
............................................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 45: Imagem tridimensional de NS analisadas por MFA antes (a) e após a liofilização (b).
Destaque para a diferença de topografia das NS, com essas “mergulhadas” em crioprotetor (b),
sendo possível visualizar somente as pontas das NS. Escaneamento de 10 x 10 μm. Z range: 200nm.
............................................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 46: Imagens de MFA de altura (a e c) e fase (b e d) de NC com 1,0 mg/mL de CloxB.
Destaque para as estruturas esféricas tanto antes (a e b) quanto após a liofilização (c e d).
Escaneamento 15 μm x 15 μm (a e b) e 10 μm x 10 μm (b e c). Z range: 500 nm (a e b) e 2000nm (c
e d). Destaca-se a formação de nuvem de crioprotetor sob as NC (d). Erro! Indicador não definido.
Figura 47: Imagem tridimensional de NC analisadas por MFA antes (a) e após a liofilização (b).
Destaque para a diferença de topografia das NC, com aparente achatamento de algumas das
partículas após liofilização (b). Escaneamento de 15 x 15 μm. Z range: 500nm.Erro!
Indicador
não definido.
Figura 48: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NC liofilizadas e ressuspendidas em água,
destacando aproximação das partículas, sem agregação/fusão. Escaneamento 3 x 3 μm. Z range:
1500 nm............................................................................................... Erro! Indicador não definido.
xiii
Figura 49: Imagem tridimensional de NC analisadas por MFA após a liofilização. Não ocorre
agregação das NC devido ao recobrimento pela sacarose. Escaneamento de 3 x 3 μm. Z range:
1500nm................................................................................................ Erro! Indicador não definido.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Diferentes tipos de nanocarreadores e algumas de suas funções (adaptado de Kanwar et
al., 2011) ............................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Tabela 2: Efeito das concentrações de polímeros no tamanho médio de nanoesferasErro! Indicador
não definido.
Tabela 3: Efeito da presença de Tween 80 no tamanho médio de nanoesferasErro! Indicador não
definido.
Tabela 4: Efeito do Volume final de solvente no preparo das NP no tamanho médio de NS ..... Erro!
Indicador não definido.
Tabela 5: Comparação do tamanho médio de nanocápsulas em relação à variação na concentração
de polímeros PCL e Quitosana............................................................ Erro! Indicador não definido.
Tabela 6: Efeito do tipo de surfactante hidrofílico no tamanho médio de nanocápsulas ............. Erro!
Indicador não definido.
Tabela 7: Efeito do tipo de óleo e concentração do surfactante hidrofóbico no tamanho médio de
NC ....................................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Tabela 8: Comparação das propriedades de tamanho de nanocápsulas em relação à variação do tipo
de óleo e variação da concentração de surfactante hidrofóbico .......... Erro! Indicador não definido.
Tabela 9: Potencial zeta de formulações estáveis de NC e NS brancasErro!
Indicador
não
definido.
Tabela 10: Tamanho médio de NS e NC brancas analisadas por ECF e MFAErro! Indicador não
definido.
xiv
Tabela 11: Efeito das variações de concentrações de Cloxacilina Benzatina no tamanho das NS
............................................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Tabela 12: Efeito da concentração de Cloxacilina Benzatina no tamanho de NCErro!
Indicador
não definido.
Tabela 13: Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NS com variadas
concentrações de CloxB ...................................................................... Erro! Indicador não definido.
Tabela 14: Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NC com variadas
concentrações de CloxB ...................................................................... Erro! Indicador não definido.
Tabela 15: Tamanho médio de NS e NC com 1,0 mg/mL de CloxB analisadas por ECF e MFA
............................................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Tabela 16: Solubilidade da CloxB em diferentes meios ..................... Erro! Indicador não definido.
Tabela 17: Modelização dos mecanismos de liberação de fármacos a partir de sistemas poliméricos
de liberação controlada considerando as diferentes geometrias ......... Erro! Indicador não definido.
Tabela 18: Parâmetros cinéticos de liberação resultantes da aplicação dos modelos matemáticos de
Higuchi e Korsmeyer-Peppas aos dados de liberação da CloxB a partir de NC e NS. ............... Erro!
Indicador não definido.
Tabela 19: Formulações liofilizadas com variadas concentrações de crioprotetoresErro! Indicador
não definido.
Tabela 20: Variação do tamanho médio e índice de polidispersão de nanoesferas congeladas a -80ºC
ou a -196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.Erro! Indicador
não definido.
Tabela 21: Tamanho médio e índice de polidispersão de nanocápsulas congeladas a -80ºC ou a 196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetoresErro! Indicador não
definido.
Tabela 22: Porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) de nanoesferas congeladas a -80ºC ou a 196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetoresErro! Indicador não
definido.
Tabela 23: Porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) de nanocápsulas congeladas a -80ºC ou a
-196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetoresErro! Indicador não
definido.
Tabela 24: Medida de potencial zeta de nanopartículas antes e após a liofilizaçãoErro!
Indicador
não definido.
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
ζ – Potencial zeta
% D – Porcentagem dissociada
% NL – Porcentagem não liberada
CaCl2 – Cloreto de Cálcio
xvi
CO2 – Dióxido de Carbono
H2O - Água
KCl – Cloreto de potássio
MgCl2 – Cloreto de Magnésio
NaCl – Cloreto de sódio
NaH2PO4 – Diidrogenofosfato de sódio
NaHCO3 – Hidrogenocarbonato de sódio (Bicarbonato de sódio)
O2 – Gás oxigênio
ANOVA – Análise de Variância
ALD – Anemometria do Laser Doppler
CETEC-MG - Centro Tecnológico de Minas Gerais
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
CLOXB - Cloxacilina benzatina
DAD – Detector de Arranjo de Diodos
D/h – Relação diâmetro/altura
DL50 – Dose letal para 50% do grupo estudado
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DP – Desvio padrão
ECF – Espectroscopia de correlação de fótons
EE – Eficiência de encapsulação
FITC – Fluoresceína isotiocianato
HPLC – “High Performance Liquid Chromatography” ou cromatografia líquida de alta
eficiência
IP – índice de polidispersão
LDH – Lactato desidrogenase
MFA – Microscopia de Força Atômica
mV - millivolts
MM – Massa molar
NC – Nanocápsulas
NP - Nanopartícula
Nc G – Nanocápsulas contendo glicose como crioprotetor
Nc S – Nanocápsulas contendo sacarose como crioprotetor
NS – Nanoesferas
Ns G – Nanoesfera contendo glicose como crioprotetor
xvii
Ns S – Nanoesfera contendo sacarose como crioprotetor
QUI – Quitosana
PBS – Tampão fosfato salino
PCL – Poli-e-caprolactona
PCL-NP – Nanopartícula de poli-ε-caprolactona convencional
PCL-QUIT-NP – Nanopartícula de poli-ε-caprolactona revestida com quitosana
PLGA – Ácido poli-lático-co-glicólico
pH – Potencial hidrogeniônico
PI – Índice de polidispersão
PLA – Ácido polilático
p/v – Porcentagem peso por volume
PVA – Ácido polivinílico
rpm – Rotações por minuto
xviii
RESUMO
xix
Este trabalho trata do desenvolvimento farmacotécnico e da caracterização físico-química de
formulações nanoestruturadas destinadas ao encapsulamento de cloxacilina benzatina, um
antimicrobiano de uso veterinário. Objetivou-se a otimização de formulações estáveis de
nanocápsulas (NC) e nanoesferas (NS) contendo o polímero poli-ε-caprolactona (PCL) e revestidas
com quitosana (QUI), um polímero com carga positiva, a fim de se obter uma formulação com
capacidade bioadesiva de administração intramamária da cloxacilina benzatina (CloxB). A
distribuição de tamanho médio das nanopartículas (NP) e o índice de polidispersão foram
determinados por espectroscopia de correlação de fótons e a morfologia por microscopia de força
atômica. A carga superficial foi determinada por anemometria de laser Doppler associada à
microeletroforese. A associação do fármaco às nanoestruturas e a cinética de liberação in vitro
foram determinados por duas diferentes técnicas de diálise e o fármaco quantificado por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As suspensões de nanocápsulas e de nanoesferas
foram preparadas pelo método de deposição interfacial de polímeros pré-formados seguido de
evaporação do solvente, conhecido como nanoprecipitação. Foram avaliadas as influências de
polímeros (quitosana e poli-ε-caprolactona), de tensoativos (lecitina e tween 80), do tipo de óleo e
do volume final sobre as características físico-químicas das suspensões coloidais. Foram obtidas
formulações de nanopartículas estáveis e monodispersas no encapsulamento da CloxB. A variação
na proporção de polímeros (0,5-2,0% de PCL e 0,05-1,0% de QUI) e a ausência de surfactantes
conduziram a uma alteração significativa no tamanho das partículas. Para as NP otimizadas foi
observado que o aumento na concentração do fármaco influencia significativamente (p<0,05) sua
carga superficial (variação de +52 a -3,5 mV para NS e de +41,3 a -28,2 mV para NC) e leva a uma
redução na estabilidade da partícula e aumento do tamanho médio (variação de 230,8 a 897,2 nm
para NS e de 263,7 a 429,1nm para NC). Essa alteração na carga superficial compromete a
estabilidade da suspensão coloidal e induz a agregação. A encapsulação máxima de CloxB nas NP
foi de 3 mg/mL sem causar efeitos de redução da eficiência de encapsulação e instabilidade do
colóide. O estudo de solubilidade da CloxB em diferentes meios mostrou elevada solubilidade em
tampão fosfato salino (PBS) (0,713 mg/mL) e em meio PBS contendo 70% de leite (1,071 mg/mL).
A liberação do fármaco a partir das nanoestruturas em 6h foi de 80% no meio PBS, entretanto em
48h somente 70% foi liberado na presença de 70% de leite no meio.. Os melhores resultados no
processo de liofilização das NP de CloxB ocorreram na condição de congelamento a -196ºC com o
uso de 25% (p/p) de sacarose. Foi feito um estudo de distribuição de NC em glândula mamária
bovina, utilizando QUI marcada com fluoresceína. As imagens mostraram ampla distribuição da
NC na glândula, indicando que as nanoparticulas podem apresentar propriedades de bioadesividade,
mesmo nas regiões proximais do úbere (15 cm da base do teto). Foi também realizado o
desenvolvimento e a validação da metodologia analítica para doseamento do estolato de
xix
eritromicina por CLAE, outro antibiótico utilizado no tratamento da mastite bovina, com objetivo
de encapsulamento. O método validado foi preciso (CV intradia de 013-1,56% e CV interdia de
0,37-2,16%) e exato (98,85-104,06%). O estudo de porcentagem e eficiência de encapsulação do
estolato de eritromicina foi realizado na concentração de 1,0 mg/mL de fármaco em NS e NC,
conforme formulação otimizada. Os resultados mostraram uma porcentagem de encapsulação de
43,30% nas NS e 44,25% nas NC e uma eficiência de encapsulação de 38,83% e 43,07%,
respectivamente. Este estudo demonstrou a viabilidade e o potencial interesse no uso de sistemas
nanométricos para encapsulação de antibióticos de administração intramamária no tratamento da
mastite bovina.
xix
xix
ABSTRACT
xxii
The
present
work
describes
pharmaceutical
and
physico-chemical
characterization
of
nanostructured formulations, intending to the encapsulation of cloxacillin benzathine, an antibiotic
used in veterinary. Stable formulations of nanocapsules (NC) and nanospheres (NS) were developed
with poly-ε-caprolactone (PCL) coated with chitosan (QUI).The average size distribution of
nanoparticles (NP) and their polydispersity were determined by photon correlation spectroscopy.
Morphology was determined by Atomic Force Microscopy and surface charge were determined by
Microeletrophoresis associated to Laser Doppler Anemometry. The drug quantification was
performed by high performance liquid chromatography (HPLC) and release kinetics in vitro studies
were done by two dialysis methods Suspensions of NC and NS were prepared by interfacial
deposition of preformed polymers followed by solvent displacement, also called nanoprecipitation.
The influence of polymers (PCL and QUI), surfactants types (lecithin and tween 80), the type of oil
used and the final volume, on the physic-chemical properties of colloidal suspensions were
evaluated. The results showed development of stable and monodispersed formulations of NP, which
were used for the encapsulation of CloxB. The variation in polymer proportion (0.5-2.0% of PCL
and 0.05-1.0% of QUI) and the % of surfactants resulted in significant changes in particle size. It
was observed that increases in drug concentration leads to reduction in particle stability with PCLQUI NP, which also influences significantly (P<0.05) their surface charges (+52 to -3.5 mV for NS
and +41.3 to -28.2 mV for NC), and particle hydrodynamic diameter (from 230.8 to 897.2 nm for
NS and from 263.7 to 429.1 nm for NC). These changes in surface charges compromises the
stability of the colloidal suspensions and induces aggregation. Maximum CloxB encapsulation in
NP was 3 mh/ml, and an increase in this concentration induces colloidal instability. CloxB present
high solubility in PBS (7,13 mg/ml) and in medium with 70% of whole milk (1,07 mg/ml). In vitro
release kinetics in PBS show a release higher than 80% in 6 hours and higher than 70% in PBS
media with milk after 48 hours. PCL-QUI NP containing CloxB were lyophilized using two
cryoprotectants (glucose and sucrose) and two freezing conditions (-80oC and -196oC). The best
results were obtained with sucrose for both NP freezing at -196oC. A study of NC interaction in
perfused bovine isolated udder were conducted, with NC coated with QUI covalently linked to
phthalocyanine isothiocyanate (FITC). The images showed the distribution of NC up to proximal
udder regions (15 cm from teat canal base), indicating that NC were able to go against mammary
gland flow achieving higher sites of the udder, where conventional formulations usually do not
reach adequate concentrations for mastitis treatment. These findings indicate the viability of
nanoparticulate dosage form to treat mastitis in catle.
INTRODUÇÃO
RAQUEL, GC
INTRODUÇÃO GERAL
A utilização de vetores com o objetivo de controlar a liberação de fármacos em sítios
de ação específicos, otimizando o regime de dosagem e a velocidade de cedência de substâncias,
tem sido alvo de intensas pesquisas na área farmacêutica nos últimos anos (Espuelas et al., 1997;
Legrand et al., 2007; Bilensoy et al., 2008). Dentre esses vetores, incluem-se as micropartículas e
os sistemas coloidais, como lipossomas e nanopartículas poliméricas (Schaffazik et al., 2003).
As nanopartículas poliméricas são sistemas carreadores de fármacos com diâmetro
inferior a 1μm. Dentre os principais sistemas nanoestruturados encontram-se os lipossomas e as
nanopartículas (nanocápsulas e nanoesferas) (Schaffazik et al., 2003). As nanocápsulas (NC) e as
nanoesferas (NS) diferem entre si quanto à composição e organização estrutural. As NC são
sistemas do tipo reservatório, constituídos por núcleo revestido por uma camada externa polimérica,
com surfactantes lipofílicos e/ou hidrofílicos em sua interface. Inicialmente o núcleo das NC era
oleoso, permitindo a encapsulação de substâncias lipossolúveis. Mais recentemente foram
desenvolvidas NC com núcleo aquoso, para encapsulamento de substâncias hidrossolúveis
(Vauthier et al., 2008). As NC podem carrear o fármaco dissolvido no núcleo e/ou adsorvido à
membrana polimérica. Por outro lado, as NS são sistemas constituídos por uma matriz polimérica
na qual o fármaco pode estar retido e/ou adsorvido (Mora-Huertas et al., 2010; Rao et al., 2011).
Vários requisitos devem ser levados em consideração no desenvolvimento de
nanopartículas (NP) como carreador de fármacos. Dentre tais requisitos podemos citar: o tamanho
de partículas, as suas propriedades de superfície e a liberação das substâncias farmacologicamente
ativas, a fim de se obter a ação do fármaco no local específico desejado, com um aprimoramento da
terapêutica e da posologia e diminuição dos efeitos tóxicos (Mohanraj et al., 2006).
A vetorização de fármacos antimicrobianos para humanos e, mais recentemente, para
uso animal é uma área promissora dentro da nanotecnologia. Uma das vantagens da vetorização de
antimicrobianos em nanopartículas poliméricas é a possibilidade de aumentar a dose máxima
tolerada e o índice terapêutico (Pinto-Alphandary et al., 2000; Schiffelers et al., 2001), devido à
liberação e disposição modificadas do antimicrobiano quando encapsulado, bem como por uma
modificação na sua biodistribuição (Irache et al., 2011). Há relatos na literatura sobre
encapsulamento de antibióticos de uso humano e veterinário como ampicilina em nanopartículas
para tratamento de infecção por Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes, cujos
experimentos foram realizados em camundongos (Fattal et al., 1991). A gentamicina foi
encapsulada em nanopartículas de PLGA para tratamento da brucelose, causada por Brucella spp
(Prior et al., 2002 e 2006; Lecaroz et al. 2006). Rifampicina, isoniazida e pirazinamida foram
2
RAQUEL, GC
encapsuladas em nanopartículas de PLGA, apresentando liberação sustentada e considerável
melhora na eficácia após administração oral (Pandey et al. 2003).
Uma afecção que poderia se beneficiar dessa tecnologia é a mastite bovina, uma
inflamação da glândula mamária causada principalmente por bactérias. Esta doença provoca uma
redução na produção e qualidade do leite, resultando em perdas econômicas consideráveis em todo
mundo, o que favorece o desenvolvimento de estratégias de controle da doença (Gehring et al.,
2006). Diferentes classes de antibióticos e suas combinações são utilizadas para o tratamento de
mastite (Gruet et al., 2001) e a permanência de resíduos desses no leite está associada ao número de
doses administradas, do veículo utilizado, da via de aplicação e da concentração de antibiótico
utilizada.
A cloxacilina benzatina é um antibiótico β-lactâmico usado clinicamente na
terapêutica veterinária devido à sua atividade antibacteriana gram-positiva. Este fármaco é utilizado
no tratamento e prevenção de mastite bovina causada por bactérias do gênero Staphylococcus
(Perez et al., 1997). A cloxacilina benzatina foi escolhida pela equipe da Embrapa Gado de Leite,
por não apresentar histórico de resistência bacteriana no banco de isolados de mastite da Embrapa
há aproximadamente 10 anos. Além disso, o sal benzatino faz com que a CloxB apresente menor
solubilidade em água em relação à cloxacilina, o que maximiza a taxa de encapsulação em
nanopartículas (Embrapa, 2009). A vetorização da cloxacilina benzatina objetiva a obtenção de uma
nova forma farmacêutica de administração do antibiótico e de tratamento da mastite, mantendo-se a
via de administração convencional, intramamária, obtendo-se concentrações elevadas do fármaco
no local da infecção, com redução na absorção sistêmica, diminuição da dose e dos efeitos adversos,
diminuição de resíduo do antibiótico no leite, além do aumento da retenção do fármaco no úbere
bovino. Para tal, foram desenvolvidas e caracterizadas físico-quimicamente e quanto à eficiência de
encapsulação e perfil de liberação do fármaco, nanocápsulas e nanoesferas destinadas ao
encapsulamento de cloxacilina benzatina, utilizando-se os polímeros poli-ε-caprolactona e
quitosana. O interesse pela quitosana têm sido crescente nos últimos anos, por ser um polímero
abundante na natureza e por suas propriedades de mucoadesividade e aumento de permeabilidade
das membranas, características que tornam esse polímero um forte candidato à produção de
nanopartículas com carga superficial positiva e mucoadesivas (Ilum, 1998).
O estolato de eritromicina é um antibiótico pertencente ao grupo dos macrolídeos
usado clinicamente na terapêutica humana e veterinária devido à sua atividade contra cocos grampositivos, tais como Staphylococcus aureus (Abu-Gharbieh et al., 2004). É um fármaco utilizado no
tratamento da mastite bovina e foi escolhido pela equipe da Embrapa Gado de Leite devido à sua
baixa solubilidade em água, baixo custo e facilidade de aquisição.
3
RAQUEL, GC
Diante do exposto, este trabalho visa à obtenção e caracterização de formulações
nanoestruturadas coloidais estáveis, que poderão, posteriormente, contribuir para o controle e
tratamento mais eficaz da mastite bovina.
4
RAQUEL, GC
REVISÃO DE LITERATURA
1 - Sistemas Vetorizados
Nas últimas décadas estudos têm demonstrado que uma abordagem eficaz para
aperfeiçoar a ação farmacológica de fármacos, é associar a molécula ativa a um sistema de liberação
nanoestruturado (Tabela 1) (Piñon-Segundo et al, 2005). A nanotecnologia vem sendo aplicada no
desenvolvimento desses sistemas de liberação controlada, que muitas vezes veiculam fármacos com
aplicação no tratamento do câncer, de doenças parasitárias, entre outras patologias (Mohanraj et al,
2006). É consenso que a utilização de sistemas coloidais nanoestruturados, tais como os lipossomas,
nanoemulsões e nanopartículas poliméricas, tornou-se uma alternativa que visa alterar a
biodistribuição de fármacos após administração por diferentes vias. O sistema de liberação vetororientado tem o potencial de aumentar o índice terapêutico de diversos fármacos já disponíveis no
mercado, aumentando sua eficácia, prevenindo a degradação ou inativação durante o trânsito até o
sítio alvo, atingindo níveis plasmáticos constantes por um longo período e protegendo o corpo de
reações adversas devido à distribuição inapropriada (Banker & Rhodes, 1996). Finalmente, esses
sistemas também podem facilitar o desenvolvimento de sistemas de liberação multifuncionais com
aplicações terapêuticas e de diagnóstico (Alexis et al, 2008).
Dentre os sistemas de liberação controlado, também conhecidos como vetores,
incluem-se as micropartículas, os sistemas lipídicos (lipossomas e emulsões submicronicas) e
particulados coloidais (nanoesferas e nanocápsulas poliméricas).
Nanopartículas poliméricas (NP) são sistemas coloidais preparados a partir de
polímeros naturais ou sintéticos (Brigger et al, 2002; Reis et al, 2006). Esses vetores podem sofrer
manipulação de suas propriedades de superfície visando atingir órgãos ou tecidos específicos, além
de poderem atuar como carreadores de fármacos, vacinas, proteínas, peptídeos e DNA (Soppimath
et al, 2001; Hans et al, 2002).
5
RAQUEL, GC
Tabela 1: Diferentes tipos de nanocarreadores e algumas de suas funções (adaptado de Kanwar et
al., 2011)
Nome
Composição
Perspectivas e usos
Ref.
Nanopartículas
poliméricas
Polímeros
biodegradáveis
e/ou
biocompatíveis
Permitem maior controle da
farmacocinética do fármaco
carreado, gerando níveis mais
constantes dos mesmos
Rawa et
al., 2008;
Mahidhar
a et al.,
2011
Nanopartículas
lipídicas sólidas
Lipídeos
sólidos
Podem ser usadas como
adjuvantes em vacinas e como
agentes para transfecção nãoviral
Mehnert
& Mader,
2001
Nanopartículas
funcionalizadas
Metais
inorgânicos,
anticorpos,
ligantes
específicos
Pode-se
incorporar
propriedades fluorescentes para
uso
como
biossensores;
também usadas como marcador
em biologia molecular e no
direcionamento de fármacos
específicos.
Schneider
et al.,
2000
Lipossomas
Lipídeos
anfifílicos
Alteram
o
perfil
farmacocinético de fármacos
encapsulados.
Rawa et
al., 2006
Polímeros
dibloco
anfifílicos
Formadas
em
meio
hidrofóbico, adequadas para
carrear fármacos insolúveis em
água devido à composição do
núcleo.
Miyata et
al, 2011
Dendrímeros
Tamanho nanométrico, fácil
modificação e preparo. Usadas
Monômeros do
como agentes de revestimento,
tipo ABn
protegendo e direcionando
fármacos para vários sítios.
Choi et
al., 2005
Nanotubos de
carbono
Composto de
fulerenos
(C60) e/ou
outros
carbonos,
formando
estruturas ocas
Foley et
al., 2002;
Martin et
al., 2003
Micelas
poliméricas
Estrutura
Aumentam o volume interno e
podem modificar facilmente
superfícies internas e externas.
Com uma camada são usados
no direcionamento de genes e
fármacos; com duas camadas,
na transfecção.
6
As NP poliméricas apresentam diâmetro inferior a 1μm e, dependendo do método de
preparo e das matérias-primas utilizadas, podem ser obtidas nanocápsulas (NC) ou nanoesferas
(NS) (Figura 1) (Irache et al, 2011, Rao et al, 2011). As NC são sistemas reservatório, constituídas
de um núcleo oleoso ou aquoso revestido por uma parede externa polimérica, contendo surfactantes
lipofílicos e/ou hidrofílicos em sua interface (Schaffazick et al, 2003a). Quando se objetiva
encapsular fármacos lipofílicos, diversos tipos de óleos podem ser utilizados, de origem vegetal ou
mineral. O principal determinante para a escolha do fármaco é a solubilidade deste no óleo ou meio
aquoso a ser utilizado. Por outro lado, as NS são sistemas matriciais, que, portanto, não apresentam
núcleo em sua estrutura. Na matriz das NS o fármaco pode estar adsorvido ou retido (Schaffazick et
al, 2003a). A nanoencapsulação tornou-se uma estratégia adequada para aumentar a
biocompatibilidade e a dispersão em escala nanométrica de compostos lipofílicos em meio aquoso e
biológico (Deda et al, 2009).
Figura 1: Representação esquemática de nanocápsulas (NC) e nanoesferas (NS) poliméricas: a)
fármaco dissolvido no núcleo oleoso das NC; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC; c)
fármaco retido na matriz polimérica das NS; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na
matriz polimérica das NS (adaptado de Schaffazick et al., 2003a).
As nanopartículas (NP) poliméricas oferecem algumas vantagens específicas em
relação aos lipossomas, tais como melhor estabilidade em fluidos biológicos e durante
armazenamento, viabilizam liberação sustentada de fármacos e são aplicáveis à maioria das vias de
administração (Vila et al, 2002). Embora os lipossomas tenham sido, e ainda sejam, utilizados como
carreadores de fármacos, a sua produção ainda é limitada devido à algumas desvantagens, como:
baixa estabilidade durante o armazenamento que leva à agregação e fusão das partículas e,
principalmente o custo elevado de fosfolipídios utilizados na formulação (Mozarafi, 2005).
Os métodos mais comuns de preparo de NP são: emulsificação e evaporação do
solvente, polimerização do monômero, nanoprecipitação e salting-out (Vauthier et al, 2008). A
7
RAQUEL, GC
nanoprecipitação, também conhecida como deposição de um polímero pré-formado seguida de
evaporação do solvente, é uma técnica simples, reprodutível e facilmente transponível para a
produção de nanopartículas em grande escala (Couvreur et al, 2002, Fessi et al, 1989; Legrand et
al, 1999). Este método consiste basicamente em verter uma solução contendo o fármaco e polímero,
dissolvidos num solvente orgânico miscível com a água, numa fase aquosa contendo um tensoativo
hidrofílico como estabilizante. Imediatamente após a injeção, o solvente orgânico difunde-se na
água, dando origem a uma suspensão coloidal de nanoesferas. Para a obtenção de nanocápsulas, um
óleo e um tensoativo lipofílico são adicionados à fase orgânica da preparação. Após a formação das
partículas, as suspensões são submetidas à evaporação para remoção do solvente orgânico e
concentração até volume desejado (Fessi et al, 1989).
No desenvolvimento de NP como sistema de transporte e liberação de fármacos, as
principais características que devem ser controladas são o tamanho das partículas, as propriedades
de superfície e a liberação de substâncias farmacologicamente ativas, a fim de atingir a ação no
local específico, com aprimoramento da posologia e da terapêutica (Mohanraj et al, 2006). Além
das vantagens das nanopartículas já citadas acima, estes sistemas apresentam outros benefícios, do
ponto de vista tecnológico, dentre os quais se destacam: método de preparo simples, alto teor de
encapsulamento de fármacos e viabilidade de encapsular substâncias tanto lipofílicas quanto
hidrofílicas (Peltonen et al, 2004). Tais características das NP possibilitam melhoras na
biodisponibilidade de fármacos, modificação de seus perfis farmacocinéticos, especificidade de
ação com diminuição dos efeitos colaterais, proteção do fármaco contra degradação e penetração
intracelular de substâncias macromoleculares. Aliado a isso, a manipulação das características
físico-químicas e de superfície viabilizam o direcionamento passivo e ativo do fármaco após sua
administração (Irache et al, 2011).
A manipulação das características superficiais de NP por meio do recobrimento com
o polímero quitosana (QUI) é uma alternativa que vem sendo muito estudada como forma de
favorecer a retenção de NP em mucosas epiteliais e possivelmente aumentar a penetração de
fármacos nesses locais (de la Fuente et al, 2010; Mao et al, 2010; Meng et al, 2011) . Visto que em
pH fisiológico a QUI apresenta cargas positivas, devido ao protonamento de seus grupos amino,
pode ocorrer interação eletrostática entre as cargas positivas das partículas recobertas com QUI e as
cargas negativas comuns à mucosa (Calvo et al, 1997), o que caracteriza um fenômeno de
mucoadesividade.
8
RAQUEL, GC
2 - Polímeros utilizados no preparo de nanopartículas
Uma extensa variedade de materiais, tanto naturais quanto sintéticos, vem sendo
empregados no preparo de nanopartículas poliméricas. O polímero ideal deve ser não-tóxico,
biodegradável e/ou biocompatível, facilmente processável e livre de impurezas. Os polímeros
sintéticos (ácidos poli-lático e poli-glicólico, poli-ε-caprolactona, poli-acrilatos) possuem a
vantagem de permitirem a liberação sustentada do fármaco, visto que, em geral apresentam
degradação mais lenta que os polímeros naturais (quitosana, albumina, gelatina) (Irache et al,
2011). O homopolímero de poli-ε-caprolactona (PCL), por exemplo, sofre uma degradação total em
dois a quatro anos (Woodruff et al, 2010), enquanto a QUI é degradada em alguns dias ou meses,
dependendo do seu teor de desacetilação (Kean et al, 2010). Graças aos progressos na química de
polímeros e na físico-química de colóides poliméricos, atualmente é possível preparar NP
poliméricas com diversas propriedades em condições controladas (Couvreur et al, 2006).
O conceito atual da vetorização de fármacos não visa apenas prolongar a duração da
liberação, mas também realizar o controle da distribuição no organismo. O controle do tempo
consiste em alterar a cinética convencional de liberação do princípio ativo, durante o tratamento,
objetivando a liberação sustentada, com possível aumento do intervalo de doses. Já o controle da
biodistribuição visa o direcionamento de um vetor de fármacos para locais desejados, objetivando o
aumento da eficácia do princípio ativo, redução de efeitos colaterais e até mesmo redução da dose a
ser administrada (Brigger et al,2002).
2.1 - Poli-ε-caprolactona
A poli-ε-caprolactona (PCL) é um polímero sintético, produzido a partir da abertura
do anel da ε-caprolactona (Figura 2) e sua posterior polimerização. É um polímero hidrofóbico,
semicristalino, com baixo ponto de fusão (59-64 ºC), temperatura de transição de fase em torno de
60 ºC e com excepcional capacidade de se combinar a outras substâncias (Chang et al, 1986). A
PCL é utilizada em combinação a diversos polímeros, como quitosana, ácidos polilático e
poliglicólico a fim de manipular o perfil de liberação de fármacos em nano e micropartículas
(Chang et al, 1986, Malheiro et al, 2010; Sahoo et al, 2010; Woodruff et al, 2010; Wu et al, 2011).
A degradação da PCL no organismo humano é lenta se comparada a outros polímeros devido à falta
de enzimas apropriadas, o que não significa que este polímero não seja biodegradável (Vert, 2009).
A PCL é degradada em dois estágios: inicialmente, uma degradação hidrolítica não enzimática das
ligações éster e posteriormente, quando a PCL já apresenta menor massa molecular, uma
degradação intracelular. Essa hipótese foi reforçada pela detecção de fragmentos de PCL em
fagossomos de macrófagos (Wooward et al, 1985; Woodruff et al, 2010).
9
RAQUEL, GC
Figura 2: Representação esquemática do polímero poli-ε-caprolactona (PCL)
2.2 - Quitosana
A quitosana (QUI) (Figura 3) é um polímero natural produzido a partir da Ndesacetilação parcial da quitina, componente da parede celular de fungos e do exoesqueleto de
artrópodes.
Possui
características
de
biodegradabilidade
e
biocompatibilidade e baixa
imunogenicidade (Meng et al, 2011), além de ser bastante abundante e ter baixo custo de produção
(Berger et al, 2004). A QUI é metabolizada por algumas enzimas humanas, especialmente a
lisozima. Em pH ácido, seus grupamentos amino estão protonados, transformado-se em um
policátion que lhe confere característica de mucoadesividade.
A mucoadesividade se refere à bioadesividade de substâncias ou partículas ao muco
ou às membranas mucosas (Smart, 2005). Para que a adesão ocorra, as moléculas da substância
devem interagir com a interface, o que pode ocorrer por ligações iônicas, covalentes, de hidrogênio,
ligações de Van-der-Waals e hidrofóbicas. No caso da QUI com membranas mucosas, ocorre
predominantemente a ligação iônica, por meio da atração eletrostática entre as cargas positivas do
polímero e as cargas negativas da superfície de mucosas (Smart, 2005). Este fenômeno torna a QUI
um candidato importante para a liberação de fármacos em mucosas (Sayin et al, 2009; Kean et al,
2010; Kumari et al, 2010). Estudos relatam a baixa toxicidade desse polímero, particularmente via
oral, tendo sido atribuída a DL50 de 16 g/kg em camundongos, um valor semelhante aos de sacarose
e cloreto de sódio (Agnihotri et al, 2004).
10
RAQUEL, GC
H2C
OH
H2C
O
OH
H2C
OH
O
O
OH
O
OH
O
OH
O
O
NH
NH2
NH2
H3C
x
y
z
Figura 3: Representação esquemática do polímero quitosana (QUI)
Polímeros catiônicos, como a quitosana e a poli-lisina podem interagir com as
proteínas das junções oclusivas (Figura 4), promovendo sua reorganização e subseqüente abertura
(Bravo-Osuna et al,2008), agindo portanto, como promotores de penetração (Kotzé et al1999;
Thanou et al, 2001).
Aliado a todas essas características que favorecem o uso da quitosana como polímero
de recobrimento de NP, há o fato de que ainda não existem relatos de uso da quitosana para
administração de NP via intramamária. Os estudos já desenvolvidos relatam a aplicação da
quitosana em vetores administrados por via oral (Prego et al, 2005), nasal (Illum et al, 1994; Vila et
al,2004), pulmonar (Grenha et al, 2005 e 2008) e oftálmica (de la Fuente et al, 2010).
11
RAQUEL, GC
Figura 4: Representação esquemática das junções oclusivas (adaptado de Biological Science 2/e –
Pearson Prentice Hall, Inc. 2005)
3 - Mastite e aplicabilidade de nanopartículas em veterinária
A vetorização de fármacos antibióticos é uma das áreas promissoras para emprego de
nanopartículas, especialmente no tratamento de infecções em humanos e animais (SantosMagalhães et al,2000; Schiffelers et al, 2001; Barratt, 2003).
A mastite é a enfermidade mais prevalente e economicamente relevante entre
bovinos leiteiros em todo o mundo (Vintov et al, 2003), afetando a produção e qualidade do leite,
além de poder ocasionar a morte do animal. No Brasil estima-se que as perdas decorrentes da
doença são da ordem de 10 a 15% na produção de leite total, o que representa, atualmente, prejuízos
de cerca de 3 a 4 milhões de litros por ano (Costa et al, 1998; Fonseca et al, 2000; Embrapa, 2010).
No mundo inteiro, estima-se que as perdas anuais ocasionadas pela mastite chegam a 35 bilhões de
dólares (Wellenberg et al, 2002).
Os prejuízos econômicos associados à mastite se devem principalmente à queda na
produção leiteira do rebanho, gastos com medicamentos, descarte do leite de animais em tratamento
e à reposição precoce de animais cronicamente acometidos, os quais acabam sendo sacrificados
(Costa et al, 2011). A mastite é a doença responsável por grande parte dos descartes em um
rebanho, chegando a 26,9% de causa dos descartes nos Estados Unidos (Demeu et al, 2011). Silva e
colaboradores (2004) verificaram que a mastite representa a causa de descarte de 56,82% dos
animais de raça holandesa no Brasil. Associado aos dados relatados, a contagem aumentada de
células somáticas e a diminuição de teores de gordura e caseína do leite provocam queda no
rendimento da indústria láctea (Wellenberg et al, 2002; Seegers et al, 2003).
A mastite bovina é uma inflamação da glândula mamária, caracterizada por
alterações patológicas no tecido glandular, com consequentes alterações físico-químicas no leite
(Gruet et al, 2001). Está relacionada à presença de microorganismos, principalmente bactérias,
como
Staphylococcus
aureus,
Streptococcus
agalactiae,
Streptococcus
dysagalactiae,
Corynebacterium bovis. Os principais agentes etiológicos da mastite foram classificados em dois
grupos, quanto à sua origem e modo de transmissão: microorganismos ambientais, que estão
presentes no meio ambiente e cuja transmissão pode ocorrer em qualquer etapa da vida do animal,
dentre os quais se destacam Escherichia coli, Streptococcus uberis, Enterobacter aerogenes,
Klebssiella spp; e microorganismos contagiosos, presentes no corpo do animal e cuja transmissão
12
RAQUEL, GC
ocorre principalmente durante a ordenha, entre eles Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Corynebacterium bovis (Gruet et al, 2001; Andersen et al, 2010; Dohoo et al, 2011).
A mastite pode ser classificada como clínica – com sinais clínicos no quarto mamário
inflamado e com alterações físico-químicas no leite – ou subclínica – que é assintomática e com
redução na produção e qualidade do leite (Gruet et al, 2001; Moon et al, 2007). O tratamento da
mastite, em geral, é realizado com uso de antimicrobianos, via intramamária – direcionando o
fármaco ao úbere, através do canal do teto – ou combinando infusão intramamária e administração
parenteral (Gruet et al, 2001). O método de administração pela via intramamária de agentes
antimicrobianos para o tratamento de mastite clínica ou subclínica é o preferido pela indústria do
leite, permitindo aplicações de pequenas quantidades de agentes antimicrobianos diretamente no
local da infecção (Tozzetti et al, 2008). Preferencialmente, o tratamento deve ocorrer durante o
período seco, visto que o úbere seco apresenta vantagens em relação ao úbere em lactação, tais
como (Oliver et al, 1990; Gruet et al, 2001):

