Toxoplasma gondii INIBE A EXPRESSÃO DA ÓXIDO NITRICO
SINTASE INDUZIDA E A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NITRICO NA
LINHAGEM DE CÉLULA EPITELIAL INTESTINAL IEC-6
JULIANA COSTA DE AZEVEDO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
FEVEREIRO DE 2011
Toxoplasma gondii INIBE A EXPRESSÃO DA ÓXIDO NITRICO
SINTASE INDUZIDA E A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NITRICO NA
LINHAGEM DE CÉLULA EPITELIAL INTESTINAL IEC-6
JULIANA COSTA DE AZEVEDO
Dissertação apresentada ao Curso de PósGraduação em Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, como parte das exigências
para obtenção do título de Mestre em
Biociências e Biotecnologia.
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
FEVEREIRO DE 2011
Toxoplasma gondii INIBE A EXPRESSÃO DA ÓXIDO NITRICO
SINTASE INDUZIDA E A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NITRICO NA
LINHAGEM DE CÉLULA EPITELIAL INTESTINAL IEC-6
JULIANA COSTA DE AZEVEDO
Dissertação apresentada ao Curso de PósGraduação em Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, como parte das exigências
para obtenção do título de Mestre em
Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em 18 de fevereiro de 2011.
Comissão examinadora:
_________________________________________________________________
Prof. Sérgio Henrique Seabra (Doutor em Ciências) - UEZO
_________________________________________________________________
Prof. Arthur Giraldi Guimarães (Doutor em Ciências) – UENF
_________________________________________________________________
Prof. Clóvis de Paula Santos (Doutor em parasitologia Veterinária) – UENF
_________________________________________________________________
Prof. Renato Augusto DaMatta (Doutor em Ciências) – LBCT/UENF
Orientador
Agradecimentos
A Deus por me proteger, me dar força e sabedoria para desenvolver esse
trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
CNPq, à Fundação de Amparo à Pesquisa Carlos Chagas Filho do Estado do Rio
de Janeiro – FAPERJ, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior – CAPES, à Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro –
UENF pelo apoio financeiro para realização deste trabalho.
Ao Dr. Renato Augusto DaMatta pela orientação, por toda dedicação,
atenção e ensinamentos ao longo desses seis anos de orientação.
Ao LBR e ao setor de fisiologia vegetal onde foram realizadas todas as
leituras de óxido nítrico.
A todos os professores do LBCT.
Ao meu revisor Dr. Clóvis de Paula Santos.
A Banca examinadora.
A todos os amigos do LBCT: Barbarella, Farlen Miranda, Fernanda, João
Roberto, Letícia, Luciana Lemos, Juliana Padrão, Laura Motta e Thiago por toda
ajuda alegria e amizade.
Ao amigo João Cláudio pelo companheirismo, amizade, e muita ajuda
principalmente nas leituras de NO e inúmeras imunofluorescências.
Aos meus alunos emprestados Carolina Rath e Gabriel Rabelo.
Ao corpo técnico do LBCT em especial ao técnico Fábio Oliveira e Adriana
Martins.
Aos amigos da UEZO Dr. Sergio Henrique Seabra, Juliana Portes, Thiago
Alves e Francisco Medros por toda alegria, e conversas agradáveis sobre o
Toxoplasma gondii.
Aos meus pais Luiz Azevedo e Vera Azevedo e irmãos Vinícius Azevedo e
Lívia Azevedo por todo amor e incentivo.
Ao meu noivo Eurico Huziwara por toda ajudar e compreensão durante a
realização desse trabalho.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
BSA - Albumina sérica bovina
CD - Cluster of diferention (marcador de superfície)
DC - células Dendríticas
DMEM- Meio de Eagle modificado por Dulbecco
eNOS - Óxido nítrico sintase endotelial
EDRF - fator relaxante derivado do endotélio
GTPase- Enzima Guanosina trifosfato
HIV - Vírus da imunodeficiência adquirida
iNOS - Óxido nítrico sintase induzida
IEC - Células epiteliais intestinais do inglês Intestinal Epithelial cells
IFN-γ- Interferon gamma
IL - 1
Interleucina I beta
LPS - Lipopolissacarídeo
MIP-1- proteínas inflamatórias de macrófagos
MCP1- proteína quimiotática de monócitos
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NF-κB - Fator de transcrição nuclear
NO - Óxido nítrico
NOS - Óxido nítrico sintase
nNOS - Óxido nítrico sintase neuronal
NK- natural Killer
PBS - Solução salina tamponada de fosfato
SFB - Soro fetal bovino
SNC - Sistema nervoso central
TNF-α - Fator de necrose tumoral α
VP - Vacúolo parasitóforo
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 – Ciclo de vida do Toxoplasma gondii (modificado de Ferguson,
2002)................................................................................................................
13
Figura 2 – Reação molecular da produção de óxido nítrico envolvendo a
óxido nítrico sintase.Óxido Nítrico Sintase (NOS) catalisa a reação entre
arginina e oxigênio, com consumo de 1.5 mol de NADPH para 1 mol de NO
produzido. Citrulina e água também são produzidas durante a reação
(adaptado de Chokshi et al., 2008)..................................................................
21
Figura 3 – Microscopia de Fluorescência de IEC-6 residentes ou ativadas
marcadas com anti-iNOS. (A) IEC-6 residente cultivada por 24 h. (B) IEC-6
ativada com interferon-gamma (IFN- ) e lipopolissacarídeo (LPS) por 24 h.
(C) IEC-6 ativada com (IFN- ) por 24 h. Note a alta expressão de iNOS
pelas IECs ativadas somente com IFN- .........................................................
31
Figura 4 – Microscopia de fluorescência de células epiteliais ativadas
marcadas com anti-iNOS (verde) e anti-Toxoplasma gondii (laranja). (A)
IEC-6 não infectadas ativadas por 24 h. (B) IEC-6 ativadas infectadas por
24 h com T. gondii (cepa RH). (C) IEC-6 ativadas, infectadas for 24 h com
T. gondii (ME-49). (D) IEC-6 não infectadas ativadas por 48 h. (E) IEC-6
ativadas infectadas por 48 h com T. gondii (cepa RH). (F) IEC-6 ativadas
infectadas por 48 h com T. gondii (ME-49). Note a diminuição da expressão
de iNOS após infecção com T. gondii de ambas as cepas, no entanto, após
48 h de infecção a IEC-6 infectada com ME-49 recuperou a expressão de
iNOS.................................................................................................................
34
Tabela 1 – Desenvolvimento do Toxoplasma gondii em IEC-6 residentes....
28
Tabela 2 – Efeito do Interferon-gamma no desenvolvimento do Toxoplasma
gondii cepa RH em IEC-6................................................................................
29
Tabela 3 – Dosagem de óxido nítrico em células epiteliais intestinais-6 após
estimulação com IFN- e LPS.........................................................................
30
Tabela 4 – Dosagem de óxido nítrico em células epiteliais intestinais após
estimulação com diferentes concentrações de IFN- .....................................
32
Tabela 5 – Inibição da produção de óxido nítrico após infecção com
Toxoplasma gondii em células epiteliais intestinais ativadas.........................
33
RESUMO
Toxoplasma gondii, o agente da toxoplasmose, é protozoário intracelular
obrigatório capaz de infectar vários tipos de células de vertebrados. A via natural
de infecção do T. gondii é a oral. Durante essa infecção, o parasito atravessa as
células do epitélio intestinal (IEC) e depois difunde para tecidos distantes. Tem
sido demonstrado que IECs expressam a enzima óxido nítrico (NO) sintase
induzida (iNOS) e são capazes de produzir NO, potente agente microbicida.
Portanto, esse parasito tem que lidar com esse mecanismo microbicida.
