Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
1º Semestre de 2015
Aula 7: Métodos de Purificação
de Proteínas Nativas
Prof. Marcos Túlio de Oliveira
[email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
1º Semestre de 2015
Agradecimentos ao Prof. João Pizauro
(Depto. Tecnologia) pelos slides
Prof. Marcos Túlio de Oliveira
[email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Introdução
As células são constituídas de proteínas
codificadas por diferentes gene.
Executam uma função específica
Para caracterizar bioquimicamente uma
proteína, o ideal é extrair e purificá-la
mantendo sua estrutura e função originais
A purificação permite a caracterização
estrutural e funcional da proteína, já que
encontram-se “livres” de contaminantes
Rompimento das células – obtenção do
extrato proteico bruto
SEMPRE, SEMPRE e SEMPRE trabalhar com
proteínas em baixa temperaturas (0 a 4ºC)!!!
Usar tampão correto (pH, cofatores,
estabilizadores, etc.)
Bactérias: Bactérias normais são rompidas ou
choque osmótico, já as com parede celular
espessa necessitam de outros tratamentos
Animal: Tecidos de animais como eritrócitos,
fígado e cérebro são fáceis de serem rompidos;
já tecidos ricos em colágeno como vasos
sanguíneos e músculo liso são mais difíceis
Vegetal: Células são mais difíceis de serem
rompidas porque contém celulose e fenóis
Material Duro
Almofariz (cadinho)
Método mecânico mais simples e mais barato para se
obter extrato de tecido ou célula
Esse método é utilizado na homogeneização de células
bacterianas e vegetais em pequenas quantidades
Material Duro
Agitação com pequenas partículas (beads)
Utiliza-se agitador para proporcionar agitação violenta de uma suspensão de
células com partículas de material resistente capaz de se desintegrar pelo
choque
Usado para obtenção de extratos livres de células de levedura
Resfriamento prévio do material e
imediatamente após ruptura são
fundamentais nesse processo!
Material Duro
French Press
Rompe células microbianas forçando a passagem das mesmas por um
orifício muito pequeno a uma alta pressão
A diferença de pressão em ambos lados do orifício e o atrito fazem as células
romperem
Aplicada em várias preparações
Material Duro
Ultrassom
São empregados no rompimento
de parede celular. As vibrações
sônicas e ultra-sônicas quebram
as células por cavitação.
É produzida pela alternância de
ondas de baixa pressão em que
as bolhas crescem até atingirem
alta pressão na qual são
comprimidas e implodem.
Material Duro
Lisozima
A parede celular das
bactérias consiste de
uma estrutura em rede
que envolve
completamente a célula.
Heteropolissacarideo
constituído por dois tipos
de monossacarídeos :
N-Acetil- ß-Dglucosamina e ácido Nacetilmurâmico
Material Mole
Material Mole
Choque osmótico
Transferência rápida de uma solução
isotônica para uma solução hipotônica.
Devido a osmose as células ficam túrgidas
provocando a lise da membrana.
Ruptura por tratamento químico
Usa-se solvente orgânico ou detergente para
romper diferentes tipos de tecidos, células e
organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes
e ácidos.
Material Mole
Etapas de separação
Centrifugação diferencial
Centrifugação diferencial é usada
para separar organelas, pedaços de
membranas e citosol (fração solúvel
do citoplasma) do extrato celular.
Etapas de separação
Matriz óssea
Placa óssea
Centrifugação
diferencial
NH2
+
Fração solúvel
Enzimas
associadas
à membrana
Matriz óssea
Placa óssea
Centrifugação
diferencial
NH2
+
Fração solúvel
Enzimas
associadas
à membrana
NH2
Enzimas
associadas
à membrana
Detergente
NH2
Enzimas
associadas
à membrana
PIPLC
NH2
Fosfatase alcalina
Pirofosfatase e ATPase
Extração de proteínas de membranas
Interação de Proteínas com a Membrana
Periféricas: associadas por interações eletrostáticas,
pontes de hidrogênio e domínios hidrofóbicos
Integrais: associada por uma cadeia polipeptídica, ácidos
graxos, oligossacarídeos ou ancoras
Âncoras as proteínas estão associadas a
membrana por âncora de lipídeos, derivadas de
fosfolipídeos da membrana
Estratégia Geral para Obtenção da
Proteína Purificada
• Extração
Isolamento
1. Material de Partida -----Extrato Bruto
2. Desintegração celular
Fracionamento
Diálise
•Solubilidade
Ultra filtração
•Tamanho
•Carga
•Afinidade Ligação
Coluna
Cromatografica
Separação
Precipitação de proteínas
• Utilização de diferenças nas
solubilidades das proteínas
– Concentração salina
• A adição de um sal na quantidade
correta pode precipitar algumas
proteínas e manter outras em solução
– (NH4)2SO4
• O sal tem muita solubilidade e estabiliza
a estrutura nativa das proteínas
• Salting in
– Muitas proteínas tornam-se mais solúveis com
aumento da concentração de sal
• Salting out
– Quando as concentrações de sal atingem
valores muito elevados, a solubilidade diminui
Ultra Filtração
• Princípio: Uma membrana semipermeável permite
a separação das moléculas menores (solventes,
íons, etc) das moléculas grandes ( peptídeos,
protéicas), pois apenas as moléculas pequenas
podem penetrar na membrana quando a pressão
osmótica é excedida
• O processo de ultra filtração é empregado para
concentração, dessalinização e fracionamento
Diálise
• Procedimento que separa as proteínas dos
solventes beneficiando-se do tamanho maior
das proteínas
Cromatografia em coluna
Gel-Filtração
• A separação e feita de acordo com o tamanho molecular
Cromatografia de
troca iônica
Cromatografia de
Afinidade


Pequenas proteínas
são ligadas aos
suportes e a mistura
complexa de
proteínas é aplicada
Proteínas ligadas
podem ser eluídas
com moléculas
pequenas ou
reagentes
Cromatografia de
Afinidade

Separa as
proteínas por
especificidade
de ligação
Exemplos de Colunas Cromatográficas
DNA-celulose
Heparina
Fosfocelulose
Blue-sepharose
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Pressão
Como analisar o resultado da
purificação?
(como visualizar proteínas e determinar a
pureza da amostra?
Absorbância
280nm
SDS-PAGE
A280
A280
SDS-PAGE
(Eletroforese em Gel de PoliacrilamidaSDS)
SDS-PAGE
Ação do SDS
SDS-PAGE
Ação do -mercaptoetanol
-S-SS
SH
S + SDS + 2-mercaptoetanol
S
S
-S-S-
4
SH
1
2
3
Amostra
Amostra
Amostra
Adição de SDS
β - Mercaptoetanol
Fervura
SDS-PAGE
o Eletroforese: Separação e visualização das proteínas no Gel
•Azul de Comassie
•Prata
SDS-PAGE
0.25 M NaSCN
Gradient 0.4-1.2 M NaSCN
1.5 M NaSCN
C+ Ind S FT W1
Blue-Sepharose
Gradient 60-100 mM KPO4
150 mM KPO4
1 2
S
FT W1 W2
Fosfocelulose
3
4
Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
1º Semestre de 2015
Próxima aula: Métodos de Purificação de Proteínas
Recombinantes