Manutenção de níveis mais uniformes de antimicrobiano, uma vez que a glândula
não sofrerá esvaziamento constante;

Não há descarte de leite contaminado com antimicrobiano;

Podem ser administradas doses mais elevadas de antimicrobiano a fim de combater a
invasão precoce de patógenos no período seco.
A terapia no período seco é realizada com dois objetivos: tratar infecções
intramamárias em quartos contaminados e prevenir novas infecções no início do período de
lactação. A maior taxa de eliminação de infecção ocorre quando o tratamento dos quartos infectados
é feito após a última ordenha do período de lactação, com altas doses de formulações de liberação
lenta (Gruet et al, 2001). Apesar das vantagens do tratamento durante o período seco, a mastite
clínica muitas vezes precisa ser tratada durante a lactação, e deve apresentar resposta clínica
perceptível em 5 a 7 dias (Gruet et al, 2001). Nesses casos, o leite coletado deverá ser totalmente
descartado, uma vez que existe contaminação com antimicrobianos. Já a mastite subclínica deve ser
tratada durante o período seco.
O úbere da vaca é constituído de dois pares de glândulas mamárias (Figura 5), cada
uma drenada por uma teta. A produção do leite se dá por glândulas exócrinas que possuem alvéolos
dilatados onde o leite é estocado. As células secretoras são responsáveis pela formação da barreira
sangue-leite e pela difusão seletiva de fármacos entre ambos os compartimentos. O alvéolo libera o
leite em pequenos ductos, que convergem para ductos maiores, e estes para a cisterna da glândula.
Esta glândula é conectada à cisterna do teto, que se abre para o canal do teto. Este canal possui
13
RAQUEL, GC
proteção imunológica local, devido à presença de células linfóides, além de uma barreira física
contra a entrada de bactérias fornecida pela camada epitélio-queratinosa que reveste o canal do teto.
Um fármaco é efetivo no tratamento de mastite quando alcança uma concentração ótima no alvo da
infecção, sendo que os patógenos causadores de mastite podem estar no leite ou em compartimentos
intracelulares, como células epiteliais dos alvéolos da glândula mamária (Gruet et al, 2001; Gehring
et al, 2006).
Figura 5: Esquema da glândula mamária bovina (Sandholm et al., 1995)
O grande impacto econômico causado pela mastite levou ao desenvolvimento de
estratégias de controle da doença, sendo que o tratamento com antimicrobianos e a antissepsia dos
tetos antes e após a ordenha são as estratégias adotadas mais relevantes. Apesar da necessidade de
14
RAQUEL, GC
adoção dos antimicrobianos, há constante pressão internacional a fim de reduzir a sua dose e
freqüência de uso (Gruet et al, 2001).
Desta maneira, algumas possibilidades podem ser investigadas com o objetivo de
desenvolver medicamentos mais eficazes para o tratamento dos animais infectados, com menor
difusão do fármaco para a corrente circulatória. A fim de diminuir essa difusão, a aplicação de
antibióticos por via intramamária é amplamente utilizada (Gruet et al, 2001; Mckellar et al, 2004;
Gehring et al, 2006; Kietzmann et al, 2010). Portanto, o desenvolvimento de uma formulação
antibiótica para o tratamento da mastite deverá possuir características como facilidade de
penetração em células fagocitárias, manutenção da atividade do antibiótico nos lisossomas dos
fagócitos, cujo meio é ácido, possibilidade de administração via intramamária sem acarretar perda
da atividade ou degradação do antibiótico e liberação sustentada no local de ação (Craven et al,
1984).
Diante desse contexto, a utilização de vetores nanoestruturados de fármacos, uma
estratégia amplamente estudada para terapia humana, surge como uma possível forma de tratamento
da mastite bovina. Sabe-se que estes vetores protegem o fármaco contra a degradação, são
rapidamente capturados por células do sistema mononuclear fagocitário e podem ser administradas
por várias vias, com aumento da seletividade pelo local de ação (Vila et al, 2002). De acordo com a
literatura, há poucos estudos quanto à utilização de vetores nanoestruturados na área veterinária
(Bodmeier et al, 1997; Gruet et al, 2001) e existem diversas possibilidades de aplicação, o que
possibilitou o depósito de patente por nosso grupo de trabalho que desenvolveu formulações
nanoestruturadas para aplicação na mastite bovina (Mosqueira, 2009).
O destino in vivo das NP parece depender das interações que ocorrem entre a
superfície da NP e os componentes biológicos ao redor dela, sendo que tais interações dependem da
via de administração do vetor (Vauthier et al, 2007). No desenvolvimento de um vetor para
administração em mucosas, como no caso da glândula mamária para o tratamento da mastite
bovina, deve ser considerado o caráter bioadesivo da superfície desse vetor, o que permitirá seu
aprisionamento no muco glandular e manutenção prolongada do vetor no sítio de ação, onde ele
poderá liberar o fármaco de maneira sustentada e diretamente no local desejado. As NP revestidas
por quitosana parecem ser promissoras para a terapia da mastite bovina já que apresenta
característica de mucoadesão (PI 1002601-0).
4 - Cloxacilina Benzatina
15
RAQUEL, GC
O surgimento de formas de liberação prolongada de penicilinas ocorreu nas décadas
de 40 e 50, sendo que uma delas foi a síntese de Penicilina G através da reação ácido-base da
penicilina com a N,N´-dibenziletilenodiamina, uma base forte, que produziu um sal com menor taxa
de degradação, menor hidrossolubilidade que a penicilina e níveis plasmáticos sustentados por um
longo período (Elias et al, 1951). Posteriormente foram desenvolvidos diversos sais derivados da
penicilina, como a Penicilina V e a Cloxacilina Benzatina (CloxB) (Szabo et al, 1951).
As penicilinas pertencem à família química dos antibióticos beta-lactâmicos, os quais
possuem estrutura semelhante à do dipeptídeo D-alanil-D-alanina presente no peptideoglicano da
parede celular das bactérias. O mecanismo de ação dos betalactâmicos ocorre por meio da sua
ligação covalente a um resíduo de aminoácido serina da enzima transpeptidase. Uma vez que essa
enzima está relacionada à síntese da parede celular bacteriana, a ligação do antibiótico a inibe e,
consequentemente, não ocorre formação da parede bacteriana (Faure, 2008).
A Cloxacilina Benzatina (Figura 6) é um antibiótico β-lactâmico usado em terapias
veterinárias devido à sua atividade contra bactérias gram-positivas. Suspensões contendo CloxB são
muito utilizadas no tratamento de mastite bovina por oferecer proteção prolongada contra novas
infecções no período seco. Apresenta eficácia contra estafilococos resistentes a penicilinas,
especialmente Staphylococcus aureus, o patógeno gram-positivo mais prevalente em infecções do
úbere bovino (Perez et al, 1997; Kietzmann et al, 2010). Suas propriedades físico-químicas, tais
como baixa solubilidade em água e em pH fisiológico, dificultam a administração de uma forma
farmacêutica convencional pela via tradicional, intramamária. Portanto, faz-se necessário o
desenvolvimento de uma formulação nanoestruturada, que seja eficaz na entrega seletiva do
fármaco no local de ação desejado, a glândula mamária.
Visando aumentar a disponibilidade da CloxB no local de ação, ou seja, dentro das
células infectadas da glândula mamária, nas quais reservatórios de bactérias se instalam e são de
difícil combate, uma das alternativas é a encapsulação da CloxB em vetores nanoestruturados.
Nanocápsulas possuindo carga superficial negativa e positiva contendo o antibiótico cloxacilina
benzatina foram preparadas e caracterizadas previamente por nosso grupo de pesquisa, obtendo-se
87% de encapsulação da CloxB em NC de PCL-QUI e 37% em NC de PCL e liberação mais rápida
do fármaco a partir de NC, com QUI como polímero de revestimento, em meio contendo PBS que
em meio contendo PBS e leite (Araújo, 2009).
16
RAQUEL, GC
H
N
H
N
S
C
O
H2C
N+
Cl
O
H
N
CH3
CH2
CH3
CH2
O
C
O
N+
O
H
H2C
H
2
Figura 6: Estrutura química da Cloxacilina Benzatina (CloxB)
5 - Liofilização de Nanopartículas
A liofilização é um processo, comumente utilizado na indústria, para assegurar a
estabilidade em longo prazo e preservar as propriedades originais de produtos farmacêuticos e
biológicos (Abdelwahed et al, 2006a). O processo consiste na remoção de água de uma amostra,
previamente congelada, por sublimação do gelo sob vácuo, o que transforma a água congelada
diretamente em vapor (Abdelwahed et al, 2006c).
O esquema do equipamento e a evolução da secagem (Boss, 2004) estão
representados na figura 7. A liofilização ocorre em três fases: a primeira etapa do processo é o
congelamento do produto (Figura 7a) a ser seco em baixas temperaturas. Ele pode ser inserido
congelado na câmara de secagem ou pode ser congelado na própria prateleira, dependendo do
equipamento. A segunda etapa é a secagem (Figura 7b). O vácuo é iniciado (Figura 7c) e o gelo é
sublimado por pressão reduzida. À medida que o gelo sublima, a amostra fica porosa. O vapor
originado na interface atravessa o material seco na câmara de liofilização e é condensado abaixo da
câmara de secagem, no condensador. Por último, ocorre a segunda secagem, na qual é retirada a
água residual adsorvida ao pó, obtendo-se o produto final seco (Figura 7d) (Tang et al, 2004; Chen
et al, 2007). Durante o processo de liofilização, a amostra congelada deve ser mantida abaixo de sua
temperatura de transição vítrea ou da temperatura de fusão (Qian et al., 2010).
17
RAQUEL, GC
Figura 7: Representação esquemática de um liofilizador e do processo de secagem (adaptado de
Araújo,2009).
O processo de liofilização tem sido aplicado, nos últimos anos, visando melhorar a
estabilidade em longo prazo de nanopartículas (De Chasteigner et al, 1996; Abdelwahed et al,
2006a). Esta aplicabilidade se deve ao fato de que os sistemas coloidais apresentam problemas de
instabilidade física (agregação e fusão de partículas) e química (hidrólise de polímeros, vazamento
de fármaco e reação química do fármaco durante estocagem) quando mantidas na forma de
suspensões aquosas por um longo período (Chacon et al, 1999; Abdelwahed et al, 2006c).
Apesar de a liofilização contribuir para o aumento da estabilidade de sistemas
coloidais, as etapas de congelamento e secagem podem provocar estresse na amostra, induzindo a
agregação das partículas e comprometendo a formação de um produto adequado (De Chasteigner et
al, 1996; Abdelwahed et al, 2006c). Entre os vários tipos de vetores, as nanocápsulas apresentam
maiores problemas durante a liofilização, devido à sua frágil estrutura, composta por uma fina
parede polimérica, envolvendo um núcleo oleoso ou aquoso. As NC podem ter sua estrutura
rompida, com extravasamento do núcleo e perda de fármaco encapsulado. Devido a tais problemas,
usualmente crioprotetores são adicionados à formulação, antes do congelamento. Além disso, o
processo de congelamento influencia os estágios primário e secundário de secagem e,
consequentemente, afeta o produto final formado. Portanto, a otimização do congelamento de
amostras deve ser considerada durante a liofilização (Patapoff et al, 2002; Abdelwahed et al,
2006c).
18
RAQUEL, GC
Diversas formas de congelamento já foram testadas para nanopartículas e estão
descritas na literatura. Para as nanoesferas é comum a utilização de nitrogênio líquido (-196°C)
(Chacon et al, 1999; De Jaeghere et al, 1999 ; Auvillain et al, 1989), congelamento em freezer a 70°C (Chacon et al, 1999), a -45°C (Saez, et al, 2000; Abdelwahed et al, 2006d) e a -60°C (Konan
et al, 2002). Para as nanocápsulas já foram estudados o congelamento em freezer a -45 °C
(Abdelwahed et al, 2006b), a -20ºC (Schaffazick et al, 2003b), a -70°C e congelamento em
nitrogênio líquido a -196°C (Auvillain et al, 1989; Chacon et al, 1999).
Quando uma solução aquosa é congelada a -196ºC, em nitrogênio líquido, a
temperatura extremamente baixa resulta na rápida formação de núcleos de gelo, com crescimento de
pequenos cristais de gelo a partir desses núcleos. Entretanto, quando se utiliza uma temperatura
mais elevada de congelamento (-80, -60, -20ºC, por exemplo) a nucleação do gelo é lenta, e esse
núcleo tende a crescer como cristais de gelo maiores, levando à formação de produtos com poros
grandes e aleatórios após a liofilização (Qian et al, 2010).
Abdelwahed e colaboradores (2006d) descreveram o que ocorre com a amostra
durante o congelamento. Sabe-se que há uma separação defases entre o gelo e a solução crioconcentrada, que contém as NP e os outros componentes da formulação. A alta concentração do
sistema particulado pode induzir agregação e, até mesmo a fusão das partículas, além do estresse
mecânico causado pela cristalização do gelo, conforme já mencionado. Para evitar tais problemas,
os crioprotetores devem ser adicionados à suspensão de NP (Abdelwahed et al, 2006a).
6 - Crioprotetores
Os crioprotetores mais comumente encontrados na literatura, usados na liofilização,
são os açúcares, tais como: sacarose, glicose (Figura 8), trealose e manitol (Auvillain et al, 1989;
Quintanar-Guerrero et al, 1998; Chacon et al, 1999; Saez et al, 2000; Konan et al, 2002;
Abdelwahed et al, 2006a) e polímeros, tais como: álcool polivinílico (Abdelwahed et al, 2006a) e a
gelatina (Saez et al, 2000). Os crioprotetores agem pela imobilização das NP na matriz vítrea dos
mesmos, o que pode prevenir sua agregação e protegê-las contra o estresse mecânico do processo
(Abdelwahed et al, 2006c). A quantidade de crioprotetor a ser adicionada varia de uma formulação
para outra. Na literatura encontram-se dados descrevendo desde o uso de 2% de crioprotetor até
30% (p/v) (Schwarz et al, 1997; Cavalli et al, 1997; Saez et al, 2000).
O mecanismo de proteção conferido pelos açúcares, utilizados como crioprotetores é
bem estudado em relação aos lipossomas (Crowe et al, 1996). São formadas pontes de hidrogênio
19
RAQUEL, GC
entre os açúcares e o grupo polar dos fosfolípides, impedindo a fusão dos lipossomas durante o
processo de desidratação (Nounou et al, 2005; Chen et al, 2010).
Em relação às NP poliméricas, o mecanismo de proteção conferido pelos
crioprotetores ainda não está totalmente elucidado. Uma hipótese é a de que os crioprotetores
formam uma matriz amorfa ao redor das NP, promovendo espaçamento entre elas e evitando, assim,
a agregação durante o congelamento, tornando-as redispersíveis (Saez et al, 2000). Além disso, seu
efeito protetor pode ser devido à formação de ligações de hidrogênio com a água fazendo com que
grupos polares presentes na superfície das partículas, como o poloxamer 188, sejam parcialmente
dessolvatados (Crowe et al., 1993; Allison et al., 1998).
Figura 8: Estrutura química da sacarose (a) e da glicose (b)
20
RAQUEL, GC
OBJETIVO GERAL
Desenvolver e caracterizar nanopartículas poliméricas contendo quitosana como
polímero de recobrimento, avaliando a influência de seus constituintes e concentrações na
estabilidade geral da formulação, bem como o efeito sobre as suas características físico-químicas,
para encapsulação eficiente da cloxacilina benzatina. Estudar ex vivo a interação de NP com a
glândula mamária em modelo de úbere bovino isolado.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Desenvolver formulações de nanocápsulas e nanoesfera de CloxB a partir dos polímeros
quitosana e poli-ε-caprolactona, avaliando a influência de seus constituintes sobre os
aspectos físico-químicos e morfológicos da preparação;