No
presente trabalho analisou-se a possibilidade da linhagem de célula epitelial
intestinal IEC-6 expressar iNOS e produzir NO e como a infecção pelo T. gondii
alteraria nesses fenômenos. As IEC-6 foram cultivadas a 37ºC em atmosfera a
5% de CO2 semeadas sobre lamínulas e ativadas ou não com interferon-gamma
(IFN- ) por 24 h. As IEC-6 ativadas foram infectadas com T. gondii (cepa RH e
ME-49). Após 24 e 48 h as células foram fixadas, e foi feita imunolocalização do
T. gondii e da iNOS; a produção de NO foi avaliada no sobrenadante da cultura
através do reagente de Griess; o desenvolvimento do T. gondii também foi
analisado. Toxoplasma gondii foi capaz de infectar e se multiplicar nas IEC-6; no
entanto, a ativação dessas células com IFN-γ inibiu a replicação desse parasito.
Além disso, a IEC-6 foi capaz de produzir NO e expressar iNOS após a ativação
com IFN- .Infecção pelo T. gondii de ambas as cepas inibiram a expressão de
iNOS e produção de NO pelas IEC-6 após 24 h de infecção. No entanto, após 48
h apenas a cepa RH manteve a inibição da expressão de iNOS e do NO. Nossos
resultados sugerem que T. gondii inibe a expressão de iNOS e produção de NO
em IEC-6 indicando que esse parasita é capaz de utilizar o mesmo mecanismo de
evasão em diferentes tipos celulares que expressam iNOS.
Palavras chaves: Enterócitos, Toxoplasma gondii, óxido nítrico, iNOS, mecanismo
de evasão.
ABSTRACT
Toxoplasma gondii, the agent of toxoplasmosis, is obligate intracellular
protozoan able to infect many types of vertebrate cells. The natural route of
infection of T. gondii is oral. During infection, the parasite crossed the intestinal
epithelial cells (IEC) and then spreads into deep tissues. It has been shown that
IECs express inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS) and are able to produce
NO powerfull microbicidal agent. Thus, this parasite has to deal with this
microbicidal machanism. We analyzed the ability of an intestinal epithelial cell line
(IEC-6) to express iNOS and produce NO and how infection with T. gondii alter
this phenomenon.IEC-6 was cultured at 37ºC in a 5% CO2 atmosphere over
coverslips and activated with interferon-gamma (IFN- ) for 24h. Activated IEC-6
was infected with T. gondii (RH and ME-49 strains). After 24 and 48 hs the cells
were fixed, and iNOS and T. gondii immunolocalized; NO production was
evaluated at the culture supernatant by the Griess reagent; the development of
T.gondii was also analized. Toxoplasma. gondii was able to infect and multiply in
IEC-6 and activation of these cells with IFN-γ inhibited the replication of the
parasite . Moreover, IEC-6 was able to produce NO and express iNOS after
interferon- activation. Infection by T. gondii of both strains at 24h was able to
inhibit expression of iNOS and NO production of IEC-6. However, after 48h only
the RH strains maintained NO inhibition and low expression of iNOS. Our studies
sugest T. gondii inhibit expression of iNOS and NO production of IEC-6 indicating
that this parasite is able to use the same escape mechanism in different cell type
that express iNOS.
Keywords:,Enterocytes, Toxoplasma gondii, nitric oxide, iNOS, evasion
mechanism.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 12
2.1. Toxoplasma gondii ................................................................................... 12
2.1.1. Taxonomia ........................................................................................ 12
2.1.2. Biologia Celular do Parasito .............................................................. 12
2.1.3. Resposta Imune ao Toxoplasma gondii e mecanismos de evasão da
célula hospedeira .................................................................................................. 14
2.1.4. Toxoplasmose ................................................................................... 17
2.2. Célula epitelial intestinal como primeira linha de defesa .......................... 18
2.2.1. iNOS e NO ........................................................................................ 20
3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 22
3.1. Objetivo geral ........................................................................................... 22
3.2. Objetivos específicos ............................................................................... 22
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 23
4.1. Manutenção da IEC-6 .............................................................................. 23
4.2. Obtenção de Toxoplasma gondii .............................................................. 23
4.2.1. Taquizoítos ........................................................................................ 23
4.2.2. Cistos teciduais ................................................................................. 24
4.3. Interação de IEC com Toxoplasma gondii................................................ 24
4.4. Expressão da iNOS revelada por imunofluorescência ............................. 24
4.5. Avaliação de nitrito ................................................................................... 25
4.6 Avaliação do crescimento do Toxoplasma gondii em IEC-6 ..................... 25
4.7 Estatística.................................................................................................. 26
5. RESULTADOS .................................................................................................. 27
5.1. Análise do desenvolvimento do Toxoplasma gondii em IEC-6 residentes e
ativadas com IFN- ................................................................................................ 27
5.2. IEC-6 expressaram a enzima oxido nítrico sintase e produziram óxido
nítrico .................................................................................................................... 29
6. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 35
7. CONCLUSÃO ................................................................................................... 38
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 39
10
1. INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii é protozoário patogênico, do grupo dos coccídeos,
membro do filo apicomplexa que engloba parasitos intracelulares caracterizados
por uma estrutura de células polarizadas, organelas secretoras exclusivas
(róptrias e micronemas), apicoplasto e complexo apical (Dubey et al., 1998). Esse
Coccídio tem o gato como seu hospedeiro definitivo e outros animais
homeotérmicos como hospedeiros intermediários, incluindo o homem (Ferguson,
2004). Esse parasito é o agente etiológico da toxoplasmose, zoonose de
importância médica e veterinária (Tenter et al., 2000).
A via natural de infecção do T. gondii é a oral que se dá através da
ingestão de carne crua ou mal passada contendo cistos de T. gondii (Tenter et al.,
2000) ou ainda através da ingestão de água contaminada com oocistos desse
parasito (toxoplasmose adquirida) presente nas fezes de gato (Viggiano et al.,
1991). A transmissão pela via oral implica em primeiro momento na invasão das
células epiteliais intestinais (IEC).. Sua função é atuar como barreira fisiológica e
imunológica, separando o conteúdo luminal, repleto de antígenos alimentares e
microrganismo, das camadas de tecidos que compõem o ambiente interno
(Pitman e Blumberg, 2000).
As IECs revestem tanto o intestino delgado como intestino grosso e a
manutenção dessa barreira é essencial para controlar seletivamente o movimento
de componentes entre o lúmen e o ambiente interno e para restringir a passagem
de microrganismos potencialmente perigosos através do trato intestinal para o
tecido subjacente (Pitman e Blumberg, 2000). Em razão da sua localização, podese dizer que as IECs representam a primeira linha de defesa contra agentes
patogênicos presentes no ambiente do lúmen intestinal (Pitman e Blumberg,
2000). Como consequência a exposiçãoa diferentes patógenos, as IECs
desenvolveram mecanismos complementares a barreira fisiológica, as quais
atuam reduzindo os riscos de invasão por microrganismos (Pitman e Blumberg,
2000).
A expressão da enzima oxido nítrico sintase induzida (iNOS) é um
mecanismo regulador de defesa contra patógenos invasores (Oswald et al.,1994).
Essa enzima catalisa a conversão de arginina e oxigênio em NO e citrulina
(Chokshi et al., 2008). A iNOS não é expressa constitutivamente nas vilosidades
11
do epitélio intestinal in vivo (Gookin et al., 2002). Esse epitélio também é capaz de
rapidamente expressar iNOS e produzir NO após injúria intestinal aguda (Banan
et al., 2001). A maior vulnerabilidade das vilosidades do epitélio sofrerem injúrias
e infecções acoplada a habilidade de rapidamente produzir NO sugerem que a
iNOS teria importante papel na defesa do epitélio (Gookin et al., 2006).
Apesar de estudos in vivo demonstrarem que as IECs são capazes de
expressar iNOS e produzir NO (Hoffman et al., 1997), pouco se sabe sobre os
mecanismos microbicidas utilizados por essas células in vitro. Estudos feitos por
Dimier e Bout (1993) demonstraram que a IEC-6 (linhagem celular epitelial
intestinal) é capaz de inibir a proliferação do T. gondii quando ativadas por IFN- .
