INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA ISOLAMENTO DE LINHAGENS
ENDOFÍTICAS E EDÁFICAS DE Bacillus thuringiensis Berliner EM CANADE-AÇÚCAR (Saccharum officinarum L)
Maria Elízia Pacheco Ferreira
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico, da Agência Paulista de
Tecnologia dos Agronegócios, para
obtenção do título de Mestre em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental no
Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Vegetal,
Segurança Alimentar e o Ambiente.
Orientador: Prof. Dr. Luís Garrigós Leite
São Paulo
2012
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Núcleo de Informação e Documentação - Biblioteca
Instituto Biológico
Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
__________________________________________________________________________
Ferreira, Maria Elízia Pacheco
Comparação de métodos para isolamento de linhagens endofiticas e edáficas de Bacillus
thuringiensis Berliner em cana de açúcar (Saccharum officinarum L). /
Maria Elízia Pacheco Ferreira. -- São Paulo, 2012.
Dissertação (Mestrado). Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação.
Área de concentração: Sanidade Vegetal, Segurança Alimentar e o Ambiente.
Linha de pesquisa: Controle biológico.
Orientador: Luis Garrigós Leite.
Versão do título para o inglês: Comparision of methods for isolation of endophytics and
edaphics Bacillus thuringiensis Berliner strains from sugar cane (Saccharum officinarum L).
1. Endofiticos 2. Edáficos 3. Bacillus thuringiensis 4. Controle biológico 5. Isolamento
I. Ferreira, Maria Elízia Pacheco II. Instituto Biológico (São Paulo). Programa de PósGraduação III. Título
IB/Bibl./2012/026
__________________________________________________________________________
iii
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO BIOLÓGICO
Pós-Graduação
Av. Cons. Rodrigues Alves 1252
CEP 04014-002 - São Paulo – SP
[email protected]
FOLHA DE APROVAÇÃO
Maria Elízia Pacheco Ferreira
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA ISOLAMENTO DE
LINHAGENS ENDOFÍTICAS E EDÁFICAS DE Bacillus thuringiensis Berliner
EM CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum officinarum L)
Orientador: Dr. Luis Garrigós Leite
Dissertação
apresentada
ao
Instituto
Biológico da Agência Paulista de Tecnologia
dos Agronegócios para obtenção do título de
Mestre em Sanidade, Segurança Alimentar e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Vegetal,
Segurança Alimentar e o Ambiente.
Aprovada em: 23 de Novembro de 2012
Banca Examinadora
Assinatura:
Prof. Dr.: Luis Garrigós Leite
Instituição: Instituto Biológico
Assinatura:
Prof. Dra.: Suzete Aparecida Lanza Destéfano
Instituição: Instituto Biológico
Assinatura:
Prof. Dr.: Ricardo Antônio Polanczyk
Instituição: Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP
iv
Aos amores da minha vida:
Augustinho (esposo), Camila, Natália e Vítor (meus três lindos filhos).
Pelo carinho e paciência que tiveram comigo nestes dois longos anos e pelas
muitas horas que lhes roubei durante a realização deste trabalho.
Dedico
v
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Dr. Luís Garrigós Leite, pelos ensinamentos e por ter sido tão
dedicado, gentil e paciente durante a realização deste trabalho, além de sua demonstração
de coragem e inovação em ingressar numa nova linha de pesquisa.
A minha grande amiga Patrícia Ballone, estagiária do Laboratório de Controle
Biológico e anjo que Deus enviou para me ajudar a realizar todos os experimentos que
culminaram nesta dissertação. Todas as palavras de agradecimento serão insuficientes para
demonstrar o meu apreço e minha gratidão.
Ao Dr. Valmir Antônio Costa, por ser tão generoso pelo empréstimo do aparelho
microscópico, sem o qual a pesquisa não teria se concretizado, e pelas lindas fotos que
tirou. E é claro, por ser uma pessoa tão agradável e gentil.
A todos os pesquisadores do Laboratório de Controle Biológico, em especial ao Dr.
Antônio Batista Filho, Dr. José Eduardo Marcondes de Almeida e Dra. Zuleide Alves
Ramiro, pelo apoio e boa convivência.
À Dra. Suzete Aparecida Lanza Destéfano, Dr. Ricardo Antônio Polanczyk e Dr.
Mário Eidi Sato, pelas preciosas contribuições durante a correção deste trabalho.
À mestre e amiga Marília Marcassi, pela ajuda durante a criação das lagartas de
Diatraea saccharalis, utilizadas durante os bioensaios.
A todos os amigos e companheiros do Laboratório de Controle Biológico que
conviveram comigo durante os dois longos anos, agradeço pela ajuda e compreensão,
especialmente às pessoas com as quais tive maior contato: Patrícia Ballone, Aline
Almeida, Ana Paula Ferreira, Ana Paula Pinto, Fábio Schmit, Lucas Simi, Mariana
Silva, Mariana Garcia, Marília Marcassi, Daysi Penna, Renata Marraschi, Roselaine
Bueno, Advaldo Francisco Barreto e Tatiane Pietrobon.
Ao mestre e amigo Fábio Schmit, por toda a ajuda que me prestou durante os
primeiros experimentos.
A minha amiga, Dra. Marise T. Suzuki, por todas as orientações acerca dos
procedimentos de isolamento e identificação da espécie bacteriana Bacillus thuringiensis.
À equipe do Instituto Agronômico de Campinas – IAC, em especial à Dra. Adriana
Parada e sua orientanda Raquel de Paula Freitas pela acolhida durante o período de
treinamento inicial que me ajudaram a dominar a técnica de isolamento dos microorganismos endofíticos.
Aos colegas de curso, professores, pesquisadores e funcionários do Programa de
Pós-graduação do Instituto Biológico, que muito me ensinaram, me divertiram e que me
transmitiram entusiasmo e esperança nos momentos mais difíceis. E à saudosa amiga Erica
vi
Pedro, pelo seu carisma e amizade e que de onde ela estiver possa nos ajudar a encontrar
paz de espírito.
À Usina São João, em especial à funcionária Monea, por ceder lagartas de D.
saccharalis que foram utilizadas durante os bioensaios.
À minha grande amiga e ex-orientadora Dra. Rosely Aparecida Liguori Imbernon,
grande incentivadora e valorizadora das minhas qualidades, agradeço pela linda carta de
recomendação.
Ao meu ex-professor Dr. João Lúcio de Azevedo, especialista em endofíticos e
responsável por instigar o meu interesse por esta linha de pesquisa, agradeço pelos
ensinamentos e por toda a ajuda durante a realização do projeto de dissertação.
A toda a equipe de amigos, alunos e funcionários da EMEF Prof. Manoel de Abreu e
EMEF Min. Synésio Rocha pela ajuda e compreensão durante as minhas inúmeras
ausências, necessárias durante a realização deste trabalho.
E finalmente, a toda a minha família: esposo, filhos, pais, irmãos (especialmente à
Helena), e aos verdadeiros amigos que sempre me incentivaram a trilhar novos caminhos e
a não desistir dos meus sonhos.
Agradeço a Deus por fazer parte da história de todas estas pessoas!
vii
“... Pedras no caminho?
Guardo todas, um dia vou construir um castelo…”
(Fernando Pessoa)
viii
FERREIRA, M.E.P. COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA ISOLAMENTO DE LINHAGENS
ENDOFÍTICAS E EDÁFICAS DE Bacillus thuringiensis Berliner EM CANA-DE-AÇÚCAR
(Saccharum officinarum L.). São Paulo. 2012 (Mestrado em Sanidade, Segurança Alimentar
e Ambiental no Agronegócio) – Instituto Biológico.
RESUMO
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L) é uma cultura de grande relevância econômica
e social no Brasil e no mundo, que apresenta grande número de pragas e patógenos
causadores de grandes prejuízos na lavoura. O Bacillus thuringiensis (Bt) mundialmente
utilizado como agente de controle biológico de vetores de patógenos humanos e pragas de
lavouras, incluindo da cana-de-açúcar foi o destaque deste trabalho, que teve por objetivo:
1. Isolar linhagens endofíticas de Bacillus sp. das raízes de cana-de-açúcar (Saccharum
officinarum L.) bem como do seu solo (edáficas), através de dois diferentes procedimentos
metodológicos; 2. Identificar as linhagens de Bacillus thuringiensis (Bt) através da avaliação
da patogenicidade dos isolados sobre o lepidóptero Diatraea saccharalis (Lepidoptera:
Crambidae) e da análise microscópica dos cristais proteicos, comparando a densidade das
populações endofíticas e edáficas. Onze amostras de raízes de cana-de-açúcar e de seu
substrato foram preparadas, submetidas a tratamento térmico e inoculadas em meio NA.
Para o isolamento pelo método OMS, utilizou-se Placas de Petri contendo meio NA
contendo Solução de Penicilina G (100mg/L), incubadas em BOD por cinco dias a 29º C. Já
no método Polanczyk, o isolamento deu-se através de duas fases, a primeira em placas de
Petri contendo NA (incubadas em BOD por cinco dias a 29º C) seguida de uma segunda
fase em meio CCY Broth líquido contendo Penicilina G (100mg/L), sob agitação durante 4872 horas. O método Polanczyk isolou maior densidade de linhagens de Bacillus sp. por
grama de solo e de raiz, comparado ao método OMS. Identificou-se 779 linhagens de
Bacillus sp. das quais 248 foram confirmadas como Bacillus thuringiensis (213 edáficas e 35
endofíticas), através dos testes de patogenicidade contra larvas de D. saccharalis e
observação microscópica dos cristais proteicos. A densidade de UFC de Bacillus
thuringiensis edáficas foi superior à endofítica. E a maioria das linhagens patogênicas que
ix
provocou 100% de mortalidade das larvas foi isolada do interior das raízes, indicando que as
linhagens endofíticas podem ter grande potencial como agente de controle biológico deste
inseto-praga. O teste de Tukey apontou diferenças significativas entre os dois
procedimentos para o isolamento de Bacillus sp. e Bacillus thuringiensis, mas não apontou
diferenças significativas entre os ambientes edáficos e endofíticos, exceto para o
procedimento de Polanczyk.
Palavras-chave: Endofíticos, Edáficos, Bacillus thuringiensis, Controle Biológico, Cana-deaçúcar, Isolamento.
x
FERREIRA, M.E.P.
COMPARISON OF TWO METHODS FOR ISOLATION
OF
ENDOPHYTICS AND EDAPHIC Bacillus thuringiensis Berliner STRAINS FROM SUGAR
CANE (Saccharum officinarum L.). São Paulo. 2012 (Mestrado em Sanidade, Segurança
Alimentar e Ambiental no Agronegócio) Instituto Biológico.
ABSTRACT
Sugarcane (Saccharum officinarum L) is a crop of great economic and social importance in
Brazil and in the world, which faces problems related to insect pests, mostly underground
pests that cause immense losses to the farms. Bacillus thuringiensis (Bt) is an agent used
worldwide for biological control of insect vectors of human diseases and pests of agriculture
crops, including sugarcane. This study aimed to: 1) Isolate endophytics strains of Bacillus sp.
from sugar cane (Saccharum officinarum L.) roots and from soil using two different
methodologies; and 2) Identify Bacillus thuringiensis (Bt) strains by evaluating its
pathogenicity to D.saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) and by microscopic analysis
detecting the presence of the protein crystals. Eleven samples of sugar cane roots and its
substrate were prepared, heat-treated and inoculated in NA. By the WHO procedure,
isolation was done using Petri dishes containing NA medium supplemented with Penicillin G
solution (100mg / L) incubated in BOD for five days at 29 °C. By the Polanczyk procedure,
isolation occurred across two phases: the first in Petri dishes containing NA, incubated in
chamber for five days at 29 °C, and de the second, in flasks containing liquid CCY Broth
medium + Penicillin G (100mg / L), kept shaking for 48-72 hours. The Polanczyk procedure
showed higher Bacillus sp. density per gram of soil and roots, compared WHO procedure.
779 strains were identified of which 248 were confirmed as Bacillus thuringiensis (213
edaphic and 35 endophytic) by using the pathogenicity tests against D. saccharalis larvae
and by observing microscopically the presence of protein crystals. Bacillus thuringiensis
showed higher UFC density in the edaphic environment compared to endophytic one.
Meanwhile, for the Polanczyk procedure, most endophytic Bt strains were considered highly
pathogenic to D. sacharallis larvae (100% mortality), indicating that endophytic environment
xi
is important site to survey Bt as potential agent for biological control of insects pests.
Furthermore, a significantly higher number of colonies of Bt was isolated by the Polanczyk
procedure compared to the WHO procedure, with no significantly difference comparing the
density of Bt in both environment, except for Polanczyk procedure.
Keywords: Bacillus thuringiensis isolation, Endophytes, Edaphic, Biological Control,
Sugarcane.
xii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 –
Lepidóptero Diatraea saccharalis, importante praga da cana-de-açúcar,
sendo parasitada pelo Himenóptero Cotesia flavipes, parasitoide
amplamente utilizado no controle biológico de pragas..................................9
FIGURA 2 –
Células de Bacillus thuringiensis mostrando o esporo ovalado (A) e o cristal
proteico........................................................................................................12
FIGURA 3 –
Características morfológicas da colônia de Bacillus thuringiensis .............13
FIGURA 4 –
Fotomicrografia de células vegetativas apontando a diferenciação
morfológica do Bacillus cereus, sem cristais proteicos (A) e Bacillus
thuringiensis – Bt com cristais proteicos (B) ...............................................13
FIGURA 5 –
Micrografia eletrônica de varredura mostrando os diferentes tipos de
cristais de Bacillus thuringiensis: cb: cristal bipiramidal; cc: cristal cuboide;
ce: cristal esférico; ep: esporo (aumento 10.000 x).....................................20
FIGURA 6 –
O ciclo de vida do Bacillus thuringiensis.....................................................21
FIGURA 7 –
Mecanismo de ação das toxinas Cry nos insetos-alvo ...............................22
FIGURA 8 –
Etapas do processo de desinfestação superficial do material vegetal: A –
Pesagem das raízes (10 g); B – Sucessão de lavagens do material vegetal
em Álcool (70%), Hipoclorito (2,5%) e Água Destilada Esterilizada (2x); C –
Plaqueamento, em triplicata, de alíquota da última água de lavagem....... 26
FIGURA 9 –
Preparo do extrato vegetal para posterior isolamento de Bacillus sp.: A –
Raízes desinfestadas e solução salina (0,8%) utilizadas no preparo do
extrato vegetal; B – Trituração das raízes através de um misturador; C –
Extrato vegetal preparado a partir das raízes trituradas em solução salina.
.....................................................................................................................27
FIGURA 10 –
Preparo das amostras de solo para posterior isolamento de Bacillus sp. A –
Pesagem do solo; B – Homogeneização e diluição seriada do solo...........28
FIGURA 11 –
Etapas do isolamento de Bacillus sp. (OMS, 1985): A – Tratamento térmico
da suspensão de solo e extrato vegetal (80º C/12 min.)l; B – Plaqueamento
em meio NA suplementado com Penicilina G (100 mg/L); C – Incubação em
BOD – 29º C/5 dias ....................................................................................29
xiii
FIGURA 12 –
Etapas do isolamento de Bacillus sp. (POLANCZYK, 2004): A – Tratamento
térmico das suspensões diluídas de solo e extrato vegetal (80º C/12 min.);
B - Plaqueamento em meio NA; C – Incubação em BOD a 29º C/5 dias; D –
Esporulação bacteriana em meio CCY Broth, suplementado com Penicilina
G (100mg/L) sob agitação (28º C por 48-72h)............................................31
FIGURA 13 –
Método de preservação das linhagens de Bacillus sp. através de tiras
esterilizadas de papel-filtro..........................................................................34
FIGURA 14 –
Diferentes tamanhos das colônias de Bacillus thuringiensis.......................48
FIGURA 15 –
Diferentes aspectos morfológicos de células de Bt.....................................49
FIGURA 16 –
Diferentes formas dos cristais proteicos presentes nas linhagens
identificadas de Bt. A – Estágio avançado de esporulação mostrando os
cristais bipiramidais e esféricos fora da célula vegetativa; B – Células
vegetativas contendo esporos e cristais esféricos......................................50
xiv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 –
Estimativa de produção de cana-de-açúcar nos Estados brasileiros (safra
2012/2013)....................................................................................................1
TABELA 2 –
Principais pragas da cultura da cana-de-açúcar...........................................6
TABELA 3 –
Principais agentes causadores de doenças da cana-de-açúcar...................7
TABELA 4 –
As 67 subespécies de Bacillus thuringiensis identificadas a partir da análise
sorológica do Antígeno Flagelar H..............................................................16
TABELA 5 –
Principais ordens de insetos susceptíveis às toxinas do Bt........................18
TABELA 6 –
Pontos de coleta das amostras de cana-de-açúcar e solo nos diferentes
municípios do Estado de São Paulo............................................................24
TABELA 7 –
Número médio de colônias bacterianas endofíticas, obtido a partir do
plaqueamento da água da última lavagem das raízes das onze amostras de
cana-de-açúcar (processo de desinfestação superficial)............................35
TABELA 8 –
Número de colônias de Bacillus sp./placa de Petri (9 cm), isoladas de 11
amostras de raízes de cana-de-açúcar e de seus respectivos substratos, a
partir de dois diferentes procedimentos metodológicos..............................37
TABELA 9 –
Número (± erro padrão) de colônias de Bacillus sp. e Bacillus
thuringiensis/0,01g solo ou raiz, isoladas de 11 amostras de raízes de
cana-de-açúcar e de seus respectivos substratos, a partir de dois
procedimentos metodológicos.....................................................................38
TABELA 10 –
Colônias de Bacillus sp. isoladas a partir de 11 amostras de raízes de
cana-de-açúcar e de seus respectivos substratos, através de dois distintos
procedimentos metodológicos.....................................................................38
TABELA 11 –
Número de colônias de Bacillus sp. por grama de raiz e de solo, isoladas a
partir de dois procedimentos, das onze amostras coletadas nos nove
municípios do interior de São Paulo............................................................40
TABELA 12 –
Porcentagem de linhagens edáficas e endofíticas de Bt, isoladas a partir
dos Métodos OMS (1985) e Polanczyk (2004)............................................42
xv
TABELA 13 –
Número de colônias de Bacillus sp. por placa de Petri (9 cm), isoladas de
11 amostras de raízes de cana-de-açúcar e de seus respectivos substratos,
a partir de dois diferentes procedimentos metodológicos...........................44
TABELA 14 –
Número de linhagens endofíticas e edáficas de Bt (amostradas e
esperadas) obtidas pelos métodos OMS e Polanczyk, e proporção em
relação às linhagens de Bacillus sp. dentro de 3 faixas percentuais de
mortalidade de Diatraea sacharallis............................................................45