Caracterizar as nanocápsulas e nanoesferas obtidas quanto ao tamanho, índice de
polidispersão, potencial zeta e morfologia;

Avaliar a liberação in vitro de uma formulação de nanocápsula e uma de nanoesfera;

Avaliar ex vivo a interação dessas nanopartículas com o úbere isolado analisando seu
potencial de aplicação pela via intramamária.
21
CAPÍTULO I
Desenvolvimento e Caracterização de Nanocápsulas e Nanoesferas Bioadesivas
RAQUEL, G.C.
1. OBJETIVO GERAL
Neste capítulo o objetivo geral foi o preparo e a caracterização de nanopartículas
poliméricas, avaliando seus constituintes e suas concentrações, visando a otimização e padronização
dos parâmetros da formulação e maior reprodutibilidade do método.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Desenvolver formulações de nanocápsulas e nanoesferas a partir dos polímeros quitosana e
poli-ε-caprolactona;

Caracterizar as nanocápsulas e nanoesferas quanto ao tamanho, índice de polidispersão e
potencial zeta;

Avaliar a morfologia e as características de superfície das nanocápsulas e nanoesferas por
microscopia de força atômica.
23
RAQUEL, GC
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
Para o preparo das nanopartículas foram utilizadas as seguintes substâncias:
fosfatidilcolina de soja (~ 70% fosfatidilcolina) (Epikuron 170®, Lucas Meyer, França), monooleato
de sorbitan (Span 80) (Sigma, EUA), Miglyol® 812N (Sasol, Brasil), Velsan® (triglicéride
cáprico/caprílico) (Pharma Special, Brasil), poloxamer 188 (Synperonic) (ICI Surfactants,
Cleveland, Reino Unido), poli-ε-caprolactona (PCL) (PM 42500Da) (Sigma, EUA), quitosana de
baixo peso molecular (QUI) (Sigma-Aldrich, Brasil), tween 80 (Vetec, Brasil), metanol grau
analítico (Labimpex, Brasil), acetona grau analítico (Vetec, Brasil), fosfato de potássio dibásico
(Rielde-Haёn®), metanol grau CLAE (Merck, Alemanha), acetonitrila grau CLAE (Tedia, EUA). A
água de qualidade Milli-Q foi purificada nos sistemas Direct-Q e Symplicity/System 185, da
Millipore®.
3.2 Preparo das Nanopartículas
As nanopartículas foram preparadas pelo método de deposição interfacial de um
polímero pré-formado, descrito por Fessi e colaboradores (1989). O processo de obtenção de
nanopartículas consiste na mistura de uma fase orgânica, miscível em água, em uma solução aquosa
contendo surfactante hidrofílico (Figura 9).
Para o preparo de nanoesferas brancas foi feita a dissolução de PCL (2,5; 5; 10; 15
ou 20 mg/mL) em acetona (2,5; 3,5 ou 6,5 mL) e metanol (1,5 mL), sob agitação magnética. Essa
solução foi vertida em uma solução aquosa contendo 6 mg/mL de tween 80 e quitosana (0,25; 0,5;
1; 2,5; 5 ou 10 mg/mL) solubilizada em ácido cítrico 0,06 mol/L, também sob agitação magnética,
mantida por 10 minutos, a 500 rpm. Posteriormente, o excesso de solvente da suspensão coloidal
obtida foi evaporado à pressão reduzida em rotavapor (Heidolph Instruments, Alemanha), a uma
temperatura de 40 ºC, até volumes finais de 2 ou 5 mL.
Para o preparo de nanocápsulas brancas foi feita a dissolução de PCL (1; 5 ou 6
mg/mL), Epikuron 170® (5; 6 ou 7,5 mg/mL) ou Span 80 (7,5 mg/mL) (tensoativos hidrofóbicos) e
25 μL/mL de Miglyol® ou Velsan® (fase oleosa) em acetona (3,5 mL) e metanol (1,5mL), sob
agitação magnética. Essa solução foi vertida em uma solução aquosa contendo Poloxamer 188 (6 ou
7,5 mg/mL) ou 6 mg/mL de tween 80 e quitosana (0,5; 1 ou 2 mg/mL) solubilizada em ácido cítrico
0,06 mol/L, também sob agitação magnética, a qual foi mantida a 500 rpm por mais 10 minutos. A
24
RAQUEL, GC
evaporação do excesso de solvente foi realizada conforme metodologia descrita acima, até volumes
finais de 2 ou 5 mL.
Figura 9: Etapas do Preparo de Nanocápsulas e Nanoesferas. 1) A solução orgânica é vertida na
solução aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por 10 minutos; 3) O solvente e o
excesso de água são evaporados.*No preparo de nanoesferas não são adicionados óleo e tensoativo
hidrofóbico.
Durante o desenvolvimento das formulações de nanocápsulas e nanoesferas, foi
estudada a influência da variação de alguns constituintes da formulação em seu tamanho, o índice
de polidispersão e o potencial zeta. Os parâmetros das formulações avaliados foram: variação nas
concentrações e nas proporções dos dois polímeros utilizados (PCL e QUI), presença ou ausência
de tensoativos hidrofóbicos, diferentes tipos de tensoativos hidrofóbicos e hidrofílicos, diferentes
tipos de óleos nas nanocápsulas e variação do volume final de formulação, sempre mantendo a
proporção de 1:2 de solventes orgânico/aquoso.
25
RAQUEL, GC
3.3 Determinação da solubilidade de CloxB em diferentes meios
Visando uma melhor avaliação dos resultados obtidos no desenvolvimento de
nanopartículas foi realizado o estudo de solubilidade da CloxB em óleos Miglyol® 812N e Velsan e
em água. Foi também determinado o coeficiente de partição octanol/água do fármaco.
Os experimentos de solubilidade foram realizados a 37ºC. Para o estudo de
solubilidade um excesso de CloxB (0,5g) foi equilibrado com cada um dos 3 meios (Miglyol®,
Velsan e água) por 72h sob agitação em um tubo de Falcon de 15 mL. Após esse período foram
coletadas alíquotas de 50 μL de cada um dos meios e colocadas em balões volumétricos de 2 mL
contendo acetonitrila:metanol (7:3). Após solubilização, alíquotas de 200 μL dessa solução foram
coletadas, diluídas para 1mL com acetonitrila: metanol (7:3) e quantificadas em CLAE a 225nm
(Mosqueira e cols., 2006).
Para a determinação do LogP, tubo Falcon contendo uma mistura 1:1 (volume total
de 15mL) de n-octanol:água foram mantidas sob agitação por 24h. Após esse período, centrifugouse a amostra, para separação dos meios. Em seguida foram adicionados 0,25g de CloxB a cada um
dos meios e estes mantidos sob agitação a 37ºC por mais 72h. Após esse período foram coletadas
alíquotas de 50 μL de cada um dos meios e colocadas em balões volumétricos de 2 mL contendo
acetonitrila:metanol (7:3). Após solubilização, alíquotas de 200 μL dessa solução foram coletadas,
diluídas para 1mL com acetonitrila: metanol (7:3) e quantificadas em CLAE a 225nm (Mosqueira e
cols., 2006).
3.4 Caracterização Físico-Química das Nanopartículas
3.4.1 Distribuição de tamanho
O tamanho médio e o índice de polidispersão das NC e NS foram determinados por
espectroscopia de correlação de fótons (ECF), utilizando o equipamento Nanosizer N5 PLUS
Beckmann Coulter (Fullerton, EUA). As medidas de tamanho foram realizadas em quadruplicata
em alíquotas da mesma amostra e os resultados obtidos foram expressos em média ± desvio padrão.
O índice de polidispersão determinado pelo equipamento reflete a homogeneidade no tamanho das
nanopartículas presentes na amostra, sendo que as amostras que apresentaram índice de
polidispersão menor que 0,3 foram consideradas monodispersas, segundo instruções do fabricante
do equipamento.
26
RAQUEL, GC
A técnica de espalhamento dinâmico da luz ou espectroscopia de correlação de
fótons baseia-se na determinação das flutuações na intensidade da luz espalhada pelas partículas,
em função do tempo, e no cálculo da respectiva função de auto- correlação. Uma grande vantagem
desta técnica em comparação ao espalhamento de luz estático é permitir a determinação da
distribuição do diâmetro das partículas, e não apenas um valor médio de diâmetro. A fim de
entendermos esse fenômeno, é necessário relembrar algumas definições. Partículas em meio líquido
movem-se ao acaso (movimento Browniano), devido a colisões com as moléculas do meio de
dispersão. Partículas menores se movimentam mais rapidamente que partículas grandes e, portanto,
apresentam coeficiente de difusão (D) maior. A medida da intensidade da luz espalhada por uma
dispersão permite detectar e analisar esse movimento browniano das partículas. A luz espalhada por
uma dispersão em um dado instante é combinada, formando um padrão de interferência que
depende das posições relativas das partículas. À medida que as partículas sofrem deslocamentos
aleatórios, o padrão de interferência acompanha estas modificações, produzindo uma variação da
intensidade da luz espalhada no detector. Embora a flutuação da intensidade espalhada seja aleatória
por natureza, ela ocorre em uma escala de tempo de micro a milissegundos. O movimento lento das
partículas grandes causará lentas alterações na intensidade da luz espalhada. Por outro lado, a
movimentação rápida de partículas pequenas provocará uma flutuação muito rápida na intensidade
da luz espalhada. Para uma dispersão de partículas com viscosidade η, em uma temperatura
constante T, o coeficiente de difusão D é inversamente proporcional ao diâmetro hidrodinâmico d H
das partículas, conforme mostra a equação de Stokes-Einstein:
Onde k é a constante de Boltzmann.
D
kT
3d H
A constante de Boltzmann é uma constante física que relaciona temperatura e energia de moléculas.
É obtida pela razão entre a constante dos gases ideais (R) pela constante de avogrado (N).
k
R
 1,3806503 10  23 J / K
N
As flutuações da intensidade da luz espalhada ao longo do tempo são representadas
por meio da função de correlação. No caso das partículas pequenas essa função de correlação entre
as intensidades diminui mais rapidamente com o tempo do que no caso das partículas grandes. No
tempo t= t0= 0, a intensidade de espalhamento em um tempo (t0 + ô) estará cada vez menos
27
RAQUEL, GC
correlacionada com a intensidade de espalhamento inicial, e a média dos produtos das intensidades
tende a zero. Para partículas esféricas e monodispersas, a função decai exponencialmente num
intervalo de tempo t, e a constante de decaimento da curva exponencial gerada pela função de
correlação está relacionada com o coeficiente de difusão translacional das partículas. A constante de
decaimento depende do índice de refração do líquido que dispersa as partículas, do ângulo de
detecção da luz espalhada e do comprimento de onda da luz incidente (Calvo e cols., 1995). O
diâmetro médio efetivo das partículas e sua dispersão foram determinados por meio da técnica de
espalhamento dinâmico de luz, a um ângulo de detecção da luz espalhada fixo em 90°, na
temperatura de 20°C em meio aquoso.
A espectroscopia de correlação de fótons (ECF), além do diâmetro médio das
nanoestruturas, fornece por meio do cálculo, o índice de polidispersão (I.P.) das formulações. O I.P.
é utilizado para determinar a distribuição de tamanho das partículas nas amostras. Formulações de
NP com valores de I.P. menores ou iguais a 0,3 apresentam-se monodispersas (Scholes e
cols., 1993).
3.4.2 Potencial Zeta (ζ)
O potencial zeta foi determinado pela técnica de microeletroforese associada à
anemometria de laser Doppler (ALD), utilizando-se o equipamento Zetasizer 3000HS (Malvern
Instruments, UK). As amostras foram analisadas, diluindo 10 μL da suspensão de nanopartículas em
9990 μL de solução aquosa NaCl 1 mmol/L previamente filtrada em filtro de 0,45 μm, obtendo-se,
assim, suspensões coloidais com forças iônicas semelhantes (1,2 ± 0,2 mS/cm2). As medidas foram
realizadas em triplicata em alíquotas da mesma amostra e os resultados obtidos foram expressos
como média ± desvio padrão.
As medidas de potencial zeta se baseiam no fenômeno relacionado à carga líquida na
superfície da partícula que afeta a distribuição de íons na sua vizinhança, aumentando a
concentração de contra-íons junto à superfície. Assim, forma-se uma dupla camada elétrica na
interface da partícula com o líquido. Essa dupla camada divide-se em duas regiões: uma região
interna, que inclui íons fortemente ligados à superfície, e uma região externa onde a distribuição dos
íons é determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Dessa maneira,
o potencial nessa região decai com o aumento da distância em relação à superfície. Quando se
alcança uma distância suficientemente grande, atinge-se o potencial de superfície, o qual é
convencionado como potencial zero. Em um campo elétrico, como em microeletroforese, cada
partícula e os íons fortemente ligados a ela se movem como uma unidade, e o potencial no plano de
cisalhamento entre essa unidade e o meio circundante é chamado potencial zeta (Figura 10).
28
RAQUEL, GC
Quando uma camada de macromoléculas é adsorvida na superfície da partícula, ela
move o plano de cisalhamento para longe da superfície, alterando o potencial zeta. O potencial zeta
é função da carga superficial da partícula, de qualquer camada adsorvida na interface com o meio e
da natureza e composição do meio que a circunda.
Figura 10: Esquema representativo da dupla camada elétrica
O potencial zeta (ζ) reflete o potencial elétrico existente na superfície das partículas e
pode ser influenciado pela carga dos diferentes componentes dessas estruturas, localizado na
interface com o meio dispersante, e pela adsorção de espécies iônicas do meio de dispersão
(Legrand e cols., 1999).
3.4.3 Análise morfológica das nanopartículas
Até o momento foram realizadas análises morfológicas das nanoesferas brancas e
contendo 0,1 mg/mL de CloxB e da formulação de nanocápsula branca. Para análise morfológica
foi utilizada a microscopia de força atômica (MFA), utilizando os equipamentos Multimode e
Dimension 300, ambos monitorados por controlador Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa
Bárbara, EUA), no Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC, MG). As imagens foram obtidas
no modo de contato intermitente (tapping mode) utilizando sondas de silício de comprimento de
228 μm, com uma freqüência de ressonância de 75-98 kHz, força constante de 29-61 N/m e raio de
curvatura de 5 nm a 10 nm.
Para obtenção das imagens, aproximadamente 5 μL das amostras foram depositados
em placas de mica clivadas no momento do uso ou em lâminas de vidro contendo parafilme em sua
superfície. Após a deposição das amostras, essas foram secadas utilizando-se um jato de argônio
unidirecional. A varredura foi efetuada em uma velocidade de 1 Hz com resolução de 512 x 512
29
RAQUEL, GC
pixels. A análise das amostras foi realizada utilizando um programa de análise do sistema (Section
Analysis).
3.5 Análise Estatística dos Dados
O diâmetro médio e o potencial zeta das NC e NS vazias e contendo CloxB foram
comparados por análise de variância (ANOVA) utilizando o programa Prisma versão 4.0. Adotouse intervalo de confiança de 95%, sendo os valores de p<0,05 aceitos como estatisticamente
significativos.
30
RAQUEL, GC
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Preparo das Nanopartículas
As nanopartículas (NC e NS) (Figura 11) são formadas instantaneamente pela rápida
difusão do solvente orgânico para o meio aquoso, promovendo a deposição interfacial do polímero.
Ocorre uma rápida precipitação do polímero quando a solução polimérica é adicionada ao nãosolvente, um processo que é cineticamente controlado. A rápida formação das nanopartículas é
governada pelo chamado efeito Marangoni, que explica a geração de turbulência interfacial entre as
interfaces do solvente e do não-solvente (Quintanar-Guerreiro e cols., 1998). As características
estruturais e físico-químicas das nanopartículas podem ser grandemente influenciadas pela
composição das formulações. No preparo de nanopartículas por nanoprecipitação, a natureza e
concentração do polímero, razão entre a quantidade de fases externa e interna e a natureza e
concentração dos surfactantes são fatores essenciais na determinação do seu tamanho. Por esta
razão, 33 formulações foram previamente testadas, empregando-se diferentes componentes e
proporções. As suspensões coloidais resultantes foram avaliadas quanto ao tamanho médio de
partícula e índice de polidispersão. As formulações de tamanho e índice de polidispersão mais
adequados foram selecionadas para a encapsulação da cloxacilina benzatina e medida de potencial
zeta.
Figura 11: Representação esquemática da constituição de nanoesferas (a) e nanocápsulas
bioadesivas (b).
3.2 Determinação da solubilidade de CloxB em diferentes meios
A solubilidade da CloxB em Miglyol®, mostrada na Tabela 2, está de acordo com
resultados previamente obtidos em nosso laboratório (Araújo, 2009) para outros óleos, como
31
RAQUEL, GC
Labrafac e Plurol Oleique. A solubilidade da CloxB em Miglyol® é maior que em Velsan, o que
favorece o suo deste óleo para encapsulamento da CloxB. Pelos dados da tabela, observa-se que a
solubilidade da CloxB em água é próxima à sua solubilidade em Miglyol®. Estes dados indicam
que a CloxB é um fármaco que apresenta grupamentos hidrofílicos em sua estrutura e, portanto, não
é predominantemente hidrofóbico. Esta suposição foi confirmada pelo cálculo do LogP, com
valores de 0,6.
Tabela 2: Solubilidade da CloxB em diferentes meios
Solubilidade
Meios
(μg/mL) a 37ºC
Miglyol®
1207,80
Velsan®
383,43
Água
1053,02
N-octanol
4079,53
Determinação a 37ºC.
P = solubilidade n-octanol/ solubilidade água = 3,874
LogP determinado = 0,6
3.3 Caracterização físico-química das nanopartículas
3.3.1 Distribuição de tamanho
A determinação do tamanho médio das nanopartículas é muito importante para a
caracterização físico-química das formulações. Por meio da determinação do tamanho das
nanoestruturas é possível acompanhar a estabilidade das formulações e a tendência das partículas
presentes na suspensão coloidal de se agregarem e sedimentarem (Magenhein e cols., 1991). O
tamanho das nanopartículas geralmente varia de 100 a 500 nm e depende de vários fatores, como
método de preparação, tipo e concentração do polímero utilizado, características físico-químicas do
fármaco encapsulado, concentração de surfactantes, proporção entre fase orgânica e aquosa,
viscosidade das fases utilizadas e velocidade de difusão da fase orgânica na aquosa (Legrand e
cols., 1999 e Mosqueira e cols., 2001).
32
RAQUEL, GC
Parâmetros envolvidos na preparação das nanocápsulas e nanoesferas (tipo e
proporção de polímeros, presença ou não de tensoativos, volumes de fase orgânica e fase aquosa e
tipo de óleo na fase orgânica de nanocápuslas) foram otimizados com a finalidade de obter
formulações monodispersas com partículas de diâmetro de até 450 nm. Os resultados estão
apresentados nas Tabelas 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9.
Tabela 3: Efeito das concentrações de polímeros no tamanho médio de nanoesferas
NS
PCL
(mg/mL)
Quitosana
(mg/mL)
Tamanho
(nm) ± DPa
Índice de Polidispersão
(nm) ± DP
*1
20
5
800,1 ± 10,4
0,336 ± 0,054
*2
15
5
871,1 ± 5,3
0,338 ± 0,068
*3
10
5
660,2 ± 7,8
0,343 ± 0,024
*4
5
5
581,8 ± 5,0
0,375 ± 0,032
*5
20
-
223,6 ± 0,4
0,062 ± 0,016
*6
5
10
716,3 ± 8,5
0,309 ± 0,041
*7
5
2,5
348,6 ± 3,7
0,154 ± 0,015
*8
5
1
379,7 ± 2,6
0,333 ± 0,011
*9
5
0,5
294,8 ± 1,4
0,057 ± 0,022
*10
5
0,25
390,8 ± 2,1
0,126 ± 0,026
Volume final de 2 mL. aDP= desvio padrão (n=4). *Formulações significativamente diferentes (p<0,05) utilizando
teste ANOVA. Formulações sem surfactante.Concentrações finais após evaporação.
A formulação de NS com apenas o polímero PCL (NS 5) apresentou tamanho médio
abaixo de 250 nm e com índice de polidispersão menor que 0,1. Ao adicionar 5 mg de QUI na
formulação (NS 1) o tamanho médio das NS aumentou significantemente (p <0,05), para um valor
mais de 3 vezes maior, sugerindo que o polímero positivo (QUI) ficou adsorvido na superfície da
partículas e que ele contribui para esse aumento de tamanho.
Os resultados apresentados na Tabela 3 mostram uma redução significativa (p<0,05)
no tamanho médio das nanoesferas à medida que a concentração de PCL é diminuída, mantendo-se
a concentração constante de QUI. Quando a concentração de PCL foi reduzida de 20 para 5 mg/ml
obteve-se NS com tamanhos médios de 800,1 nm e 581 nm, respectivamente. A redução na
concentração de PCL reduz a viscosidade do meio, o que facilita a difusão da fase orgânica através
33
RAQUEL, GC
da fase aquosa, conforme descrito por Legrand et al, em 2007. Assim, ocorre uma precipitação mais
rápida do polímero, impedindo a coalescência das nanogotas poliméricas e gerando esferas
estabilizadas com tamanho menor.
Quanto à presença do polímero QUI, observa-se uma redução acentuada no tamanho
médio das nanoesferas, por volta de 500 nm, quando a quitosana é retirada da formulação (NS 1 e
5). Provavelmente, a presença da quitosana (assim como ocorreu com o PCL) aumenta a
viscosidade do meio aquoso, interferindo no processo de interação entre as fases aquosa e orgânica
(Calvo e cols., 1997). Apesar de induzir um aumento no tamanho médio da nanopartícula, a
presença da QUI na formulação é necessária, uma vez que este polímero é responsável pela muco e
bioadesividade da partícula. Sendo assim, foram produzidas NS revestidas com quitosana, a fim de
obter uma concentração ideal de QUI, capaz de manter as propriedades de bioadesividade do
polímero em nanopartículas com tamanho médio abaixo de 400 nm e população monodispersa
(I.P<0,3).
A redução na concentração da QUI até valores de 0,5 mg/mL leva a uma diminuição
significativa do tamanho médio da partícula, provavelmente devido à redução da viscosidade do
meio aquoso e favorecimento da interação entre fases orgânica e aquosa, conforme descrito
anteriormente (Legrand e cols., 2007). Porém, quando é utilizada uma concentração de QUI de 0,25