Estudos posteriores demonstraram que a inibição do T. gondii pelas IEC-6 ocorre
devido a diminuição do ferro intracelular (Dimier e Bout, 1998), porém nesses
estudos não foram analisados a capacidade das IEC-6 em expressar iNOS e
produzir NO.
Estudos feitos com macrófagos demonstram que T. gondii é capaz de inibir
a expressão de iNOS e produção de NO nos macrófagos (Seabra et al., 2002;
2004; Guillermo e DaMatta, 2004). Esse mecanismo é utilizado pelos parasitos
como mecanismo de evasão frente a célula hospedeira. O presente estudo,
verificou a capacidade da IEC-6 em expressar iNOS e produzir NO in vitro. Além
disso, analisou o desenvolvimento do T. gondii nessas células e se esse parasito
também seria capaz de inibir a expressão de iNOS e produção de NO pelas IEC6.
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Toxoplasma gondii
2.1.1. Taxonomia
Toxoplasma gondii pertence ao reino Protista, subreino Protozoa, filo
Apicomplexa, classe Sporozoae, subclasse Coccidia, ordem Eucocciicida,
subordem Eimeriida, família Sarcocystidae, gênero Toxoplasma (Montoya e
Liensenfeld, 2004).
2.1.2. Biologia Celular do Parasito
Estudo com T. gondii é importante por inúmeras razões. Podemos dizer
primeiramente pelo T. gondii causar a toxoplasmose, doença severa que
apresenta risco de vida através de manifestações clínicas como encefalites,
retinites
e
miocardites
no
desenvolvimento
de
fetos
e
em
pacientes
imunossuprimidos (Baatz et al., 2006). E em segundo lugar T. gondii é usado
como modelo de estudo para outras doenças causadas por parasitos
apicomplexas que incluem o gênero Plasmodium causador da malária, Eimeria
causador da coccidiose em aves e mamíferos e cryptosporidium que é também
classificada como infecção oportunista em pacientes com AIDS (Dubey, 1993;
Kim e Weiss, 2004).
Toxoplasma gondii é o mais bem sucedido protozoário parasito intracelular
obrigatório capaz de infectar ampla quantidade de hospedeiros vertebrados
homeotérmicos, incluindo os seres humanos e animais de importância econômica
(Denkers e Gazzinelli, 1998; Dubey, 1998; Sibley, 2003). Esse protozoário é
também um dos mais abundantes parasitos eucarióticos em seres humanos
(Tenter et al., 2000) apresentando soroprevalência mínima de 30% podendo
chegar a 80% em certas populações como em Campos dos Goytacazes,
município do Estado do Rio de Janeiro, onde foi detectado alta soroprevalência
em grupos de baixo status socioeconômico (Bahia-Oliveira et al., 2003).
Existem diferentes cepas de toxoplasma gondii, essas cepas são
classificadas como virulentas ou avirulentas, com base em sua patogenicidade
e/ou antigenicidade usando camundongos como modelo ( Bohne et al.,1993).
13
As cepas podem ser do tipo I, que são classificadas como patogênicas que
provocam morte em camundongos, seu protótipo é a cepa RH (Howe e Sibley,
1995). As cepas do tipo II são as cistogênicas, essas induzem infecção crônica
em camundongos com a formação de cistos, cujo protótipo é ME-49 (Lunde e
jacobs, 1983). As cepas podem ainda possuir patogenicidade intermediária como
as cepas do tipo III, cujo protótipo é a cepa VEG.
O ciclo de vida do T. gondii foi completamente elucidado 60 anos após a
descoberta desse parasito (Ferguson, 2009). Seu ciclo de vida é complexo e
constituído de uma fase sexuada que ocorre somente nas IECs de felinos, o
hospedeiro definitivo, e um ciclo assexuado que ocorre nas células de diferentes
tecidos dos hospedeiros intermediários e definitivos (Dubey, 2004). Os
hospedeiros intermediários, incluindo os humanos, podem ser infectados pela
ingestão de oocistos esporulados que darão origem a esporozitos, que invadem
as céluas epiteliais transformando-se em taquizoitos (Dubey et al,1998).
Diferentemente dos outros parasitos apicomplexas, T. gondii pode ser transmitido
entre os hospedeiros intermediários por transmissão vertical (mãe-feto) ou
horizontal (carnivorismo) (Blader e Saeij, 2009). Seu ciclo se sustenta na
capacidade do parasito estabelecer infecção crônica de longa duração em
hospedeiros intermediários imunocompetentes a fim de maximizar a probabilidade
de transferência ao hospedeiro definitivo, que pertence à família dos felídeos
(figura 1).
Figura 1 – Ciclo de vida do Toxoplasma gondii (modificado de Ferguson, 2002).
14
Toxoplasma gondii existe, nos hospedeiros intermediários, em duas formas
que se interconvertem em bradizoítos e taquizoitos. Os bradizoitos possuem
crescimento lento, e se encontram nos cistos teciduais (Tenter et al., 2000).
Infecções com cistos contendo bradizoítos ocorrem após a ingestão de carne crua
ou mal passada. Após a ingestão, a parede dos cistos é digerida no estomago e
os bradizoítos resistentes a peptidases gástricas serão liberados e invadem as
IECs do intestino delgado (Blader e Saeij, 2009).
Dentro das IECs, os bradizoítos se convertem em taquizoitos, que possui
rápido crescimento e podem infectar muitas células nucleadas, se replicando no
interior do vacúolo parasitóforo (VP) de onde irá sair e infectar células vizinhas.
Esses taquizoitas ativam respostas imunes no hospedeiro que pode eliminar a
maioria dos parasitos. Alguns taquizoítos, porém, escapam da destruição se
interconvertendo novamente a bradizoítos em tecidos distantes do intestino e
imunoprevilegiados (Blader e Saeij, 2009).
2.1.3. Resposta Imune ao Toxoplasma gondii e mecanismos de evasão da
célula hospedeira
A resposta imune ao T. gondii é individual, complexa e compartimentada. A
invasão da célula hospedeira acontece em menos de 30 segundos (Sibley e
Andrews, 2000) reduzindo dramaticamente o tempo para a ação de anticorpos ou
proteínas do complemento.
Um grau de complexidade da infecção pelo T. gondii é alcançado devido à
possibilidade recorrente de infecção com diferentes cepas deste parasito com
virulência variável. Em indivíduos imunocompetentes, a infecção com T. gondii é
predominantemente controlada por imunidade mediada por células (revisado por
Denkers e Gazzinelli, 1998).
Após ingestão do T. gondii, há a passagem do parasito pelo trato
gastrointestinal. Nesse momento ocorre o contato do parasito com barreira física
composta por uma única camada de células do epitélio, as IECs. Contato do T.
gondii com as IECs é necessário para que ocorra a indução de resposta imune
(Buzoni-Gatel et al., 2006).
15
Embora seja adquirida por via oral e invadir as IECs, T. gondii não é
considerado como parasito intestinal. Entretanto, esse parasito atravessa as IECs
para se disseminar para tecidos distantes (Buzoni-Gatel et al., 2006).
Toxoplasma gondii pode diretamente induzir a produção de citocinas (IL-1;
IL-6 e GM-CSF) pelas células epiteliais (Buzoni-Gatel et al., 2006). Essas
moléculas serão fundamentais para iniciar o processo inflamatório na mucosa,
aumentando a atração de vários tipos de células do sistema imunológico. As
células infectadas começam a secretar moléculas como NO e quimiocinas em
particular a proteína quimiotática de monócitos (MCP1), proteínas inflamatórias de
macrófagos (MIP-1a; CCL3) e MIP (CCL4) os quais atraem células do sistema
imune como neutrófilos, células dendríticas (DC), macrófagos e monócitos
(Mennechet et al., 2002).
Essas células, por sua vez, secretam citocinas como IL-12, que estimula a
resposta imune adaptativa pelas células TCD4. As DC da lamina própria são
responsáveis por capturar antígenos de parasitos e processá-lo para serem
apresentados as células T. Além disso, as DC da lamina própria induzem uma
potente resposta imune dependente de IL-12 capaz de evitar o crescimento de
taquizoítos na fase replicativa (Buzoni-Gatel et al., 2006).
