Avaliação da patogenia do tifo aviário e resposta imune celular de aves
desafiadas com estirpes mutantes de Salmonella Gallinarum capazes de
produzir flagelos¹
Priscila Diniz Lopes2, Oliveiro Caetano de Freitas Neto2, Janine Denadai², Silvia Juliana Acelaz2, Diego Felipe Alves Batista2,
2
Adriana Maria de Almeida², Angelo Berchieri Junior
¹FAPESP: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
2
Departamento de Patologia Veterinária da FCAV-Unesp
XII Congresso APA - Produção e Comercialização de Ovos - 2014
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Material e Métodos
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Utilizou-se as estirpes mutantes SG Fla e SG Fla (FREITAS NETO et al., 2013), e a estirpe
selvagem (SG). 177 aves de postura comercial de variedade vermelha, susceptíveis ao tifo aviário,
foram distribuídas aleatoriamente em três grupos e receberam água e ração ad libitum. Animais dos
três grupos foram desafiados por via oral no quinto dia de vida. No grupo A utilizou-se um inóculo
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8
contendo 5 x 10 UFC/mL da estirpe SG. Os inóculos dos grupos B e C apresentaram 5 x 10 UFC/mL
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das estirpes SG Fla e SG Fla , respectivamente. O grupo D foi composto de nove aves não
desafiadas que serviram de controle negativo para a imunohistoquimica.
Avaliação da infecção sistêmica
Colheu-se fragmentos de fígado e baço de cinco aves de cada grupo nos momentos 6 e 12
horas pós-infecção (hpi) e 1, 2, 5, 7, 14, 21 e 28 dias pós-infecção (dpi). A contagem bacteriana nos
órgãos foi realizada segundo Berchieri Junior et al. (2001). Os resultados foram analisados pelo Teste
de Tukey utilizando-se nível de significância menor que 5 % (P<0,05).
Avaliação da resposta imune celular
Amostras de tonsila cecal e fígado foram submetidas à técnica de imunohistoquímica para
detecção de linfócitos T CD4+ e T CD8+. Foram colhidas amostras de três aves de cada grupo no 5º e
7º dpi. A técnica utilizada para quantificar o número de células imunomarcadas seguiu o protocolo
descrito por Cheeseman et al. (2008) com algumas modificações. Os fragmentos foram processados
no Laboratório de Histopatologia da FCAV/UNESP. Foi determinada a porcentagem de células
imunomarcadas a partir de quatro campos microscópicos por animal. A partir de tais valores, fez-se
uma média do número de linfócitos T CD4+ ou T CD8+ por grupo. A porcentagem de cada população
de linfócitos foi calculada com o software de análise de imagem (ImageProPlus). Os dados foram
1
Introdução
O tifo aviário é uma doença sistêmica provocada por Salmonella enterica subespécie enterica
sorotipo Gallinarum biotipo Gallinarum (SG), uma bactéria aflagelada. Tem sido sugerido que a
ausência de flagelos em SG favoreceria o desencadeamento de infecção sistêmica severa. O que
seria consequência da indução de resposta imunológica inata de menor intensidade na mucosa
intestinal que por sua vez estimularia resposta imune celular menos eficiente no organismo da ave
(FREITAS NETO et al., 2013).
A flagelina (proteína constituinte do flagelo) tem a propriedade de ativar receptores do tipo toll-5
(TLR-5), os quais são capazes de estimular resposta imune pró-inflamatória e celular e, deste modo,
limitar a invasão e disseminação do patógeno (CRELLIN et al., 2005). Contudo, por ser afalgelada SG
não estimularia tais receptores (CHAPPELL et al., 2009). Para investigar essa hipótese produziu-se
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em um estudo anterior um mutante flagelado de SG (SG Fla ) (FREITAS NETO et al., 2013). SG Fla
induziu resposta imune pró-inflamatória in vitro e foi menos patogênico para as aves que a estirpe
selvagem de SG. Entretanto, notou-se que SG Fla+ se torna fenotipicamente aflagelada (SG Fla -)
após dois ou mais cultivos consecutivos em meio sólido ou caldo nutriente. Considerando a utilização
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de SG Fla para a geração de futuras estirpes vacinais, seria interessante que esta estirpe
mantivesse suas características imunogênicas e de patogenicidade, mesmo quando se tornasse SG
Fla-.