mg/mL (NS 10), observa-se um aumento no tamanho médio das partículas. Esse fato foi atribuído à
alta proporção de PCL em relação à QUI (20:1), sendo que, provavelmente, a quantidade de QUI
não foi suficiente para promover o revestimento completo da nanopartícula, resultando na formação
de estruturas instáveis e de tamanho médio elevado. Além disso, após a determinação do potencial
zeta, constatou-se um desequilíbrio de cargas na formulação contendo 0,25 mg/mL de QUI, levando
a valores de carga superficial muito baixos (+4,5 mV), quando comparados à formulação com 0,5
mg/mL de QUI (+28 mV).
Além dos fatos discutidos anteriormente, foi observado, para todas as formulações
sem surfactante, a formação de precipitado logo após a evaporação do excesso de solvente (NS 1, 2,
3, 5, 6 e 7) ou no dia seguinte ao preparo da formulação (NS 4, 8, 9 e 10), indicando a necessidade
do uso de surfactante. O surfactante contribui para a estabilização da formulação uma vez que reduz
a tensão interfacial entre as fases aquosa e orgânica (Lannibois e cols., 1997; Peltonen e cols., 2003;
P. Legrand e cols., 2007). Portanto, na etapa seguinte foram produzidas formulações contendo 0,5
mg/mL de QUI e 6 mg/mL do surfactante Tween 80.
A observação dos resultados, apresentados na tabela 4, evidenciam como a presença
de um surfactante hidrofílico influencia no tamanho médio das partículas.
34
RAQUEL, GC
Tabela 4: Efeito da presença de Tween 80 no tamanho médio de nanoesferas
Tween 80
(mg/mL)
Tamanho (nm)
± DPc
Índice de
Polidispersão
(nm) ± DPc
NS
PCL (mg/mL)
CloxB
(mg/mL)
*11a
5
-
-
417,8 ± 3,5
0,095 ± 0,037
*12a
5
-
6
293,8 ± 4,3
0,225 ± 0,026
#
13b
5
0,5
-
843,3 ± 3,8
0,240 ± 0,013
#
14b
5
0,5
6
279,0 ± 2,4
0,224 ± 0,018
Volume final de 2 mL(a) e 5mL (b). cDP= desvio padrão (n=4). *, #Formulações significativamente diferentes
(p<0,05) utilizando teste ANOVA.
Como apresentado na tabela 4, a presença do surfactante hidrofílico e não-iônico
(Tween 80) influencia significativamente (p<0,05) o tamanho médio da nanoesfera. A presença
desse surfactante leva a uma redução no tamanho médio da partícula, tanto para nanoesferas sem a
cloxacilina benzatina (NS 11 e 12) quanto para aquelas contendo o fármaco (NS 13 e 14). Esse
efeito pode ser explicado pela propriedade do Tween 80 em reduzir a tensão interfacial da fase
aquosa, formando nanoesferas termodinamicamente mais estáveis pelo efeito estérico superficial
das cadeias de PEG do Tween 80 (Figura 12) reduzindo também tamanho médio das NP. Durante a
formação das nanoesferas pelo método de nanoprecipitação, a porção hidrofílica do surfactante se
organiza voltada para a fase aquosa e a porção hidrofóbica se volta para a fase orgânica (Figura 12),
o que reduz a tensão interfacial do sistema. Este fenômeno favorece a interação entre as fases
aquosa e orgânica e possibilita a formação de nanopartículas termodinamicamente estáveis e de
tamanho reduzido. Dados da literatura relatam a obtenção de nanopartículas menores pelo método
de nanoprecipitação quando surfactantes são adicionados à formulação (Lannibois e cols., 1997;
Peltonene cols., 2003; P. Legrand e cols., 2007). Adicionando-se 0,5 mg/mL de CloxB não foi
verificada variação estatística nos tamanhos médios das partículas coloidais.
35
RAQUEL, GC
Figura 12: Representação esquemática da organização do tween 80 entre as fases aquosa e orgânica
(a). Adaptado de Baldursdottir e cols., 2011. Estrutura química do tween 80 (b).
Tabela 5: Efeito do Volume final de solvente no preparo das NP no tamanho médio de NS
NS
Quitosana Volume final
(mg/mL)
(mL)
Tamanho
(nm) ± DPc
Índice de Polidispersão
(nm) ± DPc
*15a
1
2
546,1 ± 4,5
0,142 ± 0,031
*16a
1
5
307,5 ± 1,4
0,205 ± 0,027
*17b
0,5
2
293,8 ± 4,3
0,225 ± 0,026
*18b
0,5
5
251,7 ± 0,4
0,094 ± 0,018
Volume final de 2 mL(a) e 5mL (b). cDP= desvio padrão (n=4). *, #Formulações significativamente diferentes
(p<0,05) utilizando teste ANOVA. Formulações preparadas com 5mg/mL de PCL e 6 mg/mL de tween 80.
Em relação à variação do volume final da formulação, na tabela 5 é demonstrado que
a evaporação do excesso de solvente para um volume de 5mL produziu NS de tamanho médio
menor se comparado àquelas evaporadas para 2 mL. Diante de todas as variáveis abordadas para a
formulação (concentração de PCL e QUI, presença e ausência de Tween 80, diferentes volumes
finais), a formulação 18 foi selecionada como a NS ideal para encapsulamento do antibiótico
CloxB, em experimentos realizados posteriormente e descritos no capítulo 2. Essa formulação
apresenta a seguinte composição: 5 mg/mL de PCL solubilizado em 5 mL de fase orgânica, 6
mg/mL de tween 80 e 0,5 mg/mL de quitosana, em 10mL de fase aquosa. O volume final da
formulação foi 5 mL.
Após a seleção da NS ideal, passou-se para o desenvolvimento da formulação de
nanocápusla. Para as NC foram avaliadas a variação na concentração dos polímeros PCL e QUI,
além da variação no tipo de surfactante hidrofóbico e no tipo e concentração do surfactante
hidrofílico. Os resultados para a variação dos polímeros estão descritos na tabela 6.
36
RAQUEL, GC
Tabela 6: Comparação do tamanho médio de nanocápsulas em relação à variação na concentração
de polímeros PCL e Quitosana
PCL
(mg/mL)
Quitosana
(mg/mL)
Tamanho
(nm) ± DPa
Índice de
Polidispersão
(nm) ± DPa
*19
6
2
369,4 ± 8,6
0,373 ± 0,041
#
20
5
2
355,3 ± 5,6
0,401 ± 0,045
*#21
1
2
485,7 ± 3,8
0,482 ± 0,043
22
6
1
407,5 ± 12,7
0,529 ±0,026
b
23
5
1
420,4 ± 3,6
0,589 ± 0,013
b
24
1
1
516,9 ± 7,4
0,721 ± 0,008
6
0,5
236,6 ± 1,7
0,128 ± 0,022
NC
a,
a, b, c
a, c
25
Volume final de 5 mL. aDP= desvio padrão (n=4). *, #, b, cFormulações significativamente diferentes (p<0,05) utilizando
a
teste ANOVA. Fomulações 19 e 22 apresentam diferença significativa no tamanho médio em relação à formulação 25.
Formulações contendo 6mg/mL de tween 80 e 7,5 mg/mL de epikuron.
Como pode ser observado na Tabela 6, a redução na concentração do polímero PCL
de 6 para 5mg/mL (NC 19 e 20 e NC 22 e 23) não altera significativamente o tamanho médio das
partículas. Porém, quando se reduz a concentração de PCL para 1,0 mg/mL, mantendo-se a
concentração de QUI (NC 21 e NC 24), ocorre um aumento significativo do tamanho médio. Este
fato é atribuído à necessidade de se manter uma proporção ideal entre os dois polímeros a fim de se
produzir formulações estáveis e com tamanho médio ideal. Além disso, sabe-se que não é possível
obter formulações contendo somente o polímero QUI, na ausência de PCL, uma vez que o segundo
é responsável pela formação do sistema matricial, em nanoesferas, e da parede polimérica em
nanocápsulas.
Conforme apresentado para a formulação 25 a redução da concentração de QUI para
0,5 mg/mL leva à formação de NC de tamanho significativamente menor, semelhante aos dados
observados anteriormente para as NS.
37
RAQUEL, GC
Tabela 7: Efeito do tipo de surfactante hidrofílico no tamanho médio de nanocápsulas
NC
Poloxamer Tween 80
188 (mg/mL) (mg/mL)
Tamanho
(nm) ± DPa
Índice de
Polidispersão
(nm) ± DPa
26
-
7,5
407,5 ± 12,7
0,529 ±0,026
27
7,5
-
250,5 ± 2,4
0,226 ± 0,027
Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=4). Formulações significativamente diferentes (p<0,05) utilizando
teste ANOVA. Formulações contendo 6 mg/mL de PCL e 1 mg/mL de QUI.
Quanto ao tipo de surfactante hidrofílico utilizado, é possível observar pela tabela 7
que, nas condições utilizadas, o poloxamer 188 levou à formação de partículas de tamanho médio
inferior em relação ao tween 80. Portanto, o poloxamer 188 foi escolhido para o desenvolvimento
de demais formulações.
Tabela 8: Efeito do tipo de óleo e concentração do surfactante hidrofóbico no tamanho médio de
NC
NC
Epikuron
(mg/mL)
Span 80
(mg/mL)
Tamanho
(nm) ± DPa
Índice de
Polidispersão
(nm) ± DPa
19
7,5
-
369,0 ± 8,6
0,373 ± 0,041
28
-
7,5
1070,2 ± 353,1
1,356 ± 0,126
29
-
-
Instável
Instável
Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=4). Formulações significativamente diferentes (p<0,05) utilizando
teste ANOVA. Formulações contendo 6 mg/mL de PCL e 2 mg/mL de QUI.
Pela tabela 8 observa-se que entre as NC 19 e 28 há diferença significativa de
tamanho (p<0,05), demonstrando que o Epikuron® produz nanocápsulas de menor tamanho médio
que o Span 80. O Span 80 (Figura 13) é um surfactante de maior viscosidade que o Epikuron®, o
que afeta o tamanho médio das NP produzidas (Duro e cols., 1999; Müller e cols., 2001;
Lboutounne e cols., 2002). Associado a esse fato, deve-se considerar que o Epikuron® possui
caráter aniônico, o que facilita sua interação com a QUI, um polímero catiônico (Siqueira, 2008)
(Figura 14).
38
RAQUEL, GC
Figura 13: Estrutura química do monooleato de sorbitan (Span 80)
Figura 14: Estrutura química da fosfatidilcolina enriquecida com lecitina de soja (Epikuron 170®)
Tabela 9: Comparação das propriedades de tamanho de nanocápsulas em relação à variação do tipo
de óleo e variação da concentração de surfactante hidrofóbico
NC
Epikuron
(mg/mL)
Miglyol®
(μL/mL)
Velsan
(μL/mL)
Tamanho
(nm) ± DPa
Índice de
Polidispersão
(nm) ± DPa
30
7,5
25
-
263,7 ± 1,7
0,226 ± 0,027
31
7,5
-
25
234,5 ± 0,9
0,126 ± 0,011
32
6
-
25
243,1 ± 2,1
0,122 ± 0,027
33
5
-
25
262,7 ± 0,8
0,152 ± 0,017
Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=4). Formulações significativamente diferentes (p<0,05) utilizando
teste ANOVA.Formulações contendo7,5 mg/mL de poloxamer 188. Formulações contendo 6 mg/mL de PCL e
0,5mg/mL de quitosana.
Pela tabela 9, observa-se que o Velsan® (triglicerídeos de cadeia média) induz a
formação de nanocápsulas de menor tamanho que o Miglyol®, o que pode ser devido à maior
viscosidade do Miglyol® em relação ao Velsan®, o que torna a dispersão mais difícil durante a
formação da partícula, resultando em partículas maiores (Yu e cols., 1993). Mosqueira e
colaboradores demonstraram, em 2000, que a viscosidade do óleo e sua tensão interfacial têm
influência direta sobre o tamanho médio da partícula formada. Isto porque óleos com maiores
viscosidade e tensão interfacial fazem com que a migração da fase orgânica através da fase aquosa
seja mais lenta, e este é um parâmetro que influencia significativamente o tamanho médio de NP –
quanto mais lenta a migração, maior o tamanho médio das partículas formadas. Além disso, o
39
RAQUEL, GC
Miglyol® foi escolhido porque a CloxB apresentou uma maior solubilidade nesse óleo (415,04
μg/mL) que no Velsan (112,70 μg/mL), conforme resultados apresentados na Tabela 2.
Pela análise dos tamanhos médios obtidos para as formulações 31, 32 e 33 é possível
perceber que a redução das concentrações de Epikuron® levou a um aumento significativo (p<0,05)
no tamanho médio das formulações (NC 32 e 33). Resultados semelhantes já foram observados por
Mosqueira e colaboradores, em 2000, que demonstraram que um mínimo de 0,3% (3 mg/mL) de
lecitina de soja (Epikuron®) é necessário numa suspensão contendo 2,5% de fase oleosa, para a
formação de NC estáveis e com tamanho médio reduzido. Além disso, o uso de concentrações mais
elevadas de lecitina afeta a quantidade de quitosana associada à superfície da nanocápsula, uma vez
que o revestimento de quitosana na superfície das nanocápsulas ocorre devido à interação das
cargas positivas da molécula de quitosana com as cargas negativas do fosfolipídio e do polímero
(Prego e cols., 2006).
Para o encapsulamento da CloxB em nanocápsulas, foi escolhida a formulação 30,
com a seguinte composição: 6 mg/mL de PCL, 7,5 mg/mL de Epikuron 170® e 25μL/mL de
Miglyol® dissolvidos em 5 mL de fase orgânica e 7,5 mg/mL de poloxamer 188 e 0,5 mg/mL de
quitosana em 10mL de fase aquosa. A formulação foi evaporada até volume final de 5 mL
As formulações selecionadas (NS 18 e NC 30) apresentaram tamanho médio abaixo
de 300nm, população monodispersa (I.P.<0,3) e ausência de precipitado. Foi então realizada a
medida de potencial zeta das duas NP e posterior encapsulação da cloxacilina benzatina.
3.3.2 Potencial Zeta (ζ)
Os resultados de potencial zeta da NS18 e da NC30, escolhidas por serem mais
estáveis e com tamanho ideal, estão apresentados na tabela 10. Os valores positivos de potencial
zeta evidenciam o revestimento da superfície das nanopartículas com QUI, visto que as
nanopartículas contendo apenas o polímero PCL apresentam potencial zeta negativo devido à
presença dos grupos carboxílicos terminais (Leroueil-Le Verger e cols., 1998; De Campos e cols.,
2003; Mora-Huertas e cols., 2010). A QUI, por sua vez, apresenta grupamentos amino protonados
em pH abaixo de 6,5, o que torna positivas as nanopartículas revestidas de QUI, caracterizando a
propriedade catiônica desse polímero (Bilensoy e cols., 2009; Dash e cols., 2011).
40
RAQUEL, GC
Tabela 10: Potencial zeta de formulações estáveis de NC e NS brancas
Tamanho
NPa
(nm) ± DPb
Índice de
Polidispersão
c
(nm) ± DP
Potencial zeta (ζ)
(mV) ± DPd
18 (NS)
256,5 ± 2,06
0,099 ± 0,025
+26,6 ± 0,9
30 (NC)
263,7 ± 1,65
0,155 ± 0,018
+23,7 ± 2,3
a
Volume final de 5 mL; bDP=desvio padrão (n=4); camostras monodispersas (abaixo de 0,3); dDP= desvio padrão
(n=3). NS e NC brancas= sem CloxB.
3.3.3 Análise morfológica das nanopartículas
A avaliação morfológica de sistemas nanoestruturados é realizada a partir da
observação da forma, tamanho e superfície das partículas por meio das técnicas de microscopia
(Schaffazick e cols., 2003). As microscopias eletrônicas de varredura e de transmissão são as mais
comumente utilizadas. Entretanto, há alguns anos, também a microscopia de força atômica (MFA)
tem sido uma ferramenta muito usada na caracterização de nanoestruturas, como lipossomas (Li &
Palmer, 2004), nanoesferas (Gref e cols., 1994) e nanocápsulas (Leite e cols., 2005; Mosqueira e
cols., 2005). A MFA é uma das modalidades de microscopia eletrônica de varredura por sonda
mecânica e fornece informações com alta resolução, em escala nanométrica e em três dimensões,
sendo capaz ainda de resolver detalhes de superfície ao nível atômico (Neves e cols., 1998). A MFA
é uma técnica que apresenta várias vantagens em relação às microscopias eletrônicas de varredura e
de transmissão, entre elas: dispensar a utilização de vácuo ou de recobrimento da amostra,
possibilitar a realização de medidas diretas de altura e rugosidade, além de possibilitar a obtenção
de imagens de superfície de materiais sob as mais variadas condições (ar, vácuo e em meio líquido).
Nas imagens das figuras 16 e 17 podem ser observadas NS brancas depositadas sobre
a mica recentemente clivada, que indicam a presença de estruturas esféricas nanométricas. Pela
imagem de fase (b) da Figura 15, aparentemente, a nanoesfera não apresenta superfície lisa, e sim
irregular (setas pretas). A imagem de fase, tem se mostrado sensível para analisar as propriedades
da superfície do material, tais como rigidez, viscoelasticidade, e a composição química (Raghavan
et al., 2000).
41
RAQUEL, GC
Figura 15: Imagens de MFA de nanoesferas brancas, altura (a) e fase (b). Escaneamento de 5 μm x
5 μm. Z range: 200nm. É demonstrada a estrutura esférica das nanoesferas, com superfície irregular.
Figura 16: Imagens de fase de MFA de nanoesferas brancas. Escaneamento de 5 x 5 μm. É
possível visualizar a forma esférica das partículas e sua superfície irregular.
Para um melhor entendimento da superfície irregular da NS, foram feitas imagens em
zoom (Figura 17). Uma análise detalhada das imagens na Figura 17 confirma a impressão inicial a
respeito da superfície da NS branca. É possível visualizar uma superfície irregular, aparentemente
macia, mais facilmente percebida nas imagens de fase e amplitude. Estas características podem ser
42
RAQUEL, GC
produzidas pelo recobrimento com quitosana ou, mais provavelmente à presença do polímero PCL
na NP. Já foram descritas estruturas formadas por filmes de PCL, em imagens obtidas por
microscopia de força atômica (Beekmans e cols., 2000; Marletta e cols., 2007). Beekmans e
colaboradores (2000), relataram a formação de um filme de PCL – a partir do derretimento de
cristais desse polímero – que apresentava estruturas lamelares alongadas, com diferentes
orientações e com bordas curvas.
Figura 17: Imagens de MFA de nanoesferas brancas em zoom, altura (a), fase (b) e amplitude (c).
Escaneamento de 1.2 μm x 1,2 μm. Z range: 200 nm. É destacada a superfície irregular da
nanoesfera.
Na Figura 18, são apresentadas estruturas esféricas bem definidas (a), com relação
diâmetro/altura de aproximadamente 5,0. Esse resultado é diferente dos valores comumente
encontrados para NS, as quais são estruturas mais rígidas que as NC e, portanto não se achatam com
a passagem da sonda da MFA (Montasser e cols., 2002). Nesse caso, o maior achatamento pode
seratribuído à presença da quitosana, um polímero hidrofílico, que aumenta a hidrofilia da matriz e
torna a partícula mais macia e deformável. Nanoesferas rígidas tem a relação próxima de 1.
43
RAQUEL, GC
Figura 18: Imagem de MFA de nanoesferas brancas (a) e perfil topográfico (b) demonstrando
altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis). Relação d/h= 4,9.
Foram também realizadas imagens de NC brancas recobertas com QUI (Figura 19),
cuja obtenção se revelou difícil, devido ao aparecimento de material flexível e disforme ao redor
das partículas, reduzindo a resolução da imagem. Aparentemente algumas estruturas grudaram na
sonda e foram arrastadas, formando algumas projeções pontiagudas ao redor da partícula. A Figura
20 demonstra a imagem tridimensional de NC brancas, na qual podem ser visualizadas algumas
estruturas pontiagudas, que podem ser atribuídos artefactos e deformações devido à baixa fixação
da amostra ao suporte e também à diferente composição estrutural das nanocápsulas.
44
RAQUEL, GC
Figura 19: Imagem de MFA de nanocápsulas brancas, altura (a) e imagem de fase (b),
evidenciando a estrutura esférica das nanocápsulas. Escaneamento de 3 μm x 3 μm. Z range: 200
nm.
Figura 20: Imagem em 3D de nanocápsulas brancas analisadas por MFA. Escaneamento de 5 x 5
μm. Z range: 200nm.
Devido à dificuldade de obtenção de imagens de NC, foi utilizado o parafilm no
lugar da mica como superfície de preparo da amostra (Figura 21). A parafina que o constitui retém
menor quantidade de partículas – por ser uma superfície mais hidrofóbica – e pode tornar a
visualização mais fácil das NP, sem que essas sejam “arrastadas” pela sonda.
45
RAQUEL, GC
Figura 21: Imagem de MFA de nanocápsulas brancas, imagem de fase (a) e amplitude (b) de
amostras preparadas em superfície de parafilm, evidenciando sua estrutura esférica. Escaneamento
5 μm x 5 μm.
Para as NC, o perfil topográfico demonstra que a relação diâmetro/altura tem um
valor de aproximadamente 7,1. Esse resultado indica achatamento da NC, e está de acordo com a
hipótese de que as NC possam se achatar na superfície da mica, devido à seu núcleo líquido envolto
por uma membrana deformável (Montasser, e cols., 2002; Leite e cols., 2005; De Assis e cols.,
2008).
Figura 22: Imagem de MFA de nanoesferas brancas (a) e perfil topográfico (b) demonstrando
altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis). Relação d/h = 7,1.
46
RAQUEL, GC
Espectroscopia de Correlação de Fótons (ECF) mede o raio hidrodinâmico da
partícula e a técnica de MFA permite medir diretamente o tamanho de amostras em um estado
parcialmente seco, depositados em placas de mica recém-clivadas. O tamanho médio de NS e NC
brancas obtidas por MFA não foram significativamente maiores que os obtidos por ECF (tabela 11).
O aumento observado provavelmente se deve ao fenômeno de achatamento das NP na superfície de
mica sob pressão exercida pela sonda de varredura.
Tabela 11: Tamanho médio de NS e NC brancas analisadas por ECF e MFA
Tamanho médio ±
Tamanho médio ±
Índice de
DPa (nm) (ECF)
DPb (nm) (MFA)
polidispersãoc
18 (NS)
256,5 ± 2,0
277,1 ± 46,1
0,099 ± 0,025
30 (NC)
263,7 ± 1,7
302,9 ± 43,8
0,155 ± 0,018
NPa
a
Volume final de 5 mL; bDP=desvio padrão (n=4); camostras monodispersas (abaixo de 0,3); dDP= desvio padrão
(n=3). NS e NC brancas= sem CloxB.
Diante dos resultados expostos, foram selecionadas duas formulações, uma de NS e
uma de NC para dar sequência aos experimentos, com o encapsulamento do fármaco Cloxacilina
benzatina. As duas formulações selecionadas apresentaram tamanho médio e I.P. adequados (Tabela
11), além de cargas superficiais positivas (Tabela 10), características necessárias para a obtenção de
formulações bioadesivas.
47
CAPÍTULO II
________________________________________________________________________________
Preparo e Caracterização de Nanocápsulas e Nanoesferas contendo Cloxacilina
Benzatina e Estudo em modelo de perfusão de úbere bovino isolado
RAQUEL, G.C.
1. OBJETIVO GERAL
Preparar e caracterizar suspensões de nanocápsulas e nanoesferas contendo o
antibiótico CloxB de uso veterinário, a partir de formulações desenvolvidas e otimizadas no
capítulo I. Estudar a interação de nanocápsulas em modelo de perfusão de úbere bovino isolado.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Desenvolver formulações de nanocápsulas e nanoesferas contendo cloxacilina benzatina a
partir dos polímeros quitosana e poli-ε-caprolactona;