xvi
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................. viii
ABSTRACT ........................................................................................................................... x
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................,.................xii
LISTA DE TABELAS.............................................................................................................xiv
1.
INTRODUÇÃO...................................................................................................................1
2.
OBJETIVO.........................................................................................................................3
3.
REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................................4
3.1. A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) – origem, aspectos socioeconômicos
e características botânicas.........................................................................................4
3.1.1. Principais
pragas
e
patógenos
associados
à
cana-deaçúcar................................................................................................................5
3.2.
O controle biológico e as pragas e patógenos da cana-de-açúcar (Saccharum
officinarum L.).............................................................................................................7
3.3.
Os
microrganismos
endofíticos
como
agentes
de
controle
biológico....................................................................................................................10
3.4.
Bacillus
thuringiensis
Caracterização
biológica,
ecológica
e
taxonômica................................................................................................................12
3.4.1. O histórico de utilização do Bt como agente de controle
biológico...........................................................................................................16
3.4.2. Características dos cristais proteicos do Bt e seu mecanismo de
ação.................................................................................................................19
4.
MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................24
4.1. Preparo das amostras ...............................................................................................25
4.1.1. Desinfestação superficial e trituração do material vegetal .............................25
4.1.2. Homogeneização e diluição seriada das amostras de solo............................27
4.2. Isolamento das linhagens endofíticas e edáficas de Bacillus sp...............................28
4.2.1. Protocolo adaptado da Organização Mundial de Saúde – OMS (1985).........28
4.2.2. Protocolo adaptado de Polanczyk (2004) .......................................................29
xvii
4.3. Identificação das linhagens de Bacillus thuringiensis.................................................31
4.3.1. Caracterização entomopatogênica dos isolados endofíticos e edáficos sobre
larvas de Diatraea saccharalis .(Lepidoptera: Crambidae).............................32
4.3.2. Análise microscópica dos cristais proteicos ...................................................32
4.4. Preservação das linhagens de Bacillus sp................................................................33
4.5. Análise Estatística ......................................................................................................34
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................................35
5.1. Protocolo OMS (1985) x Protocolo Polanczyk (2004)...............................................36
5.2. Ambiente Endofítico x Ambiente Edáfico ..................................................................39
5.3. Identificação das linhagens de Bacillus thuringiensis ...............................................41
6.
CONCLUSÕES................................................................................................................52
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................................53
8.
ANEXOS..........................................................................................................................60
1
1. Introdução
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é uma cultura de grande relevância na
economia brasileira, sendo utilizada como alimento animal (forragem in natura), matéria
prima para fabricação de alimentos, bebidas, biocombustíveis e geração de energia
produzida a partir do bagaço proveniente do seu processamento. Além disso, o cultivo de
cana-de-açúcar é uma atividade de agronegócios de grande importância social, pois é
responsável pela geração de empregos formais em percentual mais elevado do que a
grande maioria das culturas (PETTI; FREDO, 2009), mantendo cerca de 1,28 milhão de
postos de trabalhos formais (NEVES; TROMBIN; CONSOLI, 2010).
O Brasil é líder mundial de produção de cana-de-açúcar e possui uma área de
aproximadamente nove milhões de hectares que é destinada à cultura. O país produz
719,15 milhões de toneladas de cana-de-açúcar, e está à frente da Índia, que apresenta
produção de 277,75 milhões de toneladas e da China, com produção de 111,45 milhões de
toneladas da matéria-prima (FAO, 2012).
Segundo o Primeiro Levantamento da Safra 2012/13, realizado pela CONAB (2012),
a cultura da cana-de-açúcar ocupa cerca de 3% de toda a área agricultável do Brasil e a
região sudeste se destaca na sua produção, apresentando aproximadamente 63% do total
geral produzido pelo país, seguida das regiões centro-oeste (17%), nordeste (11%), sul (8%)
e norte (0,3%). O Levantamento aponta que o plantio de cana-de-açúcar ocorre em 17
Estados brasileiros, mas sete deles merecem destaque especial, sendo eles: São Paulo,
Minas Gerais, Paraná, Goiás, Mato Grosso do Sul, Alagoas e Pernambuco. O Estado de
São Paulo lidera o ranking de maior produção de cana-de-açúcar, perfazendo
aproximadamente 51% do total geral produzido pelo país, seguido pelos Estados de Minas
Gerais (9%) e Goiás (8%), conforme aponta a Tabela 1.
Tabela 1 – Estimativa de produção de cana-de-açúcar nos Estados brasileiros (safra 2012/2013)
Estados
Área colhida
(mil hectares)
Percentual
(Participação nacional)
São Paulo
Minas Gerais
Goiás
Paraná
Mato Grosso do Sul
Alagoas
Pernambuco
4.426
768
732
614
540
458
298
51%
9%
8%
7%
6%
5%
3%
Fonte: CONAB (2012)
2
O Brasil lidera o mercado mundial de açúcar e álcool, com produção estimada de
38,85 milhões de toneladas de açúcar e 23,96 milhões de metros cúbicos de álcool
(CONAB, 2012). E estes valores poderiam ser ainda maiores se não fossem os insetospragas e os fito-patógenos que atacam as diferentes estruturas da cana-de-açúcar.
As mudanças gradativas nas técnicas de cultivo da cana ocorridas nos últimos
tempos, com a substituição da colheita através da queimada pela colheita mecanizada (Lei
Estadual nº 11.241, de 19/09/2002) tem criado um ambiente favorável ao aumento de fitopatógenos, insetos pragas e ervas daninhas, responsáveis pela diminuição da produtividade
nos canaviais (V RIFIB, 2001), fato que sugere o desenvolvimento de métodos alternativos
que substituam os atuais produtos químicos utilizados para a proteção da lavoura
canavieira, já que muitas vezes, tais produtos são utilizados de forma inadequada e
transformam-se num mecanismo de seleção de novas pragas e doenças resistentes em
áreas agricultáveis, geradores de desequilíbrios ambientais e prejuízos econômicos.
Para minimizar tais problemas, o Brasil vem investindo em institutos de pesquisa e
desenvolvimento tecnológico, melhorando as técnicas agroindustriais e incentivando
programas de Controle Biológico de Pragas e Patógenos que afetam diversas culturas como
a cana-de-açúcar, caracterizada por imensa importância socioeconômica. Atualmente,
muitos programas de controle biológico de pragas e patógenos têm demonstrado que, além
dos parasitoides, outros organismos podem ser utilizados como agentes de controle
biológico. É o caso dos protozoários, fungos, bactérias, vírus e nematoides, utilizados não
só no campo agroflorestal, mas também na área de saúde, através do controle de insetos
vetores de doenças humanas e animais (POLANCZYK; GARCIA; ALVES, 2003; DOLINSKI;
LACEY, 2007; REVISTA G.BIO, 2010; VASCONCELOS, 2012).
Soares (2006) aponta algumas bactérias esporulantes do gênero Bacillus como os
principais agentes controladores de insetos-praga e vetores de doenças utilizados como
princípio ativo de bioinseticidas, tanto no Brasil como no mundo. Segundo o autor, 13.000
toneladas de bactérias do gênero Bacillus são utilizadas como bioinseticidas em todo o
mundo, com destaque para as espécies esporulantes de Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus
sphaericus, produtoras de endotoxinas que compõem o “corpo paraesporal” ou “cristal
proteico”, altamente tóxico, sobretudo para insetos da ordem Lepidoptera e Diptera (GLARE;
O’CALLAGHANS, 2000).
Atualmente muitas estirpes de Bt com potencial entomopatogênico têm sido isoladas
não só do solo como também do interior de vegetais, sendo estes denominados “microorganismos endofíticos” ou “endófitos” (AZEVEDO et al., 2002). O crescente interesse por
micro-organismos visando o manejo integrado de pragas de culturas de grande valor
econômico é inquestionável, o que por si só justifica o tema escolhido para o presente
trabalho.
3
2.
Objetivo
O presente estudo teve por objetivo:
1.
Isolar linhagens endofíticas de Bacillus sp. da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum
L.) bem como do seu solo (edáficas), através dos procedimentos metodológicos
sugeridos pela Organização Mundial de Saúde - OMS (1985) e Polanczyk (2004)
2.
Identificar as linhagens de Bacillus thuringiensis (Bt) através da avaliação da
patogenicidade dos isolados sobre Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) e da
análise microscópica dos cristais proteicos, comparando a densidade das populações
endofíticas e edáficas.
4
3.
Revisão de Literatura
3.1.
A cana-de-açúcar
(Saccharum
officinarum
L.)
–
origem,
aspectos
socioeconômicos e características botânicas.
A cana-de-açúcar é uma planta pertencente à divisão Embryophyta Siphonogama,
subdivisão Angiosperma, classe Monocotyledônea, ordem Glumiflorae, família Gramínea,
tribo Andropogoneae, gênero Saccharum e espécie Saccharum officinarum (ENGLER1;
GILG 1924 apud REIS, 1981). Segundo o mesmo autor, a teoria mais aceita assinala
Saccharum robustum como a espécie botânica de arranque e a Nova Guiné e ilhas vizinhas
como o lugar de origem, sendo Saccharum officinarum, a espécie originária da Oceania,
embora para Bastos (1987), a sua origem presumível é o norte da Índia. Ambos os autores
partilham da ideia de que depois de ser levada a inúmeros países da Ásia e da Europa, a
cana adquire importância socioeconômica, sendo utilizada na alimentação humana há
milhares de anos antes de Cristo.
Coube a Cristóvão Colombo em sua segunda viagem, a introdução desta cultura no
continente Americano, começando seu plantio nas Ilhas de São Domingos (atual República
Dominicana) no ano de 1494. No Brasil, o cultivo iniciou-se em São Vicente, no ano de
1522, trazida da Ilha da Madeira por Martim Afonso de Souza, distribuindo-se por todas as
regiões brasileiras, devido a sua boa adaptação às nossas condições geográficas e
climáticas, bem como devido a sua importância econômica (REIS, 1981).
No Brasil, o ciclo do açúcar provocou a introdução dos escravos africanos pelos
portugueses, sendo que esses africanos muito contribuíram para o desenvolvimento da
nossa agricultura (BASTOS, 1987). A autora cita ainda que a cana é uma gramínea
semiperene, na qual o sucesso econômico dos cortes subsequentes depende de um plantio
bem feito, em solo propício, com escolha adequada das variedades melhor adaptadas à
região e menos suscetíveis às pragas e patógenos locais. Depende também do controle
adequado, por parte do agricultor, dos herbívoros e patógenos que atacam a cultura.
O plantio tradicional da cana é feito por toletes, ocorrendo na região sudeste, em
duas épocas do ano: 1. entre fevereiro e abril – para cana-de-ano-e-meio (colhida a partir de
julho do ano seguinte/18 meses) e; 2. entre setembro e outubro – para cana-de-ano (colhida
na mesma época do ano seguinte/12 meses).
A colheita da cana utilizando a queimada está sendo gradativamente, substituída
pela chamada “colheita da cana crua”, feita através da mecanização, seguindo as
1
ENGLER, A.; GILG, E. Syllabus der pflanzenfamilien : eine uebersicht uber das gesamte pflanzensystem, mit
besonderer berucksichtigung. 19. ed. Berlin : Gebruder Borntraeger, 1924.
5
determinações da Lei Federal 2661/98, art. 16, Cap. IV. Embora as alterações no manejo da
cultura tenham resultado em benefícios ambientais pode-se observar, ao mesmo tempo,
malefícios e prejuízos econômicos, devido à dificuldade de controle de certos insetospragas, patógenos e plantas daninhas. Em São Paulo, Estado de maior produção da canade-açúcar, o percentual de área de cana colhida crua já é equivalente a 56%, sendo que a
prática da queimada dos canaviais paulistas deverá cessar totalmente até 2021 nas áreas
mecanizáveis e 2031 nas áreas não mecanizáveis e com declive superior a 12%, conforme
determina a Lei Estadual nº 11.241/02 (RONQUIM, 2010).
Com relação à limitação do cultivo da cana-de-açúcar, Reis (1981) aponta a altitude
e o frio como fatores ambientais desfavoráveis, estando a maior parte das regiões tropicais
e subtropicais aptas para a cultura. Atualmente, seu cultivo desperta particular interesse,
visto que é uma das principais fontes de energia renovável.
Quanto ao desenvolvimento do vegetal, observa-se a formação de touceiras, com
parte aérea (colmo, folhas e inflorescência) e outra subterrânea (raízes e rizomas). O colmo
da cana-de-açúcar é rico em sacarose, sendo esta a parte utilizada na indústria
sucralcooleira, compondo-se de elementos sucessivos que contém um nó e um entrenó
cada um, com diâmetro variado. As características das gemas, localizadas na zona radicular
do colmo (uma em cada nó), juntamente com a cor e o diâmetro do colmo, bem como o
formato e a disposição dos entrenós, constituem elementos importantes para a
diferenciação das variedades (REIS, 1981).
3.1.1. Principais pragas e patógenos associados à cana-de-açúcar
Segundo Pinto, Botelho e Oliveira (2009) existem diversas pragas que podem atacar
os canaviais, sendo a maior parte constituída por pragas subterrâneas que atacam a raiz.
Tais pragas podem ser encontradas nas seguintes ordens:
 Lepidoptera, representada pelas brocas e lagartas
 Coleoptera, representada pelos besouros e gorgulhos
 Hemiptera, representada pelas cigarrinhas, percevejos e cochonilhas
 Isoptera, representada pelos cupins
 Hymenoptera, representada pelas formigas cortadeiras
 Orthoptera, representada pelos gafanhotos
Algumas destas pragas provocam grandes prejuízos às lavouras de cana-deaçúcar, sendo consideradas pragas primárias. Outras provocam prejuízos menos severos,
sendo consideradas pragas secundárias, muito embora todas mereçam atenção. A Tabela 2
aponta as principais espécies que causam prejuízos à cultura de cana-de-açúcar:
6
Tabela 2 – Principais pragas da cultura da cana-de-açúcar
ORDEM
Lepidoptera
PRAGA
PRINCIPAIS ESPÉCIES
Broca-da-cana
Diatraea saccharalis; Diatraea flavipennela
Broca-gigante
Telchin licus licus
Lagarta-elasmo
Broca-peluda
Elasmopalpus lignosellus
Hyponeuma taltula
Spodoptera frugiperda
Lagarta desfolhadora
Mocis latipes
Pseudoletia sequa Cirphis latiuscula
Pão-de-galinha (coró)
Euetheola humilis; Ligyrus spp.
Coleoptera
Migdolus
Gorgulho-da-cana
Hemiptera
Migdolus spp.
Sphenophorus levis; Metamasius hemipterus
Cigarrinha-das-raízes
Mahanarva fimbriolata
Cigarrinha-das-folhas
Mahanarva posticata
Percevejo-castanho
Cochonilha
Pulgão
Cupim subterrâneo
Scaptocoris castanea; Scaptocoris carvalhoi
Sacchariococcus sacchari
Rhopalosiphum maidis; Melanaphis sacchari
Heterotermes tenuis; Amitermes sp.
Isoptera
Cornitermes sp.; Embiratermes sp.;
Cupim de Montículo
Nasutitermes sp.; Syntermes sp.;
Cylindrotermes sp.
Hymenoptera
Orthoptera
Saúva
Atta spp.
Quenquém
Acromyrmex sp.
Gafanhoto
Rhammatocerus schistocercoides;
Schitocerca pallens
Fonte: PINTO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2009
7
A cana-de-açúcar também pode ser atacada por microrganismos patogênicos que
causam diversas doenças, sendo eles vírus, bactérias, fungos e micoplasmas. Das 216
doenças que atacam a cultura da cana por todo o mundo, 58 já foram relatadas no Brasil,
merecendo destaque a Ferrugem e o Carvão, causadas por agentes fúngicos, o Raquitismo
das Soqueiras e a Escaldadura das Folhas, causadas por agentes bacterianos (SANTOS,
2003), além do Amarelinho Foliar e o Mosaico, causados por agentes virais (GONÇALVES,
2003; ROSSETO; SANTIAGO, 1994). A Tabela 3 reúne informações sobre as principais
doenças que atacam os canaviais
Tabela 3 – Principais agentes causadores de doenças da cana-de-açúcar
Doença
Natureza do
Agente
Agente etiológico
Mosaico
Chlorotic Streck
Amarelinho Foliar
Raquitismo
Escaldadura
Estria vermelha e Podridão do topo
Carvão
Podridão Vermelha
Podridão Abacaxi
Iliau
Podridão da bainha
Pokkatt Boeng
Mancha ocular
Mancha anular
Mancha Parda
Ferrugem
Vírus
Vírus
Vírus
Bactéria
Bactéria
Bactéria
Fungo
Fungo
Fungo
Fungo
Fungo
Fungo
Fungo
Fungo
Fungo
Fungo
Sugarcane Mosaic Vírus
Chlorotic Streck Virus
Sugarcane yellow leaf Virus
Leifsonia xyli subsp. syli
Xanthomonas albilineans
Acidovorax avenae
Ustilago scitaminea
Colletotrichum falcatum
Ceratocystis paradoxa
Gnomonia iliau
Citospora sacchari
Fusarium subglutinans
Bipolaris sacchari
Leptosphaeria sacchari
Cercospora longipes
Puccinia melanocephala
Fonte: ROSSETTO; SANTIAGO, 1994; REIS,1981
3.2.
O controle biológico e as pragas e patógenos da cana-de-açúcar
(Saccharum officinarum L.)
A atual tendência de reduzir o consumo de agrotóxicos que causam danos ao meio
ambiente, às comunidades macro e microbiológicas e ao próprio homem tem aumentado o
interesse por estratégias de controle biológico de pragas e doenças de inúmeras espécies
cultivadas. Esta prática de controle de pragas e patógenos originou-se na metade do século
XVIII, quando Agostino Bassi observou a propriedade entomopatogênica dos fungos. Foi em
1834 que o pesquisador utilizou pela primeira vez, o fungo Beauveria bassiana na tentativa
de controlar danos causados em insetos comercialmente importantes, como o bicho-daseda (Bombix mori).
8
Ao longo dos tempos, inúmeros agentes de controle biológico foram testados e são
hoje utilizados nos mais diversos programas: são protozoários, fungos, bactérias, vírus,
nematoides, rickétsias e micoplasmas. Dentre estes, os fungos são considerados
entomopatógenos de largo espectro, apresentando grande versatilidade (ALVES, 1998;
FERRON2, 1978 apud SIA, 2006).
Alguns estudiosos enfatizam que a grande variabilidade genética dos fungos