A IL-12 induz resposta do tipo Th1(Buzoni-Gatel et al., 2006), sendo a
principal citocina que desencadeia a síntese de IFN-γ pelas células natural killer
(NK) e linfócitos T durante a infecção pelo T. gondii. A indução dessa citocina é
um importante sinal de iniciação de resistência do hospedeiro contra o parasito
(Buzoni-Gatel et al., 2006).
A atividade de linfócitos T é crucial para o controle da fase aguda e crônica
da toxoplasmose. Especialmente as células TCD8+ ligam o principal papel efetor
de linfócitos contra T. gondii, que incluem atividades citotóxicas, secreção de
citocinas como modulação da morte e regeneração das células epiteliais (Suzuki
e Remington, 1988; Buzoni-Gatel et al., 2006). Porém as células TCD4+ também
possuem papel crucial na regulação da resposta imune contra T. gondii, como
por exemplo, maior produção de IFN-γ (Gazzinelli et al., 1991).
Após a infecção de células do epitélio intestinal, na lâmina própria, o parasito
infecta e se multiplica em leucócitos (Barragan e Sibley, 2002). Neste ambiente
além da multiplicação T. gondii se dissemina para tecidos distantes através do
sangue via leucócitos CD11b+ (Courret et al., 2005).
16
Uma vez dentro de um hospedeiro o parasito desenvolve ferramentas
poderosas para modular a célula hospedeira e se transformar em uma doença
com infecção crônica podendo escapar do sistema imune do hospedeiro bem
como de drogas conhecidas como anti-toxoplasmáticas (Blader e Saeij, 2009). O
sucesso do T. gondii é resultado de um equilíbrio entre o parasito e a resposta
imune do hospedeiro, na qual o hospedeiro tenta eliminá-lo, enquanto o parasito
desenvolve estratégias de evasão e imunomodulação, permitindo a sobrevivência
tanto do hospedeiro como do parasito (Blader e Saeij, 2009).
O ambiente de hidrolases ácidas dos lisossomos representa a maquinaria
de defesa de muitas células nucleadas, porém a habilidade do parasito em
modificar esse ambiente é uma das chaves para sua sobrevivência (Sacks e
Sher, 2003). Toxoplasma gondii reside em um vacúolo restringindo a sua fusão
com lisossomos. Nesse processo o parasito estabelece um compartimento não
fusogênico conhecido como vacúolo parasitóforo (VP) que possui repertório de
proteínas integrais de membrana da célula hospedeira consideravelmente
modificado por proteínas secretadas pelo parasito (Mordue et al.,1999; Lingelbach
e Joiner, 1998). Esse remodelamento é crucial para inibição da acidificação do VP
e fusão com o lisossomo que levaria a morte do parasito.
Inúmeros estudos sugerem mecanismos pelos quais T. gondii pode
interferir na imunidade inata dos macrófagos. Um dos mais consistentes é a
disfunção observada em macrófagos infectados, que perdem a habilidade de
produzir IL-12 que é essencial para indução de IFN-γ que levará a diferenciação
das células T no tipo Th1. O mecanismo de indução de IL-12 é essencial para o
desenvolvimento e aquisição de resistência contra patógenos intracelulares
(Sacks e Sher, 2003).
A família de fatores de transcrição NF-kB é um grupo conservado de
proteínas importantes na regulação de numerosos genes envolvidos na
imunidade inata e adaptativa que inclui a codificação de IL-12, IFN- , TNF- ,
iNOS e moléculas de adesão. Estudos com T. gondii tem demonstrado a
habilidade desse parasito para interferir na ativação da via NF-kB em macrófagos
(Sacks e Sher, 2003).
Seabra et al. (2002) demonstraram a capacidade do T. gondii em inibir a
produção de NO por macrófagos ativados e que essa inibição aumenta em razão
17
ao aumento na quantidade de parasitos por macrófagos. Além disso, a inibição de
NO independe do tempo de ativação dos macrófagos (Seabra et al., 2002).
A inibição da produção de NO em macrófago provocada pela infecção do
T. gondii é mencionada como mecanismo de evasão celular utilizado pelo T.
gondii (Seabra et al., 2002; Seabra et al., 2004). Esse mecanismo de inibição de
NO por patógenos foi demonstrado também em Giardia lamblia em infecções de
IECs (Eckmann et al.,2000). Esse patógeno consome arginina que é o substrato
essencial para enzima iNOS (Buzoni-Gatel et al., 2006).
2.1.4. Toxoplasmose
A toxoplasmose é a zoonose causada pelo T. gondii. Essa doença foi
descoberta em 1908 por Splendore no Brasil e por Nicolle e Manceaux no instituto
Pasteur na Tunísia. A toxoplasmose possui distribuição mundial acometendo um
bilhão de pessoas em todo o mundo (Tedesco et al., 2007). No Brasil, a
prevalência da infecção tem sido determinada entre 50 e 80% da população
(Cantos, 2000). A toxoplasmose pode se apresentar de diversas formas no
organismo humano, porém, estudos sorológicos indicam que mais de 80% das
infecções primárias por T. gondii são assintomáticas (Wong e Remington, 1994).
A toxoplasmose pode ser congênita ou adquirida. Para que a toxoplasmose
congênita ocorra é necessário que a infecção primária aconteça durante a
gravidez (Weiss e Kim, 2007). Toxoplasma gondii possui a capacidade de migrar
através da placenta e se replicar nas células do sistema mononuclear fagocítico,
podendo infectar qualquer célula de diferentes tecidos de vários órgãos,
principalmente o sistema nervoso central (SNC) e os olhos, os quais o parasito
possui tropismo (Ferguson, 2009).
A toxoplasmose adquirida ocorre por meio de consumo de leite in natura
(cabra e vaca) (Dressen 1990; Dubey, 1993), ingestão de carne crua ou mal
cozida (pombos, suínos, bovinos, ovinos, equinos) (Tenter et al., 2000), ingestão
de frutas e legumes contaminados (Tenter et al., 2000), ingestão de água
contaminada em lugares onde não há saneamento básico (Bahia Oliveira et al.,
2003).
A infecção com T. gondii em pacientes imunocompetentes é geralmente
assintomática, tendo um curso benigno e auto limitado. Nesses indivíduos a
resposta imune atua restringindo a replicação do parasito, evitando a evolução
18
para a doença, porém o sistema imune é incapaz de eliminar o agente infeccioso.
Ao contrário disto, T. gondii é um patógeno oportunista em indivíduos
imunocomprometidos, como portadores de HIV, transplantados ou com câncer.
Sob essas condições, o parasito pode oferecer perigo de vida com toxoplasmose,
encefalites, lesões neurológicas no SNC, ou retinocoroidites (Ambroise-Thomas e
Pelloux, 1993; Ferreira e Borges, 2002).
2.2. Célula epitelial intestinal como primeira linha de defesa
O principal tipo de célula diferenciada encontrada no intestino delgado é o
enterócito. Os enterócitos são células altamente polarizadas geradas pelo seu
contato com a membrana basal e com células adjacentes (Simon-Assmann et al.,
2007). A parte apical da célula é composta por microvilosidades ricas em
transportadores e hidrolases, responsáveis por funções de absorção e digestão.
Expressão de hidrolases como lactase, sacarase, isomaltase e dipeptidilpeptase
IV são indicadores de diferenciação celular intestinal in vitro (Neutra e Louvard,
1989).
As células epiteliais da mucosa intestinal desempenham papel na
homeostase dos organismos (Bloushtain-Qimron et al., 2009; Mastrogiannaki et
al., 2009). Dependendo de sua localização no trato intestinal, elas não só
desempenham papel central em funções como absorção e secreção, mas
também possuem a capacidade de proteger o organismo de vários patógenos e
toxinas encontradas em condições normais do intestino, proporcionando uma
barreira eficaz aos antígenos do conteúdo intestinal (Podolsky et al., 2009).