Caracterizar as nanocápsulas e nanoesferas, com o fármaco encapsulado, quanto ao
tamanho, índice de polidispersão e potencial zeta;

Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de CloxB nas nanopartículas;

Avaliar a solubilidade da CloxB em diferentes meios;

Avaliar a cinética de liberação da CloxB em nanopartículas poliméricas in vitro;

Avaliar a estabilidade das NP ao longo do tempo;

Estudar a interação de nanocápsulas em modelo de perfusão de úbere bovino isolado ex vivo.
49
RAQUEL, GC
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
Para o preparo das nanocápsulas e nanoesferas foram utilizadas as seguintes
substâncias: cloxacilina benzatina, gentilmente cedida pela EMBRAPA (Lote CCB0811110),
fosfatidilcolina de soja (≈ 70% fosfatidilcolina) (Epikuron 170®, Lucas Meyer, França), mygliol®
812N (Sasol, Brasil), poloxamer 188 (Synperonic) (ICI Surfactants, Cleveland, Reino Unido), poliε-caprolactona (PCL) (PM 42500Da) (Sigma, EUA), quitosana de baixo peso molecular (QUI)
(Sigma-Aldrich, Brasil), tween 80 (Vetec, Brasil), metanol grau analítico (Labimpex, Brasil),
acetona grau analítico (Vetec, Brasil). A água de qualidade ultra-pura foi purificada nos sistemas
Direct-Q e Symplicity/System 185, da Millipore®.
Para os estudos de porcentagem e eficiência de encapsulação e perfil de liberação
foram utilizadas as seguintes substâncias: fosfato de potássio dibásico (Rielde-Haёn®), metanol
grau CLAE (Merck, Alemanha), acetonitrila grau CLAE (Tedia, EUA), leite integral em pó (Nestlé,
Brasil).
3.2 Preparo e caracterização físico-química das nanopartículas
As nanocápsulas e nanoesferas foram preparadas conforme a metodologia descrita no
capítulo I (Fessi et al., 1989).
Para o preparo de nanocápsulas foi feita a dissolução de 6 mg/mL de PCL, 7,5
mg/mL de epikuron 170® e 25μL/mL de mygliol (fase oleosa) em acetona (3,5 mL) e metanol (1,5
mL), sob agitação magnética. Essa mistura foi vertida em uma solução aquosa contendo 7,5 mg/mL
de poloxamer 188 e 0,5 mg/mL de QUI, solubilizada em ácido cítrico 0,06mol/L, também sob
agitação magnética, a qual foi mantida a 500 rpm por mais 10 minutos. Posteriormente, o excesso
de solvente da suspensão coloidal obtida foi evaporado à pressão reduzida em rotavapor (Heidolph
Instruments, Alemanha), a uma temperatura de 40ºC, até volume final de 5 mL.
Para o preparo de nanoesferas 5 mg/mL de PCL foi dissolvido em acetona (3,5 mL) e
metanol (1,5 mL), sob agitação magnética. Essa solução foi vertida em uma solução aquosa
contendo 6 mg/mL de tween 80 e de 0,5 mg/mL de QUI, solubilizada em ácido cítrico 0,06mol/L,
também sob agitação magnética, mantida por 10 minutos, a 500 rpm. A evaporação do excesso de
solvente foi realizada conforme metodologia descrita acima, até volume final de 5 mL.
Para a obtenção tanto de nanocápsulas quanto de nanoesferas contendo cloxacilina
benzatina, o fármaco foi solubilizado em metanol e adicionado à fase orgânica de maneira a se obter
50
RAQUEL, GC
diferentes concentrações finais. Foram preparadas NC de CloxB com concentrações de 0,5; 1,0; 2,0;
2,5; 3,0; 5,0; 7,0; 8,0 e 10,0mg/mL e NS de CloxB com concentrações de 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 5,0
e 7,0 mg/mL.
Após o preparo, todas as nanopartículas foram submetidas à caracterização físicoquímica por meio da medida de distribuição de tamanho em Nanosizer N5 PLUS Beckmann
Coulter (Fullerton, EUA), conforme descrito no item 3.3.1 do capítulo I e de potencial zeta em
Zetasizer 3000HS (Malvern Instruments, UK) conforme descrito no item 3.3.2 do capítulo I.
3.3 Determinação do teor de fármaco encapsulado
Para determinação da porcentagem e eficiência de encapsulação por CLAE,
inicialmente foi construída uma curva padrão da Cloxacilina Benzatina (CloxB), por um método de
doseamento previamente validado, em sistema cromatográfico consistindo de uma bomba de
módulo de separação Waters Alliance 2695, composto de injetor automático, forno de coluna e
detector de arranjo de diodos Waters 2996. A separação foi realizada em uma coluna C18 Waters
Spherisorb com partícula de 5 μm, 250 mm x 4,6 mm, protegido por uma pré-coluna de segurança
Phenomenex AJO-7597 C18 (2 mm x 4,6 mm, 3 mm). As condições cromatográficas foram: fase
móvel acetonitrila: tampão fosfato pH 3,4 (35:65), temperatura de 34°C, fluxo de 1 mL/min, de
acordo com métodos previamente validados por nosso grupo de pesquisa (Araújo, 2009).
3.3.1 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação
A porcentagem e eficiência de encapsulação foram determinadas pela técnica de
ultrafiltração/centrifugação por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) no
aparelho Waters Alliance 2695 acoplado a um detector de arranjo de diodos (DAD) Waters 2996,
por método de doseamento previamente validado por nosso grupo de pesquisa (Araújo, 2009). A
porcentagem de encapsulação objetiva determinar o teor de fármaco incorporado à nanopartícula
em relação ao total de fármaco na formulação. Foram dosadas a quantidade total de CloxB na
suspensão coloidal, a quantidade total de CloxB na suspensão coloidal após filtração em membrana
de 0,8 μm (Millex, Nalgene®) para retirada do precipitado e a quantidade de CloxB livre solúvel na
fase aquosa externa.
A porcentagem de encapsulaçãofoi calculada pela diferença entre a quantidade total
de CloxB na suspensão coloidal filtrada e a quantidade de CloxB livre solúvel na fase aquosa
51
RAQUEL, GC
externa, dividida pela quantidade total de CloxB na suspensão após filtração x 100. Utilizou-se,
portanto, a seguinte fórmula:
% Encapsulação = CloxB total na suspensão filtrada (mL) - CloxB no ultrafiltrado (mL) x 100
CloxB total na suspensão (mL)
O fármaco total foi determinado pela completa dissolução de 100 μL da suspensão de
nanopartículas agitadas, após filtração em membrana de 0,8μm, em 2 mL de acetonitrila:metanol
(7:3). A mistura foi submetida ao vórtex por cerca de 5 minutos. Em seguida, 3 alíquotas de 600 μL
foram transferidas para 3 eppendorfs e estes, centrifugados a 500 rpm por 10 minutos. Após a
centrifugação, 500 μL do sobrenadante foram misturados a 500 μL de acetonitrila:metanol (7:3) e a
quantidade de fármaco presente nesta mistura, determinada por CLAE. A CloxB livre e solúvel na
fase externa aquosa foi determinada pelo método de ultrafiltração/centrifugação de 400μL da
suspensão de NP a 500 x g por 30 minutos em unidades de AMICON (membranas de MICROCON
de 50 kDa, Millipore®) (Figura 23). 10 μL do ultrafiltrado foram retirados e diluídos com 240 μL de
acetonitrila:metanol (7:3).
A
quantidade
de
CloxB
ligada
à
membrana
foi
determinada
após
a
ultrafiltração/centrifugação. Para tal a membrana do AMICON foi lavada com água Milli-Q, imersa
em 500 μL de etanol/acetonitrila (1:1), levada ao vórtex por 15 minutos, centrifugada e a CloxB
dosada no sobrenadante. A eficiência de encapsulação das NP foi calculada pela quantidade de
CloxB encapsulado em 50μL da suspensão de NP, dividido pela quantidade de CloxB pesada e
adicionada ao preparo da suspensão de NP x 100. Seguiu-se, portanto, a seguinte fórmula:
Eficiência de Encapsulação% = Quantidade total de CloxB encapsulado (mL)
x 100
Quantidade de CloxB pesada e colocada na NP (mL)
52
RAQUEL, GC
Figura 23: Representação esquemática das dosagens de CloxB nas formulações de NC e NS para
determinação de porcentagem e eficiência de encapsulação.
3.4 Análise visual e fotomicrografia de nanopartículas
Visando a determinação da estabilidade em longo prazo das NP produzidas, foi
realizada a análise visual dessas, com avaliação da formação ou não de precipitado após esse
período. Além disso, para algumas NP, em que claramente houve formação de precipitado,
realizou-se fotomicrografia, a fim de visualizar cristais de fármaco.
3.5 Análise morfológica das nanopartículas
A análise morfológica da NS contendo 0,5 mg/mL de CloxB encapsulada foi
realizada por microscopia de força atômica (MFA) conforme metodologia descrita no capítulo 1.
3.6 Solubilidade da CloxB em PBS com diferentes quantidades de leite
As solubilidades da CloxB em tampão fosfato salino (PBS) e em tampão fosfato
salino contendo 30 e 70% de leite (PBS +30% leite e PBS+70% leite) foram avaliadas a fim de
determinar a condição sink (até 20% da concentração de saturação no meio) para os experimentos
de cinética de liberação in vitro.
Os experimentos de solubilidade foram realizados a 37ºC. Um excesso de CloxB
(0,5g) foi equilibrado com cada um dos 3 meios (PBS e PBS+30% leite e PBS+70% leite) por 72h
sob agitação em um tubo de Falcon de 15 mL. Após esse período foram coletadas alíquotas de 50
53
RAQUEL, GC
μL de cada um dos meios e colocadas em balões volumétricos de 2 mL contendo
acetonitrila:metanol (7:3). Após solubilização, alíquotas de 200 μL dessa solução foram coletadas,
diluídas para 1mL com acetonitrila: metanol (7:3) e quantificadas em CLAE a 225nm (Mosqueira e
cols., 2006).
Para o estudo de solubilidade de CloxB em amostras contendo leite, previamente foi
realizado um experimento de extração da CloxB do leite, utilizando-se uma metodologia
previamente descrita (Pérez e cols., 1997). A extração foi realizada em amostras de leite contendo
três concentrações diferentes de CloxB solubilizadas (10, 50 e 200 μg/mL). A 200 μL de amostra
foram acrescentados 400 μL de acetonitrila em eppendorf, seguido de agitação em vórtex por
10minutos e centrifugação a 10.000 rpm por 10minutos. O sobrenadante foi coletado, e a ele, foram
acrescentados 200 μL de clorofórmio, seguido de agitação em vórtex por 15minutos. Este
procedimento foi repetido duas vezes, sendo coletado o líquido inferior do eppendorf. O volume
coletado foi evaporado até secura sob vácuo e, posteriormente ressuspendidos em 1 mL de
acetonitrila:metanol (7:3) e quantificados em CLAE (Figura 24).
Figura 24: Representação esquemática da extração de CloxB em amostras de leite.
3.7 Determinação da cinética de liberação in vitro
Após o desenvolvimento da formulação e a avaliação da porcentagem e eficiência de
encapsulação dessa, foi avaliado o perfil de liberação das NP in vitro. Por este este estudo é possível
determinar a quantidade de fármaco liberado por unidade de tempo em diferentes meios,
obedecendo à condição sink (20% da concentração de saturação do fármaco no meio). A condição
sink garante que o fármaco tem o potencial de solubilização completa no meio, evidenciado-se a
capacidade da forma farmacêutica de prolongar a liberação.
A avaliação do perfil de liberação in vitro da CloxB a partir de nanocápsulas e
nanoesferas foi realizada para NS e NC contendo 1,0 mg/mL de CloxB encapsulada. As técnicas
utilizadas foram a diálise reversa em tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4 e diálise direta em PBS
54
RAQUEL, GC
contendo 70% de leite (PBS+70% leite), a 37ºC e sob agitação moderada (Banho Dubnoff
mod.304-TPAE, Nova Ética, Brasil).
Para o estudo de liberação em PBS, pela técnica de diálise reversa, sacos de diálise
contendo 500 μL de PBS foram inseridos em três recipientes com 200 mL de PBS. Em cada um dos
três recipientes foi acrescentado um volume de formulação (NC ou NS) contendo fármaco em
concentração referente à condição sink (condição sink = 2,5%). Em intervalos pré-definidos (15, 30,
60, 180, 360, 720, 1440 e 2880 minutos) foram coletadas três alíquotas de 250 μL do meio contido
no interior do saco de diálise (1 em cada recipiente) e três alíquotas de 500 μL do meio externo para
manter o equilíbrio entre os meios interno e externo. A cada uma dessas amostras foi adicionada
quantidade igual de acetonitrila, seguida de homogeneização em vórtex por 5 minutos. Ao final do
experimento, foram coletados 700 μL de cada amostra, aos quais foram adicionadas 300 μL de
metanol (a fim de manter a proporção utilizada de acentonitrila:metanol - 7:3) para precipitação dos
sais do tampão, com posterior homogeneização em vórtex por 2 minutos e centrifugação a 1000rpm
por 10 minutos. Após centrifugação foram coletadas alíquotas de 300μL do sobrenadante e
quantificadas em CLAE a 225nm.
O estudo de liberação em PBS+70% de leite foi realizado pela técnica de diálise
direta. Para tanto, três sacos de diálise contendo 5,355 mL de formulação com 1,0 mg/mL de CloxB
(condição sink = 2,5%) foram inseridos em três recipientes com 200 mL de PBS+70% de leite,
mantidos sob agitação em banho a 37ºC. Em intervalos pré-definidos (15, 30, 60, 180, 360, 720,
1440 e 2880 minutos) foram coletadas três alíquotas de 250 μL do meio externo (1 em cada
recipiente) e acrescentados 250 μL de PBS+70% de leite aos recipientes, para manter o equilíbrio
do meio. A cada uma das amostras coletadas foram adicionados 500 μL de acetonitrila, seguindo-se
o procedimento de extração descrito no item 3.6. Após a evaporação de cada amostra, foram
adicionadas 250 μL de acetonitrila:metanol (7:3) para ressuspensão da amostra e estas foram
quantificadas em CLAE a 225 nm.
Foi determinada também a solubilidade da CloxB em meios PBS e PBS+70% leite
num período de 48 horas. Para isso, 2mg de CloxB foram precisamente pesados e acrescentados em
tubos de ensaio. A esses tubos foram adicionados 2mL de PBS ou PBS+70% leite e o sistema foi
mantido sob agitação a 37ºC. Em tempos pré-determinados (15, 30, 60, 180, 360, 720, 1440 e 2880
minutos) coletou-se 100 μL do meio, ultracentrifugou-se a 8.000 rpm por 5 minutos, retirou-se 70
μL do sobrenadante. Às amostras retiradas do meio PBS acrescentou-se 70 μL de acetonitrila,
seguido de agitação em vórtex por 5 minutos. Novamente a amostra foi ultracentrifugada a 8.000
rpm, coletado o sobrenadante e adicionados 60 μL de metanol, seguida de quantificação em CLAE.
Já as amostras retiradas do meio PBS+70% leite, passaram pelo processo de extração descrito no
item 3.6, seguidas de ressupensão em acetonitrila:metanol (7:3) e quantificação em CLAE.
55
RAQUEL, GC
Os dados obtidos dos perfis de liberação/dissolução foram submetidos a tratamentos
matemáticos para a determinação de cinética de liberação/dissolução. Para isso foram aplicados aos
modelos matemáticos:

Modelo de Higuchi: para cada formulação foram construídos gráficos da raiz quadrada do
tempo versus porcentagem liberada (√t x %D)