entomopatogênicos é um dos principais fatores responsáveis pelas vantagens da utilização
destes microrganismos no controle de insetos, pois aumenta o espectro de ação destes
micro-organismos, além de diminuir a possibilidade de aparecimento de resistência ao
bioproduto. Além disso, a facilidade de disseminação do agente fúngico pelo vento e a
capacidade de penetração através da cutícula íntegra de artrópodes, atingindo diretamente
a hemocele, também são fatores preponderantes destes micro-organismos no controle de
pragas. Cerca de 80% das doenças de insetos são provocadas por fungos e
aproximadamente 750 espécies já foram descritas como agentes entomopatogênicos
(ALVES, 1998).
O crescimento do mercado de biopesticida na América Latina tem sido substancial
desde os anos de 1990, sendo que Brasil, Cuba e Colômbia são os três países que
apresentam as maiores porcentagens de utilização de agentes microbianos controladores
de pragas (CPL BUSINESS CONSULTANTS, 2010a).
No Brasil o controle biológico começou com o fungo Metarhizium anisopliae seguido
pelo fungo Beauveria bassiana e por um vírus, o Baculovírus, utilizados como agentes
controladores da cigarrinha da cana-de-açúcar e das pastagens e no controle da Anticarsia
gematalis na soja, respectivamente. Também o fungo Trichoderma foi utilizado no controle
da doença do cacaueiro, conhecida como Vassoura-de-Bruxa e causada pelo fungo
Crinipellis perniciosa (AZEVEDO et al., 2002).
Pinto, Botelho e Oliveira (2009) sugerem que a cana de açúcar é uma das poucas
culturas no Brasil em que, desde a década de 1970, tem-se utilizado alternativas biológicas,
por meio de insetos e/ou patógenos, que controlam suas principais pragas e doenças.
Atualmente, a broca-da-cana (Diatraea saccharalis - Lepidoptera: Crambidae), que ataca
principalmente o sudoeste do país, vem sendo controlada eficientemente por um parasitoide
denominado Cotesia flavipes (Figura 1). Já para as cigarrinhas-das-folhas (Mahanarva
posticata), uma das principais pragas da cana-de-açúcar da região do nordeste brasileiro e
para as cigarrinhas-das-raízes (Mahanarva fimbriolata), problema recente da cultura na
região sudeste, tem-se utilizado o fungo Metarhizium anisopliae como controlador biológico.
2
FERRON, P. Biological control of insect pests by entomopathogenic fungi. Annual Revien Entomologes, v.23, p.409-449,
1978.
9
Foto: H.N. de Oliveira
Figura 1 – Lepidóptero Diatraea saccharalis, importante praga da cana-de-açúcar, sendo parasitada
pelo Himenóptero Cotesia flavipes, parasitoide amplamente utilizado no controle
biológico de pragas.
Fonte: http://www.infobibos.com/Artigos/2009_3/himenopteros/index.htm
Os fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae também são comumente
citados como microrganismos controladores do gorgulho da cana-de-açúcar (Sphenophorus
levis), e da broca gigante (Telchin licus), assim como o parasitoide de ovos Trichogramma
spp. e algumas espécies de nematoides entomopatogênicos, os quais apresentam grande
potencial biotecnológico e poderão ser incluídos nos programas de controle biológico de
diversas pragas da cana-de-açúcar (PINTO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2009).
Soares (2006) aponta que bactérias esporulantes pertencentes ao gênero Bacillus
têm sido muito utilizadas no controle de pragas agrícolas, florestais bem como no controle
de insetos vetores de doenças. E, dentre os bioinseticidas empregados no mundo para
controle destes insetos destacam-se os produtos que utilizam como princípio ativo as
bactérias esporulantes Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus sphaericus.
Segundo dados da CPL Business Consultants (2010b) os produtos a base de Bt
ainda são os mais utilizados nos programas de controle biológico, representando cerca de
53% do mercado mundial de biopesticidas, embora, nos últimos 20 anos, tal proporção
tenha sofrido significativo declínio: na década de 1990, a utilização de produtos a base de Bt
girava em torno de 90%, ao passo que nos anos 2004/5 a estimativa de utilização era de
60%. Acredita-se que o declínio nas porcentagens de utilização dos produtos a base de Bt
esteja vinculado ao aumento nas vendas de outros bioprodutos, sobretudo aqueles a base
de Baculovírus e alguns fungos, que apresentam similar eficiência no controle das pragas e
menor custo de aplicação.
Recentemente alguns microrganismos habitantes dos tecidos vegetais têm sido
motivo de estudo nos programas de controle biológico, devido aos benefícios que eles
conferem à planta-hospedeira protegendo-a contra o ataque de herbívoros e patógenos,
10
produzindo compostos como hormônios, antibióticos e antitumorais e provocando a morte
dos patógenos causadores de doenças (SERAFINI; NEIVA; AZEVEDO, 2001).
3.3. Os micro-organismos endofíticos como agentes de controle biológico
Os micro-organismos endofíticos, também conhecidos como endófitos foram
definidos como micro-organismos que habitam tecidos internos da planta sem causar
qualquer efeito negativo imediato (BACON3; WHITE, 2000 apud BRUM, 2008).
Embora descritos pela primeira vez na segunda metade do século XIX, tais microorganismos não foram devidamente pesquisados até os anos 70 do século XX, quando
ainda eram considerados inócuos às plantas e desde sua descoberta, vários autores
procuraram defini-los. Em sua obra – Biotecnologia: avanços na agricultura e na
agroindústria, Azevedo et al. (2002) sugerem algumas das principais definições, muitas
vezes controversas, para o termo. Uma das mais interessantes definições aponta microorganismos endofíticos como “fungos e bactérias que vivem, pelo menos durante parte do
seu ciclo, no interior de vegetais, aparentemente sem causar qualquer dano aos mesmos”,
distinguindo-se dos microrganismos epifíticos que vivem na superfície das plantas, e dos
patógenos, causadores de doenças. Os autores ainda descrevem a concepção de outros
pesquisadores: 1. “Micro-organismos que vivem no interior das plantas, sem produzir
nódulos ou formações externas”, o que exclui os fixadores de nitrogênio que vivem em
simbiose com raízes de plantas, produzindo nódulos externos, bem como os fungos
micorrízicos e; 2. “Micro-organismos que habitam exclusivamente as partes aéreas de seus
hospedeiros”.
Entretanto, uma das mais amplas definições aponta que endofíticos são todos os
micro-organismos cultiváveis ou não, que habitam o interior dos tecidos vegetais, sem
causar mal ao hospedeiro e que não desenvolvem estruturas externas, excluindo dessa
maneira bactérias nodulantes e fungos micorrízicos, que embora endofíticos são estudados
de maneira separada (AZEVEDO; ARAÚJO, 2007).
Uma redefinição mais recente do termo, proposta por Mendes e Azevedo, (2007)
divide tais microrganismos em duas categorias: 1. Tipo I – os que não produzem estruturas
externas à planta e; 2. Tipo II, os que produzem estruturas externas à planta.
Apesar da preocupação com a definição do termo, a distinção entre as categorias
de micro-organismos epifíticos, endofíticos e patogênicos é puramente didática, visto que
não existem classes absolutas, mas sim interfaces entre elas. Assim, um microrganismo
epifítico pode ser eventualmente encontrado dentro de um vegetal enquanto um endofítico
3
BACON, C. W.; WHITE, J. F. Microbial endophytes. Marcel Dekker Inc., New York, N.Y.2000.
11
em certos momentos pode tornar-se um patógeno quando a planta encontra-se em
condições de estresse e, este último em outras condições, não afeta seu hospedeiro,
podendo ser considerado um endofítico.
Serafini, Neiva e Azevedo (2001) enfatizam a importância dos endofíticos como
protetores naturais da planta-hospedeira, através da inibição do ataque de herbívoros e
também pela produção de compostos antibióticos e antitumorais.
Devido a sua ação contra os patógenos e pragas de plantas, os micro-organismos
endofíticos podem ser utilizados em Programas de Controle Biológico, em consonância com
as concepções de um ambiente mais harmonioso, saudável e equilibrado, tanto para o
homem quanto para as demais espécies, idealizadas a partir da década de 1970,
atualmente muito valorizadas e cujos principais objetivos são o de melhorar a qualidade de
vida das populações, reduzir os impactos ambientais causados pelos agrotóxicos e manter
os organismos-pragas abaixo do nível de dano econômico (VENDRAMIM, 2002).
Estudos recentes têm mostrado que bactérias e fungos endofíticos também podem
atuar diretamente sobre o patógeno, parasitando suas células e impedindo o surgimento dos
sintomas da doença vegetal ou ainda produzindo compostos com ação antibiótica contra o
patógeno
alvo.
Alguns
destes
microrganismos
apresentaram
propriedades
entomopatogênicas, parasitando os insetos pragas e provocando sua morte (AZEVEDO et
al., 2002). Segundo os mesmos autores, entre as bactérias endofíticas, aproximadamente
15 gêneros foram capazes de controlar doenças fúngicas ou bacterianas de interesse.
Dentre estes, os gêneros Bacillus e Pseudomonas apresentaram maior potencial para
controle de doenças. Já entre os fungos endofíticos, os gêneros Neotyphodium e Fusarium
apresentaram maior potencial para o controle biológico.
Sabe-se também que esta capacidade de controlar pragas e patógenos da planta
foi adquirida pelos micro-organismos endofíticos ao longo de sua evolução com o seu
hospedeiro, resultando numa estreita relação mutualística entre eles e o vegetal. Dentre os
benefícios conferidos à planta hospedeira pode-se citar: maior resistência em ambientes
com estresse; maior proteção contra o ataque dos herbívoros (graças à produção de
compostos tóxicos que reduzem a atratividade da planta); maior proteção contra o ataque de
fitopatógenos (devido à produção de antibióticos e metabólitos inibidores do seu
desenvolvimento) bem como promoção do crescimento vegetal. Já os benefícios conferidos
aos micro-organismos endofíticos estão relacionados à obtenção de nutrientes e abrigo que
lhes garantem maior sobrevivência (AZEVEDO et al., 2002).
12
3.4. Bacillus thuringiensis - Caracterização biológica, ecológica e taxonômica
Bacillus thuringiensis é uma bactéria esporulante, taxonomicamente enquadradas
na Divisão Firmicutes (Gram positivas), pertencentes à família Bacillaceae, formadoras de
endósporos e com duas fases principais durante o seu ciclo de vida: Fase de Crescimento
vegetativo, onde a bactéria se multiplica através de bipartição; Fase de esporulação, onde
ocorre a diferenciação da bactéria em esporos, estrutura capaz de resistir a condições
desfavoráveis de sobrevivência, germinando e iniciando seu ciclo vegetativo quando
colocada em meio dotado de nutrientes necessários (MONNERAT; PRAÇA, 2006).
O Bt como é popularmente conhecido são bactérias em forma de bastonetes que
apresentam motilidade, um esporo ovalado, inserido em um esporângio sem inchaço e cuja
largura ultrapassa os 0,9µm (THIERY & FRACHON, 1996). São muito utilizadas como
princípio ativo de bioinseticidas graças a sua capacidade de formar cristais proteicos (corpos
paraesporais) ricos em endotoxinas de ação entomopatogênica (Figura 2). Tais proteínas,
cujo peso molecular gira em torno de 14 a 152 Kda, são codificadas por sequências gênicas
denominadas “Genes cry”, localizadas tanto no DNA cromossômico quanto nos grandes
plasmídios (GONZÁLES4; BROWN; CARLTON, 1982; SANCHIS5 et al., 1988 apud
POLANCZYK, 2004; OLIVEIRA-FILHO & MONNERAT, 2006).
B
A
Figura 2 – Células de Bacillus thuringiensis mostrando o esporo ovalado (A) e o cristal proteico (B).
Fonte: http://www.biology.ed.ac.uk/archive/jdeacon/microbes/bt.htm
Segundo Cavaleiro et al. (2005), as colônias típicas de Bacillus thuringiensis
apresentam tamanho médio de aproximadamente 0,5 cm de diâmetro e bordas irregulares,
sendo opacas e com coloração esbranquiçada (Figura 3). As autoras apontam que estes
4
5
GONZÁLES, J.M.J.; BROWN, B. S.;CARLTON, B. C. Transfer of Bacillus thuringiensis of Bacillus cereus. Proceedings of
the National Academic of Sciense, v. 79, n. 10, p. 6951-6955, 1982.
SANCHIS, V.; LERECLUS, D.; MENOU, G.; CHAUFAUX, J.; LECADET, M.M. Multiplicity of dendotoxin genes with different
specificities in Bacillus thuringiensis aizawai 7.29. Molecular Microbiology, v.2, n.3, p.393-404, 1988.
13
são micro-organismos dotados de resistência ao antibiótico Penicilina (YOUSTEN, 1991) e à
alta temperatura (OMS, 1985), características fundamentais quando se deseja isolá-las.
Figura 3 – Características morfológicas da colônia de Bacillus thuringiensis. Fonte:
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0325-75412007000400008&script=sci_arttext
Polanczyk (2004) enfatiza que “... embora geralmente o termo Bacillus
thuringiensis seja empregado para uma única espécie, na verdade ele pertence a um
complexo de várias espécies (B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis e B.
weihenstephanensis) denominado de Bacillus cereus”. O autor aponta ainda que o Bt e
B. cereus apresentam características fenotípicas e bioquímicas comuns, mas o primeiro
pode ser distinguido do segundo tipo de Bacillus pela presença dos cristais proteicos,
visíveis em microscopia de contraste de fase (Figura 4).
A
B
Figura 4 – Fotomicrografia de células vegetativas apontando a diferenciação morfológica do Bacillus
cereus, sem cristais proteicos (A) e Bacillus thuringiensis – Bt com cristais proteicos (B).
Fontes: http://www.human-healths.com/tag/bacillus-cereus-is-a-spore-forming;
http://textbookofbacteriology.net/Anthrax.html
Alguns estudos utilizando técnicas biomoleculares tais como hibridização do DNA
cromossômico, análise dos ácidos graxos/fosfolípides e comparação da sequência 16S
rRNA mostraram que a distinção entre as espécies neste grupo denominado B. cereus não
é clara e que a semelhança ocorre graças à transferência de plasmídios que codificam as
delta endotoxinas de Bt para o restante dos membros do grupo de B. cereus. Assim, ao
receber plasmídio codificador das endotoxinas, um B. cereus poderá ser capaz de produzir
os cristais proteicos, tóxicos a inúmeras espécies de insetos, atuando como uma bactéria de
Bt. E do modo inverso, ao perder a capacidade de produzir os cristais tóxicos, ele poderá
14
ser considerado um Bacillus cereus, inócuo aos insetos (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000;
HANSEN6; SALAMITOU, 2000; SCHNEPF7 et al., 1998 apud POLANCZYK, 2004).
O Bacillus thuringiensis pode ser encontrado em diferentes substratos, tais como
solo, água, insetos mortos, no interior dos vegetais (endofítico) bem como na interface soloraiz (rizosférico), conforme sugerem diversos autores. Entretanto, sua concentração no solo
é considerada um entomopatógeno agressivo, visto que dificilmente é encontrada causando
epizootias naturais em insetos e, segundo Aronson8 e Shai (2001 apud Polanczyk, 2004), a
produção de toxinas tão específicas e eficientes é justificada pela estreita relação muito
superior àquela encontrada nos tecidos vegetais, podendo atingir de 100 a 1000 UFC
(unidades formadoras de colônias) por grama de solo e de 0 a 100 UFC/cm² de tecido
vegetal (DAMGAARD, 20009 apud POLANCZYK, 2004). Além disso, a bactéria não é
simbiótica do microrganismo com a planta e com o inseto.
Para Soberon10 e Bravo (2001 apud Monnerat e Praça, 2006), apesar de o Bt ser
encontrado com maior frequência nos solos do que no interior das plantas e insetos, suas
formas vegetativas só se reproduzem no interior dos insetos hospedeiros graças ao seu
requerimento nutricional vitamínico e de aminoácidos como o ácido glutâmico.
Entretanto, existem algumas hipóteses que apontam a ação do Bt como uma
atividade inseticida acidental e o classifica como micro-organismo tipicamente de solo como
sugerem Martin e Travers (1989) e citado por Polanczyk (2004). Ohba, Mizuki e Uemori
(2009) também corroboram com tal ideia, apontando o Bt como uma espécie meramente
saprofítica ambiental, mas sem ser obrigatoriamente um patógeno de insetos. Isto se
justifica pelo fato de serem encontrados muito mais isolados de Bt dotados de proteínas
CRY não inseticidas do que isolados dotados de proteínas CRY inseticida, numa
concentração que suplanta os 90%.
Outras teorias procuram explicar de várias maneiras a presença da bactéria no
solo: 1. pela deposição de esporos por insetos e folhas considerados como reservatórios; 2.
pela sua patogenicidade a insetos de reduzida importância econômica e, portanto, pouco
estudados; 3. pelo seu maior desenvolvimento em solos ricos em matéria orgânica em
6
HANSEN, B.M.; SALAMITOU, S. Virulence of Bacillus thuringiensis. In: CHARLES, J.F.; DELÉCLUSE, A.; NIELSENLE
ROUX, C. Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. Netherlands: Kluwer Academic Publishers,
2000. cap. 3. p.41-64.
7
SCHNEPF, E.; CRICKMORE, N.; VAN RIE, J.; LERECLUS, D.; BAUM, J, et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal Crystal
proteins. Microbiology Molecular Biology Review. v. 62, n. 3, p. 775–806, 1998.
8
ARONSON, A. I.; SHAI, Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of
action. FEMS Microbiology Letters, v. 195, n. 1, p. 1-8, 2001.
9
DAMGAARD, P.H. Natural occurrence and dispersal of Bacillus thuringiensis in the environment. In: Charles, J.F.; NielsenLerous,C.; Delécluse (Ed). Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. Netherlands:Kluwer
Academic Publishers, 2000. p. 23-40.
10
SOBERON, M.; BRAVO, A. Generalidades sobre Bacillus thuringiensis. In: Metodologías utilizadas en investigacion
sobre bactérias entomopatogenas. Cidade do México: CYTED, 2001. 1 CD-ROM.
15
decomposição que serviriam de fonte de nutrientes essenciais à esporulação, ou ainda 4.
pela transformação de Bacillus cereus em Bacillus thuringiensis através da transferência
plasmidial (MEADOWS11, 1993 apud POLANCZYK, 2004).
Segundo Monnerat e Praça (2006), o Bacillus thuringiensis apresenta alta
especificidade e potencial entomopatogênico a determinados organismos artrópodes das
ordens de insetos Lepidoptera, Diptera e Coleoptera, além de ação patogênica contra
nematoides, ácaros e protozoários (EDWARDS; PAYNE; SOARES, 1988; FEITELSON;
PAYNE; KIM, 1992; CRICKMORE et al., 1995). A ação inseticida do Bt ocorre pela presença
de proteínas (delta-endotoxinas) contidas numa estrutura denominada corpo paraesporal.
As delta-endotoxinas Cry são produzidas sob forma de pro-toxinas que no interior do inseto
são transformadas em peptídeos tóxicos pela ação do pH alcalino intestinal e das proteases.
Quando a proteína é ativada causa lise das células epiteliais e a morte das larvas.
Várias cepas de Bt também produzem outras endotoxinas de menor peso molecular
(125 Kb), denominadas endotoxinas citolíticas (Cyt), que também apresentam ação
inseticida. Entretanto os genes que as codificam estão contidas somente nos grandes
plasmídeos (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000).
Em sua tese de doutorado Polanczyk (2004) aponta a dificuldade em classificar o
micro-organismo e cita os vários métodos utilizados para tal fim:

