ISSN 2236-4420
Cultivo in vitro de Brassavola tuberculata (Orchidaceae) em meio de cultura alternativo
suplementado com diferentes concentrações de açúcar e carvão ativado
Jackeline Schultz Soares1; Yara Brito Chaim Jardim Rosa1; Marichel Canazza de Macedo1; José Carlos
Sorgato1; Derek Brito Chaim Jardim Rosa1; Cedrick Brito Chaim Jardim Rosa1
1
Faculdade de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Grande Dourados, Rodovia Dourados – Itahum, Km12, Bairro
Rural. Dourados, MS. CEP: 79804-970 Mato Grosso do Sul – Brasil. E-mail: [email protected]; [email protected];
[email protected] ; [email protected]; [email protected]; [email protected]
Resumo: Meios nutritivos utilizados na propagação in vitro de Orchidaceae devem fornecer as substâncias
necessárias para a germinação in vitro das sementes e crescimento das plântulas. O objetivo deste trabalho foi
avaliar o efeito de diferentes concentrações de açúcar e carvão ativado, adicionados ao meio de cultura, na
propagação in vitro de Brassavola tuberculata Hook. As sementes foram semeadas em meio de cultura alternativo,
-1
modificado por diferentes concentrações de açúcar (0; 12,5; 25; 37,5 e 50 g L ) e carvão ativado (0; 1,5; 3,0; 4,5 e
-1
6,0 g L ). Após 12 meses da semeadura e permanência em sala de crescimento com temperatura e fotoperíodo
-2 -1
controlados (23ºC±2; 12 horas e 13,51 µmol m s ), as plântulas foram retiradas dos frascos e avaliadas quanto à
porcentagem de germinação, número de plantas, comprimento dos pseudobulbos e da maior raiz. Foi utilizado o
delineamento experimental inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com 4 repetições. Os resultados
obtidos permitiram concluir que o carvão é necessário à germinação e ao crescimento inicial da espécie estudada,
e a mesma não necessita de fornecimento suplementar de açúcar neste meio de cultura para germinação e as
-1
fases iniciais do desenvolvimento. Assim, recomenda-se a adição de 4,5 g L de carvão para cultivo in vitro de B.
tuberculata em meio alternativo.
Palavras chave: espécies nativas do Brasil, carboidrato, carvão ativado, meio assimbiótico.
In vitro culture of Brassavola tuberculata (Orchidaceae) in alternative media supplemented with different
concentration of sugar and activated charcoal
Abstract: Nutrient medium used for Orchidaceae plant cultivation in vitro should provide important substances for
seed germination and seedling growth. This work aimed to evaluate the effect of five concentrations of sugar and
activated charcoal on in vitro propagation of Brassavola tuberculata Hook. The seeds were sown on alternative
-1
culture media supplemented with different concentration of sugar (0; 12, 5; 25; 37, 5 e 50 g L ) and activated
-1
charcoal (0; 1.5; 3.0; 4.5 e 6.0 g L ). After 12 months of cultivation at 23 ±2 ºC under a 12-h photoperiod, and
-2 -1
13.51 µmol m s of luminosity, the seedlings were removed from the vessels and evaluated regarding germination
percentage, number, length of the pseudobulbs and the larger root. A completely randomized design was used and
the treatments were arranged in a factorial 5 x 5 scheme with 4 replications. B. tuberculata did not germinate
without charcoal but does not require supply of sugar in the culture media for initial developmental phases. So, it is
-1
recommended to supplement the culture alternative media for in vitro cultivation of B. tuberculata with 4.5 g L of
activated charcoal.
Key words: Brazilian native species, carbohydrate, activated charcoal, assimbiotic media.
Introdução
Devido à beleza de suas flores, as plantas da
família Orchidaceae são muito apreciadas por
colecionadores e comerciantes (Stefanello et al.,
2009) que, a partir do extrativismo, tem retirado as
orquídeas de áreas naturais. Além disso, o avanço da
agricultura tem destruído os ecossistemas onde estão
inseridas, dificultando sua sobrevivência e reprodução
(Imes, 1997). A velocidade com que esses processos
ocorrem é uma das razões para os estudos acerca da
propagação dessas espécies, para que possam ser
utilizadas tanto em programas de reintrodução quanto
para a comercialização (Bach e Castro, 2004).
Magistra, Cruz das Almas-BA, v. 24, n. 3, p. 226-233, jul./set. 2012.
Soares et al.