A função de barreira epitelial depende de um grau bastante elevado de
organização intracelular e intercelular (Madara, 1995). A integridade estrutural do
interior de cada célula epitelial é mantida pela presença de complexa rede de
microfilamentos de citoesqueleto (Pitman e Blumberg,2000). Esses filamentos
variam na sua composição e localização. Os filamentos de actina, por exemplo,
formam anel na parte apical e basolateral dos pólos das células, enquanto que
filamentos intermediários estão no citoplasma e fazem a ancoragem em pontos da
membrana plasmática (Goldman et al.,1996; Rodriguez-Boulan et al., 1992).
Essas estruturas são essenciais para a manutenção da polaridade e no suporte
19
dos pontos de contato célula-célula (Pitman e Blumberg, 2000) As junções
intercelulares são compostas pelas junções do tipo tight ou junções de oclusão.
Essas junções garantem a interação células-célula fazendo parte da barreira
física contra a penetração de microrganismos intestinais (Buzoni-Gatel et al.,
2006). A adesão célula-célula dessas junções é mediada por interações ocludinas
(Pitman e Blumberg, 2000).
A monocamada de célula epitelial é suportada por uma lâmina basal, uma
membrana não lipídica contínua cujos constituintes primários incluem laminina,
proteoglicanos de sufato de heparina, e colágeno do tipo IV (Timpl, 1989).
Devido a complexidade celular do intestino, com a possibilidade de
interação entre os diferentes tipos celulares, existe grande dificuldade para
estudos dessas células in vivo. A capacidade para cultura de células epiteliais in
vitro foi de grande importância para investigar as propriedades dessas células
(Quaroni et al., 1979).
Quaroni et al. (1979) reportou o estabelecimento por longo tempo de
culturas de células epiteliais intestinais de rato, os quais foram nomeados IEC.
Essas células foram derivadas de diferentes níveis do trato intestinal obtidos de
explantes mantidos em meio contendo colagenases para redução do crescimento
de células mesenquimais. Essas linhagens de células foram exclusivamente
caracterizadas e tornaram-se modelo amplamente utilizado para células da cripta
em cultura de célula (Quaroni et al., 1999).
Pouco se sabe a respeito dos mecanismos microbicidas dessas células,
pois esses mecanismos não foram completamente elucidados. Porém sabe-se
que essas células não desempenham apenas papel de barreira, e em razão
disso, inúmeros estudos com essas células tem sido realizados (Pitman e
Blumberg, 2000). Uma série de mecanismos de defesa amplamente específicos
está envolvida na defesa contra ataques de microrganismos (Pitman e Blumberg,
2000).
Estudos demostram que as IECs expressam iNOS e produzem NO quando
estimuladas por IFN-γ e grandes quantidades de lipopolissacarídeo (LPS)
(Stempelj et al.,2007; Forsythe et al., 2002). iNOS pode exercer importante papel
na defesa do epitélio. A infecção de células epiteliais com Cryptosporidium
parvum induziu a expressão de iNOS e o uso de inibidor da produção de NO
resultou em aumentos significativos da taxa de crescimento do parasito,
20
mostrando que essa enzima medeia a defesa contra esse parasito em enterócito
(Gookin et al., 2006).
Sabe-se que as IECs in vivo, quando imunoestimuladas, expressam iNOS,
gerando amostras significantes de NO (Morin et al., 1998; Salzman et al.,1998).
Estudos in cito realizados em crianças infectadas com G. lamblia mostram através
da analise de imunohistoquímica a presença de iNOS no citoplasma das células
epiteliais intestinais (Mokrzycka et al., 2010).
2.2.1. iNOS e NO
A estrutura molecular do NO é composta por oxigênio e nitrogênio, ligados
por uma ligação dupla (Kroncke et al., 1997). NO é uma molécula de meia vida
curta
que
tem
importante
papel
em
muitos
processos
fisiológicos
e
patofisiológicos (Keklikoglu et al., 2008). NO foi primeiramente descrito como fator
relaxante derivado do endotélio (do inglês EDRF): um potente vasodilatador de
curta duração. Estudos subsequentes revelaram seu papel como regulador de
fluxo sanguíneo, capaz de induzir variedade de processos fisiológicos, incluindo
homeostase tecidual, como neurotransmissor e em processos inflamatórios
(Chang et al., 2004).
NO é um produto da conversão do amino ácido L-arginina em L-citrulina
pela enzima NOS (Óxido Nítrico Sintase) na presença de nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato (NADPH) (Fig. 2) (Chokshi et al., 2008). Existem três
isoformas de NOS, cada uma codificada por diferentes genes. Duas dessas
isoformas, NOS endotelial (eNOS/NOS 3) e neuronal (nNOS/ NOS 1) são
expressas constitutivamente em dois níveis, possuem domínios de ligação a
calmodulina em uma forma cálcio dependente e produzem concentrações
picomolares de NO (Mayer, 1998).
21
Figura 2 – Reação molecular da produção de óxido nítrico envolvendo a óxido
nítrico sintase.
Óxido Nítrico Sintase (NOS) catalisa a reação entre arginina e oxigênio, com
consumo de 1.5 mol de NADPH para 1 mol de NO produzido. Citrulina e água
também são produzidas durante a reação (adaptado de Chokshi et al., 2008).
A terceira isoforma, NOS induzida (iNOS/NOS 2) é cálcio independente, se
liga com alta afinidade a calmodulina independente da presença do cálcio (Spratt
et al., 2007). Em contraste a iNOS não é expressa sob condições normais, mais é
induzida durante a inflamação. Essa isoforma produz grandes quantidades de NO
(micromolar) por um limitado período de tempo.
A iNOS foi originalmente descrita como uma enzima expressa por
macrófagos ativados, gerando NO a partir do L-arginina, e assim contribuindo
para controle da replicação ou eliminação dos patógenos microbianos
intracelulares (Bogdan et al., 2000). Porém, sabe-se que a geração de NO é uma
característica genuína de células do sistema imune como DC, NK, mastócitos e
células fagocíticas que incluem monócitos, macrófagos, microglia, células de
Kuppfer, eosinófilos e neutrófilos. Além disso, o NO também é sintetizado por
células que estão envolvidas em reações imunes como as células endoteliais,
células
epiteliais,
células
vasculares
da
musculatura
lisa,
fibroblastos,
queratinócitos, condrócitos, hepatócitos, células mesangliais e células de
Schwann (Bogdan, 2001).
A isoforma de iNOS é positivamente ou negativamente regulada pelo
contato célula-célula (via adesão e moléculas coestimulatórias), citocinas,
complexos imune e produtos microbianos e virais (MacMicking et al., 1997;
Bogdan, 2000). Embora o IFN- e LPS sejam os mais estudados e descritos como
mediadores regulatórios de iNOS, novos mediadores estão sendo descobertos,
como a combinação de IL-12 e IL-18 que induzem iNOS em várias populações de
22
macrófagos através de mecanismo mediado por produção autócrina de IFN(Frucht et al., 2001).
O papel efetor como antiparasitário do NO e da iNOS in vivo e in vitro foi
demonstrado contra um grande número de parasitos que incluem Plasmodium
sp., Leishimania sp., Schistosoma sp., T. gondii e Trypanosoma brucei (Motard et
al., 1993; Clark et al., 1996). A produção de NO é comumente associada como
agente microbicida que regula infecções provocadas por protozoários (Brunet,
2001). O NO pode exercer citotoxidade através de um número diferente de
mecanismos (Lyons, 1995), podendo matar diretamente taquizoítos de T. gondii
por inibição de enzimas mitocondriais e enzimas nucleares essenciais (Brunet,
2001).
Os parasitos podem fazer com que células do sistema imunológico
induzam citocinas como: IFN-γ, Fator de Necrose Tumoral alfa (TNFInterleucina I beta (IL-1
e
e produtos de patógenos como glicosilfosfatidilinositol
podem estimular a expressão de iNOS em células hospedeiras infectadas
(Almeida et al., 2000; Tachado et al., 1997). Uma vez realizada a tradução de
iNOS, ocorrerá a produção de NO.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Caracterizar mecanismos microbicidas e o mecanismo de evasão do
Toxoplasma gondii em células IEC-6.