Modelo de Korsmeyer-Peppas: para cada formulação foi calculado o expoente de difusão
(n) a partir da construção de gráficos de log do tempo pelo log da porcentagem de fármaco
não liberada (log t x log %NL).
3.8 Interação de nanocápsulas com a glândula mamária em modelo de perfusão de úbere
bovino isolado
O estudo da interação de NC em modelo de úbere bovino perfundido isolado foi
realizado de acordo com metodologia descrita por Kietzmann e cols. (1993). Os úberes bovinos
apresentando tamanho médio, formato simétrico e comprimento de teto entre 6-8 cm, foram obtidos
de vacas Girolando (Bos taurus taurus × Bos taurus indicus), que estavam em lactação antes do
abate. Cada úbere foi examinado antes do abate através de apalpação dos quartos e inspeção do
leite. Além disso, o tecido glandular foi avaliado quanto à possibilidade de haver incisões
decorrentes do abate, o que poderia prejudicar o experimento. Foi verificado se as artérias
(pudendal)externas direita e esquerda poderiam ser canuladas. Após 10-15 minutos após o abate,
uma glândula (suitable) foi limpa para remoção de sangue e coágulos nas veias, por meio de
lavagem com 2 L de solução Tyrode (136.8 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 1.8 mmol/L CaCl 2 x
2H2O, 1.05 mmol/L MgCl2 x 6H2O, 0.416 mmol/L NaH2PO4 x 2H2O, 11.9 mmol/L NaHCO3 e 5.5
mmol/L D(+)-glicose x 1H2O; a 39oC) contendo citrato de sódio 0.1%. Os úberes foram
transportados ao laboratório e fixados numa posição natural, com um suporte de metal usando uma
inserção na pele proximal e no ligamento suspensório (Figura 41). Em seguida, as grandes artérias
do úbere foram imediatamente supridas com o liquido de perfusão (ou seja, solução Tyrode
gaseificada com carbogênio (95% O2, 5% CO2) a 38oC). O fluxo do perfusato foi mantido entre 60100 mL/min. As grandes veias foram canuladas para possibilitar o recuperação do líquido de
perfusão. A glândula mamária foi drenada por cerca de 5 min durante os 30 min de fase de
equilíbrio. A viabilidade do úbere perfundido foi controlada usando parâmetros bioquímicos, como
atividade de lactato-desidrogenase (LDH) e consumo de glicose do perfusato. Esses testes foram
56
RAQUEL, GC
realizados com uso de kits comerciais, LDH P-L e GLUC-PAP, respectivamente (Randox Crumlin,
Reino Unido). Quatro quartos mamários foram usados nesse experimento. Decorrido o tempo de
equilíbrio, 500 mg de CloxB em NC foram administrados via canal do teto e massageado para a
cisterna da glândula. A CloxB injetada estava encapsulada em NC de quitosana
ligada
covalentemente à fluoresceína isotiocianato (FITC) (Ma & Lim, 2003) Após 6 horas, três amostras
de tecido glandular foram coletadas dos quartos tratados ( a 5, 10 e 15 cm de distância da base do
teto). As amostras de tecido foram congeladas a -80oC e em seguida, foram feitos cortes de tecido
com micrótomo de congelamento (HYRAX-C50, Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Imagens e fotos do
tecido glandular foram feitas em microscópio óptico de fluorescência (Axioplan I, Carl Zeiss, Jena,
Alemanha).
57
RAQUEL, GC
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Preparo e caracterização físico-química das nanopartículas
Quando se pretende uma administração intravenosa das NP, o tamanho dessas deve
ser estritamente controlado, pois partículas maiores que 4 μm de diâmetro podem causar oclusão
dos capilares sanguíneos, um fenômeno conhecido como embolia (Chorny e cols.,2002). Porém,
uma vez que as NP desenvolvidas nesse trabalho destinam-se à administração intramamária, o
controle do tamanho e índice de polidispersão não necessita ser tão rigoroso. Portanto, foram
consideradas aceitáveis NP que apresentassem tamanhos até 400 nm e índice de polidispersão até
0,4, desde que permanecessem estáveis ao longo de alguns meses. Os parâmetros de estabilidade ao
longo dos meses foram estabelecidos por meio do exame visual das formulações e da determinação
de tamanho médio e I.P. após três meses de preparo. Os resultados de medida de tamanho médio,
índice de polidispersão e potencial zeta estão apresentados nas tabelas 12 e 13 para nanoesferas e
nanocápsulas, respectivamente.
Tabela 12: Efeito das variações de concentrações de Cloxacilina Benzatina no tamanho das NS
Índice de
Potencial
Polidispersão
Zeta (ζ)
(nm) ± DPa
(mV) ± DPb
256,5 ± 2,1
0,099 ± 0,02
+26,6±0,9
0,5
246,7 ± 0,9
0,130 ± 0,04
+52,0 ± 0,4
NsB
1,0
230,8 ± 0,7
0,101 ± 0,02
+51,9±0,2
NsC*
2,0
306,5 ± 3,2
0,108 ± 0,03
+19,9±1,1
NsD
2,5
270,2 ± 4,7
0,107 ± 0,04
+16,0±0,7
NsE*
3,0
294,1 ± 12,9
0,139 ± 0,02
+18,6±1,7
NsF*
5,0
542,7 ± 8,8
0,370 ± 0,03
+23,8±0,7
NsG*
7,0
897,2 ± 33,6
0,467 ± 0,07
-3,5±1,0
CloxB
Tamanho médio
(mg/mL)
(nm) ± DPa
Ns18
-
NsA
NS
Volume final de 5 mL. aDP= desvio padrão (n=4), bDP= desvio padrão (n=3). *Formulações significativamente
diferentes (p<0,05) em relação à NS13B, utilizando teste ANOVA.
Os resultados da caracterização físico-química das NS revestidas com QUI estão
mostrados na Tabela 12. De acordo com os resultados, é possível inferir que o aumento da
concentração do fármaco induz uma variação no tamanho médio e no índice de polidispersão das
58
RAQUEL, GC
NS. Nas concentrações iniciais (0,5 e 1,0mg/mL) ocorre uma pequena redução no tamanho das
partículas em relação à NS branca (Ns18). Nas NsD e NsE, contendo 2,5 e 3,0 mg/mL de CloxB há
uma redução no tamanho médio, provavelmente devido ao extravasamento de fármaco da NP. Uma
vez que pouca quantidade de fármaco está efetivamente encapsulado, o tamanho médio da
nanoesfera se aproxima ao da formulação branca. Nas NsF e G (contendo 5,0 e 7,0 mg/mL de
CloxB), há um aumento excessivo no tamanho médio, atribuído a uma instabilidade na partícula,
provocada pelo excesso de fármaco e a alterações significativas do potencial zeta. Associado a isso,
durante a análise visual, as NsF e G foi observado aumento de tamanho médio e do I.P. três meses
após o preparo, caracterizando instabilidade da formulação.
As nanoesferas foram consideradas adequadas em relação ao tamanho médio e I.P.
até concentrações de CloxB de 3,0mg/mL, uma vez que concentrações maiores de fármaco levaram
a um aumento significativo e excessivo de tamanho médio em relação à formulação branca.
O potencial zeta reflete o potencial elétrico das superfícies das partículas, que é
influenciado pela carga dos diferentes componentes das NS, como os tensoativos e polímeros
(Couvreur e cols., 2002). Lecitinas, poloxamer e polímeros são os componentes que mais afetam
este parâmetro. Apesar de muitos polímeros, especialmente os á-hidróxi-ácidos como o PLA e
lecitinas gerarem carga negativa na superfície da partícula, tensoativos não-iônicos como poloxamer
tendem a reduzir o valor absoluto do potencial zeta. Valores de potencial zeta acima de 30 mV
(positivos ou negativos) indicam suspensões de NS (NsA e B) mais estáveis porque a repulsão entre
as partículas previne a agregação (Couvreur e cols., 2002; Hans & Lowman, 2002). Ainda, o
potencial zeta é muito útil para investigar se a substância biologicamente ativa está encapsulada no
núcleo da nanoestrutura ou simplesmente adsorvida na superfície (Couvreur e cols., 2002). Calvo e
colaboradores (1997b) prepararam emulsões submicrométricas e NC de PCL, em que a QUI foi
incorporada à interface óleo/água para fornecer carga positiva às nanopartículas (+ 37 mV a + 61
mV), objetivando facilitar a interação destas com as membranas biológicas, aumentando a
capacidade de transportar fármacos e prevenindo a desestabilização das nanoestruturas devido a
adsorção de cátions e proteínas catiônicas presentes nos fluidos biológicos.
Em relação às medidas de potencial zeta (tabela 12), os valores mantiveram-se
positivos, caracterizando um recobrimento pela quitosana (Santander-Ortega e cols., 2011; Meng e
cols., 2011), até concentrações de CloxB de 5,0 mg/mL. A utilização de 0,15 % de QUI na
formulação conferiu um potencial zeta positivo para as formulações em torno de +25 mV,
corroborando com os valores positivos obtidos por outros autores para nanopartículas com o mesmo
revestimento (Calvo e cols., 1997b; Campos e cols., 2003; Prego e cols., 2005). O potencial
positivo é devido à presença dos grupamentos amino do polissacarídeo quitosana (Calvo e cols.,
1997a; Felt e cols., 1998). O diâmetro de partícula e população unimodal mostraram-se compatíveis
59
RAQUEL, GC
com as nanopartículas obtidas pelo método de nanoprecipitação (Fessi e cols., 1988; Couvreur e
cols., 2002). Os valores elevados de potencial zeta favorecem a estabilidade da formulação, uma
vez que as partículas não sofrerão atração umas pelas outras e, portanto, não tenderão à agregação.
Quando uma concentração mais elevada de CloxB, de 7,0 mg/mL, é adicionada à formulação, é
observada uma brusca redução do potencial zeta, para valores negativos e próximos a zero. O valor
negativo sugere uma interferência do fármaco sobre o recobrimento com quitosana, uma vez que
prevalece uma carga característica de NP que contêm somente o polímero PCL (Tabela 12) (Verger
e cols.,1998).
A tendência à sedimentação da suspensão coloidal de nanopartículas em longo prazo
e estudos de estabilidade podem ser monitorados pela determinação de mudanças na distribuição de
tamanho de partículas das suspensões coloidais (Magenhein e cols., 1991). No estudo de
estabilidade de armazenamento, as NS também mantiveram tamanho próximo ao inicial, sem
diferença significativa (p<0,05), até concentrações de fármaco de 3,0 mg/mL (Figura 25).
Figura 25: Estabilidade no armazenamento referente ao diâmetro médio de NS recém-preparadas e
após 90 dias (4ºC). Volume final das formulações: 5 mL. *Aumento significativo de tamanho após 2 meses (p<0,05)
utilizando teste ANOVA.
Quanto às nanocápsulas, os resultados de tamanho médio mostram um aumento
significativo (p<0,05) no tamanho das NC com o aumento da concentração do fármaco, o que está
de acordo com trabalho anterior (Araujo, 2009). Entretanto, mesmo com essa elevação, as partículas
60
RAQUEL, GC
ainda apresentam tamanho médio e I.P. aceitáveis até concentrações de CloxB de 7,0 mg/mL
(Tabela 13).
Araújo(2009) relatou que o tamanho da NC revestida com quitosana contendo
cloxacilina benzatina a 2,5 mg/ml foi de 291 nm com IP de 0,319. Já no presente trabalho estes
resultados foram de 353,7 nm e 0,398. Isto pode ser devido aos diferentes tipos de óleo, tensoativos
e peso molecular da quitosana utilizados.
Tabela 13: Efeito da concentração de Cloxacilina Benzatina no tamanho de NC
NC
CloxB
(mg/mL)
Tamanho médio
(nm) ± DPa
Índice de
Polidispersão
(nm) ± DPa
Potencial
Zeta (ζ)
(mV) ± DPb
30
-
263,7 ± 1,6
0,155 ± 0,02
+23,7±2,3
NcA
0,5
264,9 ± 3,7
0,194 ± 0,03
+39,4±0,7
NcB
1,0
295,3 ± 2,0
0,204 ± 0,04
+41,3±2,7
NcC
2,0
282,0 ± 6,1
0,230 ± 0,02
+28,2±0,7
NcD
2,5
353,7 ± 5,3
0,398 ± 0,07
+30,8±0,7
NcE
3,0
328,3 ± 1,5
0,336 ± 0,02
+28,5±2,3
NcF
5,0
403,2 ± 11,7
0,403 ± 0,01
+34,7±1,9
NcG
7,0
349,6 ± 1,9
0,335 ± 0,01
-26,7+1,3
NcH
8,0
429,1 ± 6,3
0,402 ± 0,02
-24,3±4,3
NcI
10,0
380,6 ± 4,9
0,252 ± 0,02
-28,2±5,4
Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=4), bDP= desvio padrão (n=3). Formulações significativamente
diferentes (p<0,05) utilizando teste ANOVA.
As medidas de potencial zeta (Tabela 13) apresentaram valores positivos para
concentrações de fármaco até 5,0 mg/mL, caracterizando um recobrimento superficial das NP pela
quitosana (Santander-Ortega e cols., 2011; Meng e cols., 2011; Araújo, 2009), semelhante ao que
foi observado para as nanoesferas. Se comparado o valor de NC revestida com quitosana contendo
2,5 mg/ml deste trabalho (+30 mV) com o do trabalho anterior de Araujo (+16,5mV) é observado
um valor absoluto maior do primeiro em relação ao segundo, indicando uma maior estabilidade em
longo prazo (Araújo, 2009). Em concentrações mais elevadas de CloxB, de 7,0; 8,0 e 10,0 mg/mL,
nota-se uma brusca redução do potencial zeta, para valores negativos próximos a -20 mV. Assim
61
RAQUEL, GC
como suposto para as NS, o valor negativo sugere uma interferência do fármaco sobre o
recobrimento com quitosana. Provavelmente, o sal benzatino está dissolvido no núcleo oleoso da
NC, enquanto a cloxacilina, que apresenta carga negativa, interage com as cargas positivas da
quitosana. Sendo assim, com um excesso de fármaco, todas as cargas positivas da quitosana podem
ter sido neutralizadas pelas cargas negativas da cloxacilina, restando ainda um excedente de cargas
negativas, devido à alta concentração do fármaco.
No estudo de estabilidade de armazenamento, as NC mantiveram tamanho próximo
do inicial, sem diferença significativa (p<0,05), até concentrações de fármaco de 5,0mg/mL (Figura
26).
Figura 26: Estabilidade no armazenamento referente ao diâmetro médio de NC recém-preparadas e
após 90 dias (4ºC). Volume final das formulações: 5 mL. *Aumento significativo de tamanho após 2 meses (p<0,05)
utilizando teste ANOVA.
4.2 Determinação do teor de fármaco encapsulado
4.2.1 Porcentagem e Eficiência de encapsulação
A porcentagem de encapsulação objetiva determinar o teor de fármaco incorporado
às nanoestruturas em relação ao total de fármaco presente na suspensão coloidal final de NP. A
determinação da quantidade de fármaco associada às NP é especialmente complexa devido ao
62
RAQUEL, GC
tamanho reduzido dessas, o que dificulta a separação da fração de fármaco livre da fração associada
à NP. Uma técnica de separação bastante utilizada é a ultracentrifugação, na qual a concentração de
fármaco livre e solúvel, presente na suspensão, é determinada no centrifugado. Por sua vez, a
concentração total de fármaco é geralmente determinada pela completa dissolução da NP em um
solvente adequado. Dessa maneira, a concentração do fármaco associado às nanoestruturas é
calculada pela diferença entre as concentrações de fármaco total e livre. Os valores de porcentagem
e eficiência de encapsulação (EE) estão apresentados nas tabelas 14 e 15.
As NS apresentaram baixa EE para formulações contendo maiores concentrações de
fármaco (5,0 e 7,0 mg/mL), devido à instabilidade dessas nanopartículas. Um resultado
contraditório foi uma baixa porcentagem e eficiência de encapsulação para a NS contendo 0,5
mg/mL de CloxB, o que pode ter ocorrido devido a problemas de agregação pelo potencial de
superfície.
A análise da quantidade em massa de CloxB em NS, considerando a eficiência de
encapsulação, mostra que pode ser encapsulada uma quantidade máxima de 1437,21 µg de fármaco.
Tabela 14: Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NS com variadas
concentrações de CloxB
CloxB
NS
(mg/mL)
%
Encapsulação
± DPa
Eficiência de
Encapsulação
(%) ± DPa
Massa de pptb
(μg)
Massa CloxB
encapsuladac
(μg)
NsA
0,5
54,86 ± 1,73
21,89 ± 0,77
10,59
109,47
NsB
1,0
74,26 ± 2,26
47,85 ± 1,62
155,97
478,53
NsC
2,0
67,20 ± 0,51
41,83 ± 0,16
127,89
836,66
NsD
2,5
67,15 ± 1,86
46,57 ± 3,48
91,26
1164,31
NsE
3,0
67,79 ± 1,55
47,90 ± 3,5
97,19
1437,21
NsF
5,0
55,23 ± 2,05
25,96 ± 1,40
1696,48
1298,43
NsG
7,0
44,67 ± 5,02
13,98 + 1,89
3521,69
979,19
Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=3).bprecipitado dosado após filtração das formulações. cmassa CloxB
encapsulada considerando a eficiência de encapsulação.
Semelhante ao ocorrido com as nanoesferas, as NC também apresentaram baixa EE
para formulações contendo maiores concentrações de fármaco (5,0; 7,0; 8,0 e 10,0 mg/mL), devido
à instabilidade dessas nanopartículas. Entretanto, a porcentagem de encapsulação foi maior que a de
63
RAQUEL, GC
nanoesferas. Esse resultado está de acordo com estudos realizados anteriormente, que mostram que
as NC encapsulam maior quantidade em peso de fármacos lipofílicos que as NS (Barratt, 2000;
Santos-Magalhães & Mosqueira, 2010) devido a problemas estéricos de acomodação das moléculas
na matrix polimérica.
Observa-se, pela comparação entre as tabelas 14 e 15, que as nanoesferas são mais
influenciadas pelo aumento da concentração de CloxB, sofrendo uma maior redução na
porcentagem de encapsulação. As NC, teoricamente, podem acomodar uma maior quantidade de
fármaco em seu núcleo líquido, se comparado à estrutura matricial das NS (Mosqueira e cols.,
2006). Há uma quantidade máxima de CloxB que pode ser encapsulada tanto em NC quanto em NS,
provocando menores efeitos na carga superficial, no tamanho médio e na teor de fármaco
encapsulado.
Tabela 15: Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NC com variadas
concentrações de CloxB
(mg/mL)
% Encapsulação
± DPa
Eficiência de
Encapsulação
(%) ± DPa
Massa de
pptb (μg)
Massa CloxB
encapsuladac
(μg)
NcA
0,5
78,32 ± 1,97
58,14 ± 6,27
30,27
290,70
NcB
1,0
79,55 ± 0,26
52,65 ± 0,05
0,24
526,52
NcC
2,0
78,96 ± 0,41
36,90 ± 0,19
270,96
738,13
NcD
2,5
77,78 ± 0,29
36,16 ± 0,32
504,69
904,12
NcE
3,0
72,27 ± 0,19
21,80 ± 0,06
1298,31
654,07
NcF
5,0
59,46 ± 0,13
16,03 ± 0,04
2656,27
801,74
NcG
7,0
64,26 ± 0,39
11,54 ± 0,17
4839,31
808,35
NcH
8,0
64,36 ± 1,33
10,55 ± 0,69
5576,75
844,41
NcI
10,0
68,69 ± 0,41
12,45 ± 0,17
6736,62
1245,54
NC
CloxB
Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=3).bprecipitado dosado após filtração das formulações. cmassa CloxB
encapsulada considerando a eficiência de encapsulação.
De acordo com estudos publicados, diversos fatores são capazes de influenciar a
quantidade de fármaco associada a sistemas nanoestruturados, dentre os quais se destacam as
características físico-químicas do fármaco (Calvo e cols., 1996), o pH do meio (Brasser e cols.,
1991), as características da superfície das partículas ou a natureza do polímero (Vila e cols., 2002) e
64
RAQUEL, GC
a quantidade de fármaco adicionada à formulação (Brasser e cols., 1991). Modificando-se as
características de superfície das partículas, é possível obter diferentes taxas de encapsulação do
fármaco, para uma mesma concentração inicial do mesmo.
Em comparação a resultados já obtidos em nosso laboratório (Araújo, 2009), as
nanopartículas recobertas de quitosana apresentadas no presente trabalho mostraram uma maior
taxa de encapsulação de CloxB se comparadas a NP contendo somente polímero PCL (potencia zeta
negativo). Como exemplo, podemos citar as NC com 0,5 mg/mL de CloxB. As NC negativas
apresentaram 67% de porcentagem de encapsulação e 34% de eficiência de encapsulação, enquanto
para as NC positivas, recobertas com quitosana, os valores foram de 78,32% e 58,14%,
respectivamente (Tabela 15) (Araújo , 2009). Os dados reforçam os argumentos já discutidos nesse
trabalho, de que a presença da quitosana, um polímero carregado positivamente, pode interagir com
o ânion cloxacilina e favorecer a sua adsorção na superfície das NP.
4.3 Análise visual e de microscopia óptica das nanopartículas
Após um mês de preparo das nanopartículas, essas foram analisadas visualmente
quanto à formação de precipitado. Foi observada formação de precipitado nas seguintes
formulações:
- NsF e NsG (contendo 5,0 e 7,0 mg/mL de CloxB, respectivamente)
- NcF, NcG, NcH e NcI (contendo 5,0; 7,0; 8,0 e 10,0 mg/mL de CloxB,
respectivamente).
Nas figuras 28, 29 e 30, é possível observar a formação de precipitado, atribuído ao
fármaco, em algumas das formulações citadas acima. As imagens, associadas ao aumento de
tamanho médio após três meses e à redução na porcentagem e eficiência de encapsulação e na carga
superficial de tais formulações, indicam que o aumento da concentração de fármaco, reduz a
estabilidade da partícula. Além disso, sugerem que o limite de fármaco passível de ser encapsulado,
foi excedido. A estabilidade dos sistemas coloidais foi, provavelmente, comprometida pela redução
da carga superficial das nanopartículas, induzindo agregação dessas.
65
RAQUEL, GC
Figura 27: Fotografia de formulações de nanoesferas, com destaque para a formação de precipitado
provocado pelo aumento da concentração de fármaco à formulação. (a) NsC (1,0 mg/mL de CloxB)
e (b) NsG (7,0 mg/mL de CloxB).
Figura 28: Fotografia de formulações de nanoesferas, comparando duas formulações com a mesma
composição, mas com diferentes concentrações de fármaco. (a) NsC contendo 1,0 mg/mL de
CloxB, sem precipitado aparente e (b) NsF contendo 5,0 mg/mL de CloxB, com precipitado
aparente.
66
RAQUEL, GC
Figura 29: Fotografia de formulações de nanocápsulas, com destaque para a formação de
precipitado provocado pelo aumento da concentração de fármaco à formulação. (a) NcC (1,0
mg/mL de CloxB), (b) NcG (7,0 mg/mL de CloxB) e (c) NcI (10,0 mg/mL de CloxB).
Em seguida foram feitas fotomicrografias de algumas formulações, a fim de
visualizar cristais de fármaco nas formulações em que havia agregado aparente. As fotomicrografias
foram realizadas em Microscópio Óptico, obtendo-se imagens de duas NS (NsC e NsG) e duas NC
(NcG e NcI). A Figura 30, demonstra a imagem comparativa entre uma NS em que não há
formação de precipitado aparente (NsC) e uma em que há precipitado aparente (NsG). Para as
nanoesferas, mesmo aquelas em que há formação aparente de precipitado, não foi possível observar
cristais de fármaco. Apenas é possível visualizar agregados grosseiros, atribuídos tanto às partículas
quanto ao fármaco.
Figura 30: Fotomicrografia de formulações de nanoesferas, em que é possível comparar uma NsC
em que não há formação de precipitado (a) e uma NsG em que há formação de precipitado (b).
67
RAQUEL, GC
Destaca-se a visualização de agregados, atribuídos às nanopartículas e ao fármaco, na imagem b.
Aumento 1000x.
Na Figura 31, estão representadas fotomicrografias de nanocápsulas com formação
de precipitado e é possível observar estruturas semelhantes a cristais, que foram atribuídas à CloxB.
A imagem A representa a NcG, sendo possível observar cristais refringentes à esquerda e à direita
da imagem, além de alguns agregados de nanopartículas. Na imagem B, que representa a NcI, notase ao centro um grande agregado de cristais, atribuído à CloxB a vários agregados de nanopartículas
por toda a extensão da lâmina.
Figura 31: Fotomicrografia de formulações de nanocápsulas, em que é possível observar cristais,
atribuídos à precipitação da CloxB. (a) NcG e (b) NcI. Aumento 1000x
4.4 Análise morfológica das nanopartículas
Nanoesferas recobertas por QUI contendo 0,5mg/mL CloxB encapsulada foram
analisadas morfologicamente por microscopia de força atômica. As imagens obtidas podem ser
visualizadas nas figuras 33, 34 e 35 e. Nas imagens da Figura 32, podem ser observadas partículas
depositadas sobre a mica recentemente clivada, indicando a presença de estruturas esféricas
nanométricas. É possível visualizar também uma maior quantidade de partículas apresentando
tamanhos variados, o que está de acordo com o aumento do índice de polidispersão das NS com
fármaco encapsulado (0,133) em relação à NS branca (0,099). Na imagem topográfica da Figura 33,
é possível notar que há um aumento no tamanho médio da NS contendo fármaco (312,5 nm) em
relação à NS branca (280,5), o que está de acordo com as medidas de tamanho médio por ECF.
68
RAQUEL, GC
(a)
(b)
Figura 32: Imagem de MFA de nanoesferas, altura (a) e imagem de fase (b). Escaneamento 10 μm
x 10 μm. Z range: 200 nm. Observa-se grande número de partículas com tamanhos variados.
Figura 33: Imagem de altura de MFA de nanoesferas contendo 0,5 mg/mL de CloxB (a) e perfil
topográfico (b) demonstrando altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis e
verdes).Relação d/h = 5,1.
Na imagem tridimensional da Figura 34, são observadas estruturas esféricas, assim
como observado anteriormente para NS brancas.
69
RAQUEL, GC
Figura 34: Imagem tridimensional de nanocápsulas contendo 0,5 mg/mL de CloxB analisadas por
MFA. Escaneamento de 5 x 5 μm. Z range: 200nm.
Quando foram feitas imagens sucessivas da mesma região da amostra de NS (Figura
35), é observado um escurecimento da NP a cada passagem da sonda, o que pode ser mais um
indício de que a NS apresenta estrutura mais macia e deformável, não observado em nanoesferas
produzidas exclusivamente a partir do PCL.
70
RAQUEL, GC
Figura 35: Imagens de MFA de fase de NS destacando escurecimento das NP com a passagem
sucessiva da sonda (a, b,c,d). Escaneamento 10 μm x 10 μm. Z range: 341 nm.
Ainda a respeito das NS contendo 0,5 mg/mL de CloxB, à medida que as NP vão
escurecendo pela passagem da sonda, a superfície irregular da partícula fica mais visível (Figura
36).
71
RAQUEL, GC
Figura 36: Imagem MFA de NS, fase, destacando a superfície irregulares da NS com 0,5 mg/mL
de CloxB e seu escurecimento pela passagem sucessiva da sonda (a, b, c). Escaneamento 1,5 μm x
1,5 μm. Z range: 341 nm.
Conforme já discutido no capítulo 1, a obtenção de imagens de NC é difícil, devido
ao arraste da partícula pela sonda. Nas figuras 38 e 39, são apresentadas imagens de NC contendo
1,0 mg/mL de CloxB, depositadas sobre mica recentemente clivada.
A Figura 37 demonstra estruturas esféricas de NC, com uma maior dispersão de
tamanho médio, o que está de acordo com os dados obtidos anteriormente, uma vez que a adição de
fármaco à formulação contribui para o aumento do índice de polidispersão das partículas.
Figura 37: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NC com 1,0 mg/mL de CloxB, destacando
escurecimento das NP com a passagem sucessiva da sonda (a, b,c,d). Escaneamento 10 μm x 10
μm. Z range: 400 nm.
72
RAQUEL, GC
A Figura 38 apresenta o perfil topográfico da NC com 1,0 mg/mL de CloxB, a qual
apresenta relação diâmetro/altura (D/h) de 7,5, caracterizando achatamento da NC devido à sua
estrutura vesicular, conforme discutido anteriormente no capítulo 1.
Figura 38: Imagem de MFA de NC contendo 1,0 mg/mL de CloxB (a) e perfil topográfico (b)
demonstrando altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis e verdes). Relação
d/h = 7,5.
Foi avaliado também o tamanho médio das NP contendo CloxB, medidos por MFA,
e estes comparados à medida realizada pela técnica de ECF. Os resultados estão apresentados na
Tabela 16
Tabela 16: Tamanho médio de NS e NC com 1,0 mg/mL de CloxB analisadas por ECF e MFA
Tamanho médio ±
Tamanho médio ±
Índice de
DPa (nm) (ECF)
DPb (nm) (MFA)
polidispersãoc
NS
230,8 ± 0,71
295,91 ± 30,89
0,101 ± 0,02
NC
295,3 ± 1,98
328,8 ± 47,04
0,204 ± 0,04
NPa
a
Volume final de 5 mL; bDP=desvio padrão (n=4); camostras monodispersas (abaixo de 0,3); dDP= desvio padrão
(n=3).
73
RAQUEL, GC
4.5 Solubilidade da CloxB em PBS com diferentes quantidades de leite
A solubilidade em PBS e PBS+30% leite (Nestlé) apresentou-se elevada, com
valores acima do esperado. Esta elevada solubilidade pode ter sido favorecida pela temperatura
(37ºC) e pela presença de grupamentos carboxila e hidroxila da cloxacilina, a qual está presente na
CloxB em proporção de 2 moléculas de cloxacilinas para 1 de benzatina (2:1). Os dados da Tabela
17 mostram que a solubilidade da CloxB em PBS contendo 70% de leite é maior que a solubilidade
em PBS contendo 30% de leite. Dessa maneira, o meio PBS + 70% de leite foi selecionado para os
estudos de cinética de liberação in vitro. Além disso, deve-se considerar que a CloxB pode se ligar a
algumas substâncias presentes no leite, tais como gorduras, proteínas, entre outros, o que aumenta a
solubilidade desse fármaco em amostras contendo leite.
Tabela 17: Solubilidade da CloxB em diferentes meios
Meios
Solubilidade
(μg/mL) a 37ºC
PBS
713,47
PBS + 30% leite
675,30
PBS + 70% leite
1070,96
PBS: tampão fosfato salino pH7,4. Leite em pó integral ressuspendido conforme fabricante (Nestlé).
Os resultados da Tabela 17 demonstram que a solubilidade da CloxB no óleo
Miglyol® é aproximadamente quatro vezes maior que a sua solubilidade no óleo Velsan®. Esse
resultado justifica a utilização do Miglyol® em substituição ao Velsan® para o encapsulamento de
CloxB, apesar de ter sido demonstrado no capítulo 1 que o Velsan® leva à formação de NC de
menor tamanho que o Miglyol® (dados apresentados na Tabela 9 – capítulo 1).
Outra informação obtida na Tabela 17 é a respeito da hidrofobicidade da CloxB.
Observa-se que a solubilidade do fármaco em água é cerca de duas vezes menor que em Miglyol®,
indicando que a CloxB possui, predominantemente, grupamentos hidrofóbicos em sua composição,
o que justifica a boa encapsulação desse em NS e NC. O resultado de solubilidade em água está de
acordo com dados previamente obtidos por nosso grupo de pesquisa (Araújo, 2009), em que foi
encontrada solubilidade de 0,3 mg/mL. Em relação à solubilidade da CloxB em meios contendo
PBS e leite, essa apresenta quase o dobro de solubilidade em PBS contendo 70% de leite. Esta
maior solubilidade pode ter sido obtida pelo fato de o leite possuir substâncias como lipídeos,
proteínas, entre outras, às quais a CloxB pode se ligar, aumentando sua solubilidade nesse meio
74
RAQUEL, GC
(Rossi & Wright, 1997). Sendo assim, esse meio foi selecionado para os estudos de liberação em
leite.
4.6 Determinação da cinética de Liberação in vitro
O sistema de liberação controlado de fármacos foi desenvolvido com o objetivo de
favorecer a condução, captação, retenção e liberação do fármaco no local e doses adequados e por
um período prolongado (Langer, 1990). O estudo do perfil de liberação in vitro fornece informações
fundamentais a respeito dos processos físico-químicos e dos mecanismos que influenciam a taxa de
liberação de fármacos. Os dados obtidos favorecem uma abordagem científica para o a projeção e
desenvolvimento de sistemas de liberação sustentada com propriedades desejáveis (D´Souza e cols.,
2005).
Três possíveis mecanismos de liberação do fármaco a partir de sistemas constituídos
de polímeros biodegradáveis são os seguintes, a saber: (i) difusão através do polímero, (ii) difusão
através dos poros da matriz polimérica e (iii) liberação do fármaco através da erosão do polímero
(Jeong e cols., 2003). Entretanto, predizer o perfil de liberação exato de um fármaco ainda é difícil,
pois esse perfil é governado por diversos fatores, dentre os quais: interação polímero-fármaco
(Blanco e cols., 1997), a interação fármaco-fármaco (Kang e cols., 2008), a adsorção de água (Desai
e cols., 2010), e o fechamento dos poros existentes na matriz (Kang e cols., 2008).
O transporte através do polímero pode ocorrer quando a molécula do fármaco for
pequena e hidrofóbica (Raman e cols., 2005). Contudo, o fármaco deve entrar na fase aquosa, na
superfície ou nos poros dentro dos sistemas de liberação controlada, antes de ser liberado. O
fármaco encapsulado também pode ser liberado sem qualquer transporte devido à degradação do
polímero, isto é, sua erosão. Esta gera poros e assim aumenta a taxa de difusão (Raman e cols.,
2005). Parte do fármaco pode também, permanecer adsorvida à superfície da partícula. Nesse caso,
o fármaco adsorvido se dissolve em contato com o meio de liberação, sendo liberado mais
rapidamente, num chamado “efeito burst”, o qual, em geral, é seguido por uma liberação mais lenta
a partir do interior da partícula (Dash e cols., 2011a).
No caso de NC, que são sistemas
reservatório, espera-se, em geral, uma liberação mais rápida do fármaco que de NS, que são
sistemas matriciais. Isto porque a difusão do fármaco através da parede polimérica das NC deve ser
mais rápida que através da matriz polimérica das NS.
A degradação do PCL é bastante lenta, se comparada a outros polímeros (Pitt, 1990).
O mecanismo de liberação de fármacos a partir de sistemas coloidais contendo PCL é geralmente
dominado pela difusão do fármaco através da matriz polimérca (Sinha e cols., 2004; Mukerjee e
75
RAQUEL, GC
cols., 2007). Sendo assim, em geral formulações compostas por PCL liberam a droga em um padrão
bifásico, na qual a liberação em “burst” é mais acentuada para fármacos hidrofílicos que lipofílicos
(Dash e cols, 2011b).
A quitosana é um polímero hidrofílico e a difusão de água no interior e sua matriz é
rápida, anterior à sua degradação. Sendo assim, sistemas constituídos de quitosana absorvem água e
intumescem (Ren e cols., 2005), afetando a liberação de fármacos nesses sistemas. A liberação de
fármacos, a partir de sistemas particulados compostos de quitosana, usualmente segue três
mecanismos: (i) liberação a partir da superfície das partículas, (ii) difusão através da matriz
intumescida e (iii) liberação devido à erosão da superfície da partícula (Dash e cols., 2011a). Na
maioria dos casos, a liberação segue mais de um dos mecanismos citado. Na liberação a partir da
superfície da partícula, ocorre o chamado “efeito burst”, citado acima.
A liberação controlada através da difusão ocorre em três etapas: (a) a água penetra no
sistema particulado, (b) a matriz vítrea se torna emborrachada e intumesce, (c) a droga se difunde a
partir da matriz intumescida (Dash e cols., 2011a). Esse tipo de liberação é inicialmente lento, mas
se torna mais rápido quando o fármaco se dissolve e a matriz intumesce.
Nas formulações descritas no presente trabalho, há a influência dos polímeros PCL e
quitosana na liberação do fármaco CloxB. Assim, é provável que a liberação da CloxB resulte em
quatro possíveis mecanismos de liberação (Fig. 29):

Liberação de fármaco adsorvido à superfície da partícula (“efeito burst”);

Difusão através da matriz polimérica intumescida;

Difusão através dos poros do polímero.
O perfil de liberação é usado como base para a avaliação dos mecanismos envolvidos
no processo. Entretanto, conforme citado anteriormente, este perfil de liberação de fármacos é
algumas vezes bifásico ou trifásico. A interpretação quantitativa dos valores obtidos no teste de
liberação/dissolução é facilitada pelo uso de equações genéricas, que matematicamente traduzem a
curva de dissolução em função de alguns parâmetros relacionados com a forma farmacêutica (Costa
& Lobo, 2001). Vários modelos cinéticos têm sido propostos para descrever as características de
liberação do fármaco em sistemas poliméricos (Fredenberg e cols., 2011). Dentre estes, dois dos
mais importantes e facilmente aplicáveis, são o modelo de Higuchi e modeo de Korsmeyer-Peppas,
cujas equações são descritas abaixo:
76
RAQUEL, GC