Em condições naturais, a propagação das
orquídeas se dá pelo desenvolvimento de gemas
laterais formando clones (Hoffmann et al.,1997) ou
pela disseminação das sementes que, por serem
desprovidas de endosperma, necessitam da
associação com de fungos micorrizicos para
germinação (Kalimuthu et al., 2007). Este fato reduz o
número de sucessos de recrutamentos em
populações naturais e, em uma perspectiva
econômica, a germinação natural dificulta a produção
dessas espécies a partir de sementes. No entanto,
com a adoção das técnicas de germinação in vitro
(Alam et al., 2002), a produção comercial de
orquídeas tem se tornado cada vez mais expressiva,
o que é importante para a conservação uma vez que
garante a viabilidade genética que é perdida com a
cultura de tecidos. Além da germinação, os meios
assimbióticos para orquidáceas devem também
propiciar o crescimento e desenvolvimento das
plantas.
Para atender às necessidades de cada espécie,
mudanças nos meios de cultura têm sido estudadas
por diversos pesquisadores (Rego-Oliveira et al.,
2003; Chapla et al., 2009; Gantait et al., 2009;
Moreira et al, 2009; Pacek-Bieniek et al., 2010).
Entretanto, os meios de cultura comerciais são
complexos, com diversos nutrientes, vitaminas e
reguladores de crescimento (Ventura et al., 2002),
que elevam os custos da propagação. Por esta razão
e visando a facilidade de formulação e acessibilidade
dos componentes, Campos (2002) propôs um meio
alternativo, no qual a maioria das orquídeas germina
e cresce.
Um dos componentes essenciais ao cultivo in
vitro são os carboidratos, pois as plantas propagadas
nesta condição necessitam de uma fonte de energia
externa, já que nesta fase são praticamente
heterotróficas (Caldas et al., 1998). Desta forma
várias fontes de carboidratos tais como sacarose,
maltose e glucose (Rego-Oliveira et al., 2003; Moreira
et al., 2009), são adicionadas aos meios de cultura
convencionais visando suprir esta necessidade. Outro
componente que tem enriquecido os meios de cultura
227
é o carvão ativado, pois a ele são atribuídos efeitos
benéficos tais como aumento na altura e no
enraizamento in vitro de algumas espécies de
orquídeas (George e Ravishankar, 1997; Chapla et
al., 2009; Gantait et al., 2009; Pacek-Bieniek et al.,
2010).
Grande tem sido o interesse por orquídeas
nativas brasileiras, visando não apenas os
colecionadores, mas também os programas de
melhoramento e de reintrodução das espécies em
seus habitats. Entre as orquídeas com este potencial,
destaca-se Brassavola tuberculata, uma espécie que
ocorre no cerrado (Mendonça et al., 1998) e se
distribui no estado de Mato Grosso do Sul (Rech et
al., 2011), destacando-se por seu elevado valor
florístico e rusticidade, sendo este gênero
amplamente utilizado na produção de híbridos duplos
e triplos com Cattleya, Laelia, Sophronitis e
Epidendrum.
Os estudos visando obtenção de um protocolo
de germinação e crescimento in vitro para B.
tuberculata não existem. Assim essa pesquisa teve
por objetivo avaliar o efeito da adição de diferentes
concentrações de açúcar e carvão ativado na
germinação assimbiótica e crescimento inicial desta
espécie.
Material e Métodos
O experimento foi realizado no Laboratório de
Cultivo in vitro da Faculdade de Ciências Agrárias
(FCA) da Universidade Federal da Grande Dourados
(UFGD). Foram utilizadas como material de estudo
sementes de Brassavola tuberculata (Figura 1),
provenientes de uma reserva legal do município de
o
Dourados – MS, localizada nas coordenadas 22 24’
o
S e 54 46’ W, com altitude média de 327 m. As
médias anuais de temperatura do ar máxima e
mínima são de 24 e 20ºC, respectivamente, com
precipitação total anual entre 1250 e 1500 mm. O
clima regional é do tipo Cwa mesotérmico úmido,
segundo a classificação de Köppen (1948).
Magistra, Cruz das Almas-BA, v. 24, n. 3, p. 226-233, jul./set. 2012.
Soares et al.