3.2. Objetivos específicos
- Analisar o desenvolvimento do T. gondii nas IEC-6 residentes e ativadas;
- Verificar se a ativação das IEC-6 com IFN- e LPS induzem a expressão de
iNOS e produção de NO;
- Verificar se ocorre inibição na expressão de iNOS e produção de NO após a
infecção do parasito.
23
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Manutenção da IEC-6
A linhagem de epitélio intestinal de rato (IEC-6) (Quaroni et al., 1979) foi
mantida em garrafas de 25 cm2 com meio Dulbecco’s modified Eagle medium
(DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1U/ml de insulina.
Essas células foram mantidas a 37º C em atmosfera umidificada de 5% de CO 2.
Atingindo confluência, as células foram removidas da garrafa utilizando 1 ml de
tripsina a 2% e 0,02% de versene por poucos segundos seguida da adição de 4
ml de DMEM suplementado com 10% de SFB. As células liberadas foram
centrifugadas a 500g, 10 min, 4º C, ressuspensas em 1 ml de DMEM, contadas
na câmara de Neubauer e 105 (para ensaio de imunofluorescência e crescimento
do parasito) ou 106 (leitura de NO) células foram plaqueadas sobre lamínulas
redondas em placa de 24 poços. As células foram ativadas após 1 h de
plaqueamento inicialmente com diferentes concentrações de IFN- recombinante
murino (50, 100, 200, 400, 800, 1600 U/ml) por 24 hs de cultivo sem ou com LPS
(0,2 μg/ml).
4.2. Obtenção de Toxoplasma gondii
4.2.1. Taquizoítos
Taquizoítos de T. gondii, cepa RH (Sabin e Feldman, 1948), foram
mantidos por passagens sucessivas na cavidade peritoneal de camundongos
suíços com idade entre três e quatro semanas. Após 48 h o lavado peritoneal foi
realizado com DMEM para obtenção dos parasitos (Trembicki et al., 1984),
centrifguação 100 g e a quantificação foi feita em câmera de Neubauer.
Taquizoítos de T. gondii, cepa ME-49 foram mantidas no meio intracelular
de culturas de fibroblastos (célula VERO). Essas células foram mantidas em
garrafa de cultura de 25 cm2 usando DMEM suplementado com 10% de SFB a
37º C em atmosfera umidificada de 5% de CO2. Após a liberação dos taquizoitas,
o sobrenadante da garrafa (aproximadamente 5 mL) foi transferido para um tubo
de 15 mL; 5 mL de DMEM sem soro foram adicionados a garrafa que foi
24
brevemente lavada. Esse meio de cultura contendo mais parasitos foi transferido
para o mesmo tubo de 15 mL, totalizando 10 mL aproximadamente. O
sobrenadante foi centrifugado a 50 g por 5 min na centrifuga não refrigerada para
descarte de restos celulares. O sobrenadante foi centrifugado a 500g por 10 min,
homogeneizado com 1 mL de DMEM sem soro e o número de parasitos foi
quantificado conforme a cepa RH.
4.2.2. Cistos teciduais
A cepa ME-49 foi mantida em camundongo em banco de parasitos
localizado no infectório do LBCT. A manutenção do banco foi realizada da
seguinte maneira: camundongos suíços foram inoculados via peritoneal com 20
cistos de ME-49, em 0,2 mL de PBS. Quando estes camundongos atingiram o
estágio crônico da doença (3 meses após a inoculação) foram eutanasiados com
CO2, os cérebros removidos e homogenizados em 1 ml de PBS. Em seguida, foi
realizada a contagem dos cistos, em alíquotas de 20μl entre lamina e lamínula. A
utilização de parasitos provenientes deste banco em experimentos anteriores
demonstra uma padronização dos cistos utilizados, tanto em tamanho quanto em
quantidade. Esta metodologia foi adaptada de Liesenfeld et al. (1996).
4.3. Interação de IEC com Toxoplasma gondii
As interações das IEC com taquizoítos das cepas RH e ME-49 de T. gondii
foram realizadas a 37ºC, atmosfera de 5% de CO2 utilizando a proporção de 5:1 e
10:1 protozoários por IEC respectivamente para verificar o crescimento do
parasito e para ensaio de imunofluorescência (item 4.4) após 24 e 48 h de
infecção e 1:1 protozoários por IEC para dosagem de NO no sobrenadante (item
4.5).
4.4. Expressão da iNOS revelada por imunofluorescência
As lamínulas com células aderidas obtidas conforme o item 4.3 foram
coletadas e fixadas por 30 min com 3% de formaldeído recém preparado em PBS,
lavadas 3 vezes com PBS, permeabilizadas com 0,5 % de triton em PBS,
25
incubadas por 30 min em 50mM de cloreto de amônio em PBS e 10 min em PBS
contendo 3% de albumina sérica bovina (BSA-PBS). As células foram incubadas
por 40 min com anticorpo policlonal anti-iNOS de coelho (Santa Cruz, sc-8310)
diluído 1:50 em PBS-BSA e anti- T. gondii (soro de camundongos cronicamente
infectados com T. gondii) diluído 1:5000 em PBS-BSA. As células foram lavadas 2
vezes com PBS e 1 vez com PBS-BSA; incubadas por 30 min com anticorpo antiIgG de coelho marcado com Alexa 488 (invitrogen), para revelar iNOS, diluído
1:200 em PBS-BSA e anti-mouse IgG conjugado com TRITC (sigma) diluído
1:200 em PBS-BSA, para revelar taquizoitos. As células foram lavadas 8 vezes
com PBS, montadas em Prolongold com DAPI (Molecular Probes) e as Imagens
capturadas com câmera AxioCam Mrc5 no sistema Axiovision da Zeiss.
4.5. Avaliação de nitrito
NO foi indiretamente avaliado medindo-se o nitrito nos sobrenadantes das
culturas coletados após 24 e 48 h de ativação (Green et al., 1982). Brevemente,
50µl do sobrenadante de cada poço foi colocado com um mesmo volume do
reagente de Griess (1:1, de 0,1% N-1-nafeti-etilanadiamina, Sigma – N-5889, em
água destilada e 1% de sulfanilamida, Sigma – S-9251 em 5% de ácido fosfórico,
Sigma – P5811) em placas de 96 poços. Após 10 min, a concentração de nitrito
foi avaliada através da leitura da absorbância em 540 nm. A concentração de
nitrito foi calculada a partir de uma curva padrão pré-calibrada usando nitrito de
sódio diluído em DMEM.
4.6 Avaliação do crescimento do Toxoplasma gondii em IEC-6
Após interação de IEC-6 com T. gondii (RH) em diferentes tempos (2, 24 e
48 h), as lamínulas foram recolhidas, fixadas em metanol, e coradas com solução
de Giemsa (diluído em água destilada na proporção de 1:10), desidratadas numa
série de soluções acetona-xilol, montadas sobre Entellan e observadas em
microscópio óptico Axioplan - ZEISS. As células coradas foram quantificadas da
seguinte forma: a) porcentagem de IEC-6 com parasitos, b) número médio de
parasitos aderidos nas IEC-6, c) número médio de parasitos interiorizados. Essas
26
contagens foram utilizadas para analisar o desenvolvimento do T. gondii nas IEC6 residentes e ativadas com IFN-γ.
4.7 Estatística
Foram realizados Testes T Student para observar a significância dos
resultados utilizando p<0,05 e teste Tukey a 5% de probabilidade.
27
5. RESULTADOS
5.1. Análise do desenvolvimento do Toxoplasma gondii em IEC-6 residentes
e ativadas com IFN-
As IEC-6 foram infectadas com diferentes concentrações de T. gondii e o
seu crescimento analisado. As IEC-6 não ativadas são susceptíveis a infecção,
pois taquizoítos se multiplicaram nestas células. IEC-6 resistiu por até 48 h de
infecção pelo t. gondii (Tabela 1).