Modelo de Higuchi
Mt/M∞ = KHt1/2

(1)
Modelo de Korsmeyer-Peppas
Mt/M∞ = Ktn
(2)
Onde Mt é a quantidade do fármaco liberada no tempo t, M∞ a quantidade total de
fármaco num tempo infinito, e K é a constante cinética.
O Modelo de Higuchi (1) descreve o mecanismo de liberação dos fármacos como um
processo de difusão baseado na lei de Fick, sendo dependente da raiz quadrada do tempo. Porém, o
uso desta relação em sistemas que intumescem, tais como aqueles compostos de quitosana, pode
tornar-se insuficiente, uma vez que esses sistemas podem sofrer erosão (Costa & Lobo, 2001).
Um dos critérios mais comuns para se escolher um modelo que melhor descreve o
perfil de liberação de determinada formulação é através do coeficiente de correlação linear, r 2. Para
tanto, realiza-se a regressão linear para cada modelo, sendo que o modelo mais adequado para
aquela formulação será aquele que apresentar o maior r2 (Costa & Lobo, 2001).
O Modelo de Korsmeyer-Peppas, 1983, (4) é geralmente usado para analisar a
liberação de formas farmacêuticas poliméricas quando o mecanismo não está bem esclarecido ou
quando resulta da combinação de dois processos aparentemente independentes: difusão do fármaco
(transporte Fickiano) e do chamado transporte caso II (não Fickiano, controlado pela erosão do
polímero e relaxamento das cadeias poliméricas). Os valores do expoente difusional (n) são usados
a fim de caracterizar diferentes mecanismos de liberação. A Tabela 18 mostra os valores de n
agrupados para cada geometria de forma farmacêutica correlacionando o mecanismo de liberação
proveniente a cada valor.
Tabela 18: Modelização dos mecanismos de liberação de fármacos a partir de sistemas poliméricos
de liberação controlada considerando as diferentes geometrias
Mecanismo de liberação do
fármaco
Expoente difusional (n)
Filmes
Cilindos
Esferas
0,5
0,45
0,43
Difusão fickiana
0,5 < n < 1,0
0,45 < n < 0,89
0,43 < n < 0,85
Transporte anômalo
1,0
0,89
0,85
Transporte caso II
> 1,0
> 0,89
> 0,85
Transporte super-caso II
Fonte: adaptado de Costa & Lobo, 2001.
77
RAQUEL, GC
Os resultados referentes aos perfis de liberação da CloxB a partir de NS e NC
poliméricas estão apresentados nas figuras 40 e 41.
Figura 39: Perfil de liberação in vitro de NP (NS 1,0mg/mL e NC 1,0mg/mL) a 37ºC em PBS em
condições sink (2,5% da solubilidade máxima de CloxB em PBS). Gráfico maior = tempos de 0 a
2880 minutos; Gráfico menor= tempos de 0 a 180minutos.
A dissolução da CloxB em PBS é mais rápida que sua liberação das NP nos
primeiros 180 minutos, confirmando a hipótese de liberação sustentada das NP (Figura 39).
Entretanto, após esse periodo a liberação da CloxB das NC é tão rápida quanto a dissolução do
fármaco livre. Essas diferenças podem ser atribuídas à capacidade das NS, em particular, em reter o
fármaco disperso na sua matriz polimérica (Irache e cols., 2011, Rao e cols., 2011). O efeito burst é
pronunciado para os dois tipos de NP, indicando uma grande quantidade de fármaco associado à
superfície das NP (40-60%). Esse resultado está de acordo com valores obtidos de potencial zeta,
discutidos previamente neste capítulo. Após 6 h (360 minutos), ambas as formulações apresentaram
liberação próxima a 100% (91% para NS e 89% para NC), mantendo a porcentagem de fármaco
liberada a partir desse tempo. Esse resultado está de acordo com trabalho anterior realizado por
nosso grupo de pesquisa(Araújo, 2009), onde NC revestidas de quitosana contendo 2,5 mg/mL de
CloxB apresentaram liberação em PBS contendo 1% de leite de mais de 70% após 6 h. Foi
determinado a LogP da CloxB, obtendo-se um valor de 0,6, o que indica uma substância com
relativa hidrofilia. Fármacos mais hidrofílicos, como a cloxacilina, em geral apresentam liberação
mais rápida em condições sink, mesmo quando encapsulados na forma de sal benzatino. Além disso
presença da quitosana, um polímero hidrofílico, favorece a captação de água, com conseqüente
78
RAQUEL, GC
intumescimento do polímero, facilitando a dissolução do fármaco e fornecendo uma liberação mais
rápida. Resultados anteriores, obtidos por nosso grupo de pesquisa (Araújo, 2009), mostraram que a
liberação de CloxB a partir de NC de PCL-QUI foi mais rápida que as de NC de PCL. A associação
do ânion cloxacilina com a interface da NP é, aparentemente, facilitada pela carga positiva dos
grupos de quitosana. A membrana de diálise no meio PBS parece não ser uma barreira à difusão,
porque o perfil de dissolução não se apresentou muito diferente do perfil de liberação. Esse fato
valida o método de diálise reversa para o estudo desse tipo de liberação em condições sink.
Figura 40: Perfil de liberação in vitro de NP (NS 1,0mg/mL e NC 1,0mg/mL) a 37ºC em PBS+
70% leite em condições sink (2,5% da solubilidade máxima de CloxB em PBS+leite). Gráfico
maior = tempos de 0 a 2880 minutos; Gráfico menor= tempos de 0 a 180minutos.
Formulações visando administração intramamária em vacas, durante ou após o
periodo de lactação, devem ser avaliadas em meios contendo baixas e altas procentagens de leite, de
acordo com o perído de administração (período seco ou período de lactação). A metodologia para
avaliar a liberação da droga de carreadores nanoparticulados nessas condições é bem mais
complexa, porque gotículas de leite, com cerca de 0,5 μm (Keenan e cols., 2000) interferem na
separação de NP do meio externo. Além disso, há a possibilidade da CloxB se associar a proteínas e
lipídeos do leite (Rossi & Wright, 1997), o que pode facilitar a liberação de drogas das NP. Por
outro lado, esse fato pode impedir a difusão da CloxB liberada para dentro da membrana de diálise,
mecanismo que ocorre na técnica de diálise reversa, comprometendo o experimento em presença de
leite. Sendo assim, entre as diferentes metodologias, a diálise direta é uma alternativa para o estudo
da liberação em meio contendo leite. Sua desvantagem é a simulação de liberação em meios nos
79
RAQUEL, GC
quais a contato entre a NP e o meio não é direta. Apesar disso, a diálise direta foi utilizada nesse
trabalho devido à sua simplicidade e aplicabilidade. O perfil de liberação da CloxB de PCL-QUINP em PBS contendo 70% de leite é mostrado na Figura 40. Há um burst inicial, mais pronunciado
para NC, assim como observado na liberação em PBS. A NC liberou CloxB mais rápido que a NS
ao longo de todo o experimento, pois NS são sistemas matriciais e liberam o fármaco mais
lentamente. Após 360 minutos, NS haviam liberado 37% da CloxB e as NC 47%, enquanto 67% da
CloxB livre havia sido dissolvida. Após 48 horas de experimento, a quantidade máxima de CloxB
liberada das NS era 70% e das NC era 73%. Esses resultados sugerem que as NP são capazes de
reter a CloxB em meios contendo leite. Uma vez que o meio utilizado no estudo se assemelha
àquele encontrado no local de administração – glândula mamária – a retenção de cerca de 30% da
CloxB, mesmo após 48 h de estudo, evidenciam a aplicabilidade dessas formulações. Os resultados
obtidos com essa metodologia foram diferentes daqueles obtidos em PBS, provavelmente devido às
diferentes técnicas aplicadas e à presença do leite no meio de liberação.
Visando auxiliar o entendimento dos mecanismos de liberação do fármaco, alguns
modelos matemáticos foram aplicados de forma à descrever matematicamente o fenômeno, para
ambas as técnicas de liberação in vitro. Na Tabela 19 são apresentados os valores de coeficiente de
correlação linear (r2), coeficiente difusional (n) e constante de velocidadede liberação (k) obtidos a
partir da construção de gráficos nos modelos de Higuchi (raiz quadrada do tempo em função da
porcentagem liberada) e modelo de Korsmeyer-Peppas. Além disso, foram construídas as equações,
correspondentes ao modelo selecionado para cada formulação.
Tabela 19: Parâmetros cinéticos de liberação resultantes da aplicação dos modelos matemáticos de
Higuchi e Korsmeyer-Peppas aos dados de liberação da CloxB a partir de NC e NS
Formulação/meio de
Modelo de Higuchi
modelo de Korsemeyer-Peppas
Mecanismo de
liberação
r2
K
r2
k
n
transporte
NSPBS
0,6998
0,046
0,9671
0,163
0,269
Difusão Fickiana
NCPBS
0,6053
0,036
0,8093
0,298
0,174
Difusão Fickiana
NSPBS-Leite
0,9320
0,021
0,989
0,057
0,326
Difusão Fickiana
NCPBS-Leite
0,8709
0,026
0,9832
0,044
0,389
Difusão Fickiana
r2: coeficiente de correlação linear; k: constant de velocidade de liberação, n: expoente difusional, NS: nanoesfera,
NC: nanocapsula. NS e NCPBS = estudo de liberação em PBS a 37 oC. NS e NCPBS-Leite = estudo de liberação em PBS
com 70% de leite integral a 37oC; Modelos de Higuchi e Korsemeyer-Peppas (Costa & Lobo, 2000).
80
RAQUEL, GC
A liberação da CloxB a partir de NP de PCL-QUI é melhor descrita pelo modelo
matemático descrito por Korsmeyer-Peppas (1983) (Tabela 19), conforme o coeficiente de
correlação linear obtido (entre 0,809 e 0,989). Correlações menores foram obtidos para o modelo de
Higuchi (entre 0,6053 e 0,9320). O valor de expoente difusional, abaixo de 0.43 para todas as
formulações, indica que a liberação é regida principalmente pela difusão Fickiana a partir da matrix
polimérica.
A análise dos resultados obtidos no estudo de liberação mostra que a administração
de uma dose de CloxB encapsulada em NP tem potencial de controle da liberação da CloxB em
meio similar ao presente no interior da glândula mamária, se comparado ao fármaco livre.
4.7 Interação de nanocápsulas em modelo de perfusão de úbere bovino isolado
O úbere da vaca é composto por dois pares de glândulas mamárias, cada uma
drenada por um teto. Conforme descrito previamente, a produção do leite ocorre em glândulas
exócrinas que possuem alvéolos dilatados, onde o leite é estocado e em seguida liberado nos ductos.
Tais ductos convergem para a cisterna da glândula (Gehring & Smith, 2006). Em geral, após a
administração intramamária, a formulação deve ir contra o fluxo de leite, em ductos galactóforos,
para atingir o tecido proximal do úbere (em relação ao teto). Úberes isolados perfundidos foram
usados para avaliar a interação entre o tecido e a NC contendo CloxB e marcadas com quitosana
fluorescente. A atividade de LDH menor que 10 U/L e consumo de glicose maior que 0.6 mg/h
(correspondendo a 10% da glucose perfundida) garantiram a viabilidade dos úberes durante a
perfusão, no período de experimento (Kietzmann e cols., 2010). A Figura 41 mostra cortes
histológicos representativos da glândula mamária a 5, 10 e 15 cm da base do teto e um corte
controle (tecido sem NC). Podem ser observados ductos galactóforos (setas vermelhas) em todos os
cortes. A 5cm, três ductos fluorescentes estão evidenciados, mostrando a presença de NC com
quitosana marcada. Nos cortes a 10 e 15 cm é possível ver um ducto fluorescente em cada imagem,
considerando que, com o aumento da distância vertical da base do teto, há uma redução no número
e diâmetro dos ductos. Esses resultados indicam uma migração vertical das NC a partir do local de
aplicação, até regiões mais proximais do úbere (em relação ao teto). Estudos preliminares, usando
formulações convencionais de cloxacilina, descreveram que a concentração da droga diminuía com
o aumento da distância vertical da base do teto (Kietzmann e cols., 2010). Esse fato contribui para a
falha terapêutica no tratamento da mastite, pois os patógenos estão geralmente localizados nas
regiões mais proximais do úbere, como nas células envolvidas na produção e estocagem do leite
(Gruet e cols., 2001). As fotomicrografias mostram claramente a presença de fluorescência aderida
81
RAQUEL, GC
a tais regiões do úbere. Isso indica que provavelmente um tempo de contato mais prolongado dos
fármacos com os patógenos possa ocorrer nestes sítios do úbere bovino. Além disso, as NC
submicrônicas aparentemente migram contra o fluxo da glândula mamária, o que é favorecido pelo
movimento browniano intrínseco às nanopartículas. Uma vez que as vacas estavam em lactação
antes do abate e considerando que continuou ocorrendo produção de um pseudo-leite durante todo o
experimento, os resultados obtidos são promissores para estudos mais aprofundados. Portanto, uso
de carreadores nanométricos de fármacos se revela uma estratégia interessante no tratamento da
mastite.
Figura 41: Interação de NC em modelo de perfusão de úbere bovino. Glândula mamária fixada em
suporte de metal para experimento ex vivo (a), cortes histológicos representativos de tecido
mamário em microscopia de campo brilhante (b1 e c1) e de fluorescência (b2 e c2). Corte de tecido
controle (sem NC) (b1 e b2) e cortes de tecido da glândula mamária a 5, 10 e 15 cm da base do teto
após 6 horas de administração intramamária de NC de quitosana contendo CloxB (c1 e c2). As setas
vermelhas indicam os ductos galactóforos. Destaca-se a fluorescência visualizada em todos os
cortes de 5, 10 e 15 cm, demonstrando presença de NC nas regiões tanto proximais quanto distais
da base do teto. Barra = 0,15mm.
82
CAPÍTULO III
Liofilização de Nanopartículas
83
RAQUEL, GC
1. OBJETIVO GERAL
Liofilizar suspensões de nanopartículas, contendo CloxB, utilizando diferentes
condições de congelamento e crioprotetores. Realizar a caracterização físico-quimica e morfológica
do material liofilizado.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Liofilizar as formulações otimizadas de nanocápsulas e uma nanoesferas contendo 1mg/mL
de CloxB encapsulado, utilizando duas condições de congelamento – freezer -80ºC e
nitrogênio líquido – e cinco concentrações de dois crioprotetores – sacarose e glicose.

Caracterizar as nanocápsulas e nanoesferas liofilizadas quanto ao tamanho, índice de
polidispersão e potencial zeta;

Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de CloxB nas nanopartículas após liofilização e
avaliar seus efeitos sobre esses parâmetros;