No presente estudo, avaliou-se a patogenicidade e resposta imune induzida pelas estirpes SG
Fla+ e SG Fla- durante infecção experimental em aves. Sabe-se que moléculas presentes no epitélio
intestinal de mamíferos, como os lisofosfolipídeos, podem induzir nova síntese de flagelina no sorovar
Typhimurium (STM) (SUBRAMANIAN & QADRI, 2005). É possível que o mesmo ocorresse com SG
Fla- durante a infecção de aves. Neste caso, mesmo sem flagelos, SG Fla- manteria suas
propriedades imunogênicas.
submetidos a uma análise de variância ANOVA seguida pelo Teste de Tukey utilizando-se nível de
significância menor que 5 % (P<0,05).
Fígado
8
*
6
4
2
0
6
i
hp
12
i
hp
1
i
dp
2
i
dp
5
i
dp
7
i
dp
Momentos pós-infecção
14
i
dp
M édia (Log1 0) de células viáveis (UFC/g)
M édia (Log1 0) de células viáveis (UFC/g)
Resultados e Discussão
Os resultados referentes à infecção sistêmica estão demonstrados na Figura 1. A quantidade
de SG Fla+ em fígado foi significativamente menor que a de SG Fla- no 7º dpi. Notou-se que as
quantidades das estirpes SG e SG Fla - em fígado e baço nos momentos 5 e 7 dpi foram
biologicamente superiores as de SG Fla +, embora não haja diferença significativa. Ao que tudo indica,
a presença do flagelo em SG Fla+ contribuiu para a redução da infecção sistêmica.
Baço
8
(A) SG
(B) SG Fla+
(C) SG Fla-
6
4
2
0
6
i
hp
12
i
hp
1
i
dp
2
i
dp
5
i
dp
7
i
dp
14
i
dp
Momentos pós-infecção
Figura 1 Média (log10) das UFCs/g em amostras de fígado e baço de aves desafiadas com SG, SG
Fla+ e SG Fla-. (*) indica diferença entre médias dos tratamentos dos grupos B e C pelo
teste de Tukey (P<0,05).
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Os resultados do presente estudo indicaram que SG Fla+ estimulou a expansão clonal de
linfócitos T CD4+ de forma mais eficiente no fígado e na tonsila cecal do que as demais estirpes
(Figura 2). O fluxo de células T CD4+ foi significativamente superior na tonsila cecal (5º dpi) e no
fígado (7º dpi) de aves desafiada com SG Fla+ (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001). Quanto aos linfócitos
T CD8+, observou-se, no 5º dpi, maior fluxo celular na tonsila de aves desafiadas com SG e SG Fla(*P<0,05) em comparação ao grupo controle (Figura 3). Porém no fígado, a quantidade de linfócitos T
CD8+ foi maior em aves desafiadas com SG Fla + no 7º dpi (*P<0,05). Além disso, notou-se que
enquanto nas aves desafiadas com SG e SG Fla- houve diminuição da população linfócitos T CD8+
+
em fígado entre o 5º e 7º dpi, naquelas desafiadas com SG Fla houve um aumento destas células.
No fígado pôde-se observar que SG e SG Fla estimularam mais a expansão clonal de T CD8+
(função de destruição de células infectadas), no entanto esta resposta não foi eficaz para destruição
de SG e SG Fla-, uma vez que estas estirpes foram recuperadas em quantidades mais elevadas em
fígado e baço. SG Fla+ estimulou aumento de linfócitos T CD4+ e T CD8+ em fígado, mas com
predomínio de T CD4+; ao que tudo indica esse perfil de resposta foi mais eficiente para controlar a
multiplicação e destruir o patógeno. SG Fla+ também induziu maior fluxo de células T CD4+ na tonsila
que as demais estirpes, o que poderia ter auxiliado o organismo da ave na destruição de SG Fla+ que
estivessem localizadas na nessa região.
A resposta imune do tipo Th-1 estimulada em aves desafiadas em SG Fla +, demonstrou ser
mais eficiente no controle da infecção. Acredita-se o flagelo foi um componente essencial para o
desencadeamento deste perfil de resposta imune, possivelmente devido à ativação de receptores
TLR-5 (McSORLEY et al., 2000).