Pela combinação de aminoácidos e espectro inseticida, Hofte e Whiteley (1989)
apontam 38 toxinas agrupadas em 14 classes diferentes, sendo as quatro principais: I –
atividade contra lepidópteros; II – atividade contra lepidópteros e dípteros; III – atividade
contra coleópteros; IV – atividade contra dípteros,

Pela sequência de aminoácidos, Crickmore et al. (1998) apontam 250 genes cry
sequenciados e agrupados em 40 grupos de toxinas Cry

Pela caracterização bioquímica, método não recomendado para classificação do Bt,
devido às variações nas respostas.

Pelas técnicas de biologia molecular, capazes de promover a diferenciação inter e
intraespecífica.

Pela sorotipagem – método comumente utilizado para diferenciar as subespécies de Bt
(Tabela 4). Existem aproximadamente 82 sorotipos diferentes de Bt, mas nem todos os
grupos sorológicos apresentam atividade inseticida e alguns apresentam reação
cruzada com isolados de Bacillus cereus; algumas cepas de Bt não formadoras de
cristais são classificadas como Bacillus cereus (LECADET et al., 1999).
11
MEADOWS, M.P. Bacillus thuringiensis in the environment: ecology and risk assessment. In: ENTWISTLE, P.F.; CORY, J.S.
BAILEY, M.J.; HIGGS, S. (Ed). Bacillus thuringiensis an environmental biopesticide: theory and practice. Chichester:
John Wiley, 1993. p. 193-220.
16
Tabela 4 – As 67 subespécies de Bacillus thuringiensis identificadas a partir da análise sorológica do
Antígeno
Antígeno Flagelar H.
Subespécie de
Antígeno
Subespécie de
Antígeno
Subespécie de B.
Flagelar
B. thuringiensis
Flagelar
B. thuringiensis
Flagelar
thuringiensis
1
thuringiensis
18a 18c
yosoo
42
jinghongiensis
2
finitimus
19
tochigiensis
43
guiyanguebsus
3a 3c
alesti
20a 20b
yunnanensis
44
higo
3a 3b 3c
kurstaki
20a 20c
pondicheriensis
45
roskildiensis
3a 3d
sumiyoshiensis
21
colmeri
46
chanpaisis
3a 3d 3e
fukuokaensis
22
shandongiensis
47
wratislaviensis
4a 4b
Sotto
23
japonensis
48
baleárica
4a 4c
kenyae
24a 24b
neoleonensis
49
muju
5a 5c
galleriae
24a 24c
novosibirsk
50
navarrensis
5a 5c
canadensis
25
coreanensis
51
xiaguangiensis
6
entomocidus
26
silo
52
kim
7
aizawai
27
mexicanensis
53
asturiensis
8a 8b
morrisoni
28a 28b
monterrey
54
poloniensis
8a 8c
ostriniae
28a 28c
jegathesan
55
palmanyolensis
8b 8d
nigeriensis
29
amagiensis
56
rongseni
9
tolworthi
30
medellin
57
pirenaica
10a 10b
darmstadiensis
31
toguchini
58
argentinensis
10a 10c
londrina
32
cameroun
59
ibérica
11a 11b
toumanoffi
33
leesis
60
pingluonsis
11a 11c
kyushuensis
34
konkukian
61
sylvestriensis
12
thompsoni
35
seoulensis
62
zhaodongensis
13
pakistani
36
malaysiensis
63
bolívia
14
israelensis
37
anadalousiensis
64
azorensis
15
dakota
38
oswaldocruzi
65
pulsiensis
16
indiana
39
brasiliensis
66
gracioensis
17
tohokuensis
40
huazhongensis
67
vazensis
18a 18b
kumamotoensis
41
sooncheon
-
-
Fonte: LECADET et al., 1999
Outra proteína de ação tóxica produzida pelo Bt é a Thuringiensina, classificada
como β-exotoxina com ação tóxica tanto para insetos como para vertebrados e, por isso os
isolados desta categoria não são utilizados como bioinseticidas.
3.4.1. O histórico de utilização do Bt como agente de controle biológico
Os produtos a base de Bt são comercializáveis há mais de 50 anos e segundo
Polanczyk, Valicente e Barreto (2008) seu mercado consumidor vem crescendo no Brasil e
17
no mundo. Aproximadamente duzentos produtos a base de Bt são utilizados, tanto na área
agrícola quanto na área de saúde pública. Tais bioprodutos são responsáveis por 53% do
mercado mundial de bioinseticidas, e só na América Latina, África e Oriente Médio, as
estimativas de venda giram em torno de 36 milhões de dólares ao ano. Embora tenha
ocorrido declínio das proporções de venda dos bioinseticidas Bt quando comparadas às
estimativas feitas nos anos de 1990 (90% do mercado mundial) e nos anos 2004/5 (60% do
mercado mundial) isso não traduz diminuição da importância deste bioproduto para o
controle dos insetos-praga e vetores de doenças, estando o declínio relacionado ao
aumento das vendas de bioprodutos a base de outros agentes microbianos, tais como
fungos e vírus (CPL – BUSINESS CONSULTANTS, 2010b).
No continente americano os Estados Unidos lidera o mercado consumidor de
bioprodutos a base de Bt, com estimativa de 57% de utilização contra 40% utilizados nos
países da América Latina. Já o Brasil apresenta-se como o líder latino americano, com
estimativa de mercado de 12,7 milhões de dólares anuais. Entretanto, Cuba, Costa Rica,
Equador e Honduras também são importantes mercados de bioprodutos Bt (CPL –
BUSINESS CONSULTANTS, 2010b).
Através de um levantamento histórico, Monnerat e Praça (2006) sugerem que a
primeira citação de doença de inseto causada por Bt ocorreu em 1902 no Japão, quando
Ishiwata observou mortalidade do inseto do Bicho-da-Seda (Bombix mori), devido à infecção
por uma bactéria esporulante, primeiramente denominada Bacillus sotto. Em 1911, a mesma
bactéria foi descrita por Berliner, na Alemanha, isolada da lagarta-da-traça da farinha
Anagasta Kuhniella, inseto da ordem Lepidoptera. O pesquisador a denominou Bacillus
thuringiensis em homenagem à região onde as lagartas foram coletadas. Mas, só em 1938
que a bactéria esporulante foi reconhecida como agente de controle biológico, quando o
bioinseticida Sporeíne foi produzido na França.
Monnerat e Praça (2006) citam que a partir de 1950, países como Rússia,
Checoslováquia, França, Alemanha e Estados Unidos iniciaram a produção de inseticida
biológico a base de Bt. E com a descoberta de uma estirpe, denominada B. thuringiensis
subsp. Kurstaki, em 1960, que apresentava toxicidade de 2 a 200 vezes superior às estirpes
normalmente utilizadas nos produtos comerciais, a procura por outras estirpes foi
intensificada. A partir daí, inúmeras estirpes com diferentes toxinas foram isoladas, algumas
apresentando alta toxicidade contra os dípteros (GOLDBERG12; MARGALIT, 1977), outras
contra coleópteros (KRIEG13 et al., 1983). E fechando a retrospectiva histórica da
descoberta e utilização das estirpes de Bt, Monnerat e Praça (2006) citam alguns trabalhos
12
GOLBERG, L.J.; MARGALIT. J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii,
Uranotaenia unguiculata, Culex univittatus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosquito News, v.37, n. 3, p. 355-358, 1977.
13
KRIEG A., HUGER A. M., LANGENBRUCH G. A., SCHNETTER W. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis: ein neuer,
gegenüber larven von coleopteren wirksamer pathotyp. Zeitschrift fur Ang. Entomology, v. 96, p.500-508, 1983.
18
que apontaram a eficiência do Bt contra nematoides, ácaros e protozoários (EDWARDS;
PAYNE; SOARES, 1989; FEITELSON; PAYNE; KIM, 1992; CRICKMORE et al., 1995).
Até a década de 1970 a potência dos bioinseticidas formulados com Bt era baseada
no número de esporos. Entretanto, hoje em dia novas formulações passaram a levar em
consideração a presença dos cristais que contêm as delta-endotoxinas (POLANCKZYK;
VALICENTE; BARRETO, 2008).
Alguns autores atribuem o sucesso dos bioinseticidas a base de Bt a sua
especificidade aos insetos e demais organismos hospedeiros, assim como ao seu efeito não
poluente ao meio ambiente e a não toxicidade às plantas, mamíferos e vertebrados como
um todo, tornando o bioproduto muito seguro e compatível com as atuais concepções de um
ambiente saudável e equilibrado.
Glare e O’Callagham (2000) apontam a alta
susceptibilidade de algumas ordens de insetos às toxinas do Bt: mais de mil espécies de
insetos são susceptíveis a elas, sendo que dentre as diversas ordens dotadas de
susceptibilidade, três delas destacam-se, sendo a Lepidoptera, Diptera e Coleoptera,
conforme mostra tabela abaixo:
Tabela 5 – Principais ordens de insetos susceptíveis às toxinas do Bt
Ordem
Número de espécies
Susceptíveis
Diptera
266
Hemiptera
48
Hymenoptera
62
Isoptera
5
Coleoptera
106
Lepidoptera
572
Neuroptera
4
Orthoptera
6
Siphonoptera
7
Thysanoptera
3
Fonte: POLANCZYK (2004)
Para Soares (2006), as únicas limitações em relação à utilização do Bt como
bioinseticida são: 1. Seu elevado custo em relação aos inseticidas químicos; 2. Seu estreito
espectro de ação; 3. A necessidade de o inseto-alvo ingerir o produto; 4. Seu baixo poder
residual e, 5. O desconhecimento sobre a correta utilização do produto.
Atualmente, o produto a base de Bt com maior alcance no mercado mundial é o
Dipel (Bt Kurstaki HD-1), que apesar de apresentar pouca toxicidade contra ácaros,
19
coleópteros, dípteros e hemípteros, apresenta alta toxicidade contra 170 espécies de
Lepidópteros (BEEGLE14;
YAMAMOTO,
1992 apud
POLANCZYK,
2004;
GLARE;
O’CALLAGHAM, 2000)
No Brasil a utilização de produtos a base de Bt Kurstaki/Aizawai está por volta de
275 toneladas (CPL – BUSINESS CONSULTANTS, 2010) e, segundo Polanczyk, Valicente
e Barretos (2008) cerca de cento e cinquenta mil hectares brasileiros são tratados com
bioinseticidas a base de Bt no intuito de controlar diversas pragas agrícolas de importantes
culturas, tais como:
 Citros - Bicho-furão dos citros (Ecdytolopha aurantiana)
 Soja - Lagarta-da-soja (A. gemmatalis)
 Praga das pastagens - Curuquerê- dos capinzais (Mocis latipes)
 Eucaliptos - (Thyrinteina arnobia)
 Cucurbitáceas – Broca das cucurbitáceas (Diaphania nitidalis e Diaphania
hyalinata)
 Café - lagarta dos cafezais (E. imperialis magnífica e Erinnyis ello)
 Tomate - Traça dos tomateiros (Tuta absoluta)
 Milho - Lagarta do milho (Spodoptera frugiperda)
 Cana - Broca-da-cana (Diatraea saccharalis)
Entretanto, o mesmo autor acredita que em um país como o Brasil que apresenta
enorme potencial agrícola, justificado pelo seu privilegiado clima, abundância de recursos
hídricos e pela sua rica biodiversidade, o potencial de utilização dos produtos a base de Bt
poderá ser estendido.
Além de ser uma importante ferramenta utilizada no manejo integrado de pragas da
lavoura, o Bt é muito utilizado na área da saúde pública, para o controle de alguns insetos
culicídeos e simulídeos, transmissores de agentes etiológicos de doenças humanas, tais
como febre amarela, dengue, malária, leishmaniose, filarioses, encefalites virais
(CIMERMAN; CIMERMAN, 2001; RUAS NETO; SILVEIRA, 1989).
3.4.2. Características dos cristais proteicos do Bt e seu mecanismo de ação
O Bacillus thuringiensis é um micro-organismo esporulante capaz de produzir toxinas
que são patogênicas a diversos organismos vivos. Tais toxinas são codificadas por genes
denominados “Genes cry”, localizados tanto no material cromossômico quanto nos
plasmídeos. As delta-endotoxinas, comumente chamadas de proteínas CRY são apenas
alguns dos constituintes do cristal proteico presentes no Bt, cujo peso molecular varia entre
14
BEEGLE, C.B.; YAMAMOTO, T. Invitation paper (C. P. Alexander Fund): History of Bacillus thuringiensis Berliner research
and development. The Canadian Entomologist, v. 124, n. 3, p. 587-616,1992.
20
14 a 152 kda. O cristal também pode ser constituído de endotoxinas citolíticas (Cyt) de
menor peso molecular (de 25 a 28 kda). Entretanto, os genes que as codificam estão
contidos somente em grandes plasmídeos.
Cada célula precisa sintetizar de 106 a 2x 106 moléculas de endotoxinas para formar
o cristal proteico (AGAISSE; LERECLUS, 1995), sendo que a forma do cristal é determinada
pelo número de endotoxinas produzidas bem como pela sua composição e estrutura
molecular (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000; LERECLUS15; DELÉCLUSE; LECADET, 1993
apud POLANCZYK, 2004) (Figura 5).
ce
ce
ep
cc
cb
Figura 5 – Micrografia eletrônica de varredura mostrando os diferentes tipos de cristais de Bacillus
thuringiensis: cb: cristal bipiramidal; cc: cristal cuboide; ce: cristal esférico; ep: esporo
(aumento 10.000 x).
Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-204X2004000100002
A fase de esporulação do Bt, intimamente ligada à formação do cristal proteico,
ocorre sob certas condições de restrições de nutrientes ou acúmulo de metabólitos e
endotoxinas produzidas pela célula bacteriana (YAMAMOTO16; DEAN, 2000 apud
POLANCZYK, 2004).
Monnerat e Praça (2006) sugerem que a formação do cristal ocorra no segundo
estágio da esporulação, e sua liberação aconteça quando as células são lisadas. Segundo
os autores, durante o ciclo vegetativo a célula cresce e se biparte, enquanto que no ciclo de
esporulação a célula passa por sete estágios que culmina na formação e liberação do cristal
e do esporo (Figura 6).
15
LERECLUS, D.; DELÉCLUSE, A; LECADET, M.M. Diversity of Bacillus thuringiensis toxins and genes. In: Bacillus
thuringiensis , an enviromental biopesticidal: theory and practice. Ed: Philip F. Entwistle, Jenny S. Cory , Mark J. Bailey,
Stephen Higgs.England, 311p.1993.
16
YAMAMOTO, T.; DEAN, D. H. Insecticidal proteins produced by bacteria pathogenic to agricultural pests, p.81-100. In:
CHARLES, J. F.; DELÉCLUSE, A.; NIELSEN, L. E.; ROUX, C. (eds) Entomopathogenic bacteria: from laboratory to
field application. Dordrecht, Kluwer Academic, 2000. 548p.
21
Germinação
Lise
Esporulação
2ª fase
Ciclo
Vegetativo
Esporulação
1ª fase
Divisão
Celular
Figura 6 – O ciclo de vida do Bacillus thuringiensis. Fonte:
http://www.unalmed.edu.co/cinco/gerencia/vera/Vera%20Biotechnologies_archivos/Page881. htm
A formação do esporo ocorre quando as condições do meio encontram-se adversas.
O primeiro estágio corresponde à primeira fase da esporulação, onde a célula bacteriana
para seu crescimento. Ao iniciar o segundo estágio, há a formação do septo de
esporulação logo após a duplicação do material genético, seguida pela espiralização da
cromatina e pelo aparecimento de uma estrutura condensada, de natureza proteica, que
dará origem ao cristal proteico. O terceiro estágio caracteriza-se pela formação do préesporo, que cresce concomitantemente à aglutinação das proteínas Cry, responsáveis pela
a formação do cristal proteico (quarto estágio). No quinto estágio do ciclo biológico do
Bacillus thuringiensis, há a formação do envelope esporal em torno do esporo, deixando o
cristal proteico, ainda em crescimento, fora do corpo esporal. É no sexto estágio (segunda
fase da esporulação) que ocorre a maturação do esporo, sendo que nesta fase o cristal
proteico atinge seu máximo tamanho. E finalmente, no sétimo estágio da esporulação
ocorre a lise celular e a expulsão, tanto do cristal proteico quanto do esporo, altamente
resistente às adversidades ambientais. Ao encontrar condições propícias de nutrientes,
umidade, temperatura e pH, os esporos germinam e entram na fase vegetativa na qual
ocorre a multiplicação celular, garantindo, assim a perpetuação da espécie (MONNERAT;
PRAÇA, 2006).
O mecanismo de ação das toxinas do Bt está ligado à ingestão dos cristais proteicos
pelo inseto suscetível, que ocorre após a lise bacteriana. A morte do inseto é resultado de
um processo que pode durar de um a três dias após a ingestão dos cristais e dos esporos.
O processo de intoxicação do inseto-alvo passa por vários estágios e está
relacionado à ingestão e solubilização dos cristais proteicos; liberação e ativação das protoxinas; reconhecimento dos receptores específicos das delta-endotoxinas e formação de
poros nas células do epitélio intestinal do inseto, resultando na lise celular, sepse e morte do
inseto. A Figura 7 descreve, de forma pormenorizada, o mecanismo completo da ação das
22
toxinas Cry sobre o inseto-alvo (COPPING17; MENN, 2000 apud POLANCZYK, 2004;
FIUZA, 2010).
3
4
Figura 7 – Mecanismo de ação das toxinas Cry nos insetos-alvo
Fonte: http://www.biomax-mep.com.br/controle-ecologico-da-traca-da-farinha- ephestia-sp/
1.
O pH alcalino presente no intestino médio dos insetos suscetíveis leva à solubilização
dos cristais proteicos, ingeridos juntamente com os esporos, e à liberação das protoxinas. A alcalinidade do sistema digestório do inseto e a capacidade de decomposição
dos cristais do Bt são dois fatores que determinam o nível de especificidade da toxina
frente ao inseto-alvo.
2.
As pro-toxinas são ativadas pela ação das enzimas digestivas, originando quatro ou
mais polipeptídeos tóxicos, que constituem as delta-endotoxinas. A composição
proteolítica e a estrutura proteica do cristal são fatores importantes na determinação da
eficiência das delta-endotoxinas como biopesticida.
3.
As delta-endotoxinas são hidrolisadas e atravessam a membrana celular ligando-se aos
receptores específicos presentes na membrana apical das células colunares do intestino
médio do inseto. A ligação de forte afinidade entre a toxina e o receptor é considerada
um importante fator de determinação do espectro inseticida das proteínas Cry, embora
não seja o único determinante.
4.
O reconhecimento do receptor pela delta-endotoxina induz a formação de poros na
membrana celular do epitélio intestinal, o que gera interferência no gradiente iônico e
balanço osmótico celular, levando a um aumento da permeabilidade e absorção de
água pela célula, hipertrofia celular, vacuolização do citoplasma e lise celular. Assim, a
parede do intestino é destruída, gerando a paralisia intestinal do inseto. Os esporos
17
COPPING, I. G.; MENN, J. J. Review biopesticides:
Management Science. v. 56, n.5, p.651-676, 2000.
a review
of
their
action, applications
and
efficacy. Pest
23
alcançam a hemocele e a diminuição do pH, provocada pela mistura do conteúdo
intestinal, leva à germinação dos esporos. A morte do inseto ocorre pela cessação da
alimentação ou pela sepse, o qual serve como fonte de alimento para o crescimento
vegetativo da bactéria.