Avaliar os efeitos da liofilização sobre as características de morfologia das nanopartículas
por microscopia de força atômica.
84
RAQUEL, GC
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
Para os experimentos de liofilização foram usados sacarose (Isofar, Brasil) e glicose
(Vetec, Brasil), como crioprotetores. Além desses reagentes, foram usados todos os materiais
necessários à produção de NC e NS, conforme descrito no capítulo II.
Nos experimentos em modelo de perfusão em úbere bovino isoladoforam utilizados
cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, diidrogenofosfato de
sódio e hidrogenocarbonato de sódio, todos obtidos da Sigma-Aldrich (Brasil). D(+)-glicose foi
obtida da Vetec (Brasil) e dióxido de carbono e oxigênio da White-Martins (Brasil).
3.2 Preparo de nanopartículas
As nanocápsulas e nanoesferas foram preparadas conforme a metodologia descrita no
capítulo II (Mosqueira e cols., 2011). No estudo de liofilização foram usadas tanto NC quanto NS
contendo 1,0 mg/mL de CloxB.
3.3 Liofilização de nanopartículas
Selecionou-se uma nanocápsula e uma nanoesfera, com as quais foram realizados
experimentos de liofilização. A liofilização foi realizada em liofilizador L101 (Liobras, Brasil), que
atinge temperatura de -45 ± 5ºC e possui bomba de vácuo, permitindo que a pressão do sistema
fique em torno de 150 μHg. Cada formulação de nanopartícula foi liofilizada variando-se
parâmetros de congelamento, tipo e concentração de crioprotetores. O volume de amostra inserido
no liofilizador não ultrapassou 30% da capacidade desse, um parâmetro pré-fixado nos
experimentos descritos neste trabalho.
As condições utilizadas tanto para nanocápsulas quanto para nanoesferas, no presente
trabalho foram:
- Congelamento por 24h a -80ºC, seguido de liofilização por 24 horas;
- Congelamento em nitrogênio líquido (-196ºC) por 2 minutos, seguido de liofilização por 24
horas;
85
RAQUEL, GC
- Uso de sacarose ou glicose como crioprotetores nas concentrações de 2,5; 5; 10; 25 e 30%
(p/v).
Assim, a cada 0,5 mL da suspensão de nanopartículas foi adicionado mais 0,5 mL da
solução de crioprotetor em variadas concentrações, com posterior agitação, em recipientes de
plástico, conforme Tabela 20.
Tabela 20: Formulações liofilizadas com variadas concentrações de crioprotetores.
Açúcar
Sacarose
Glicose
Açúcar % (p/v)
Formulação de
nanoesferas (Ns)
Formulação de
nanocápsulas (Nc)
2,5
Ns S 2,5%
Nc S 2,5%
5,0
Ns S 5%
Nc S 5%
10,0
Ns S 10%
Nc S 10%
25,0
Ns S 25%
Nc S 25%
30,0
Ns S 30%
Nc S 30%
2,5
Ns G 2,5%
Nc G 2,5%
5,0
Ns G 5%
Nc G 5%
10,0
Ns G 10%
Nc G 10%
25,0
Ns G 25%
Nc G 25%
30,0
Ns G 30%
Nc G 30%
3.4 Caracterização físico química de nanopartículas
Após o preparo das NP, todas foram submetidas à caracterização físico-química por
meio da medida de distribuição de tamanho em Nanosizer N5 PLUS Beckmann Coulter (Fullerton,
EUA), conforme descrito no item 3.3.1 do capítulo I. Algumas formulações foram selecionadas
para medida de potencial zeta em Zetasizer 3000HS (Malvern Instruments, UK) conforme descrito
no item 3.3.2 do capítulo I.
86
RAQUEL, GC
3.5 Determinação do teor de fármaco encapsulado
O teor defármaco encapsulado foi determinado para algumas formulações
selecionadas de NC e NS. A seleção de tais formulações foi feita de acordo com as medidas de
tamanho médio obtidas pela técnica de Espectroscopia de correlação fotônica (ECF). Formulações
que apresentaram menor variação de tamanho médio e índice de polidispersão, antes e após a
liofilização, foram selecionadas.
3.6 Análise morfológica de formulações liofilizadas
A análise morfológica de NP contendo 1,0 mg/mL de CloxB encapsulada foi
realizada por microscopia de força atômica (MFA) conforme metodologia descrita no capítulo I.
87
RAQUEL, GC
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Liofilização de nanopartículas
4.1.1 Tamanho médio de nanopartículas liofilizadas
O tamanho médio e o índice de polidispersão das nanoesferas e das nanocápsulas
contendo 1,0 mg/mL de CloxB, foram avaliados, antes e após a liofilização, e os resultados estão
apresentados nas tabelas 21 e 21.
Na Tabela 21 são apresentados os resultados de tamanho médio e índice de
polidispersão de nanoesferas liofilizadas utilizando dois tipos de crioprotetores (glicose e sacarose)
e duas condições de congelamento (-80oC e -196oC – nitrogênio líquido). Foi avaliada a eficácia
comparativa de glicose e sacarose em proteger as NS do estresse provocado pela etapa de
congelamento, com resultados expressos quanto ao tamanho médio e índice de polidispersão (I.P.) .
Além disso, foi avaliada também, a influência da condição de congelamento no tamanho médio e
I.P. de NP.
Na primeira parte da tabela, são apresentados os resultados da liofilização de NS sem
adição de crioprotetores, congeladas a -80ºC por 24h e a -196ºC (nitrogênio líquido) por 5 minutos.
Foram observados, nesses casos, agregação das NS e aumento significativo do tamanho médio e
índice de polidispersão, destacado pela grande variação positiva nos tamanhos médios, I.P., além de
relação de tamanhos médios final e inicial (Tf/Ti), de 2,34 para NS congelada a -196ºC e 2,40 para
NS congelada a -80ºC. Dados semelhantes já foram observados por diversos autores, tanto para
nanopartículas quanto para lipossomas (Konan e cols., 2002; Nounou e cols., 2005; Abdelwahed e
cols., 2006d), uma vez que os crioprotetores, quando presentes na formulação, protegem as NP dos
efeitos danosos do congelamento, evitam a desestabilização e conseqüente agregação dessas.
Na segunda parte da tabela, são apresentados os resultados das formulações de NS
liofilizadas com sacarose em cinco diferentes concentrações (2,5-30%). É possível observar que, o
congelamento a -196ºC (nitrogênio líquido), levou a uma menor variação no tamanho médio e do
I.P. das NS. Esse resultado foi anteriormente observado por outros autores (Abdelwahed e cols.,
2006d). Esses dados podem ser mais claramente visualizados pela relação Tf/Ti, a qual apresentou
um número maior de valores próximos a 1,0 para as formulações de NS congeladas a -196ºC.
88
RAQUEL, GC
Tabela 21: Variação do tamanho médio e índice de polidispersão de nanoesferas congeladas a 80ºC ou a -196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.
Formulação
Variação de
tamanho médio final
e inicial (nm)
Variação de I.P. final
e inicial
Tf/Ti
Ns 0% (-196ºC)
+
413,2*
+
0,73
2,34
Ns 0% (-80ºC)
+
429,9*
+
0,74
2,40
Ns S 2,5% (-196oC)
+
109,0*
+
0,03
1,35
Ns S 2,5% (-80oC)
+
171,1*
+
0,27
1,55
Ns S 5% (-196oC)
+
51,1*
+
0,06
1,16
Ns S 5%(-80oC)
+
65,5*
+
0,37
1,21
8,2
+
0,01
1,02
120,2*
+
0,38
1,39
- 0,07
1,11
0,81
2,44
- 0,06
1,17
ND
ND
Ns S 10% (-196oC)
Ns S 10% (-80oC)
+
+
Ns S 25% (-196oC)
Ns S 25% (-80oC)
Ns S 30% (-196oC)
+
442,8*
+
53,9*
+
Ns S 30% (-80oC)
Ns G 2,5% (-196oC)
Ns G 2,5% (-80oC)
Ns G 10% (-196oC)
Ns G 10% (-80oC)
+
ND
72,9*
+
0,20
1,23
110,5*
+
0,27
1,36
14,7
+
0,06
1,04
111,1*
+
0,36
1,36
- 18,4
- 0,03
0,94
0,03
1,05
+
+
Ns G 5% (-196oC)
Ns G 5% (-80oC)
36,8
+
+
+
18,3
+
Ns G 25% (-196oC)
- 35,3
- 0,13
0,88
Ns G 25% (-80oC)
- 11,7
- 0,09
0,96
Ns G 30% (-196oC)
- 21,9
- 0,07
0,93
Ns G 30% (-80oC)
- 6,6
- 0,05
0,98
S: Sacarose. G: Glicose. I.P.: índicede polidispersão. Variação no tamanho médio final e inicial = tamanho médio
após liofilizar – tamanho médio antes de liofilizar. Variação no I.P. final e incial = I.P.após liofilizar – I.P. antes de
liofilizar. Tf/Ti= tamanho final (após liofilização)/tamanho incial (antes da liofilização). ND=não
determinado.*Formulações com diferença significativa do tamanho médio final em relação ao tamanho médio inicial
(306,9nm).
Quando um congelamento ultra-rápido é aplicado à amostra, como no caso da
imersão em nitrogênio líquido, o crioprotetor mantém-se uniformemente disperso por toda a
89
RAQUEL, GC
formulação. Já no congelamento lento, o crioprotetor pode distribuir-se heterogeneamente na
amostra, reduzindo sua capacidade de proteção para as NP. Além disso, o congelamento lento leva a
formação de cristais de gelo maiores, os quais são prejudiciais na manutenção da integridade da
matriz da NP, resultando numa estrutura desordenada do produto final (Chen e cols., 2010).
Ainda na segunda parte da tabela, é observado que concentrações maiores de
sacarose, de 5 a 30% - no congelamento a -196ºC - e de 5% e 10% - no congelamento a -80ºC levaram a uma redução do tamanho médio das NS, indicando que há uma concentração mínima
necessária de crioprotetor capaz de proteger as NP dos danos provocados pelo processo (Liversidge
e cols., 1994). Nas amostras congeladas a -196ºC, as concentrações de 25 e 30% de sacarose ainda
mostraram-se satisfatórias, com relações Tf/Ti próximas a 1,0. Já para as amostras congeladas a
-80ºC, as NS liofilizadas com 25 e 30% de sacarose apresentaram alta taxa de formação de
precipitado após ressuspensão, além de uma valor Tf/Ti de 2,44 para NS com 25% de sacarose. Esta
diferença, ocorrida entre as duas condições de congelamento, pode ser atribuída à heterogeneidade
de distribuição da solução do crioprotetor na amostra durante o congelamento lento (-80ºC por
24h). Uma vez que as soluções mais concentradas de sacarose apresentam alta viscosidade, é
possível que parte da solução tenha migrado para o fundo do recipiente antes do congelamento.
Sendo assim, apesar de concentrações mais altas de crioprotetores serem capazes de proteger
melhor as NP (Engel e cols., 1994; Liversidge e cols., 1994), nesse caso não houve boa distribuição
da solução de sacarose na amostra, dificultando a ação do crioprotetor na mesma.
Para a sacarose, as melhores condições encontradas, em termos de tamanho médio e
relação Tf/Ti, foram: congelamento a -196ºC utilizando 10% e 25% de sacarose (Ns S 10% e Ns S
25%, -196ºC).
Na terceira parte da tabela, são apresentados os resultados de liofilização de NS com
glicose em cinco diferentes concentrações (2,5-30%). Assim como observado para a sacarose, no
caso de NS liofilizadas com glicose, o congelamento a -196ºC também apresentou melhores
resultados de tamanho médio e I.P. Ainda na terceira parte da tabela, observa-se que um aumento da
concentração de sacarose de 2,5 até 30%, nas duas condições de congelamento, levou a uma
redução na relação Tf/Ti das NS. Nas amostras com 25 e 30% de glicose, congeladas a -80ºC,
apesar de ter havido redução do tamanho médio, a formulação quebrou, apresentando formação de
precipitado após a ressuspensão. Nas amostras congeladas a -196ºC, as concentrações de 25 e 30%
de sacarose ainda mostraram-se satisfatórias, mantendo os parâmetros da formulação próximos aos
anteriores à liofilização.
Um problema encontrado na liofilização de NS usando glicose como crioprotetor, foi
alteração de cor do pó formado. O produto formado na liofilização com sacarose apresentava cor
90
RAQUEL, GC
branca, já o produto formado na liofilização com glicose apresentou aspecto arroxeado. Já foi
relatada a formação de produto de cor amarelada em nanossuspensões liofilizadas, coloração que foi
atribuída à presença de Tween 80 na formulação (Van Eerdenbrugh e cols., 2007). O aparecimento
desta coloração pode ser atribuído a algum tipo de reação indesejável entre os constituintes da
formulação, que deverá ser investigado posteriormente.
Para a glicose, as melhores condições encontradas, em termos de tamanho médio e
relação Tf/Ti, foram: congelamento a -196ºC, utilizando 10% de glicose e congelamento a -80ºC,
utilizando 10% de glicose.
91
RAQUEL, GC
Tabela 22: Tamanho médio e índice de polidispersão de nanocápsulas congeladas a -80ºC ou a 196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.
Formulação
Variação de
tamanho médio final
e inicial (nm)
Nc 0% (-196ºC)
+
Variação de I.P.
final e inicial
Tf/Ti
695,4*
+
0,85
3,24
Nc 0% (-80ºC)
+
1032,6*
+
0,69
4,33
Nc S 2,5% (-196oC)
+
2866,8*
+
0,65
10,35
200,1*
+
0,32
1,66
3303,9*
+
1,34
11,66
Nc S 2,5% (-80oC)
Nc S 5% (-196oC)
+
+
Nc S 5% (-80oC)
+
122,7*
+
0,15
1,40
Nc S 10% (-196oC)
+
431,0*
+
0,66
2,41
Nc S 10% (-80oC)
+
111,2*
+
0,13
1,37
Nc S 25% (-196oC)
+
149,4*
+
0,27
1,49
ND
ND
0,26
1,41
ND
ND
Nc S 25% (-80oC)
ND
Nc S 30% (-196oC)
+
Nc S 30% (-80oC)
Nc G 2,5% (-196oC)
Nc G 2,5% (-80oC)
Nc G 5% (-196oC)
Nc G 5% (-80oC)
123,6*
+
ND
5203,0*
+
11641,8*
+
17,96
- 0,12
38,94
8625,0*
+
0,72
29,11
10020,8*
+
0,34
33,66
+
+
0,05
+
Nc G 10% (-196oC)
+
3549,5*
+
1,24
12,57
Nc G 10% (-80oC)
+
2641,3*
- 0,04
9,61
Nc G 25% (-196oC)
+
262,8*
+
0,63
1,86
Nc G 25% (-80oC)
+
434,0*
+
0,89
2,42
Nc G 30% (-196oC)
+
526,4*
+
0,79
2,72
Nc G 30% (-80oC)
+
147,6*
+
0,33
1,49
S: Sacarose. G: Glicose. I.P.: índicede polidispersão. Variação no tamanho médio final e inicial = tamanho médio
após liofilizar – tamanho médio antes de liofilizar. Variação no I.P. final e incial = I.P.após liofilizar – I.P. antes de
liofilizar. Tf/Ti= tamanho final (após liofilização)/tamanho incial (antes da liofilização).ND=não determinado.
*Formulações com diferença significativa do tamanho médio final em relação ao tamanho médio inicial (309,7nm).
92
RAQUEL, GC
Na Tabela 22 são apresentados os resultados de tamanho médio e índice de
polidispersão de nanocápsulas liofilizadas utilizando dois tipos de crioprotetores (glicose e
sacarose) e duas condições de congelamento (-80oC e -196oC – nitrogênio líquido). Também foram
avaliadas a eficácia comparativa de glicose e sacarose como crioprotetores e a influência da
condição de congelamento no tamanho médio e I.P. de NP.
Na primeira parte da tabela, são apresentados os resultados da liofilização de NC sem
adição de crioprotetores, congeladas a -80ºC por 24h e a -196ºC (nitrogênio líquido) por 5 minutos.
Após ressuspensão das NC liofilizadas, foi observada quebra da formulação, com grande
quantidade de precipitado formado, separando a amostra em duas fases, confirmando resultados já
esperados devido à ausência de crioprotetores.
Na segunda parte da tabela, são apresentados os resultados de NC liofilizadas com
sacarose em cinco diferentes concentrações (2,5-30%). É possível observar que, o congelamento a 196ºC (nitrogênio líquido), levou a uma maior variação no tamanho médio e I.P. das NC, resultado
mais facilmente visualizado pela relação Tf/Ti, a qual apresentou um número valores acima de 1,0
para todas as NS congeladas a -196ºC com sacarose. Para concentrações de 2,5 e 5% de sacarose os
valores Tf/Ti foram de 10,35 e 11,66, respectivamente, indicando que o crioprotetor não estava
presente em quantidade suficiente para proteger a NC da desestabilização e formação de agregados.
A sacarose foi mais eficiente em proteger as NC contra os danos provocados pela etapa de
congelamento em concentrações de 25 e 30%, ou seja, em concentrações mais elevadas. Esse
resultado está de acordo com dados anteriormente observados (Liversidge e cols., 1994), em que foi
demonstrado que concentrações de sacarose próximas a 25% eram mais adequadas para liofilização
de NP.
Para as NC congeladas a -80ºC, com sacarose, obteve-se resultados satisfatórios, para
sacarose a 2,5, 5 e 10%, com valores de Tf/Ti iguais a 1,66, 1,40 e 1,37, respectivamente. Usando
concentrações de 25 e 30% de sacarose, nessa condição de congelamento mais lenta, obteve-se um
produto com aspecto “açucarado” e com grande quantidade de precipitado após ressuspensão, não
sendo possível determinar seu tamanho médio.
Utilizando a sacarose, as melhores condições encontradas, em termos de tamanho
médio e relação Tf/Ti, foram: congelamento a -196ºC utilizando 25% e 30% de sacarose (Nc S 25%
e Nc S 30%, -196ºC) e congelamento a -80ºC utilizando 5% de sacarose (Nc S 5%, -80ºC).
Na terceira parte da tabela, são apresentados os resultados de liofilização de NC com
glicose em cinco diferentes concentrações (2,5-30%). Para concentrações de glicose até 10%,
ambas as condições de congelamento se mostraram inadequadas, resultando em partículas com
tamanho médio acentuadamente aumentado e grande formação de precipitado. Os valores de Tf/Ti
93
RAQUEL, GC
apresentaram-se todos acima de 9,0, indicando a formação de agregados e a provável ruptura da
partícula, com separação de fases na amostra ressuspendida.
Com o uso de concentrações mais elevadas de glicose, de 25 e 30% obteve-se
melhora nos produtos finais, com destaque para a Nc com 25% de glicose congelada a -196ºC – que
apresentou Tf/Ti=1,86 – e para a Nc com 30% de glicose congelada a -80ºC – que apresentou
relação Tf/Ti=1,49.
Para a glicose, as melhores condições encontradas, em termos de tamanho médio e
relação Tf/Ti, foram: congelamento a -196ºC, utilizando 25% de glicose e congelamento a -80ºC,
utilizando 30% de glicose.
A análise dos resultados sugere que, para a liofilização de NC, são necessárias
quantidades maiores de crioprotetores, uma vez que as NC possuem estrutura mais frágil que as NS,
e podem ser afetadas pelo estresse do congelamento, resultando na formação de agregados
(Abdelwahed e cols., 2006a; Abdelwahed e cols., 2006b). Para as NC há uma grande dificuldade no
estabelecimento de boas condições para liofilização. Abdelwahed e colaboradores(2006ª)
descreveram a liofilização de NC de PCL, com sucesso, utilizando sacarose e PVP a 5%. Já
Auvillan e colaboradores (1989), liofilizaram NC de PLA e PCL com trealose a 30%, empregando
diferentes tipos de óleos. Entretanto, o PVP inviabiliza a administração por vias parenterais e
mesmo intramamária, devido à baixa biodegradabilidade deste polímero. A trealose, por sua vez
possui custo elevado e poderia inviabilizar a produção em grande escala.
Em nosso grupo de pesquisa, foram liofilizadas NC brancas (sem fármaco),
utilizando sacarose, glicose, manitol e polidextrose, sendo que, somente amostras contendo sacarose
forneceram bons resultados (Ararújo, 2009).
4.1.2 Determinação do teor de fármaco encapsulado
Os valores de porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) das NP liofilizadas
estão apresentados nas tabelas 23 e 24. Os resultados comparam os valores de porcentagem e
eficiência de encapsulação das NP antes e após a liofilização, a fim de verificar a influência desse
processo no teor de fármaco encapsulado.
94
RAQUEL, GC
Tabela 23: Porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) de nanoesferas congeladas a -80ºC ou a
-196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.
Formulação
Variação na % encapsulação
final e inicial
Variação na EE final e inicial
Ns S 2,5% (-196oC)
ND
ND
Ns S 2,5% (-80oC)
-0,47
-13,28
Ns S 5% (-196oC)
-7,67
-23,15
Ns S 5% (-80oC)
3,5
-15,59
Ns S 10% (-196oC)
-5,75
-19,11
Ns S 10% (-80oC)
1,6
-25,7
Ns S 25% (-196oC)
4,28
-19,37
Ns S 25% (-80oC)
ND
ND
Ns S 30% (-196oC)
-1,64
-24,63
Ns S 30% (-80oC)
ND
ND
Ns G 10% (-196oC)
12,17
-4,87
Ns G 10% (-80oC)
ND
ND
Ns G 25% (-196oC)
9,04
-12,82
Ns G 25% (-80oC)
-21,77
-45,25
Ns G 30% (-196oC)
-11,48
-23,34
Ns G 30% (-80oC)
-59,37
-47,19
S: Sacarose. G: Glicose. EE: Eficiência de encapsulação. Variação na % encapsulação final e inicial = %
encapsulação após liofilizar – % encapsulação antes de liofilizar. Variação na EE final e incial = EE após liofilizar –
EE antes de liofilizar.
Experimentos de porcentagem e eficiência de encapsulação foram realizados em
amostras de NS liofilizadas e que, após ressupensão, apresentaram tamanho médio e I.P. dispersão
adequados, além de ausência de precipitado. A amostra Ns S 2,5% (-80ºC), por exemplo,
apresentou tamanho médio e I.P. adequados, porém, houve clara formação de precipitado após
ressupensão.
É observado que, para algumas formulações liofilizadas tanto com sacarose quanto
com glicose, houve aumento no teor de fármaco encapsulado após a liofilização, se comparados ao
resultado anterior ao processo. Esses dados provavelmente se devem às variações de absorbância e
95
RAQUEL, GC
área sob a curva obtidas por CLAE, uma vez que os experimentos para NS antes e depois de
liofilizadas foram realizados em dias diferentes.
Todas as NS liofilizadas com sacarose testadas, utilizando ambos os métodos de
congelamento, apresentaram porcentagem de encapsulação acima de 65% e EE acima de 20%. É
possível perceber que os valores de porcentagem de encapsulação estão mais próximos do valor
encontrado antes da liofilização, que era de 74,26%. Entrento, para os valores de EE, há uma nítida
redução após a liofilização. A EE leva em consideração as perdas durante o processo, sendo assim,
uma vez que há perdas na produção de NP, somadas às perdas durante a liofilização, valores
menores de EE depois da liofilização são esperados. Para as NS liofilizadas com sacarose, as que
forneceram
melhores
resultados
para
porcentagem
e
eficiência
de
encapsulação,
respectivamente,foram:
- Ns S 5% a -80ºC (77,76/32,26%)
- Ns S 25% a -196ºC (78,54/28,48%)
Entre as duas formulações citadas, a Ns liofilizada com sacarose a 25% foi
considerada a mais adequada devido aos resultados de tamanho médio e I.P., somados aos
resultados de teor de fármaco encapsulado.
Dentre as NS liofilizadas com glicose, a maioria apresentou porcentagem de
encapsulação acima de 60% e EE acima de 26%, com excessão das Ns congeladas a -80ºC, com 25
e 30% de glicose e da Ns congelada a -196ºC, com 30% de glicose, que apresentaram valores
baixos de EE, chegando a 0,66% para a Ns G 30% (-80ºC).
Conforme descrito anteriormente, todas as Ns congeladas com glicose, formaram pós
de cor arroxeda, o que pode ser um indício de reação que venha a instabilizar a amostra a longo
prazo. É possível que os valores satisfatórios de porcentagem e EE, chegando a até 43% de EE,
tenham sido obtidos uma vez que esse experimento foi realizado no mesmo dia da liofilização.
Assim como relatado para a sacarose, houve uma maior alteração nos valores finais
de EE que nos de porcentagem de encapsulação.
Para as NS liofilizadas com glicose, as que forneceram melhores resultados para
porcentagem e eficiência de encapsulação, respectivamente, foram:
- Ns G 10% a -196ºC (86,43/42,98%)
- Ns G 10% a -80ºC (79,8/37,6%)
- Ns G 25% a -196oC (83,3/35,03%)
Entre as três formulações citadas, a Ns liofilizada com glicose a 10% e -196ºC foi
considerada a mais adequada devido aos resultados de tamanho médio e I.P., somados aos
resultados de teor de fármaco encapsulado.
96
RAQUEL, GC
Tabela 24: Porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) de nanocápsulas congeladas a -80ºC ou
a -196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.
Formulação
Variação na %
encapsulação final e inicial
Variação na EE final e
inicial
Nc S 5% (-196oC)
ND
ND
Nc S 5% (-80oC)
+ 2,54
-22,71
Nc S 10% (-196oC)
-1,05
-8,98
Nc S 10% (-80oC)
-1,54
-30,32
Nc S 25% (-196oC)
+ 3,68
-9,48
Nc S 25% (-80oC)
ND
ND
Nc S 30% (-196oC)
+ 1,19
-19,52
Nc S 30% (-80oC)
ND
ND
Ns G 30% (-196oC)
ND
ND
Ns G 30% (-80oC)
+ 5,05
-19,39
S: Sacarose. G: Glicose. I.P.: índicede polidispersão. Tf/Ti: tamanho final (após liofilização)/tamanho incial (antes da
liofilização).
Em relação às NC, os estudos de teor de fármaco encapsulado foram realizados para
uma menor quantidade de amostra, devido a problemas de instabilidade dessas e a tamanhos médios
inadequados. Foram selecionadas, para os experimentos, amostras sem formação de precipitado e
com pouca variação de tamanho médio em relação à NC antes da liofilização. Entre as NC
selecionadas para o experimento, todas as liofilizadas com glicose e sacarose, utilizando ambos os
métodos de congelamento, apresentaram porcentagem de encapsulação acima de 78% e EE acima
de 22%.
Assim como ocorrido com as NS, entre as NC houve uma menor variação dos
valores de porcentagem de encapsulação que dos EE, comparando-se dados antes e após a
liofilização.
Apesar das NC terem apresentado um maior aumento de tamanho médio e I.P., após
a liofilização, que as NS, em relação aos resultados de teor de fármaco encapsulado, foram obtidos
resultados satisfatórios para todas as NC. Os dados apresentados indicam que houve sucesso na
97
RAQUEL, GC
liofilização de NC utilizando tanto a sacarose, em concentrações entre 5 e 30%, quanto a glicose a
30%.
Para as NC liofilizadas, tanto com sacarose quanto com glicose, as que forneceram
melhores resultados para porcentagem e eficiência de encapsulação, respectivamente, foram:
- Nc S 25% a -196ºC (83,23/43,17%)
- Nc G 30% a -80ºC (84,6/33,26%)
Entre as duas formulações citadas, a Nc liofilizada com sacarose a 25% e -196ºC foi
considerada a mais adequada devido aos resultados de tamanho médio e I.P., somados aos
resultados de teor de fármaco encapsulado.
O processo de liofilização pode comprometer, não só a estrutura das NP, como
também o teor de fármaco nelas encapsulado. Alguns estudos envolvendo lipossomas e
nanopartículas relatam a redução da eficiência de encapsulação de fármacos em amostras
liofilizadas, se comparadas com as mesmas antes da liofilização. Glavas-Dodov e colaboradores
(2005) descreveram uma pequena redução da eficiência de encapsulação em todas as amostras de
lipossomas liofilizadas com sacarose. Beck-Broichsitter e colaboradores (2011) demonstraram a
liofilização de nanopartículas contendo sildenafil. As NP eram compostas pelo polímero ácido
poli(D,L-co-glicólico) (PLGA) e pelo copolímero de álcool polivinínico e PLGA (PVA-co-PLGA)
e em nenhuma delas houve redução significativa do teor de fármaco encapsulado.
Os açúcares são bem conhecidos como agentes crioprotetores (Li e cols., 2000). Eles
podem formar uma matriz amorfa e vítrea em torno da partícula durante o congelamento, além de
exibirem uma baixa mobilidade molecular após secagem. Esta formação vítrea é essencial para
prevenir danos à partícula, tais como processos de fusão e cristalização, que poderiam levar ao
extravasamento de fármacos encapsulados (Van Winden e cols., 1999). Sendo assim, a adição de
crioprotetores como glicose e sacarose às formulações, colaboram para que haja apenas uma
pequena redução da eficiência de encapsulação.
4.1.3 Análise morfológica de nanopartículas liofilizadas
Imagens da morfologia de nanopartículas foram realizadas, para a mesma amostra,
antes e depois de sua liofilização, após ressuspensão do pó em água milli-Q. Objetivou-se investigar
possíveis alterações provocadas pelo processo de congelamento e secagem das NP, além do efeito
do crioprotetor sobre elas.
98
RAQUEL, GC
Para tanto, foram selecionadas duas amostras, uma de NS e uma de NC. Foram
selecionadas as amostras que forneceram melhores resultados de tamanho médio e teor de fármaco
encapsulado após a liofilização. Entre as NS, foi selecionada aquela liofilizada com 25% de
sacarose, congelada a -196ºC. Apesar de as NS liofilizadas com glicose terem apresentado bons
resultados, o produto formado apresentou coloração não característica, arroxeada, conforme
descrito anteriormente. A NC selecionada também foi aquela liofilizada com 25% de sacarose e
congelada a -196ºC.
As imagens de nanoesferas obtidas estão representadas pelas figuras 42, 43, 44 e 45.
A Figura 42 demonstra imagens de altura e fase de NS antes (a e b) e após a
liofilização (c e d). Pela observação das imagens é possível afirmar que as formulações, tanto antes
quanto depois de liofilizadas, apresentam forma esférica.
Figura 42: Imagens de MFA de altura (a e c) e fase (b e d) de NS com 1,0 mg/mL de CloxB.
Destaque para as estruturas esféricas tanto antes (a e b) quanto após a liofilização (c e d).
Escaneamento 20 μm x 20 μm (a e b) e 10 μm x 10μm (c e d). Z range: 500 nm (a e b) e 1000nm (c
e d).
99
RAQUEL, GC
Ainda a respeito da Figura 42, observou-se que algumas NS antes da liofilização,
apresentaram-se associadas (destaque em vermelho), o que não ocorreu nas imagens de NS
liofilizadas. Estas parecem ser protegidas da agregação pela presença do crioprotetor. Isto porque o
crioprotetor, ao recobrir as partículas, fornece um espaçamento entre elas, impedindo sua
agregação.
As NS liofilizadas estão depositadas sobre alguma substância, uma espécie de
“nuvem”, atribuída ao crioprotetor, uma vez que esse apresenta superfície hidrofílica (sacarose) e de
difícil secagem. Esses resultados já foram observados anteriormente por nosso grupo de pesquisa
(Araújo, 2009) e também foram atribuídas à sacarose. As “nuvens” de crioprotetor sobre as quais as
NS se depositam, podem ser melhor visualizadas nas figuras 48 e 49. Na Figura 43, são
representadas imagens de altura (a) e fase (b), nas quais observam-se as NS, sendo que algumas
estão depositadas sobre uma mancha clara, atribuída à nuvem de crioprotetor citada.
Figura 43: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NS liofilizadas e ressuspendidas em água,
destacando manchas claras, atribuídas ao crioprotetor sacarose, sobre as quais estão depositadas
algumas NS . Escaneamento 30 x 30 μm. Z range: 1000 nm.
100
RAQUEL, GC
Figura 44: Imagens de MFA de altura de NS liofilizadas, após ressupensão em água, destacando
manchas claras, atribuídas ao crioprotetor sacarose. Escaneamento 30 x 30 μm. Z range: 1000 nm.
Além dos resultados já discutidos, a análise da imagem tridimensional das NS após a
liofilização (Figura 45), permite inferir que os crioprotetores aparecem como camadas envolvendo
as partículas. É possível visualizar apenas a ponta dessas NS na imagem tridimensional, além de ser
vista uma superfície irregular, com morros, sobre a qual as NS estão depositadas. Essa superfície
provavelmente é causada pela sacarose. Observam-se também camadas de material sobre a lâmina
com baixa altura, que provavelmente são referentes às camadas de crioprotetor após secagem.
101
RAQUEL, GC
Figura 45: Imagem tridimensional de NS analisadas por MFA antes (a) e após a liofilização (b).
Destaque para a diferença de topografia das NS, com essas “mergulhadas” em crioprotetor (b),
sendo possível visualizar somente as pontas das NS. Escaneamento de 10 x 10 μm. Z range: 200nm.
As imagens de nanocápsulas obtidas estão representadas pelas figuras 46, 47, 48 e
49.
Na figura 46 são observadas imagens de altura e fase de NC antes (a e b) e após a
liofilização (c e d). Pela observação das imagens é possível afirmar que as formulações, tanto antes
quanto depois de liofilizadas, apresentam forma esférica. Assim como visualizado nas NS, as NC
liofilizadas, apresentaram camadas de crioprotetor envolvendo-as, o que é mais facilmente
visualizado na imagem de fase (item d). O crioprotetor utilizado na liofilização de ambas as NP é a
sacarose. Na imagem de fase da NC liofilizada (item d) também observa-se o espaçamento
provocado pelo recobrimento do crioprotetor, que impede a agregação e/ou fusão das NC.
102
RAQUEL, GC
Figura 46: Imagens de MFA de altura (a e c) e fase (b e d) de NC com 1,0 mg/mL de CloxB.
Destaque para as estruturas esféricas tanto antes (a e b) quanto após a liofilização (c e d).
Escaneamento 15 μm x 15 μm (a e b) e 10 μm x 10 μm (b e c). Z range: 500 nm (a e b) e 2000nm (c
e d). Destaca-se a formação de nuvem de crioprotetor sob as NC (d).
Imagens tridimensionais de NC antes e após a liofilização (Figura 47), indicam que
ocorre uma pequena alteração no aspecto geral das NC após a liofilização e ressupensão em água
milli-Q. A superfície sobre a qual foram vistas as NC liofilizadas apresenta diversas manchas,
atribuídas à presença do crioprotetor, sacarose.
103
RAQUEL, GC
Figura 47: Imagem tridimensional de NC analisadas por MFA antes (a) e após a liofilização (b).
Destaque para a diferença de topografia das NC, com aparente achatamento de algumas das
partículas após liofilização (b). Escaneamento de 15 x 15 μm. Z range: 500nm.
A agregação/fusão de NC é comum no processo de deposição e secagem da amostra
sobre a mica (Mosqueira e cols., 2005). Entretanto, para as NC liofilizadas, observa-se a
aproximação dessas, porém sem agregação. Este fato é devido ao recobrimento pela sacarose, o que
impede que as NP se agreguem, conforme discutido anteriormente. As imagens das figuras 53 e 54
demonstram claramente os dados discutidos aqui. São visualizadas, tanto pelas imagens de altura e
fase (Figura 48), quanto pela imagem tridimensional (Figura H), que as NC estão próximas, mas
sem sofrer agregação/fusão.
104
RAQUEL, GC
Figura 48: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NC liofilizadas e ressuspendidas em água,
destacando aproximação das partículas, sem agregação/fusão. Escaneamento 3 x 3 μm. Z range:
1500 nm.
Figura 49: Imagem tridimensional de NC analisadas por MFA após a liofilização. Não ocorre
agregação das NC devido ao recobrimento pela sacarose. Escaneamento de 3 x 3 μm. Z range:
1500nm.
4.1.4 Medida de potencial zeta de nanopartículas liofilizadas
105
RAQUEL, GC
Na Tabela 25 estão representados os valores de potencial zeta de nanopartículas
antes e após a liofilização. Os resultados indicam uma redução significativa das cargas superficiais
tanto de NS quanto de NC, porém ainda mantidas em valores elevados o suficiente para garantir a
estabilidade das formulações. Essa redução dos valores de potencial zeta pode ser atribuída ao
estresse decorrente do processo de congelamento e liofilização e também à presença do crioprotetor
sacarose.
Tabela 25: Medida de potencial zeta de nanopartículas antes e após a liofilização.
NP
Potencial
Zeta (ζ) antes da
liofilização
(mV) ± DPb
Potencial
Zeta (ζ) após a
liofilização
(mV) ± DPb
Ns S 25% (-196oC)
+ 51.9
+ 38.2
Nc S 25% (-196oC)
+ 41.3
+ 30.7
Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=4), bDP= desvio padrão (n=3). Formulações significativamente
diferentes (p<0,05) utilizando teste ANOVA.
106
RAQUEL, GC
CONCLUSÃO
107
RAQUEL, GC

Foram desenvolvidas e otimizadas duas formulações de NP preparadas pelo método de
nanoprecipitação. Uma nanocápsula e uma nanoesfera, as quais foram utilizadas no
encapsulamento do fármaco Cloxacilina benzatina;

A MFA foi uma técnica considerada precisa para determinar a variabilidade na relação
diâmetro/altura das nanoesferas. Está técnica permitiu observar as NS e NC com relação a
sua morfologia e determinar algumas características superficiais. As imagens de AFM de
NP brancas mostraram partículas de superfície irregular aparentemente macia,
características atribuídas à forma de organização da QUI na superfície das NP. A relação
diâmetro altura das NS foi de 5,1, acima do valor 1,0 normalmente encontrados para NS e
atribuído à presença da quitosana;

O fármaco cloxacilina benzatina foi eficientemente associado às nanoesferas até
concentrações de 3,0mg/mL. Acima dessa concentração as formulações apresentaram
redução acentuada da eficiência de encapsulação, além de aumento significativo do tamanho
e índice de polidispersão em relação à NS branca e formação de precipitado (a partir de
5,0mg/mL).

O fármaco cloxacilina benzatina foi eficientemente associado às nanocápsulas também até
concentrações de 3,0mg/mL, a partir da qual houve redução acentuada da eficiência de
encapsulação. Entretanto, diferente do ocorrido com as NS, a formação de precipitado só
ocorreu em formulações contendo fármaco a paritr de 7,0mg/mL.

Todas as formulações contendo QUI apresentaram valores positivos de potencial zeta,
caracterizando o recobrimento da NP pelo polímero. As exceções foram as NP contendo
CloxB encapsulada em concentrações elevadas (7,0mg/mL de CloxB em NS e 7,0; 8,0 e
10,0mg/mL de CloxB em NC). A redução brusca dos valores de potencial zeta dessas
formulações corroboram com os dados de instabilidade apresentados por elas, tais como
aumento significativo de tamanho e formação de precipitado.

As imagens de NS contendo 0,5mg/mL de CloxB mostraram uma maior variabilidade de
tamanho de partículas em relação à NS branca, além de superfície macia e deformável,
atribuída à associação entre o fármaco e a quitosana na superfície da NS.

A cloxacilina benzatina apresentou elevada solubilidade em mygliol®, em meio PBS e PBS
contendo 70% de leite.

No estudo de liberação, os gráficos mostram uma liberação inicial rápida para as duas NP,
seguida de uma liberação mais gradual do fármaco. Após 6h (360minutos), ambas as
formulações apresentaram liberação próximo a 100% (91% para NS e 89% para NC),
mantendo a porcentagem de fármaco liberada a partir desse tempo;
108
RAQUEL, GC

Os estudos de cinética de liberação em meio PBS contendo 70% de leite demonstrou uma
liberação incial rápida da CloxB, tanto de NC quanto de NS. Após 48 h de experimento,
cerca de 70% da CloxB havia sido liberada das NP. A manutenção de 30% do fármaco,
mesmo após 48 h do experimento indica que essas NP são capazes de manter o fármaco em
sua estrutura em meios contendo leite. Esse é um resultado promissor para o tratamento de
mastite, visando à liberação sustentada de fármacos;

Estudo da interação de NC em modelo de perfusão de úbere bovino isolado demonstrou uma
clara migração dessas nanopartículas até regiões mais altas do úbere bovino. Esse resultado
indica a possibilidade de obtenção de concentrações mais elevadasde fármacos nessas
regiões, o que, normalmente não é obtido com formulações convencionais;

Formulações otimizadas de NS e NC foram liofilizadas, avaliando-se duas condições de
congelamento (freezer a -80ºC e nitrogênio líquido a -196ºC) e dois crioprotetores (sacarose
e glicose). Resultados satisfatórios foram obtidos para a liofilização com 25% de sacarose e
congelamento em nitrogênio líquido, tanto para NC quanto para NS.
109
ANEXO I
Nanoesfera 1,0 mg/mL de CloxB – liberação em PBS
110
RAQUEL, GC
Nanocápsula 1,0 mg/mL CloxB – liberação em PBS
111
RAQUEL, GC
Nanoesfera 1,0 mg/mL – liberação em PBS + 70% de leite
112
RAQUEL, GC
Nanocápsula 1,0 mg/mL de CloxB – liberação em PBS + 70% leite
113
RAQUEL, GC
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