A
228
C
B
Figura 1 - A) Brassavola tuberculata Hook em seu habitat; B) detalhe da flor – foto de Dalton Hollad Baptista; C) Brassocattleya
tramandaí, híbrido natural entre Brassavola tuberculata e Cattleya tigrina – foto de Luiz Felipe Varella
Cápsulas maduras de B. tuberculata foram
coletadas e as sementes provenientes destas, foram
retiradas, homogeneizadas, pesadas e, três porções
de 5,0 mg cada, foram colocadas em tubos de ensaio
e cada uma delas recebeu uma 3 mL de solução
aquosa de cloreto de trifenil tetrazólio 0,5%. As
suspensões de sementes foram acondicionadas em
ambiente desprovido de luz e 25 ºC ±2. Após 24
horas as suspensões de tetrazólio foram acrescidas
de 7 mL de água destilada e agitadas, sendo pipetado
1 mL para identificação e contagem de sementes
viáveis em câmara de Peters com o auxílio de lupa.
Para cada amostra foram realizadas três leituras,
sendo posteriormente calculada a média entre elas. O
teste identificou 700 sementes viáveis por miligrama
de sementes, com porcentagem de viabilidade de
70%. Após a confirmação da viabilidade procedeu-se
a semeadura in vitro.
Utilizou-se um meio de cultura proposto por
Campos (2002), modificado pela utilização de 70 g de
tomate tipo italiano, variedade Santa Cruz, maduros,
vermelhos, sem casca e sementes, 50 g de banana
nanica amarelada, sem casca (provenientes de
cultivo convencional), 3 mL de adubo NPK na
formulação 10-10-10, 17 g de ágar bacteriológico,
açúcar cristal – C12H22O11- (nas concentrações 0,0;
-1
12,5; 25; 37,5 e 50 g L ), carvão ativado (nas
-1
concentrações de 0,0; 1,5; 3,0; 4,5; 6,0 g L ), 150 mL
de água de coco e água destilada para completar um
litro.
Após homogeneização no liquidificador, o pH
foi ajustado para 5,8 com KOH e meio de cultura foi
transferido para frascos de 600 mL providos de tampa
metálica. Cada frasco recebeu 80 mL do meio, sendo,
a seguir, esterilizado em autoclave por 20 minutos a
120°C e 1 atm
de pressão. Em seguida à
esterilização e solidificação do meio, os frascos foram
transferidos para câmara de fluxo laminar,
previamente esterilizada com luz germicida por 15
minutos, para realização da semeadura in vitro.
Para semeadura foram utilizadas 50 mg de
sementes que foram desinfestadas por 15 minutos
em uma solução composta por 15 mL de hipoclorito
de sódio (2,5%) e 30 mL de água destilada
esterilizada em autoclave (Campos, 2002). Decorrido
este tempo a suspensão foi diluída para 250 mL com
água destilada estéril, no interior da câmara de fluxo
laminar. Cada frasco recebeu, com a utilização de
pipetador automático, 2 mL da suspensão de
sementes (aproximadamente 280 sementes viáveis
por frasco). Foram utilizados quatro frascos para cada
tratamento.
Após a semeadura os frascos foram tampados
e lacrados com filme plástico, sendo acondicionados
em sala de crescimento com temperatura média de
23°C ± 2 e fotoperíodo de 12 horas, com intensidade
-2
-1
luminosa de 13,51 µmol m s obtida por meio de
duas lâmpadas brancas fluorescentes de 40 W cada.
Decorridos doze meses, os frascos foram
abertos e foram contabilizadas a porcentagem de
germinação e o número de plântulas produzidas,
sendo todas elas avaliadas quanto ao comprimento
dos pseudobulbos e da maior raiz e, posteriormente,
calculadas as médias dos valores obtidos para cada
repetição.
Foi utilizado o delineamento experimental
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5x5
com quatro repetições de um frasco cada. Todas as
variáveis foram submetidas à análise de variância e
quando significativas as médias foram comparadas
por regressão ou teste de médias (Tukey 5%) com a
utilização do aplicativo computacional SISVAR 5.3
(Ferreira, 2010).
Resultados e Discussão
Houve efeito isolado do carvão (p<0,01) sobre
todas as variáveis estudadas. Efeitos isolados do
açúcar e da interação carvão x açúcar (p<0,05) foram
Magistra, Cruz das Almas-BA, v. 24, n. 3, p. 226-233, jul./set. 2012.
Soares et al.
registrados apenas sobre a porcentagem de
germinação (%G) e número de plantas (NP). Em
relação ao comprimento de pseudobulbos e da maior
raiz, independentemente das concentrações de
açúcar utilizadas, os valores médios observados
foram de 5,23 e 6,28 mm, respectivamente.