Os principais sintomas de intoxicação do inseto-alvo pelas toxinas do Bt são: parada
alimentar, paralisia intestinal, vômito, diarreia, infecção generalizada, escurecimento
tegumentar e morte (MONNERAT; PRAÇA, 2006; ALVES; LOPES, 2008).
24
4.
Material e métodos
O presente estudo foi realizado no Laboratório de Controle Biológico de Campinas,
unidade de pesquisa do Instituto Biológico, entre os meses de julho de 2011 a agosto de
2012.
Por sua grande importância econômica e social, a cana-de-açúcar (Saccharum
officinarum L.) foi a cultura escolhida para a realização do isolamento bacteriano endofítico,
ao passo que a população microbiana edáfica foi obtida a partir do solo localizado na
interface raiz-solo. A coleta foi realizada em canaviais de nove diferentes municípios do
interior do Estado de São Paulo, conforme aponta a Tabela 6.
Tabela 6 – Pontos de coleta das amostras de cana-de-açúcar e solo nos diferentes municípios do
Estado de São Paulo
Amostra
Município de coleta
01
Santo Antônio de Posse
02
Santo Antônio de Posse
03
Holambra
04
Limeira
05
Araras
06
Ipeúna
07
Charqueada
08
São Pedro
09
São Pedro
10
Santa Maria da Serra
11
Campinas
As onze amostras de solo e raízes coletadas foram acondicionadas em sacos
plásticos individualizados, identificadas e transportadas em caixas de isopor à temperatura
ambiente até as dependências do laboratório.
O material vegetal foi superficialmente desinfestado (processo característico do
isolamento de micro-organismos endofíticos) e em seguida submetido a dois diferentes
procedimentos metodológicos para isolamento de Bacillus sp., sugeridos pela OMS (1985)
25
e por Polanczyk (2004). As amostras de solo também foram submetidas aos mesmos
procedimentos para isolamento de Bacillus sp. já mencionados.
Após o isolamento, realizou-se a caracterização entomopatogênica dos isolados de
Bacillus sp. sobre o lepidóptero Diatraea saccharalis (popularmente denominado Broca-dacana), que associada à análise microscópica da presença dos cristais proteicos objetivou
identificar as linhagens endofíticas e edáficas de Bacillus thuringiensis com ação patogênica
capaz de matar uma porcentagem igual ou superior a 20% das lagartas, comparando suas
populações. O método estatístico empregado foi o Teste de Tukey, que analisou o nível de
significância dos resultados obtidos.
Segue abaixo, o detalhamento do método empregado durante a execução do
trabalho.
4.1.
Preparo das amostras
4.1.1. Desinfestação superficial e trituração do material vegetal
Dez gramas de cada amostra de raízes de cana-de-açúcar foram lavados e
submetidos ao processo de desinfestação superficial de acordo com adaptações do
Protocolo de Isolamento de Micro-organismos Endofíticos (ARAÚJO et al., 2003; AZEVEDO
et al., 2002).
Após serem lavadas em água corrente, com esponja e sabão para retirada de poeira,
de partículas de solo e de material externo mais grosseiro, a superfície das raízes foi
desinfestada eliminando-se, assim a microbiota epifítica e conservando-se somente a
endofítica. Segue abaixo o procedimento de desinfestação, realizado no interior de Câmara
de Fluxo Laminar (Figura 8).
 Imersão do material vegetal em Álcool 70% – por dois minutos, permitindo a
esterilização parcial do material e a alteração da tensão superficial, tornando-o
apropriado para o próximo passo do tratamento;
 Imersão do material vegetal em solução de Hipoclorito de sódio (2,5%) – por
cerca de 10 minutos
 Imersão do material vegetal em Álcool 70% - por um minuto
 Lavagem do material vegetal com água destilada esterilizada por duas vezes
consecutivas – no intuito de retirar os resíduos de álcool e hipoclorito de sódio.
Para a verificação da eficiência do processo de eliminação dos epifíticos, 100 µL da
última água de lavagem foram aliquotados e plaqueados em placa de Petri, contendo
26
meio de cultura NA (0,3% de extrato de carne; 0,5% de peptona; 0,8% de NaCl e
1,8% de ágar bacteriológico). As placas, em triplicatas foram acondicionadas em
BOD a 29ºC por cerca de cinco dias, quando, então foi quantificado o número de
colônias crescidas. Azevedo et al. (2002) enfatizam que o número ideal de
crescimento bacteriano nestas placas de Petri gira em torno de três colônias.
Entretanto, é aceitável uma quantia superior a esta quando se trabalha com um
material vegetal muito rico em organismos endofíticos.
A
B
C
Figura 8 – Etapas do processo de desinfestação superficial do material vegetal: A –
Pesagem das raízes (10 g); B – Sucessão de lavagens do material vegetal
em Álcool (70%), Hipoclorito (2,5%) e Água Destilada Esterilizada (2x); C –
Plaqueamento, em triplicata, de alíquota da última água de lavagem.
Cada amostra de raízes desinfestadas foi colocada em um Becker contendo 100 mL
de solução salina (0,8% NaCl) esterilizada, e triturada com o auxílio de um agitador (Figura
9). Em seguida, o extrato das raízes trituradas foi submetido aos dois procedimentos de
isolamento de Bacillus sp., sugeridos pela OMS (1985) e Polanczyk (2004) e detalhados no
item 4.2.
27
A
B
C
Figura 9 – Preparo do extrato vegetal para posterior isolamento de Bacillus sp.: A – Raízes
desinfestadas e a solução salina (0,8%) utilizadas no preparo do extrato vegetal; B
– Trituração das raízes através de um misturador; C – Extrato vegetal preparado a
partir das raízes trituradas em solução salina.
4.1.2. Homogeneização e diluição seriada das amostras de solo
Um grama de cada amostra de solo foi homogeneizado em 10 mL de solução salina
(0,006 mM FeS04 . 7H20; 0,01 mM CaC03 . 7H20; 0,08 mM MgS04 . 7H20; 0,07 mM MnS04 .
7H20; 0,006 mM ZnS04 . 7H20; pH 7,0) como sugerido por Polanczyk (2004). Em seguida, as
suspensões foram submetidas à agitação por aproximadamente duas horas no intuito de
liberar células de Bacillus da fração coloidal do solo, de acordo com Valicente18 et al. (1998
apud Polanczyk, 2004). Cada suspensão foi diluída até uma concentração de 10-3 e 10-4
(Figura 10) e submetida aos dois procedimentos de isolamento de Bacillus sp., conforme
métodos elaborados pela OMS (1985) e por Polanczyk (2004), detalhados no item 4.2.
18
VALICENTE, F. H.; VASCONCELOS, M. J. V.; PAIVA, E.; FARIA, A.; SOUZA, F.; BARRETO, M. Caracterização através da
PCR de cepas de Bacillus thuringiensis de diferentes regiões do Brasil. In: SIMPÓSIO DE CONTROLE BIOLÓGICO, 6, Rio
de Janeiro, 1998, Anais. Rio de Janeiro: EMBRAPA/FIOCRUZ, 1998. p.164.
28
A
B
Figura 10 – Preparo das amostras de solo para posterior isolamento de Bacillus sp.:
A – Pesagem do solo; B – Homogeneização e diluição seriada do solo.
4.2.
Isolamento das linhagens endofíticas e edáficas de Bacillus sp.
O isolamento das linhagens endofíticas e edáficas de Bacillus foi realizado após a
obtenção do extrato das raízes e da suspensão seriada do solo, utilizando-se dois
diferentes procedimentos metodológicos:
i. Protocolo adaptado da Organização Mundial de Saúde/OMS (1985), caracterizado
por crescimento bacteriano em Placa de Petri contendo meio NA, suplementado de
Penicilina G a 100 mg/L (JUNG et al., 1998);
ii. Protocolo adaptado de Polanczyk (2004), caracterizado por crescimento bacteriano
em Placa de Petri contendo meio NA, seguido de crescimento bacteriano em meio
líquido CCY Broth (STEWART et al., 1981) e suplementado de Penicilina G a
100mg/L (JUNG et al.,, 1998)
Ambos os procedimentos de isolamento são apresentados de forma pormenorizada
no item 4.2.1. e 4.2.2.
4.2.1. Protocolo adaptado da Organização Mundial de Saúde/OMS (1985)
Os extratos das raízes e as suspensões não diluídas de solo foram submetidos a um
tratamento térmico a 80º C durante doze minutos a fim de eliminar, tanto as bactérias não
esporulantes quanto as formas vegetativas das bactérias esporulantes, deixando vivos
apenas seus esporos, resistentes a alta temperatura. Em seguida, 100 µL de cada amostra
de material foram depositados, separadamente e em triplicatas, sobre Placas de Petri,
contendo o meio de cultura NA (0,3% de extrato de carne; 0,5% de peptona; 0,8% de NaCl e
1,8% de ágar bacteriológico), suplementado com solução do antibiótico de Penicilina G (100
mg/L), seletivo para Bacillus thuringiensis e Bacillus cereus (JUNG et al., 1998). As placas
29
de Petri foram acondicionadas em BOD a 29º C e examinadas após cinco dias, quando
foram quantificadas as colônias crescidas (Figura 11), levando-se em consideração as
características morfológicas típicas de Bacillus sp.
A
B
C
A
Figura 11 – Etapas do isolamento de Bacillus sp. (OMS, 1985): A – Tratamento térmico da
suspensão de solo e extrato vegetal (80º C/12 min.)l; B – Plaqueamento em meio NA
suplementado com Penicilina G (100 mg/L); C – Incubação em BOD – 29º C/5 dias
Nas placas de Petri que apresentaram crescimento superior a vinte colônias,
realizou-se uma amostragem aleatória do material, no intuito de diminuir a quantidade de
colônias analisadas, tornando viável o processo de identificação das linhagens e impedir
que o excesso de trabalho interferisse nos resultados obtidos. Para isso, estabeleceu-se o
critério de “Máximo Número de Colônias (MNC)”, obtido pela somatória 20 + 10% do total
geral de colônias morfologicamente semelhantes ao gênero Bacillus. Assim, numa placa de
Petri que apresentasse 40 colônias morfologicamente semelhantes às pertencentes ao
gênero Bacillus, foram aleatoriamente amostradas um número de 24 colônias (20 + 10%).
Tais colônias que foram capazes de crescer nas placas de Petri contendo meio NA
com Penicilina (100mg/L) foram confirmadas como pertencentes ao gênero Bacillus, devido
às características de resistência ao tratamento térmico e resistência à Penicilina G na
concentração indicada. A porcentagem de UFC de Bacillus sp. por grama de raiz e de solo
sobre o total das colônias amostradas serviu de base para o cálculo do número esperado de
UFC de Bacillus por grama de raiz e de solo e apontado no ítem 5.1. Tal número esperado
de UFC de Bacillus sp. foi obtido a partir da fórmula:
⁄
4.2.2. Protocolo adaptado de Polanczyk (2004)
Os extratos das raízes e as suspensões diluídas de solo (10-3 e 10-4) foram
submetidos a um tratamento térmico a 80º C durante doze minutos a fim de eliminar as
bactérias não esporulantes e as células vegetativas das formas esporulantes, deixando
vivos apenas seus esporos, resistentes a alta temperatura. Em seguida, 100 µL de cada
30
amostra de material foram depositados, separadamente e em triplicatas, sobre Placas de
Petri, contendo o meio de cultura NA (0,3% de extrato de carne; 0,5% de peptona; 0,8% de
NaCl e 1,8% de ágar bacteriológico) e acondicionadas em BOD a 29º C durante cinco dias.
Foi considerada como melhor suspensão diluída de solo (10-3 ou 10-4) aquela que permitiu o
crescimento do maior número de colônias, espaçadas entre si.
Após o período de incubação, as colônias que apresentaram características
morfológicas semelhantes ao gênero Bacillus (tamanho médio de aproximadamente 0,5 cm
de diâmetro e bordas irregulares, opacidade e coloração esbranquiçada) foram
quantificadas e submetidas ao processo de agitação em meio de cultura líquido CCY Broth
(STEWART et al., 1981) suplementado com solução antibiótica de Penicilina G (100mg/L),
no intuito de selecionar colônias de Bacillus thuringiensis (resistentes à Penicilina), garantir
sua esporulação bem como a formação dos cristais proteicos (típicos de linhagens Bt).
Aliquotou-se 5mL de meio e, com o auxílio de uma alça metálica, foram inoculadas as
colônias, sendo então submetidas à agitação de 160 rpm e incubadas a 28ºC por um
período de 48 a 72 horas (Figura 12). O meio CCY acrescido de Penicilina G foi adotado
como meio seletivo para o crescimento e esporulação já que é rico em íons metálicos, tais
como Magnésio, Ferro, Zinco, Cálcio e Manganês responsáveis pela constituição e
resistência do esporo ao calor e aos raios ultravioletas (LACEY19, 1984; ARCAS20, 1996;
BERNHARD21; UTZ, 1993; BELTRAN22 et al., 1998 apud SOARES, 2006). Além disso, é
constituído por componentes que agem como fonte de carbono orgânico, de grande
importância para a síntese de cristais.
Como no procedimento OMS realizou-se uma amostragem aleatória do material
obtido nas placas de Petri, o qual foi submetido à fase de esporulação. Assim, das placas
que apresentaram crescimento superior a vinte colônias, apenas o Máximo Número de
Colônias (MNC), obtido pela somatória 20 + 10% do total geral de colônias
morfologicamente semelhantes ao gênero Bacillus, foi submetido à fase de esporulação.
19
LACEY, L. A. Production and formulation of Bacillus sphaericus. Mosquito News. v. 44, n. 2-I, p. 153-159, 1984.
20
ARCAS, J. A. Protucción de bactérias entomopatogênicas. In: Microorganismos Patógenos Empleados en el Controle
Microbiano de Insetos Plagas. Leucona, E. R. Buenos Aires: Talleres Graficos Mariano Mas., p. 208-222, 1996.
21
BERNHARD, K.; UTZ, R. Production of Bacillus thuringiensis Insecticides for Experimental and Commercial Uses. In:
ENTWISTLE, P. F.; CORY, J. S.; BAILEY, M. J.; HIGGS, S. (Eds.) Bacillus thuringiensis, An Environmental
Biopesticide: Theory and Practice. John Wiley & Sons, Chichester UK, 1993.
22
BELTRÁN, L.; DÍAZ, S.; BERDUGO, C.; ZAMORA, A.; BUITRAGO, G.; MORENO, N. Estratégia para el desiño de um medio
de cultivo para la fermentación com Bacillus sphaericus. R. Colombiana de Biotecnologia, v. 1, n. 1, p. 28-34, 1998.
31
A
B
C
D
ccy
Figura 12 – Etapas do isolamento de Bacillus sp. (POLANCZYK, 2004): A – Tratamento térmico
das suspensões diluídas de solo e extrato vegetal (80º C/12 min.); B - Plaqueamento
em meio NA; C – Incubação em BOD a 29º C/5 dias; D – Esporulação bacteriana em
meio CCY Broth, suplementado com Penicilina G (100mg/L) sob agitação (28º C por
48-72h)
Todas as colônias que foram capazes de crescer em meio líquido CCY Broth com
Penicilina (100mg/L), provocando turvação do meio, foram confirmadas como pertencentes
ao gênero Bacillus, devido às características de resistência ao tratamento térmico e
resistência à Penicilina G na concentração indicada. Como descrito no item 4.2.1 a
porcentagem de UFC de Bacillus sp. por grama de raiz e de solo sobre o total das colônias
amostradas serviu de base para o cálculo do número esperado de UFC de Bacillus por
grama de raiz e de solo, também indicado no item 5.1. Tal número esperado de UFC de
Bacillus foi calculado através da seguinte fórmula:
⁄
4.3. Identificação das linhagens de Bacillus thuringiensis
Todos os isolados que foram capazes de crescer em meio de cultura Na com
solução de Penicilina G (100 mg/L) ou em meio CCY com solução de Penicilina G (100
mg/L), mostraram-se resistentes, tanto ao antibiótico quanto ao tratamento térmico,
características típicas de Bacillus thuringiensis e Bacillus cereus (POLANCZYK, 2004).
Tendo em vista que estas duas espécies bacterianas podem ser diferenciadas pela
presença de cristais proteicos (LUTHY23; WORFERSBERGER, 2000 apud POLANCZYK,
2004), tóxicos para uma grande variedade de insetos e observáveis através de microscopia
de contraste de fase em células de Bt, realizou-se a identificação das linhagens de Bacillus
thuringiensis através da caracterização entomopatogênica dos isolados sobre larvas de
Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae), assim como pela análise microscópica da
presença dos cristais proteicos, conforme itens 4.3.1 e 4.3.2.
23
LUTHY, P.; WORFERSBERGER, M. G. Pathogenisis of Bacillus thuringiensis toxins. In: CHARLES, J.F.; DELÉCLUSE, A.;
NIELSEN-LEROUX, C. (Ed.) Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. Netherlands: Kluwer Academy
Publishers, 2000. p. 167-180.
32
4.3.1. Caracterização entomopatogênica dos isolados endofíticos e edáficos
sobre larvas de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae)
Os isolados endofíticos e edáficos de Bacillus sp. obtidos a partir dos protocolos da
OMS (1985) e Polanczyk (2004), submetidos à esporulação conforme especificado no item
4.2.2. e que promoveram turvação do meio de cultura foram entomopatogenicamente
caracterizados, a partir da inoculação de toletes de cana-de-açúcar e do seu oferecimento
às larvas do lepidóptero Diatraea saccharalis, no intuito de se identificar as linhagens
patogênicas que promovessem mortalidade igual ou superior a 20% das larvas. As larvas
utilizadas no experimento foram cedidas pela Usina São João e pelo Setor de Criação de
Insetos do Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico/Campinas.
A caracterização entomopatogênica foi realizada em triplicata e constou dos
seguintes passos: 1. Inoculação de 1 mL do isolado sobre um pedaço de cana (1cm2)
parcialmente seco sob luz ultravioleta, disposto em um tubo chato esterilizado e deixado em
repouso por um período de 6 horas para a absorção do isolado pelo material vegetal; 2.
Secagem do tolete da cana através da retirada do excesso de cultura com papel-toalha; 3.
Colocação de cinco larvas (terceiro ínstar) do lepidóptero Diatraea saccharalis sobre o tolete
de cana; 4. Vedação do tubo chato com algodão hidrofóbico. O procedimento adotou um
controle positivo (bioinseticida Dipel, cultivado em meio de cultura CCY Broth suplementado
com solução de Penicilina G – 100mg/L) e também um controle negativo (água destilada).
Os tubos chatos contendo as larvas foram acondicionados em sala climatizada com
controle de temperatura e umidade e a análise da porcentagem de mortalidade das larvas
foi realizada após um período de cinco a sete dias. Foram considerados possíveis isolados
de Bt todos aqueles que promoveram a morte das larvas, numa porcentagem igual ou