28
Tabela 1. Desenvolvimento do Toxoplasma gondii (cepa RH) em IEC-6 residentes
Tempo / Quantidade de parasitos por poço
Células
2h
1x105
2h
5x105
2h
1x106
24 h
1x105
24 h
5x105
24 h
1x106
48 h
1x105
11,65±2,63
15,7±10,0
30,87±7,7
12,85±2,74
25,11±8,8
18,9±6,92
9,3±2,59
Ader
1,5±0,17
1,47±0,32
1,2±0,14
1,1±0,12
1,15±0,43
0,7±0,42
1,0±0,15
1,0±0,24
0,34±0,32
Int
0,08±0,12
0,029±0,1
0,1±0,56
0,05±0,10
3,14±0,78
2,3±0,88
0,4±0,15
7,0±0,9
5,97±0,8
IEC c/
IEC-6 c/- Células epiteliais intestinais infectadas com toxoplasma gondii (cepa RH)
Ader -Número médio de parasitos aderidos
Int- Número médio de parasitos interiorizados
48 h
5x105
48 h
1x106
20,9±11,11 27,32±7,02
29
Foi analisada a capacidade microbicida da IEC-6 ativadas com IFN-γ frente
ao T. gondii. Houve diminuição do número de células infectadas com T. gondii
após 2, 24 e 48 h de infecção nas células ativadas com 800 U/ml de IFN(Tabela 2). Quando as células foram ativadas com o dobro da quantidade de IFN(1600 U/ml) não houve diminuição de células infectadas.
Tabela 2. Efeito do Interferon-gamma (IFN- ) no desenvolvimento do Toxoplasma
gondii, cepa RH, em IEC-6.
Cepa RH
% de células infectadas
Tempo após infecção com T. gondii
2h
24 h
48 h
Controle
25,4 ± 3,33
44,84 ± 4,54
51,48 ± 2,35
Células com 800 U IFN-
7,16 ± 3,63*
9,99 ± 7,79*
27,39 ± 7,77*
Células com 1600 U IFN-
26,79 ± 8,35 ns
9,71 ± 0,98 ns
41,45 ± 5,32 ns
n=3
P<0,05
*Significativamente diferentes em relação ao valor de IEC-6 infectadas não ativadas (controle)
ns= não significativo.
5.2. IEC-6 expressaram a enzima oxido nítrico sintase e produziram óxido
nítrico
Primeiramente foi avaliado se havia capacidade de produção de NO in vitro
pelas IEC-6. As células foram primeiramente estimuladas com LPS (0,2 μg/ml) e
IFN- (200, 400, 800U/ml). Os resultados da leitura de NO (Tabela 3) mostraram
que as IEC-6 produziram NO em maior quantidade quando estimuladas somente
com IFN- .
Esses resultados estão de acordo com os de imunofluorescência no qual a
maior quantidade de expressão de iNOS pelas IEC-6 foi verificado em células
ativadas somente com IFN- (Figura 3).
30
Tabela 3. Dosagem de óxido nítrico em células epiteliais intestinais-6 após
estimulação com Interferon-gamma (IFN- ) e Lipopolissacarídeo (LPS).
Produção de Nitrito (µM)
24 h
IEC-6
Ativado 200 U/ml IFN- e LPSa
3,09 ± 1,43
Ativado 200 U/ml IFN-
6,38 ± 1,38*
Ativado 400 U/ml IFN- e LPSa
4,97± 0,94
Ativado 400 U/ml IFN-
9,99 ± 1,82*
Ativado 800 U/ml IFN- e LPSa
4,29 ± 3,16
Ativado 800 U/ml IFN-
9,84 ± 0,90*
a
Concentração LPS = 0.2 ug/ml
n=3
P<0,05
*Significativamente diferentes em relação ao valor de IEC-6 ativadas com IFN- (200, 400, 800) e
LPS.
31
Figura 3. Microscopia de Fluorescência de IEC-6 residentes ou ativadas
marcadas com anti-iNOS. (A) IEC-6 residente cultivada por 24 h. (B) IEC-6
ativada com interferon-gamma (IFN- ) e lipopolissacarídeo (LPS) por 24 h. (C)
IEC-6 ativada com (IFN- ) por 24 h. Note a alta expressão de iNOS pelas IECs
ativadas somente com IFN- .Barra: 20 μm
32
Em razão das IEC-6 apresentarem maior expressão de iNOS quando
estimuladas somente com IFN- . Nós estimulamos essas células com diferentes
concentrações de IFN- que variavam de 50 à 1.600 U/ml.
Foi verificado que a medida que aumentava-se a concentração de
IFN- aumentava-se também a produção de NO por essas células (Tabela 4).
Porém, quando as células foram ativadas com 800 U/ml IFN- houve maior
produção de NO pelas IEC-6 de acordo com o teste Tukey a 5% de probabilidade.
Tabela 4. Dosagem de óxido nítrico em células epiteliais intestinais após
estimulação com diferentes concentrações de Interferon-gamma (IFN- ).
Concentrações Interferon-gamma
Produção de NO ( M)
IEC-6 Residente
14,65 e
50 U
17,5 b
100U
17,5 b
200U
17,28 c
400U
17,59 b
800U
18,68 a
1250U
16,45 d
1600U
17,54 b
Médias seguidas de mesma letra, na mesma coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo
Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Após confirmação da concentração ideal para estimulação da expressão de
iNOS e produção de NO pelas IEC-6 foi analisada a capacidade da infecção do T.
gondii em inibir a expressão dessa enzima e consequentemente a produção de
NO.
As IEC-6 foram ativadas com 800U/ml de IFN- por 24 h e em seguida
infectadas com duas diferentes cepas de T. gondii (RH ou ME-49) por 24 e 48 h.
Ambas as cepas inibiram a expressão de iNOS e a produção de NO. No entanto,
a cepa ME-49 foi menos eficiente na manutenção da inibição após 48 h de
infecção (Tabela 5).
Para confirmação dos resultados foi feito ensaio de imunofluorescência.
Ambas as cepas inibiram a expressão de iNOS após 24 h de infecção (compare
Figura 4a com 4b e 4c). A baixa expressão de iNOS foi mantida após infecção
33
com a cepa RH por 48 h (compare Figura 4d com figura 4e). Porém, IEC-6
infectada com a cepa ME-49 recuperaram a expressão de iNOS após 48 h de
infecção (Figura 4f).
Tabela 5. Inibição da produção de óxido nítrico após infecção com Toxoplasma
gondii em células epiteliais intestinais (IEC-6) ativadas.
IEC-6
Produção de Nitrito ( M)
24 h
% inibição 24 h
48 h
% inibição 48 h
Não infectada
16,5 ± 3,52
-
17,0 ± 3,08
-
T. gondii RH
8,3 ± 0,26*
49,7
7,4 ± 1,16*
56,5
T. gondii ME-49
9,5 ± 0,20*
42,4
15,2 ± 0,46ns
10,6
n=3
P<0,05
*Significativamente diferentes em relação ao valor de IEC-6 ativadas com IFN- não infectadas.
ns= não significativo
34
Figura 4. Microscopia de fluorescência de células epiteliais ativadas marcadas
com anti-iNOS (verde) e anti-Toxoplasma gondii (laranja). (A) IEC-6 não
infectadas ativadas por 24 h. (B) IEC-6 ativadas infectadas por 24 h com T. gondii
(cepa RH). (C) IEC-6 ativadas, infectadas for 24 h com T. gondii (ME-49). (D) IEC6 não infectadas ativadas por 48 h. (E) IEC-6 ativadas infectadas por 48 h com T.
gondii (cepa RH). (F) IEC-6 ativadas infectadas por 48 h com T. gondii (ME-49).