XII Congresso APA - Produção e Comercialização de Ovos - 2014
Tonsila cecal
Fígado
***
**
20
15
***
*
SG
***
SG Fla+
SG FlaControle
15
10
% ÁREA
% ÁREA
**
5
**
10
5
0
5
D
PI
7
D
PI
0
PI
D
5
Dias pós-infecção
Dias pós-infecção
Figura 2 Quantificação de linfócitos T CD4+ marcados por imunohistoquímica em cortes de fígado e
tonsila cecal de aves não desafiadas e desafiadas com SG, SG Fla+ e SG Fla-. Colunas
representam a média da porcentagem de áreas marcadas ± DP de três aves por grupo.
(*) Diferença entre médias de células imunomarcadas pelo teste de Tukey (*P<0,05,
**P<0,01, ***P<0,001).
Tonsila cecal
Fígado
8
10
*
*
6
*
% ÁREA
% ÁREA
8
6
4
SG
SG FLA+
SG FLACONTROLE
4
2
2
0
0
7
PI
PI
D
D
PI
5
5
D
Dias pós-infecção
Dias pós-infecção
+
Figura 3 Quantificação de linfócitos T CD8 marcados por imunohistoquímica em cortes de fígado e
tonsila cecal de aves não desafiadas e desafiadas com SG, SG Fla+ e SG Fla-. Colunas
representam a média da porcentagem de áreas marcadas ± DP de três aves por grupo. (*)
Diferença entre médias de células imunomarcadas pelo teste de Tukey (*P<0,05).
Conclusões
Os dados do presente estudo indicam que a resposta imune celular em aves infectadas com a
+
+
estirpe SG Fla foi melhor modulada; com predomínio de linfócitos T CD4 em fígado e tonsila. Como
consequência, houve retardo na invasão sistêmica e melhor controle da multiplicação bacteriana no
baço e fígado. Mesmo sendo capaz de produzir flagelos, a estirpe SG Fla- comportou-se de forma
semelhante à SG, indicando que não houve a síntese de flagelina durante infecção de aves.
Agradecimentos
Agradecemos a FAPESP e CNPq pelo auxílio à pesquisa.
Referências Bibliográficas
BERCHIERI JUNIOR, A.; MURPHY, C. K.; MARSTON, K.; BARROW, P. A. Observations on the
persistence and vertical transmission of Salmonella enterica serovars Pullorum and Gallinarum in
chickens: effect of bacterial and host genetic background. Avian Pathology, v. 30, n. 3, p. 221-231,
2001.
XII Congresso APA - Produção e Comercialização de Ovos - 2014
Página
CHEESEMAN, J. H.; LEVY, N. A.; KAISER, P.; LILLEHOJ, H. S.; LAMONT, S. J. Salmonella
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3
CHAPPELL, L.; KAISER, P.; BARROW, P.; JONES, M. A.; JOHNSTON, C.; WIGLEY, P. The
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CRELLIN, N. K.; GARCIA, R. V.; HADISFAR, O.; ALLAN, S. E.; STEINER, T. S.; LEVINGS, M. K.
Human CD4+ T Cells Express TLR5 and Its Ligand Flagellin Enhances the Suppressive Capacity and
Expression of FOXP3 in CD4+CD25+ T Regulatory Cells. The Journal of Immunology, v. 175, p.
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FREITAS NETO, O. C.; SETTA, A.; IMRE, A.; BUKOVINSKI, A.; ELAZOMI, A.; KAISER, P.;
BERCHIERI JUNIOR, A.; BARROW, P.; JONES, M. A flagellated motile Salmonella Gallinarum
mutant (SG Fla+) elicits a pro-inflammatory response from avian epithelial cells and macrophages and
is less virulent to chickens. Veterinary Microbiology, v. 165, n. 3-4, p. 425-33, 2013.
McSORLEY, S. J.; COOKSON, B. T.; JENKINS, M. K. Characterization of CD4+ T Cell Responses
During Natural Infection with Salmonella typhimurium. The Journal of Immunology, v. 164, p. 986-993,
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SUBRAMANIAN, N.; & QADRI, A. Lysophospholipid sensing triggers secretion of flagellin from
pathogenic salmonella. Nature Immunology, v. 7, p. 583-589, 2006.
XII Congresso APA - Produção e Comercialização de Ovos - 2014