superior a 20%, os quais foram investigados quanto à presença de cristais proteicos, através
da análise em microscópio com contraste de fase.
4.3.2. Análise microscópica dos cristais proteicos
Os isolados que promoveram a mortalidade das larvas de Diatraea saccharalis num
percentual igual ou superior a 20% foram submetidos ao processo de esporulação em meio
CCY Broth (STEWART et al., 1981) suplementado com Penicilina G (100mg/L) sob agitação
de 160 rpm e incubados a 28º C por 48-72 horas, a fim de permitir a formação dos cristais
proteicos, visíveis ao microscópio óptico com contraste de fase (1000x) nas células de
Bacillus thuringiensis.
33
As lâminas foram preparadas a partir dos isolados cultivados em 48 e 72 horas,
coradas pelo Método de Wirtz-Conklin (Anexo 1) e observadas ao microscópio óptico com
contraste de fase em objetiva de imersão (1000x). Foram consideradas linhagens de
Bacillus thuringiensis todas aquelas que permitiram visualização dos cristais proteicos,
corados em rosa escuro em contraste com o esporo, corado em verde, como sugere o
Método de coloração de Wirtz-Conklin.
O cálculo da porcentagem de linhagens Bt sobre o total das linhagens de Bacillus
sp., isoladas através dos dois procedimentos metodológicos, serviu de fator para calcular o
número, amostrado e esperado, de UFC de Bt por grama de raiz e solo. Tais números,
apontados na Tabela 14 do item 5.3., foram calculados a partir das seguintes fórmulas:
e
4.4. Preservação das linhagens de Bacillus sp.
As linhagens endofíticas e edáficas de Bacillus sp., isoladas a partir do protocolo da
OMS (1985) e Polanczyk (2004) foram preservadas em tiras de papel-filtro esterilizadas
(5cm x 0,5cm), conforme adaptação do método sugerido por Monnerat e Praça (2006)
(Figura 13). Esse procedimento de preservação é capaz de conservar os esporos
bacterianos por aproximadamente quinze anos e para tal finalidade foi necessário submeter
os isolados à agitação por 72 horas em meio CCY Broth (STEWART et al.,, 1981)
suplementado de Penicilina G (100 mg/L) no intuito de se obter os esporos. Os isolados
esporulados foram submetidos a tratamento térmico de 55ºC durante 40 minutos (para a
eliminação das células vegetativas e a preservação dos esporos no meio de cultura),
aliquotados (100µL da suspensão) e colocados sobre tiras de papel-filtro (previamente
esterilizadas e dispostas em tubos rosqueados). Os tubos foram acondicionados em estufas
à temperatura de 37º C e aí permaneceram até a secagem completa das tiras de papel,
sendo em seguida, estocados à temperatura ambiente.
34
Figura 13 – Método de preservação das linhagens de Bacillus sp. através de tiras
esterilizadas de papel-filtro
4.5 . Análise estatística
Os dados referentes ao número de colônias/placa, isoladas de 11 amostras de raízes
de cana-de-açúcar e de seus respectivos substratos, a partir dos dois diferentes
procedimentos metodológicos, foram transformados em Log(x+1) e submetidos à análise de
variância, comparando-se as médias pelo teste de Tukey (P<0,05).
35
5. Resultados e Discussão
Onze amostras de raízes de cana-de-açúcar e dos respectivos solos ao seu redor
foram coletadas em nove diferentes municípios do interior do estado de São Paulo, tendo
em vista o isolamento e a identificação das populações endofíticas e edáficas de Bacillus sp.
O processo de desinfestação superficial das raízes da cana, passo inicial para o
isolamento das bactérias endofíticas, foi realizado com êxito de acordo com os dados
apontados na Tabela 7. O número de colônias bacterianas crescidas por placa de Petri a
partir da inoculação de 100 µL da água usada na última lavagem das raízes, em meio
Nutriente Ágar (NA) variou de 0 a 4 colônias, apresentando-se dentro da faixa considerada
adequada para o isolamento dos micro-organismos endofíticos, segundo Azevedo et al.
(2002).
Tabela 7 – Número médio de colônias bacterianas endofíticas, obtido a partir do plaqueamento da
água da última lavagem das raízes das onze amostras de cana-de-açúcar (processo de
desinfestação superficial)
Amostra
Município
Média de colônias
bacterianas endofíticas
por 100 µL de água
da última lavagem
01
Santo Antônio de Posse
0,0
02
Santo Antônio de Posse
4,0
03
Holambra
3,5
04
Limeira
0,0
05
Araras
0,3
06
Ipeúna
0,3
07
Charqueada
0,5
08
São Pedro
4,0
09
São Pedro
0,0
10
Santa Maria da Serra
2,6
11
Campinas
0,6
Média total
1,4
36
5.1.
Protocolo OMS (1985) x Protocolo Polanczyk (2004)
Pelo protocolo de Polanczyk (2004) foi possível isolar Bacillus endofíticos e
edáficos de todas as onze amostras de raízes e solo, enquanto que pelo protocolo OMS
(1985), o isolamento foi observado em apenas três amostras de raízes e cinco amostras de
solo, as quais geraram um pequeno número de linhagens (exceto para a amostra 4 de onde
foram obtidas 54 colônias), como mostra a Tabela 8. Além disso, os protocolos
estabelecidos pela OMS (1985) e por Polanczyk (2004) se diferiram significativamente
quanto ao número de colônias de Bacillus sp./placa de Petri, isoladas dos ambientes edáfico
e endofítico (F=32,5; d=3 40; P<0,001) (Tabela 9), considerando-se os 11 locais de
levantamento como repetições para cada ambiente de coleta, em cada metodologia.
O protocolo de Polanczyk (2004) permitiu isolar um maior número de UFC de
Bacillus sp. por grama de amostra, tanto do ambiente edáfico quanto do ambiente
endofítico, quando comparado ao protocolo OMS (1985), conforme aponta a Tabela 10
(Polanczyk - 5,11 x 106 UFC/g de solo e 13,0 x 102 UFC/g de raiz; OMS – 1,87 x 102 UFC/ g
de solo e 0,33 x 102 UFC/ g de raiz). Assim, o método Polanczyk permitiu isolar densidades
muito superiores deste gênero bacteriano, comparado ao método OMS (27.326 vezes
superiores no ambiente edáfico e 39 vezes superiores no ambiente endofítico). Entretanto,
quanto se analisa o percentual de linhagens identificadas como Bacillus sp. em relação ao
total de linhagens amostradas, o método OMS apresentou maior especificidade no
isolamento deste gênero bacteriano quando comparado ao método Polanczyk (OMS – 100%
das linhagens endofíticas e edáficas amostradas foram identificadas como Bacillus sp.;
Polanczyk – 76% das linhagens endofíticas e 93% das linhagens edáficas amostradas
foram identificadas como Bacillus sp.)
Desta forma, embora o método OMS (1985) tenha apresentado maior
especificidade no isolamento de Bacillus sp., o método Polanczyk (2004) demonstrou ser um
processo muito mais vantajoso para estudos de diversidade e para formação de bancos de
isolados, graças a sua maior capacidade de isolar densidades bacterianas muito superiores
ao do primeiro método.
37
Tabela 8 – Número de colônias de Bacillus sp./placa de Petri (9 cm), isoladas de 11 amostras de
raízes de cana-de-açúcar e de seus respectivos substratos, a partir de dois diferentes
procedimentos metodológicos.
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
Total
Colônias por
placas
0
3
0
58
1
0
0
1
0
3
0
66*
Colônias
amostradas
0
3
0
54
1
0
0
1
0
3
0
62**
0
3
0
54
1
0
0
1
0
3
0
62***
Colônias por
placas
0
0
0
0
1
7
0
0
0
0
3
11*
Colônias
amostradas
0
0
0
0
1
7
0
0
0
0
3
11**
0
0
0
0
1
7
0
0
0
0
3
11***
Colônias por
placas
13
18
7
15
26
30
15
150
33
42
19
368*
Colônias
amostradas
13
18
7
15
26
30
15
76
33
42
19
294**
9
16
5
15
26
30
15
76
33
42
10
277***
Colônias por
placas
56
191
429
8
5
18
213
297
50
21
57
1345*
Colônias
amostradas
56
80
103
8
5
18
82
81
50
21
57
561**
41
41
56
8
5
18
81
81
49
21
28
429***
Edáfica
Edáfica
Endofítica
Polanczyk (2004)
Endofítica
OMS (1985)
Amostra
Linhagens
confirmadas
de Bacillus
Linhagens
confirmadas
de Bacillus
Linhagens
confirmadas
de Bacillus
Linhagens
confirmadas
de Bacillus
*Número total de colônias por placas – 1.790 (1.356 Endofíticas e 434 Edáficas)
**Número total de colônias amostradas – 928 (572 Endofíticas e 356 Edáficas)
***Número total de Linhagens confirmadas de Bacillus sp. – 779 (440 Endofíticas e 339 Edáficas)
38
Polanczyk
OMS
Tabela 9 – Número (± erro padrão) de colônias de Bacillus sp. e Bacillus thuringiensis/0,01g solo ou
raiz, isoladas de 11 amostras de raízes de cana-de-açúcar e de seus respectivos
substratos, a partir de dois procedimentos metodológicos.
Bacillus sp.
Bacillus thuringiensis
Edáfico
5,6 ± 4,8 a
3,0 ± 2,9 a
Endofítico
1,0 ± 0,7 a
0,2 ± 0,1 a
252.000 ± 61.000 c
70.000 ± 29.000 c
39,0 ± 7,9 b
12,4 ± 4,3 b
Edáfico
Endofítico
*Os valores foram previamente corrigidos a partir da fórmula Log (x+1)
**Médias seguidas de mesma letra, nas colunas, não apresentam diferenças estatísticas pelo teste
de Tukey a 5%
Tabela 10 – Colônias de Bacillus sp. isoladas a partir de 11 amostras de raízes de cana-de-açúcar e
de seus respectivos substratos, através de dois distintos procedimentos metodológicos.
Edáfica
Endofítica
Ambiente
(a)
(b)
(c)
(d)
Parâmetros
Método
OMS
Polanczyk
(1985)
(2004)
Colônias totais
 por placa
 UFC/g raiz
0,33
2
0,33 x 10
40,75
2
40,75 x 10
Colônias amostradas
 por placa
 Bacillus sp. /placa
 Bacillus sp. /g raiz
0,33
(a)
0,33
2
0,33 x 10
17,0
(b)
13,0
2
13,0 x 10
UFC esperadas de Bacillus sp./g raiz
0,33 x 10
30,97x 10
Colônias totais
 por placa
 UFC/g solo
2,0
2
2,0 x 10
11,15
6
7,87 x 10
Colônias amostradas
 por placa
 Bacillus sp. /placa
 Bacillus sp. /g solo
1,87
(c)
1,87
2
1,87 x 10
8,9
(d)
8,39
6
5,11 x 10
UFC esperadas de Bacillus sp./g solo
2,0 x 10
2
100% das colônias amostradas foram confirmadas como Bacillus sp.
76% das colônias amostradas foram confirmadas como Bacillus sp.
100% das colônias amostradas foram confirmadas como Bacillus sp.
94% das colônias amostradas foram confirmadas como Bacillus sp.
2
7,39 x 10
2
6
39
Uma das grandes diferenças entre os protocolos OMS (1985) e Polanczyk (2004)
reside no tempo dispendido e na forma de realizar os dois procedimentos de isolamento
bacteriano. O protocolo sugerido pela OMS (1985) é o método mais utilizado para o
isolamento de bactérias do gênero Bacillus, por ser considerado fácil, rápido e barato para
aplicação, tendo como base metodológica a deposição das amostras termicamente tratadas
sobre placas de Petri contendo meio sólido. Silva e Monnerat (2002) compararam três
diferentes métodos de isolamento de Bacillus entomopatogênicos e chegaram à conclusão
que o método de isolamento de linhagens de Bacillus thuringiensis ou Bacillus cereus
proposto pela OMS é mais eficiente, sendo, portanto o mais indicado para esta finalidade.
Entretanto, os mesmos autores concluíram que para o isolamento de linhagens de Bacillus
sphaericus, o método do Acetato proporciona resultados mais satisfatórios.
Já o protocolo sugerido por Polanczyk (2004) difere-se do OMS por apresentar duas
fases de isolamento: uma fase referente ao choque térmico seguido do plaqueamento em
meio sólido sem antibiótico e outra fase de crescimento e esporulação das colônias
(previamente cultivadas nas placas de Petri) em meio líquido com antibiótico (Penicilina G 100 mg/L), sob agitação por 48 – 72 horas. De acordo com o autor, esse método é mais
trabalhoso, demorado e dispendioso quando comparado ao protocolo OMS, porém
demonstra-se mais eficiente para o isolamento de linhagens de Bacillus thuringiensis e
Bacillus cereus. O autor ressalta ainda que a agitação das colônias em meio líquido
contendo Penicilina é de fundamental importância para o isolamento destas duas espécies
de Bacillus, pois impede o crescimento de bactérias sensíveis ao antibiótico e favorece a
esporulação por proporcionar maior aeração.
5.2. Ambiente Endofítico x Ambiente Edáfico
Os dois métodos avaliados apontaram uma densidade de Bacillus sp. muito superior
no ambiente edáfico comparado ao endofítico (Tabela 10), entretanto sem haver diferenças
significativas entre os dois ambientes pelo método de OMS (F=32,5; d=3 40; P=0,780),
porém ocorrendo diferenças significativas pelo método de Polanczyk (F=32,5; d=3 40;
P<0,001) (Tabela 9). Pelo método OMS constatou-se que a densidade das linhagens
edáficas foi 5,6 vezes superior à endofítica (1,87 x 102 UFC/g de solo e 0,33 x 102 UFC/g de
raiz), enquanto que pelo método Polanczyk a densidade de linhagens edáficas obtidas foi
3.930 vezes superior à endofítica (5,11 x 106 UFC/g de solo e 13 x 102 UFC/g de raiz), como
aponta a Tabela 10. Tais resultados confirmam a análise de vários autores que ressaltam o
solo como o principal reservatório natural de bactérias do gênero Bacillus (AZAMBUJA et al.,
2009-2010; IBARRA et al., 2003; MOHAMED et al., 2007).
40
Analisando os dados da Tabela 11, percebe-se que ocorreu uma variação de UFC de
Bacillus sp. nos ambientes edáfico e endofítico, nos nove municípios de coleta de materiais.
Tabela 11 – Número de colônias de Bacillus sp. por grama de raiz e de solo, isoladas a partir de dois
procedimentos, das onze amostras coletadas nos nove municípios do interior de São
Paulo.
OMS (1985)
POLANCZYK (2004)
Amostra
Município
UFC/g de
raiz
UFC/g de
solo
01
S. Antônio de Posse
0
0
02
S. Antônio de Posse
0
1,0 x 10
03
Holambra
0
0
04
Limeira
0
18,0 x 10
2
2,66 x 10
05
Araras
0,33 x 10
2
0,33 x 10
2
1,66 x 10
06
Ipeúna
2,33 x 10
2
0
6 x 10
07
Charqueada
0
0
27 x 10
08
São Pedro
0
0,33 x 10
27 x 10
09
São Pedro
0
0
10
Santa Maria da Serra
0
1,0 x 10
11
Campinas
1,0 x 10
Média total
2
2
0,33 x 10
13,6
2
UFC/g de
Raiz
6 x 10
UFC/g de
solo
2
6
3 x 10
2
5,33 x 10
2
1,66 x 10
13,66 x 10
18,66 x 10
0,5 x 10
2
8,66 x 10
1,87 x 10
2
5,0 x 10
6
2
25,33 x 10
2
7 x 10
2
2
6
6
2
0
6
1,0 x 10
16,33 x 10
2
6
2
2
2
6
1,1 x 10
6
1,4 x 10
6
6
9,33 x 10
3,33 x 10
2
5,11 x 10
13 x 10
6
6
A amostra 4, oriunda do município de Limeira, apresentou a menor concentração de
UFC de Bacillus na raiz e no solo, enquanto que a amostra 8, coletada no município de São
Pedro apresentou a maior concentração de UFC nesses dois ambientes. Alguns autores
apontam que as práticas agrícolas, tais como o manejo do solo, rotação de cultura,
aplicação de agrotóxicos e uso de maquinários interferem na microbiota terrestre, afetando a
qualidade do solo e modificando suas propriedades físicas, químicas e biológicas
41
(VALARINI24 et al., 2002; ANDRÉA25; HOLLWEG, 2004 apud AZAMBUJA et al., 2009-2010),
o que pode explicar as diferenças nas concentrações das bactérias do gênero Bacillus nos
diferentes municípios. Fato interessante ocorreu nas amostras coletadas nos municípios de
Holambra (Amostra 3) e São Pedro (amostra 9), que apresentaram as mais altas
concentrações de UFC no ambiente endofítico, e as mais baixas concentrações no ambiente
edáfico, sendo que o inverso ocorreu para as amostras coletadas no município de Araras
(alta concentração de UFC no solo, e baixa concentração na raiz). Portanto, as densidades
populacionais deste gênero bacteriano podem não seguir uma mesma tendência nos dois
ambientes (solo e raiz). É possível ainda deduzir que, além da capacidade de
penetrabilidade do micro-organismo nos tecidos vegetais, o potencial de multiplicação,
dispersão e de persistência do agente microbiano no interior do vegetal podem ser fatores
que determinem uma maior ou menor densidade de micro-organismos endofíticos.
5.3. Identificação das linhagens de Bacillus thuringiensis
As linhagens confirmadas no gênero Bacillus foram submetidas aos testes de
patogenicidade contra larvas do lepidóptero Diatraea saccharalis no intuito de se apontar as
linhagens entomopatogênicas que poderiam ser identificadas como Bacillus thuringiensis.
Os bioensaios com as linhagens de bactérias edáficas + endofíticas do gênero
Bacillus revelaram um total de 248 linhagens entomopatogênicas, representando 31,8% do
total das 779 linhagens testadas. O percentual obtido foi muito similar à sugestão de Tanada
e Kaya (1992), os quais sugerem que a população ambiental de Bt em relação à população
de Bacillus cereus é de aproximadamente 35%. A porcentagem obtida no presente trabalho
também não apresentou grande diferença do resultado obtido por Polanczyk (2004), que
isolou 461 linhagens de Bacillus sp. de amostras de solo e destas 41,2% apresentaram
propriedade entomopatogênica.
Das 248 linhagens entomopatogênicas, 100% foram identificadas como Bacillus
thuringiensis a partir da constatação da presença dos cristais proteicos que as diferem das
linhagens de Bacillus cereus (LUTHY & WORFERSBERGER23, 2000 apud POLANCZYK,
2004).
Ocorreram diferenças significativas entre os dois métodos no que se refere ao
número de colônias de Bacillus thuringiensis por placa, obtidas dos ambientes edáfico e
endofítico (F=8,793; d=3 40; P<0,001) (Tabela 9). O método Polanczyk isolou maior
24
25
VALARINI, P.J.; DIAZ ALVAREZ, M.C.; GASCÓ, J. M.; GUERRERO, F.; TOKESHI, H. Integrated evaluation of soil quality
after the incorporation of organic matter and microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology, v. 33, p. 53-58, 2002.
ANDRÉA, M.M.; HOLLWEG, M.J. 2004. Comparação de métodos para determinação de biomassa microbiana em dois solos.
Revista Brasileira Cia. do Solo, v.28, p. 981-986, 2004.
42
densidade de linhagens de Bacillus thuringiensis quando comparado ao método OMS. Pelo
método de Polanczyk foram obtidas 213 linhagens de Bt (85,88% do total das linhagens de
Bacillus sp.) em comparação as 35 linhagens de Bt (14,10%), isoladas pelo método OMS,
como aponta a Tabela 12.
Tabela 12 – Porcentagens de linhagens edáficas e endofíticas de Bt, isoladas a partir dos Métodos
OMS (1985) e Polanczyk (2004)
Polanczyk
OMS
Método
Parâmetro
Colônias de Bt
por 0,01g de
solo ou raiz
% de Bt em relação ao total
de Bacillus
entomopatogênico
Total de Bt
35
14,10%
Bt
Edáficos
33
13,30%
Bt
Endofíticos
2
0,80%
Total de Bt
770.136
85,88%
Bt
Edáficos
770.000
31,04%
Bt
Endofíticos