Analisando o desdobramento significativo entre
as concentrações de carvão e de açúcar sobre a %G
e NP de B. tuberculata, observou-se maior influência
do açúcar do que do carvão sobre estas variáveis. As
concentrações de açúcar influenciaram a %G e o NP
apenas com a utilização das concentrações de 1,5 e
-1
4,5 g L de carvão no nível 5 e 1% de probabilidade
respectivamente (Figura 1). Embora a % G nestes
229
tratamentos tenha sido baixa (inferior a 50,0%) todas
as sementes germinadas se desenvolveram em
plântulas.
O aumento das concentrações de açúcar
resultou na diminuição da %G e do NP. Tanto na
-1
presença de 1,5 ou 4,5 g L , de carvão, as maiores
%G e NP foram observadas na ausência de açúcar
(5,9 e 11,1 % e 16,4 e 30,9 plantas respectivamente)
(Figura 1). Estes resultados permitem estimar uma
taxa de decréscimo de 0,2% e 0,56 plantas para cada
grama de açúcar adicionado ao meio de cultura na
-1
presença de 4,5 g L de carvão e um decréscimo de
-1
0,13% e de 0,35 plantas com a utilização de 1,5 g L
de carvão.
16
carvão 1,5 g/L = 5,866 -0,126*x R2 = 0,534
14
2
% de Germinação
carvão 4,5 g/L = 11,068 -0,200**x R = 0,539
12
10
8
6
4
2
0
0,0
12,5
25,0
37,5
50,0
45
Nº de plantas
40
2
carvão 1,5 g/L= 16,398 -0,349*x R = 0,527
2
35
carvão 4,5 g/L= 30,998 - 0,560**x R = 0,539
30
25
20
15
10
5
0
0,0
12,5
25,0
37,5
50,0
-1
Açúcar (g L )
carvão 1,5 g/L
carvão 4,5 g/L
carvão 1,5 g/L
carvão 4,5 g/L
Figura 2 – Porcentagem de germinação e número de plantas de Brassavola tuberculata Hook em função do efeito conjunto
-1
das concentrações de açúcar e de duas concentrações de carvão ativado (1,5 e 4,5 g L ). Universidade Federal da
Grande Dourados, Dourados, 2012.
Magistra, Cruz das Almas-BA, v. 24, n. 3, p. 226-233, jul./set. 2012.
Soares et al.
Em todas as concentrações de açúcar os
maiores valores de %G e de NP foram registrados
-1
com a utilização de 4,5 g L de carvão uma vez que,
-1
com a utilização de 0,0; 3,0 e 6,0 g L de carvão, os
valores médios de %G foram de 0,0; 1,7 e 1,8% e os
de NP foram de 0,0; 5,0 e 5,0 plantas
respectivamente,
independentemente
das
concentrações de açúcar utilizadas.
As concentrações de carvão apresentaram
efeito significativo sobre a %G e NP apenas na
ausência do açúcar (Figura 2).
Para as
-1
concentrações 12,5; 25,0; 37,5 e 50,0 g L , os
valores médios de %G foram de 3,2; 2,5; 1,6 e 0,5% e
de NP foram de 9,0; 7,4; 4,5 e 1,3 plantas,
respectivamente, independente das concentrações de
carvão utilizadas.
Conforme apresentado na Figura 2 a ausência
do açúcar no meio de cultura alternativo associada à
-1
utilização de 4,5 g L de carvão propiciou os maiores
resultados de % de germinação (14,8%) e NP (41,3
plantas) valores estes maiores (p<0,05) que os
observados para as demais concentrações. A
ausência de carvão assim como a maior dose
-1
utilizada (6,0 g L ) não promoveu a germinação em
meio alternativo, indicando ser este componente
essencial neste meio de cultivo e em concentrações
-1
que variem de 1,5 a 4,5 g L .
Segundo Pasqual (2001) a deficiência de
energia luminosa e baixa concentração de CO2, em
cultivos in vitro, dificultam a fotossíntese, fazendo
com que as plântulas dependam de uma fonte
externa de carboidratos os quais fornecem energia e
esqueleto de carbono necessário à síntese de
polissacarídeos, aminoácidos e proteínas, sendo,
portanto fundamentais na germinação e crescimento
de plantas submetidas a este tipo de cultivo.
Os resultados observados neste trabalho
mostram que B. tuberculata germina e cresce melhor
sem o fornecimento suplementar de açúcar. Isso
provavelmente ocorre devido à formulação do meio
de cultura utilizado, uma vez que o mesmo é
constituído, entre outros compostos, por banana,
tomate e água de coco que fornecem as
concentrações de açúcar suficientes a estas duas
fases de desenvolvimento dessa orquídea.