Note a diminuição da expressão de iNOS após infecção com T. gondii de ambas
as cepas, no entanto, após 48 h de infecção a IEC-6 infectada com ME-49
recuperou a expressão de iNOS Barra: 20 μm
35
6. DISCUSSÃO
Durante a infecção oral com T. gondii as IEC-6 são as células que
primeiramente tem o contato com o parasito (Buzoni-Gatel et al., 2006). T. gondii
atravessa essas células sem se multiplicar (Speer e Dubey, 1998) e irá se
desenvolver nas células da lamina própria incluindo macrófagos e neutrófilos
(Speer e Dubey, 1998; Dunay et al., 2008). Durante esse processo pode ocorrer
extensa necrose no intestino, especialmente no íleo, que irá variar dependendo
da cepa do parasito e da linhagem do camundongo (Liesenfeld, 2002). Porém as
IECs são uma das células mais resistentes a infecção com T. gondii presentes no
íleo (Dunay et al., 2008). No presente trabalho, demonstramos que T. gondii foi
capaz de se multiplicar nas IEC-6 e que a ativação dessas células com IFN-γ leva
a diminuição da replicação do parasito. Também foi demonstrado que essas
células expressam iNOS e produzem NO. Porém, a infecção com T. gondii inibe a
expressão dessa enzima e a produção de NO por essas células.
Primeiramente foi analisado o desenvolvimento do T. gondii nas IEC-6. As
IEC-6 residentes são susceptíveis a infecção, pois taquizoítos se multiplicaram
nestas células. IEC-6 resistiu por até 48 h de infecção. (Tabela 1). Trabalhos
anteriores (Meng et al., 2009) nos quais foram realizadas analise do crescimento
do T. gondii nas IEC-6 também demonstraram a suscetibilidade dessas células a
infecção e proliferação do parasito (Meng et al., 2009).
Nossos dados (Tabela 2) confirmam que as IEC-6 quando ativadas com
IFN- , inibem a replicação do parasito. Esses resultados confirmam dados
publicados em trabalhos anteriores nos quais foi demonstrada a capacidade de
inibição da replicação do parasito pelas IECs ativadas (Dimier e Bout, 1993;
Dimier e Bout, 1998). Contudo, no trabalho de Dimier e Bout, (1993 e 1998) foi
demonstrado que o desenvolvimento do T. gondii é inibido em razão da
diminuição do ferro intracelular. No entanto, existem outros mecanismos que
podem levar a inibição do T. gondii. Dois desses mecanismos já foram
previamente demonstrados em macrófagos, como o envolvimento da autofagia
(Subauste, 2009) e produção de NO (Brunet, 2001).
Sabe-se que após a entrada do T. gondii na célula hospedeira há a
formação do VP. Esse vacúolo, que até então era caracterizado como não
fusogênico com o lisossomo, passa a ser visto como alvo de degradação
36
lisossomal (Subauste, 2009). Isso ocorre quando as células são ativadas com
IFN- que induz a formação de um vacúolo autofagossomico ao redor do VP que
leva o vacúolo a fusão com o lisossomo e degradação do T. gondii (Ling et
al.,2006). O mecanismo de autofagia ocorre em todos os tipos celulares, de
leveduras até mamíferos (Deretic, 2006). Portanto, a inibição do T. gondii
mediada por autofagia induzida pela ativação do IFN-γ também pode estar
ocorrendo nas IECs. Novos estudos são necessários para se verificar essa
possibilidade.
Além disso, no estudo realizado por Dimier e Bout, a produção de NO não
foi detectada. Todavia, a produção de NO pelas IEC-6 foram demonstradas em
outros estudos (Stempelj et al., 2007; Forsythe et al., 2002). Estudos mostram o
potencial das células epiteliais na produção de NO como molécula efetora contra
a proliferação de G. lamblia (Eckmann, 2003).
Para verificar a capacidade das IEC-6 de expressar iNOS e produzir NO
estimulamos essas células com IFN- e LPS. A adição de LPS resultou em baixa
expressão de iNOS e baixa produção de NO provavelmente em função da
concentração utilizada. O LPS induz produção de NO pelas IEC-6 como
demonstrado por Stempelj et al. (2007) e Forsythe et al. (2002). Entretanto as
concentrações utilizadas por esses autores foram respectivamente maiores (25
μg/ml e 50 μg/ml) as empregadas aqui. Desta forma, é possível que não tenha
havido estímulo suficiente do LPS contido na cultura para sinergizar com IFN- e
aumentar a expressão de iNOS e a produção de NO pelas IEC-6. Além disso, a
pequena quantidade de LPS utilizado em nosso trabalho possivelmente exerceu
efeito inibitório na expressão de iNOS pelas IEC-6 por mecanismo ainda não
conhecido.
Após resultados que demonstraram efeito inibitório na produção de NO
pelo LPS, as células passaram a ser ativadas somente com IFN- . Diferentes
concentrações que variavam de 50 a 1600U/ml foram testadas (Dimier e Bout,
1998). De acordo com os resultados a concentração de 800U/ml de IFNproporcionou
maior
produção
de
NO
pelas
IEC-6.
Os
resultados
do
desenvolvimento do parasito demonstraram que o efeito inibitório da replicação do
T. gondii é dose dependente. Em nosso modelo, maior concentração de IFN-γ
induziu maior produção de NO pelas IECs, indicando que a produção de NO por
essas células também é dose dependente, podendo ser esse um mecanismo
37
também utilizado pelas IEC com ação microbicida capaz de inibir a replicação do
T. gondii nessas células (Brunet, 2001). Os níveis de NO produzidos pelas IEC-6
detectados neste trabalho foram menores quando comparados com a produção
de NO por macrófagos (Seabra et al., 2002). Isso mostra que as IEC-6 podem
produzir NO. Porém, não são tão eficientes como os macrófagos.
iNOS é extremamente presente nas células da lâmina própria do íleo de
camundongos C57Bl/6 após infecção oral pelo T. gondii (Dunay et al., 2008).
Além disso, a baixa resistência dos camundongos knockout para o receptor da
proteina MCP1 infectados apresentaram baixa expressão de iNOS nas células da
lamina própria. Entretanto, as IEC-6 desses camundongos eram extremamente
positivas para iNOS (Dunay et al., 2008). Embora essas células sejam positivas
para iNOS, a baixa produção de NO demonstrada em nosso trabalho sugerem
que a produção de NO não contribuiu muito para controle do T. gondii por essas
células.
Ambas as cepas de T. gondii inibiram a expressão de iNOS e a produção
de NO após 24 h de infecção. Esse mecanismo de evasão é similar a um dos
mecanismos descritos em macrófagos ativados (Guillermo e DaMatta, 2004;
Seabra et al., 2002; Seabra et al., 2004). Embora o NO seja caracterizado como
agente microbicida contra T. gondii (Adams et al, 1990) a similaridade na inibição
da produção de NO entre macrófagos e IEC-6 indicam que a capacidade do T.
gondii de evadir a produção de NO é semelhante. O exato mecanismo molecular
pelo qual o T. gondii inibe a produção de NO será estudado.
O fato da cepa ME-49 não inibir a expressão de iNOS após 48 h indica que
a baixa virulência dessa cepa não possui requisitos suficientes para evadir da
atividade microbicida da célula. Além disso, essa cepa pode ser destruída por
outros mecanismos microbicidas como destruição vacuolar dependente das IRG
que tem sido demonstrado em macrófagos ativados (Zhao et al., 2009) ou por
mecanismos que envolvem autofagia (Zhao et al., 2009; Andrade et al.,2006;
Subauste, 2009).
38
7. CONCLUSÃO
Toxoplasma gondii invade e se multiplicar nas IEC-6 in vitro. Essas células
quando ativadas inibem o desenvolvimento do T. gondii, expressam iNOS e
produzem NO. Toxoplasma. gondii inibe esse mecanismo microbicida. Entretanto,
somente a cepa mais virulenta (RH) mantem a inibição por 48 h. Novos estudos
são necessários para melhor entendimento dos mecanismos moleculares que
controlam a inibição de NO como mecanismo microbicida nas IEC-6 e se existe
envolvimento de autofagia no processo.
39
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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