136
54,83%
Ainda na Tabela 12, constatou-se que o método OMS isolou um maior percentual de
linhagens Bt nas amostras edáficas (13,3%) em relação às endofíticas (0,8%), do total de
colônias isoladas de Bacillus sp. Já pelo método Polanczyk, observou-se um resultado
inverso (31,04% de linhagens Bt de origem edáfica e 54,8% de origem endofítica).
Entretanto, não ocorreram diferenças significativas no número de colônias de Bt obtidas por
placa, para os dois ambientes pelo método da OMS (F=8,8; d=3 40; P=0, 931), embora
tenham ocorrido diferenças significativas pelo método de Polanczyk (F=8,8; d=3 40;
P<0,001) (Tabela 9).
Pelo método OMS, apenas duas amostras de solo e duas amostras de raízes
apontaram a presença de linhagens de Bt, enquanto que pelo método Polanczyk (2004)
foram obtidas linhagens de Bt de todas as amostras de solo e de oito amostras de raízes
43
(Tabela 13), deixando evidente o maior potencial de isolamento de linhagens Bt do segundo
protocolo, tanto das amostras endofíticas quanto das edáficas. Além disso, os dados inferem
que o número de linhagens bacterianas isoladas a partir do Protocolo OMS pode não
traduzir a realidade, já que a falta de aeração e o meio de cultura, pobre em sais
necessários à esporulação da bactéria, dificultam o crescimento das colônias de Bt nas
placas de Petri, não apontando, em muitas delas, nenhum crescimento bacteriano. E quanto
ao fato de o método Polanczyk ter indicado um maior percentual de linhagens de Bt no
ambiente endofítico em relação ao ambiente edáfico, é possível inferir que pode não ser um
equívoco, mas sim o indício de que o percentual de linhagens Bt em alguns ambientes
endofíticos pode ser superior ao ambiente edáfico, sendo este o método ideal para o
isolamento de Bt endofítico.
A fim de se avaliar o potencial patogênico, as linhagens Bt foram divididas em três
categorias de acordo com o percentual de mortalidade de larvas de Diatraea saccharalis
(Tabela 14):
i.
Linhagens que provocaram baixo percentual de mortalidade de larvas de
Diatraea saccharalis (20% a 49,9%) – Baixo potencial como agente de
biocontrole
ii.
Linhagens que provocaram de médio a alto percentual de mortalidade das
larvas de Diatraea saccharalis (50% a 99,9%) – Médio potencial como agente
de biocontrole
iii.
Linhagens que provocaram percentual altíssimo de mortalidade Diatraea
saccharalis (100%) – Alto potencial como agente de biocontrole
44
Tabela 13 – Número de colônias de Bacillus sp. por placa de Petri (9 cm), isoladas de 11
amostras de raízes de cana-de-açúcar e de seus respectivos substratos, a partir de
dois diferentes procedimentos metodológicos
Edáfica
Endofítica
Edáfica
Endofítica
Polanczyk (2004)
OMS (1985)
Método/
ambiente
Parâmetro
Amostra
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
Total
Total de
Bacillus sp.
0
3
0
54
1
0
0
1
0
3
0
62
Bacillus
entomopatogênicos
0
0
0
32
0
0
0
1
0
0
0
33
B. thuringiensis
0
0
0
32
0
0
0
1
0
0
0
33
Total de
Bacillus sp.
0
0
0
0
1
7
0
0
0
0
3
11
Bacillus
entomopatogênicos
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
2
B. thuringiensis
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
2
Total de Bacillus
sp.
9
16
5
15
26
30
15
76
33
42
10
277
Bacillus
entomopatogênicos
1
9
4
2
2
4
9
35
3
1
7
77
B. thuringiensis
1
9
4
2
2
4
9
35
3
3
7
77
Total de
Bacillus sp.
41
41
56
8
5
18
81
81
49
21
28
429
Bacillus
entomopatogênicos
22
17
30
0
0
4
42
5
1
0
15
136
B. thuringiensis
22
17
30
0
0
4
42
5
1
0
15
136
45
Tabela 14 – Número de linhagens endofíticas e edáficas de Bt (amostradas e esperadas) obtidas
pelos métodos OMS e Polanczyk, e proporção em relação às linhagens de Bacillus sp.
dentro de 3 faixas percentuais de mortalidade de Diatraea sacharallis.
Endofítico
OMS
Edáfico
Método/
ambiente
Mortalidade
das larvas
(%)
Linhagens
de
Bacillus
sp. por
placa ou
por g/solo
ou raiz
Linhagens
edáficas
62
2
1,87 x 10
% de Bt em
relação às
linhagens de
Bacillus sp.
33
53,22%
1,0 x 10
20 a 49,9
19
30,64%
0,57 x 10
2
0,61 x 10
2
50 a 99,9
14
22,58%
0,42 x 10
2
0,45 x 10
2
100
0
0%
---
2
18,18%
0,06 x 10
20 a 49
1
9,09%
50 a 99,9
1
100
Edáfico
Endofítico
2
UFC de Bt
esperadas
por grama de
solo ou raiz
1,06 x 10
2
--2
0,06 x 10
0,03 x 10
2
0,03 x 10
2
9,09%
0,03 x 10
2
0,03 x 10
2
0
0%
---
77
27,79%
1,42 x 10
20 a 49
44
15,88%
50 a 99,9
29
100
Linhagens
endofíticas
11
2
0,33x10
2
--6
2,05 x 10
0,81 x 10
6
1,17 x 10
6
10,46%
0,53 x 10
6
0,77 x 10
6
4
1,44%
0,07 x 10
6
0,10 x 10
6
136
31,70%
4,12 x 10
2
9,81 x 10
20 a 49
101
23,54%
3,06 x 10
2
7,29 x 10
2
50 a 99,9
28
6,52%
0,84 x 10
2
2,02 x 10
2
100
7
1,63%
0,21 x 10
2
0,50 x 10
2
Linhagens
edáficas
Polanczyk
UFC de Bt/g
de solo ou
raiz,
encontradas
nos isolados
amostrados
(20 + 10%)
Colônias
de Bt
por
placa
Linhagens
endofíticas
277
6
5,11 x 10
429
2
13,0 x 10
6
2
Comparando-se as densidades de bactérias da espécie Bacillus thuringiensis
encontradas no ambiente endofítico com aquelas do ambiente edáfico, notou-se pelos dois
métodos, população bem superior no solo, com densidades esperadas de 1,06 x 102 e 2,05
x 106 UFC/g de solo (para os métodos OMS e Polanczyk, respectivamente), superando
muitas vezes a população na raiz, com densidades esperadas de 0,06 x 10 2 e 9,81 x 102
UFC/ g de raiz (para os métodos OMS e Polanczyk, respectivamente), como já apresentado
46
na Tabela 14. A densidade das linhagens edáficas de Bacillus thuringiensis foi 17,6 vezes
superior à endofítica (para o método OMS) e 2.089 vezes superior à endofítica (para o
método Polanczyk). Pode-se deduzir que é mais fácil isolar Bt do ambiente edáfico do que
do ambiente endofítico, devido à superioridade nas densidades de Bt neste ambiente.
Nota-se também a partir da análise dos percentuais de Bt (Tabela 14) que tanto no
ambiente edáfico quanto no ambiente endofítico as linhagens Bt mais comumente
encontradas são aquelas que provocam baixo percentual de mortalidade de larvas do
lepidóptero Diatraea saccharalis, e, portanto com baixo potencial para o controle biológico
destes insetos-praga. Entretanto, é no ambiente edáfico que se encontra a maior
porcentagem de linhagens Bt com médio a alto potencial para biocontrole.
Pôde-se perceber que 53,22% dos isolados edáficos obtidos através do Método OMS
manifestaram toxicidade ao lepidóptero. Este resultado foi muito semelhante ao obtido por
Martim e Travers (1989) que isolaram 1000 linhagens Bt dos cinco continentes e
identificaram ação toxica para lepidópteros e dípteros em 60% delas. Entretanto, ambos os
resultados foram muito superiores ao obtido pelo método Polanczyk (27,79%).
As linhagens Bt de altíssimo potencial para o biocontrole (capazes de matar 100%
das larvas de Diatraea saccharalis) foram isoladas apenas pelo método Polanczyk, tanto do
ambiente edáfico (1,44%) quanto do ambiente endofítico (1,63%). embora o maior
percentual destas linhagens tenha originado das raízes. Tais resultados não foram muito
diferentes dos 3,3% obtidos por Loguercio26 et al. (2001 apud Fatoretto et al., 2007), e dos
3,84% obtidos por Hernandez (1988) no México. Outros trabalhos realizados em diversos
países apontam diferentes percentuais de Bt edáfico com alta e altíssima capacidade de
matar lepidópteros. Em bioensaios com linhagens de Bt contra S. frugiperda, Fatoretto et al.
(2007) obtiveram 35% de linhagens com altíssima capacidade de provocar mortalidade em
larvas deste lepidóptero, sendo capazes de matar de 90% a 100% das larvas. Um alto
percentual (34%) também foi obtido na Argentina, por Dias et al.(1999). No México,
Bohorova27 et al. (1996 apud Polanczyk, 2004) identificaram apenas uma linhagem de Bt (de
um total de 352 isolados) com capacidade de matar 70% a 80% das larvas de lepidópteros,
representando um ínfimo percentual de 0,28%. Já na Colômbia Arango28, Romero e Orduz
26
LOGUERCIO, L. L.; SANTOS, C. G.; BARRETO, M. R.; GUIMARAES, C. T.; PAIVA, E. Association of PCR and feeding
bioassays as a large-scale method to screen tropical Bacillus thuringiensis isolates for a cry constitution with higher
insecticidal effect against Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) larvae. Letters in Appl. Microbiol., v. 32, p. 362367, 2001.
27
BOHOROVA, N.; MACIEL, A.M.; BRITO, R.M.; AGUILART, L.; IBARRA, J.E.; HOISINGTON, D. Selection and
characterization of Mexican strains of Bacillus thuringiensis active against four major lepidopteran maize pests.
Entomophaga, v. 41, p. 153±165. 1996.
28
ARANGO, J.A.; ROMERO, M.; ORDUZ, S. Diversity of Bacillus thuringiensis strains from Colombia with insecticidal activity
against Spodoptera frugiperda (Lepidoptera:Noctuidae). J Appl Microbiol., v. 92, p. 466-474, 2002.
47
(2002) e Uribe29, Martinez e Cerón (2003 apud Polanczyk, 2004) identificaram 11 de 1290
isolados Bt com capacidade para matar de 70% a 95% de larvas de S. frugiperda (o que
representa 0,85%). No presente trabalho a maior porcentagem de Bt com capacidade de
provocar alto percentual de mortalidade em larvas de Diatraea saccharalis, que foi obtida
das raízes da cana e não do seu solo, sugere que a relação entre linhagens responsáveis
por altíssimo percentual de mortalidade deste lepidóptero e linhagens responsáveis por
menores percentuais de mortalidade seja maior no ambiente endofítico do que no ambiente
edáfico. Portanto, no interior dos vegetais é possível que possa haver linhagens muito mais
promissoras para componentes de bioinseticidas.
É bastante comum, como já mencionado, trabalhos que apontam a presença de Bt no
solo. Entretanto, quando se trata de analisar a presença de linhagens Bt no ambiente
endofítico o número de trabalhos publicados é muito inferior. Algumas pesquisas apontam
que esta espécie bacteriana é colonizadora de vários tecidos vegetais, podendo ser
encontrada em diversos tipos de plantas, tais como: cana-de-açúcar (SUZUKI, 2011),
mandioca (SUZUKI, 2006; TEIXEIRA et al., 2007), algodão e couve (MONNERAT et al.,
2003). Teixeira et al. (2007) realizaram estudos sobre a diversidade de micro-organismos
endofíticos da mandioca (Manihot esculenta Crantz) em três Estados brasileiros (São Paulo,
Amazonas e Bahia) e obtiveram 47 espécies de micro-organismos pertencentes a 27
gêneros, sendo o Bacillus o mais frequente de todos. Os mesmos autores identificaram
linhagens de Bt em mandiocas provenientes dos três Estados (8,6% em mandiocas
paulistas; 2,24% em mandiocas amazonenses e 21,74% em mandiocas baianas), indicando
nos três Estados, grande variação de percentual de Bt endofítico. No presente trabalho,
nota-se valores muito maiores de Bt no interior da cana (31,70% pelo Método Polanczyk e
18,18% pelo Método OMS) comparado àquele do interior da mandioca, apontando uma
predileção da bactéria por alguns tipos de plantas dependendo do espaço geográfico.
Azevedo (1998) sugere que estes micro-organismos, em geral, adentram as plantas
por aberturas naturais (estômatos e hidatódios) e feridas (causadas por insetos, fungos, e
abrasões promovidas pelo crescimento), sendo as raízes suas principais portas de entrada.
Para Monnerat et al. (2003) a planta absorve a bactéria do solo e esta se prolifera e circula
pelos tecidos vegetais, co-evoluindo com a planta e exercendo a função de protegê-la contra
o ataque de pragas. Sendo assim, é provável que os altos percentuais de Bt em cana-deaçúcar comparados aos percentuais em mandioca possa ser justificado pela maior
necessidade que tem a cana-de-açúcar de se proteger contra a grande diversidade de
pragas que atacam os canaviais, sobretudo aquelas subterrâneas que atacam a raiz
(PINTO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2009).
29
URIBE, D.; MARTINEZ, W.; CERÓN, J. Distribution and diversity of cry genes in native strains of Bacillus thuringiensis
obtained from different ecosystems from Colombia. J Invertebr Pathol., v. 82, p.119-127, 2003.
48
A observação macroscópica das colônias de Bt apontaram diferentes padrões
morfológicos desta espécie bacteriana. Conforme aponta a Figura 14, pode-se perceber que
algumas colônias de Bt são maiores do que outras, embora todas elas apresentem as
características típicas das colônias de Bt sugeridas por Cavaleiro et al. (2005), tais como
borda arredondada e coloração branca e opaca. As cores das etiquetas representam o
percentual de mortalidade de larvas de D. saccharalis, provocado pelas linhagens Bt:
vermelha – altíssimo percentual de mortalidade; preta – médio/alto percentual; verde –
baixo percentual de mortalidade.
Figura 14 – Diferentes tamanhos das colônias de Bacillus thuringiensis:
S= solo; R= raiz
A observação microscópica das linhagens de Bacillus thuringiensis também apontou
diferentes padrões celulares da espécie em questão, muito embora todas apresentassem
cristais proteicos responsáveis pela toxicidade da bactéria (Figura 15). Algumas formas
celulares são mais compridas, contendo número variado de cristais proteicos (Figura 15D),
enquanto outras já apresentam-se mais curtas e largas, contendo apenas um cristal proteico
em seu interior (Figura 15B). Alguns autores sugerem que os cristais proteicos variam em
forma, tamanho e no modo de sua formação, dependendo da subespécie da linhagem Bt
(NORRIS30, 1971) e que os cristais bipiramidais apareçam nas subespécies que possuem
ação tóxica contra lepidópteros, enquanto que os cristais com forma triangular, cuboidal,
plano, em forma de barra ou amorfos apareçam nas subespécies com ação tóxica contra
outras ordens. Assim sendo, a forma e o número dos cristais dentro do esporângio podem
indicar a atividade inseticida de uma estirpe (HABIB; ANDRADE, 1998; LERECLUS15;
30
NORRIS, J. R. 1971. The protein crystal toxin of Bacillus thuringiensis biosynthesis and physical structure. In: BURGES, H.
D.; HUSSEY, N. W. (ed.), Microbial control of insects and mites. Academic Press Inc., London. 1971. p. 229-246.
49
LECADET, 1993 apud MELATTI, 2008) e a formação destes cristais está relacionada ao tipo
de gene cry que esta subespécie possui (HOFTE; WHITELEY, 1989; TAYLOR et al., 1992;
CRICKMORE et al., 1998; AGAISSE; LERECLUS, 1995; MONNERAT; BRAVO, 2000).
Nove das onze linhagens de Bt responsáveis pela mortalidade de 100% das larvas
de D. saccharalis apresentaram o padrão celular mostrado na figura 15A. Observou-se
também uma linhagem de Bt com formato curvo, como aponta a figura 15C.
A
B
esporo
Cristal
proteico
Cristal
proteico
esporo
C
D
Cristais
proteicos
esporo
Cristais
proteicos
esporo
FIGURA 15 – Diferentes aspectos morfológicos de células de Bt
50
Foram observados diferentes tipos de cristais proteicos com formas e tamanhos
variados, alguns apresentando forma esférica, outros cuboides ou bipiramidais (Figura 16),
Estas observações estão de acordo com alguns autores que sugerem a presença destes
tipos de cristais em linhagens com ação tóxica contra lepidópteros (HOFTE & WHITELEY,
1989; TAYLOR et al., 1992; TANADA; KAYA, 1992; YAMAMOTO31; MCLAUGHLIN, 1981 e
TOJO32 et al., 1986 apud TANADA; KAIA, 1992). O número de cristais no interior das células
também variou.
A
Cristal bipiramidal
Esporo
Cristal esférico
Esporo
B
Cristais
esférico
s
Figura 16- Diferentes formas dos cristais proteicos presentes nas linhagens identificadas de Bt.
A – Estágio avançado de esporulação mostrando os cristais bipiramidais e esféricos
fora da célula vegetativa; B – Células vegetativas contendo esporos e cristais
esféricos.
31
32
YAMAMOTO, T.; MCLAUGHLIN, R. E. Isolation of a protein from the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis var.
kurstaki toxic to the mosquito larva, Aedes taeniorhynchus. Biochem. biophys. Res. Commun. v. 103, p. 414 – 421, 1981.
TOJO, A.; SAMASANTI, W.; YOSHIDA, N.; AIZAWA, K. Effects of the three proteases from gut juice of the silkworm,
Bombyx mori, on the two morphologically different inclusions of δ-endotoxin produced by Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1
strain. Agric Biol Chem., v. 50, p. 575 – 580, 1986.
51
De acordo com Tanada e Kaya (1992) alguns autores indicam que a maioria das
linhagens Bt, apresenta apenas um cristal proteico. Quando existem muitos cristais em um
mesmo esporângio, eles devem diferir em tipos e formas (SHARPE33; BAKER, 1979;
ARONSON34; BECKMAN; DUNN. 1986) O autor indica ainda que, quando a linhagem
apresenta dois cristais proteicos, sendo um deles bipiramidal e o outro ovoidal ou esférico
(tal como aparece na Figura 16A), estes diferem na toxicidade para insetos e nas
propriedades antigênicas (KRYWIENCZYK35; DULMAGE; FAST, 1978; SHARPE33; BAKER,
1979). Isso sugere que o isolado Bt representado na Figura 16A pode ter ação tóxica para
outros organismos, além do efeito tóxico já confirmado para D. saccharalis.
Diante dos dados obtidos no presente trabalho, pôde-se notar que o Método
Polanczyk é um procedimento muito eficiente no isolamento de linhagens edáficas e
endofíticas de Bacillus thuringiensis e que o interior dos tecidos vegetais pode representar
um ambiente muito promissor para a obtenção de agentes de controle biológico contra
pragas da agricultura.
33
SHARPE, E. S.; BAKER, F. L. Ultrastruture of the unusual crystal of the HD-1 isolate of Bacillus thuringiensis, var. Kurstaki. J.
Invertebr. Pathol., v. 34, p. 320-322, 1979.
34
ARONSON, A. I.; BECKMAN, W. Y.; DUNN, P. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens. Microbiology Review, v.
50, p. 1-24,1986.
35
KRYWIENCZYK, J.; DULMAGE, H.T.; Fast, P.G. Occurence of two serologically distinct groups within
thuringiensis serotype 3ab var kurstaki. J. Invertebr. Pathol., v. 31, p. 372-375, 1978.
Bacitlus
52
6. Conclusões