Os efeitos isolados das concentrações de
carvão sobre o comprimento dos pseudobulbos e da
maior raiz são apresentados na Figura 3.
230
A maior raiz de B. tuberculata (9,41 mm) foi
-1
registrada com a utilização de 4,35 g L de carvão, e
o maior comprimento de pseudobulbo (7,99mm) com
-1
a utilização da dose calculada de 4,33 g L de
carvão. A ausência do carvão no meio alternativo não
promoveu germinação. O aumento das doses de
carvão propiciou respostas semelhantes em relação
ao CPB e CMR de B. tuberculata, sendo observada
uma correlação positiva (0,999) entre os seus valores.
A partir desta concentração houve decréscimo nos
valores destas variáveis evidenciando o efeito
desfavorável de doses superiores a esta para o
crescimento in vitro de B. tuberculata (Figura 3).
A resposta de Orchidaceae em relação à
suplementação de meios nutritivos com carvão é
distinta para cada espécie. Enquanto neste trabalho
a ausência de carvão não promoveu germinação,
Chapla et al. (2009) obtiveram maior comprimento de
raiz
de Miltonia flavescens na ausência deste
-1
componente. Doses variando entre 1 e 2 g L de
carvão ativado acrescidas aos meios de cultivo,
promoveram o desenvolvimento da parte aérea de
Miltonia flavescens (Chapla et al., 2009) e foram
benéficas à propagação in vitro de Cattleya
walkeriana (Faria
et al., 2002) entretanto foi
-1
necessária a adição de 5 g L de carvão para a
promoção do desenvolvimento da parte aérea de
Catasetum fimbriatum (Morales et al., 2006).
A ação benéfica do carvão, segundo
Madhusudhanan e Rahiman (2000), decorre da sua
capacidade em aumentar a atividade do sistema
radicular pois tem a capacidade de absorver os
polifenóis produzidos pelas reações químicas do meio
de cultura, que podem atuar como inibidores de
crescimento. Desta forma, o sistema radicular se
torna mais eficiente na absorção dos nutrientes
possibilitando o maior crescimento das plantas. Outro
benefício do carvão segundo Grattapaglia e Machado
(1998) é que simula a condição de escuro, na qual as
raízes se desenvolvem melhor. A proporcionalidade
no incremento em comprimento de pseudobulbos e
comprimento da maior raiz dentro de determinadas
concentrações de carvão reafirmam o relato de
Pasqual et al. (1997) que salientam que, embora o
carvão ativado não seja um regulador de crescimento,
ele modifica a composição do meio de cultura,
podendo regular ou melhorar o crescimento das
plantas.
Magistra, Cruz das Almas-BA, v. 24, n. 3, p. 226-233, jul./set. 2012.
% de Germinação
Soares et al.
231
a
16
14
12
10
8
6
4
b
b
2
0
c
c
N° de plantas
0,0
1,5
3,0
4,5
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
6,0
a
b
b
c
0,0
c
1,5
3,0
4,5
6,0
-1
Carvão (g L )
Figura 3 - Porcentagem de germinação e número de plantas de Brassavola tuberculata Hook em função das concentrações de
carvão ativado na ausência de açúcar. Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados, 2012.
14,0
CMR =0,038 + 4,305**x -0,494*x2 R2 = 0,674
CPB e CMR (mm)
12,0
10,0
CPB
8,0
CMR
CPM
6,0
CMR
4,0
2
2,0
2
CPM = 0,010 + 3,687*x -0,425*x R = 0,705
0,0
0,0
1,5
3,0
4,5
6,0
-1
Carvão (g L )
Figura 4 – Valores de comprimento de pseudobulbos (CBP) e da maior raiz (CMR) de plantas de Brasavola tuberculata Hook
em função das concentrações de carvão ativado. Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados, 2012.
Magistra, Cruz das Almas-BA, v. 24, n. 3, p. 226-233, jul./set. 2012.
Soares et al.
Conclusão
Com base nos resultados observados concluise que o carvão é necessário à germinação e ao
crescimento inicial in vitro de B tuberculata e que a
espécie não necessita de fornecimento suplementar
de açúcar para germinação e crescimento inicial em
meio de cultivo alternativo.
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Recebido em: 06/06/2012
Aceito em: 24/07/2012