O isolamento de Bacillus pode ser realizado pelo procedimento sugerido pela
Organização Mundial de Saúde – OMS (1985) e por aquele sugerido por
Polanczyk (2004), tendo este último capacidade de isolar maior densidade de
Bacillus sp.
e menor específicidade que o primeiro procedimento para
isolamento deste gênero bacteriano.

A densidade de UFC de Bacillus thuringiensis no solo é superior àquela
apresentada no interior das raízes de cana-de-açúcar.

Por sua alta capacidade de isolar linhagens Bt, o procedimento sugerido por
Polanczyk (2004) é o mais eficiente procedimento de isolamento de Bt
endofítico.

O tamanho das colônias de Bacillus thuringiensis pode variar de acordo com
a linhagem

As células de diferentes linhagens de Bacillus thuringiensis podem apresentar
diferenças no tamanho, formato e na quantidade de cristais proteicos, e estes
podem exibir variadas formas, tamanhos e ação tóxica sobre os diversos
insetos-praga e vetores de doenças.
53
7. Referências Bibliográficas
AGAISSE, H. & LERECLUS, D. How does Bacillus thuringiensis produce so much inseticidal
crystal protein? Journal of Bacteriology, v. 177, n. 21, p. 6027-6032, 1995.
ALVES, S. B. (Ed.). Controle Microbiano de Insetos. 2ª ed. Piracicaba: Fealq, 1998.
ALVES, S. B.; LOPES, R. B. (Ed.). Controle microbiano de pragas na América Latina:
avanços e desafios. Piracicaba: FEALQ, 2008.
ARAÚJO, W. L.; LIMA, A. S.; AZEVEDO, J. L.; KUKLINSKY-SOBRAL, J.; MARCON, J.;
LACAVA, P. T. Manual: isolamento de microrganismos endofíticos. Piracicaba: CALQ, 1,
2003. 86p.
AZAMBUJA, A. O.; ALLES, G. C.; FRITZ, L. L.; RECBE, M. H. R., FIUZA, L. M. Ecologia de
Bacillus entomopatogênicos. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, n. 38, p. 14 -23,
2009-2010. Disponível em <http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio38/ecologia.pdf>
Acesso em 08 ago. 2012.
AZEVEDO, J.L. Microrganismos Endofíticos. In: MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. (Eds.)
Ecologia Microbiana. Ed. EMBRAPA, Jaguariúna-SP. p.117-137, 1998.
AZEVEDO, J. L.; MACCHERONI, W. J.; ARAÚJO, W. L.; PEREIRA, J.O. Microrganismos
Endofíticos e seu Papel em Plantas Tropicais In: SERAFINI, L. A.; BARROS, N. M.;
AZEVEDO, J. L. Biotecnologia: Avanços na Agricultura e na Agroindústria. Caxias do
Sul, RS, Universidade de Caxias do Sul, p. 235 – 268, 2002, 433p.
AZEVEDO, J. L.; ARAÚJO, W. L. Diversity and applications of endophytic fungi isolated
from tropical plants, p.189-207. In: GANGULI B, N.; DESHMUKH, S. K. (eds) Fungi:
multifaceted microbes. Boca Raton, CRC Press, 2007. 321p.
BASTOS, E. Cana-de-açúcar: o verde mar de energia. Coleção Brasil Agrícola. Ícone:
1987. 130p.
BIOTECNOLOGIA CIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO. Edição Especial: Ecotoxicologia de
Bacillus thuringiensis. Brasília, DF: Ano IX, n. 38. 2009-2010.
BRUM, M. C. P. Fungos endofíticos de Vitis labrusca L. var. Niagara Rosada e o seu
potencial biotecnológico. Mogi das Cruzes, 2008. Tese (Doutorado) - Universidade de
Mogi das Cruzes, 2008.
______. Microrganismos endofíticos da videira Niagara Rosada (Vitis labrusca L.) e o
controle de Fusarium. Mogi das Cruzes, 2006. Dissertação (Mestrado) - Universidade de
Mogi das Cruzes, 2006.
54
CAVALEIRO, H.; PRAÇA, L. B.; MARTINS, E. S.; MEDEIROS, P. T.; GOMES, A. C. M. M.;
MONNERAT, R. G. Novas estirpes de Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus
testados contra larvas de insetos da ordem lepidoptera e diptera. Brasília: Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2005. 22p. (Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 87)
Disponível em:
<http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CENARGEN/26683/1/bp087.pdf> Acesso
em: 06 ago. 2012.
CIMERMAN, B.; CIMERMAN, S. Parasitologia Humana e seus Fundamentos gerais. 2
ed., São Paulo: Atheneu, 2001.
COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO (CONAB). Acompanhamento da safra
brasileira: cana-de-açúcar, segundo levantamento, agosto/2012 . Disponível em: <http://
http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/12_08_09_15_07_05_boletim_cana_p
ortugues_-_agosto_2012_2o_lev.pdf> Acesso em: 08 ago. 2012.
CPL BUSINESS CONSULTANTS. The Biopesticides Market in Latin America, Africa &
Middle East. v. 5, 2010a. Disponível em:
<http://www.cplsis.com/index.php?reportid=332&category=76> Acesso em: 08 ago. 2012.
CPL BUSINESS CONSULTANTS. The 2010 Worldwide Biopesticides Market Summary,
v. 1, 2010b. Disponível em: <http://www.cplsis.com/index.php?reportid=335&category=76>
Acesso em: 08 ago. 2012.
CRICKMORE, N.; ZEIGLER, D.R.; FEITELSON, J.; SCHNEPF, E.; LAMBERT, B.;
LERECLUS, D.; GAWRON-BURKE, C.; DEAN, D.H. Revision of the nomenclature for
Bacillus thuringiensis cry genes, p. 14. In: Program and abstracts of the 28th Annual
Meeting of the Society for Invertebrate Pathology. Society for Invertebrate Pathology,
Ithaca, USA. 1995.
______, ZEIGLER D.R., FEITELSON J., SCHNEPF E., VANRIE J., LERECLUS D., BAUM
J., DEAN D.H. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal
proteins. Microbiol. and Mol. Biol. Rev., v. 62, n.3, p. 807-813, 1998.
DIAS, SC; SAGARDOY, MA; SILVA, SF; DIAS, JMCS. Characterization and Pathogenic
evaluation of Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus isolates from argentinean soils.
BioControl, v.44, p.59-71, 1999.
DOLINSKI, C.; LACEY, LAWRENCE, A. Microbial control of arthropod pests of tropical tree
fruits. Neotrop. Entomol., Londrina, v. 36, n. 2, Apr. 2007. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1519566X2007000200001&lng=en&nrm=iso>. Acesso em: 01 out. 2012.
EDWARDS D. L., PAYNE J., SOARES G. G. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having
activity against nematodes. European Patent Application, EP 0 303 426 A2. 1988.
FAO, 2012 - Food Agriculture Organization. Faostat. Disponível em <http://faostat.fao.org>
Acesso em: 06 ago. 2012.
55
FATORETTO, J. C.; SENA, J. A. D.; BARRETO, M. R.; LEMOS, M. V. F.; BOIÇA
JUNIOR, A. L. Associação de bioensaios e caracterização molecular para seleção de
novos isolados de Bacillus thuringiensis efetivos contra Spodoptera frugiperda (J. E.
Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Neotropical Entomology, v. 36, n. 5, p. 737-745, set.out.
2007.
FEITELSON J. S., PAYNE J., KIM, L. Bacillus thuringiensis insects and beyond. Biotechnology, 10, 271-275. 1992.
FIUZA, L. M. Mecanismo de ação de Bacillus thuringiensis. Biotecnologia, Ciência e
Desenvolvimento, Brasília, DF, n. 38, p. 32-35. 2009-2010.
FRACHON, E.; THIERY, I. Identification, iIsolation, culture and preservation of
entomopathogenic bacteria. In: LACEY, L. A. (Ed.) Manual of Techniques in Insect
Pathology. Academic Press, cap. 3, p. 55-116, 1997.
GLARE, T.R.; O’CALLAGHAM, M. Bacillus thuringiensis: biology, ecology and safety.
Chichester: John Wiley and Sons; 2000. p. 350.
GONÇALVES, M. C. Principais Viroses da Cana-de-Açúcar. in RIFIB, 9, 2003, Sertãozinho,
SP. Anais da IX Reunião Itinerante de Fitossanidade do Instituto Biológico – Cana-deaçúcar: Antônio Batista Filho, José Eduardo M. de Almeida, Amaury da S. dos Santos, Elias
Gutierrez Júnior, Luís Antônio Paiva, 2003. 62p.
HABIB; M.E.M.; ANDRADE, C.F.S. 1998. Bactérias entomopatogênicas. In: FEALQ (ed.).
Controle Microbiano de Insetos. São Paulo. p. 383 – 446, 1998.
HERNANDEZ, J.L.L. Évaluation de la toxité de Bacillus thuringiensis sur Spodoptera
frugiperda. Entomophaga 33:163-171, 1988.
HÖFTE, H.; WHITELEY, H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis.
Microbiology Reviews, v. 53, p. 242-255, 1989.
IBARRA, J. E.; RINCÓN, M. C.; ORDÚZ, S.; NORIEGA, D.; BENITENDE, G.; MONNERAT,
R.; REGIS, L.; OLIVEIRA, C.M.F.; LANZ, H.; RODRIGUES, M.H.; SÁNCHEZ, J.; PEÑA, G.;
BRAVO, A. Diversity of Bacillus thuringiensis strain from Latin America with insecticidal
activity against different mosquito species. Applied Environmental Microbiology., v. 69, p.
5269-5274. 2003.
IBGE - INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2010. Disponível em:
<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/pam/2010/default.shtm> Acesso em: 06
ago. 2012.
JUNG, Y. C.; KIM, S. U.; CÔTE, J. C.; LECADET, M. M.; CHUNG, Y. S.; BOK, S. H.
Characterization of a new Bacillus thuringiensis subsp. Higo strain isolated from rice bran in
korea. Journal of invertebrate pathology, v. 71, p. 95-96, 1998.
56
LEÃO DE SOUSA, E. L.; MACEDO, I. de C. Etanol e bioeletricidade: a cana-de-açúcar
no futuro da matriz energética (Coord. e Org.). São Paulo: Luc Projetos de Comunicação,
2010.
LECADET, M.M.; FRACHON, E.; DUMANOIR, V.C.; RIPOUTEAU, H.; HAMON, S.;
LAURENT, P. THIÉRY, I. Updating the H-antigen classification of Bacillus thuringiensis. J.
Appl. Microbiol. v.86, 1999. p. 660-672.
MARTIN, P.A.; TRAVERS, R.S. Worldwide abundance and distribution of Bacillus
thuringiensis isolates. Applied and Environmental Microbiology, Massachusetts, v.55,
n.10, p.2437-2442, 1989.
MELATTI, V. M. Seleção de estirpes de Bacillus thuringiensis tóxicas ao pulgão do
algodoeiro (Aphis gossypii). Dissertação de Mestrado. Universidade De Brasília, 2008.
MENDES, R.; AZEVEDO, J. L. Valor biotecnológico de fungos endofíticos isolados de
plantas de interesse econômico. In: MAIA, L. C.; MALOSSO, E.; YANO-MELO A.M.
Micologia: avanços no conhecimento.1ed. Recife: Ed. Universitária da UFPE, 2007.
p.129-140.
MOHAMED, E.A.M.; ABE, M.; GHANEM,K.M.; ABDEL-FATTAH, Y.R.; NAKAGAWA, Y.; ELHELOW, E. R. Diversity of Bacillus Genotypes in soil samples from El-omayed biosphere
reserve in Egypt. Journal of Culture Collections, n.5, p. 78-84. 2007.
MONNERAT, R.G.; BRAVO, A. Proteínas bioinseticidas produzidas pela bactéria Bacillus
thuringiensis: modo de ação e resistência. In: MELO, I.S.; AZEVEDO, J.L. (Ed.). Controle
biológico. Jaguariúna: Embrapa-CNPMA, 2000. v.3, p.163-200.
______; SANTOS, R.; BARROS, P.; BATISTA, A.; BERRY, C. Isolamento e
caracterização de estirpes de Bacillus thuringiensis endofíticas de algodão. Embrapa:
Brasília, 2003 (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Comunicado técnico, 98).
Disponível em:
<http://www.cnpa.embrapa.br/produtos/algodao/publicacoes/trabalhos_cba4/090.pdf>
Acesso em: 06 ago. 2012.
______; PRAÇA, L.B. Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus. In: OLIVEIRA-FILHO, E.
C.; MONNERAT, R. G. (Ed.) Fundamentos para a regulação de Semioquímicos,
Inimigos naturais e Agentes Microbiológicos de Controle de Pragas. Embrapa, 2006.
cap. 6, p. 121-155.
NEVES, M. F; TROMBIN, V. G.; CONSOLI, M. O mapa sucroenergético do Brasil. In: LEÃO
DE SOUSA, E. L.; MACEDO, I. de C. Etanol e bioeletricidade: a cana-de-açúcar no
futuro da matriz energética (Coord. e Org.). São Paulo: Luc Projetos de Comunicação,
2010.
OHBA, M.; MIZUKI, E.; UEMORI, A. Parasporin, a New Anticancer Protein Group from
Bacillus thuringiensis. Anticancer Research, v. 29, p. 427-434, 2009.
57
OLIVEIRA-FILHO, E. C.; MONNERAT, R. G. Fundamentos para a regulação de
Semioquímicos, Inimigos naturais e Agentes Microbiológicos de Controle de Pragas.
Embrapa, 2006.
PARRA, J. R. P.; BOTELHO, P. S. M.; CORRÊA-FERREIRA, B. S.; BENTO, J. M. Controle
Biológico no Brasil – Parasitóides e Predadores. 1ª ed. São Paulo: Manole, 2002. 609p.
PETTI, R; C. E. FREDO. Emprego Formal na Cana-de-açúcar. Análises e Indicadores do
Agronegócio – IEA, São Paulo, v. 4, n. 4, abr. 2009.
PINTO, A.de S.; BOTELHO, P. S. M.; OLIVEIRA, H. N. de. Guia ilustrado de pragas e
insetos benéficos da cana-de-açúcar. Piracicaba: CP 2, 2009. 160p.
POLANCZYK, R. A.; GARCIA, M. de O; ALVES, S. B. Potencial de Bacillus thuringiensis
israelensis Berliner no controle de Aedes aegypti. Rev. Saúde Pública, São Paulo, v. 37, n.
6, Dec. 2003. Disponível em:
<http://www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S003489102003000600020&lng=en&nrm=iso>. Acesso em 06 Ago. 2012.
______; R. A. Estudos de Bacillus thuringiensis Berliner visando ao controle de
Spodoptera frugiperda (J. E. Smith). Piracicaba: USP, 2004. Tese (Doutorado) - Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2004.
______.; VALICENTE, F.H; BARRETO, M. R. Utilização de Bacillus thuringiensis no controle
de pragas agrícolas na América Latina. In ALVES, S. B.; LOPES, R. B. (Ed.) Controle
Microbiano de Pragas na América Latina. Fealq, 2008. cap. 4, p. 111-135.
REIS, O. S. (Org.). Cultura da Cana-de-açúcar. Empresa Paranaense de Assistência
Técnica e Extensão Cultural. Curitiba, 1981.37p.
REUNIÃO ITINERANTE DE FITOSSANIDADE DO INSTITUTO BIOLÓGICO - (RIFIB), 5,
2001, Sertãozinho, SP. Anais da V Reunião Itinerante de Fitossanidade do Instituto
Biológico – Cana-de-açúcar: José Eduardo M. de Almeida, Amaury da S. dos Santos,
Antônio Batista Filho, Elitamara Morsoletto Santos e Maria Aparecida Vicente Cano, 2001.
62p. Disponível em: <http://www.biologico.sp.gov.br/rifib/V%20RIFIB%20anais.PDF> Acesso
em: 18 jan.2010, 21h00min.
______, 9, 2003, Sertãozinho, SP. Anais da IX Reunião Itinerante de Fitossanidade do
Instituto Biológico – Cana-de-açúcar: Antônio Batista Filho, José Eduardo M. de Almeida,
Amaury da S. dos Santos, Elias Gutierrez Júnior, Luís Antônio Paiva, 2003. 62p.
REVISTA G. BIO. Controle Biológico no Brasil. Edição Especial, São Paulo: abr. 2010.
ROSSETO, R.; SANTIAGO, A.D. Doenças da cana-de-açúcar e seu controle. Informações
Agronômicas, n.67, set., 1994. Encarte. Disponível em:
<http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/Repositorio/InformacoesAgronomicas_67IDfdwBc3usO9.pdf>. Acesso em: 18 jan. 2010, 21h 30min.
58
RONQUIM, C. C. Queimada na colheita da cana-de-açúcar: impactos ambientais,
sociais e econômicos. Campinas: Embrapa Monitoramento por Satélite, 2010. 45 p.: il.
(Embrapa Monitoramento por Satélite. Documentos, 77). Disponível em: <http://
http://www.cnpm.embrapa.br/publica/download/Doc_77.pdf>. Acesso em 18 ago. 2012.
RUAS NETO, A. L., SILVEIRA, S. M. 1989. Uso de inseticidas bacterianos para o controle
de culicídeos e simulídeos no Rio Grande do Sul. Mem. Inst Oswaldo Cruz, v.84, 1989.
p. 39-45.
SALLES, J. F. ; BALDANI, J. I. . Bacillus thuringiensis como agente de controle
biológico. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 1998 (Série Documentos/Embrapa
Agrobiologia).
SANTOS, A. da S. Doenças causadas por Fungos e Bactérias em Cana-de-Açúcar. In
RIFIB, 9, 2003, Sertãozinho, SP. Anais da IX Reunião Itinerante de Fitossanidade do
Instituto Biológico – Cana-de-açúcar: Antônio Batista Filho, José Eduardo M. de Almeida,
Amaury da S. dos Santos, Elias Gutierrez Júnior, Luís Antônio Paiva, 2003. 62p.
SÃO PAULO, Lei nº 11.241, de 19 de setembro de 2002. Dispõe sobre a eliminação da
queima da palha da cana-de-açúcar e dá providências correlatas. Diário Oficial [Governo
do Estado de São Paulo], São Paulo, SP, 2002.
SERAFINI, L. A.; NEIVA, M. B.; AZEVEDO, J. L. Biotecnologia: Princípios e Aplicações In:
______, Biotecnologia na Agricultura e na Agroindústria. Guaíba: Agropecuária, p. 5861, 2001.
SIA, E. F. Isolados endofíticos e entomopatogênicos de Beauveria: Caracterização e
importância Biotecnológica. Mogi das Cruzes: UMC, 2006. Dissertação (Mestrado) Programa de Pós-graduação UMC, Mogi das Cruzes, 2006.
SILVA, S.F.da; MONNERAT, R.G. Comparação entre três Métodos de Isolamento de
Bacilos Entomopatogênicos. Embrapa, 2002.
SOARES, C. M. S. Produção, Formulação e Aplicação de Bactérias. In: OLIVEIRA-FILHO,
E. C.; MONNERAT, R. G. Fundamentos para a regulação de Semioquímicos, Inimigos
naturais e Agentes Microbiológicos de Controle de Pragas. Embrapa, 2006. cap. 10, p.
219-238.
SUZUKI, M. T. Caracterização e ecologia de Bacillus thuringiensis TC2 3.1R6
endofítico de cana-de-açúcar (Saccharum sp). São Paulo: 2011. Tese (Doutorado) –
Universidade de São Paulo/Instituto Butantan/Instituto de Pesquisas Tecnológicas, São
Paulo, 2011.
______, M.T. Isolamento, identificação e caracterização de linhagens endofíticas de
Bacillus thuringiensis de mandioca (Manihot esculenta Crantz). São Paulo: 2006.
Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo/Instituto Butantan/Instituto de
Pesquisas Tecnológicas, São Paulo, 2006.
59
STEWART, G. S. A. B.; JOHNSTONE, K.; HAGELBERG, E.; ELLAR, D. J. Commitment of
bacterial spores to germinate. A measure of the trigger reaction. Biochemistry Journal, v.
198, p. 101-106, 1981.
TAYLOR, R.; TIPPET, J.; GIBB, G.; PELLS, S.; PIKE, D.; JORDAN, L.; ELY, S. Identification
and characterization of a novel Bacillus thuringiensis d-endotoxin entomocidal to coleopteran
and lepidopteran larvae. Molecular Microbiology, v.6, p.1211-1217, 1992.
TANADA, Y.; KAYA, H. Insect Pathology. Academic Press, 1992. cap. 4, p. 83-146.
TEIXEIRA, M.A.; MELO, I.S. de; VIEIRA, R.F.; COSTA, F.E. de C.; HARAKAVA, R.
Microrganismos endofíticos de mandioca de áreas comerciais e etnovariedades em três
estados brasileiros. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.42, p.43-49, 2007.
THIERY, I; FRACHON, E. Identification, isolation, culture and preservation of
entomopathogenic bacteria. In: LACEY, L.A. Manual of Techniques in Insect Pathology.
(Biological Techniques Series). London: Academic Press, 1997. Cap. III-1. p. 55-75.
VAN DRIESCHE, R. G.; BELLOWS JR., T. Biological Control. Chapman & Hall, 1996.
447p.
VASCONCELOS, Y. Inseto contra inseto. Revista Pesquisa Fapesp. Brasília, DF, n. 194, p.
68-73, maio. 2012. Disponível em: <http://revistapesquisa.fapesp.br/wpcontent/uploads/2012/05/Pesquisa_195-26.pdf> Acesso em: 06 ago. 2012.
VENDRAMIM, J. D. . O Controle Biológico e a Resistência de Plantas. In: PARRA, J.R.P.;
CORREA-FERREIRA, B.S.; BOTELHO, P.S.M.; BENTO, J.M.S. (Org.). Controle Biológico
de Pragas: Parasitóides e Predadores. 1 ed. São Paulo: Manole, 2002, v. 1, p. 511-528.
VIAN, C. E.F. Alcoolquímica. In: AGÊNCIA DE INFORMAÇÃO EMBRAPA – CANA-DEAÇÚCAR, 2005-2007. Disponível em: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-deacucar/arvore/CONTAGO1_132_22122006154842.html Acesso em: 18 jan. 2010,
21h15min.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Microbial Pest Control Agent Bacillus thuringiensis.
Geneva, 1999. Disponível em:
<http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/42242/1/WHO_EHC_217.pdf> Acesso em 06 ago.
2012.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Informal consultation on the development of
Bacillus sphaericus as a microbial larvicide. Geneve, 1985. 24p.
YOUSTEN, A. A. Entomopathogenic bacteria for biological control. Workshop Manual.
Mimeography Document, Fundação André Tosello, Campinas, Brazil. 50p, 1991.
60
8. Anexos
8.1. Coloração de Wirtz-Conklin

Preparar o esfregaço para ser corado (secagem e fixação).

Cobrir o esfregaço com Verde de Malaquita (5%) e colocar a preparação num
local quente (sobre o vapor) durante 2 a 3 minutos. Não deixar que o corante
evapore nem que entre em fervura.

Deixar arrefecer a lâmina e lavá-la com água corrente.

Retirar o excesso de água

Repetir o procedimento com o corante Verde Malaquita

Cobrir o esfregaço com Safranina (1,5%) e deixar atuar durante 30 segundos.

Lavar em água corrente sempre com a lâmina inclinada.

Secar em papel de filtro e observar ao MO em objetiva de imersão.
8.2. Meio CCY Broth (STEWART e colaboradores, 1981)
A. Tampão Fosfato
KH2PO4 – 1,7g
K2HPO4 – 4,5g
Complete com 50 mL de água destilada (autoclavar e conservar na geladeira)
B. Estoque Nutriente
L-Glutamina – 200 mg
Caseína hidrolisada (ácido) – 10g
Bacto casitone – 10g
Extrato de levedura – 4g
Glicerol – 6 mL
Completar com 100 mL de água (autoclavar e conservar na geladeira)
C. Sais CCY
ZnCl (0,005M) – 0,34g
MgCl2 . 6H2O (0,5M) – 5,08g
MnCl2 . 6H2O (0,01M) – 0,098g
CaCl2 . 2H2O (0,2M) – 1,47g
FeCl3 . 6.H2O (0,05M) – 0,675g
Completar com 49,5 mL de água destilada e adicione 0,5 mL de HCl
61
Filtrar a solução passando por uma membrana (0,22µm)
Preparação de 1 L de Meio
1) 2,5 mL de Tampão Fosfato
2) 10 mL de Nutriente Estoque
3) Completar com 1 L de água destilada
4) Autoclavar
5) Adicionar 1 mL de Sais
8.3. Solução de Penicilina G

Diluir 1 grama de Penicilina G em 9 mL de água destilada

Filtrar a solução em membrana (0,22 µm)

Retirar alíquota de 1 mL em 1 L de meio.
8.4. Meio Nutriente-Ágar (NA) – 1 Litro
 3 g de Extrato de Carne
 5 g de Peptona
 8 g de NaCl
 18 g de Ágar
 1 Litro de água destilada
 Autoclavar
8.5. Solução salina – Trituração das Raízes
 Diluir 0,8 g de NaCl em 100 mL de água destilada
 Autoclavar
62