UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
Bipolaris sorokiniana (Cochliobolus sativus) EM
SEMENTES DE CEVADA: DETECÇÃO,
TRANSMISSÃO E CONTROLE
JAVIER TOLEDO BARBA
ORIENTADOR: Prof. PhD. ERLEI MELO REIS
CO-ORIENTADOR: Prof. PhD. CARLOS A. FORCELINI
Dissertação apresentada à Faculdade
de Agronomia e Medicina Veterinária
da UPF, para obtenção do título de
Mestre em Agronomia – área de
Concentração Fitopatologia.
Passo Fundo, outubro de 2001
III
BIOGRAFIA DO AUTOR
JAVIER TOLEDO BARBA, nascido em 12 de abril de
1968, natural de Santa Cruz de la Sierra, Bolívia. Engenheiro
agrônomo, graduado em 1992 junto à Faculdade de Agronomia da
Universidade Autônoma “Gabriel René Moreno” (UAGRM), da
cidade de Santa Cruz de la Sierra, Bolívia.
Durante três anos (1990 – 1993), trabalhou como auxiliar
de cátedra da disciplina de Fitopatologia Geral e Fitopatologia
Agrícola na UAGRM.
Em 1993, ingressou no Centro de Investigación Agrícola
Tropical – CIAT (Santa Cruz de la Sierra, Bolívia), onde atuou,
inicialmente, como pesquisador em Entomologia e, posteriormente,
como pesquisador em Fitopatologia na cultura do trigo e da soja, até
fevereiro de 1999.
Em março de 1999, e com a licença do CIAT, iniciou o
curso de pós-graduação em Agronomia na área de concentração em
Fitopatologia, em nível de mestrado, na Faculdade de Agronomia e
Medicina Veterinária, da Universidade de Passo Fundo.
IV
À memória eterna da minha adorada mãe:
Hilda,
.........e de meus avós:
Nené e Esteban
DEDICO
A meu pai: Ovidio
..........e irmãos: Ovidio, Jorge, Diana e Angela
OFEREÇO
V
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da
Universidade de Passo Fundo, pela oportunidade de ter realizado o
curso e pelo aprimoramento profissional alcançado.
Ao CIAT de Santa Cruz de la Sierra, Bolívia, pela licença
e apoio logístico outorgado durante o tempo que durou o curso.
Ao governo inglês, através do Projeto FOR-CIAT, pela
concessão da bolsa de estudos sem a qual a realização do curso teria
sido inviável.
Ao professor orientador, Dr. Erlei Melo Reis, pela
acolhida, amizade e incentivo para continuar no caminho da pesquisa.
Pela sua orientação segura e atenciosa em todos os momentos do
curso, demonstrando sempre grande experiência profissional e
dedicação.
Ao professor co-orientador, Dr. Carlos A. Forcelini, pela
amizade e apoio incondicional durante os trabalhos, principalmente
nos momentos de maior dificuldade. Pela orientação criteriosa e
oportuna.
A toda minha família, que, mesmo distante, não poupou
esforços em me estimular para a realização do curso.
À professora Dra. Jurema Schons, pela eficiente e
constante colaboração como coordenadora do curso e, especialmente,
pela amizade brindada.
À professora e amiga Dra. Norimar Denardin, exemplo de
integridade e bondade, pelo carinho, compreensão, incentivo e
amizade incondicional brindados em tudo momento.
VI
À professora Dileta, pela amizade e orientação oportuna
na estatística.
Aos professores e funcionários da FAMV/UPF, pelo
auxílio e dedicação dispensados durante o curso.
Aos colegas, pela amizade brindada.
À Regina, Graça e Rosana, funcionárias da Biblioteca da
Embrapa-Trigo,
pela
amizade,
colaboração
e
auxílio
na
disponibilização do material bibliográfico.
A todos que, direta ou indiretamente, tornaram possível a
execução deste curso.
VII
SUMÁRIO
Página
RESUMO.....................................................................................
1
ABSTRACT.................................................................................
3
CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO.....................................................................
4
2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................
6
2.1 Importância econômica de Bipolaris sorokiniana na
cultura da cevada.............................................................
6
2.1.1 Podridão comum de raízes (PCR)..........................
6
2.1.2 Mancha marrom ou helmintosporiose e ponta
preta........................................................................
7
2.2 Distribuição geográfica de Bipolaris sorokiniana no
mundo..............................................................................
8
2.3 Etiologia............................................................................
9
2.3.1 Antecedentes..........................................................
9
2.3.2 Sinônimos...............................................................
10
2.3.3 Características morfológicas...................................
11
2.3.4 Taxonomia..............................................................
12
2.4 Sintomatologia causada por Bipolaris sorokiniana na
cevada..............................................................................
13
2.4.1 Podridão comum de raízes.....................................
13
2.4.2 Mancha marrom ou helmintosporiose...................
13
2.5 Epidemiologia: ambiente e doença...................................
14
2.5.1 Esporulação e germinação......................................
15
2.6 Ciclo da doença.................................................................
15
2.6.1 Fontes de inóculo...................................................
15
VIII
2.6.2 Disseminação.........................................................
17
2.6.3 Transmissão..........................................................
18
2.6.4 Germinação, penetração e colonização................
20
2.6.5 Esporulação...........................................................
21
2.6.6 Sobrevivência........................................................
21
2.8 Detecção de Bipolaris sorokiniana em sementes............
26
2.8.1 Métodos sem incubação........................................
27
2.8.1.1 Detecção por observação direta da
semente seca.............................................
27
2.8.2 Métodos com incubação.........................................
28
2.8.2.1 Método do papel-filtro...............................
28
2.8.2.2 Detecção através de meios de cultura.........
30
2.8.3 Detecção através da análise de pigmentos..............
31
2.8.4 Detecção por técnicas imunológicas.......................
31
2.8.5 Detecção através de técnicas moleculares..............
32
2.9 Controle de Bipolaris sorokiniana: tratamento de
sementes.......................................................................
33
2.9.1 Tratamento físico (termoterapia)..........................
33
2.9.2 Tratamento biológico.............................................
34
2.9.3 Tratamento químico...............................................
35
2.9.3.1 Uso de solventes orgânicos como veículo
de fungicidas............................................
36
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................
38
CAPÍTULO II
EFEITO DO SUBSTRATO NA MORFOLOGIA DE
CONÍDIOS DE Bipolaris sorokiniana E DA DENSIDADE
DE INÓCULO NA INTENSIDADE DA MANCHA
MARROM EM CEVADA........................................................
54
IX
CAPÍTULO III
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE
Bipolaris sorokiniana EM SEMENTES DE CEVADA..........
71
CAPÍTULO IV
EFEITO DA TEMPERATURA NA TRANSMISSÃO DE
Bipolaris sorokiniana DA SEMENTE PARA PLÂNTULAS
DE CEVADA.............................................................................
90
CAPÍTULO V
EFEITO DE SOLVENTES ORGÂNICOS USADOS
COMO VEÍCULOS DE FUNGICIDAS NO CONTROLE
IN VITRO E IN VIVO DE Bipolaris sorokiniana EM
SEMENTES DE CEVADA....................................................... 110
CAPÍTULO VI
CONCLUSÕES......................................................................... 130
Bipolaris sorokiniana (Cochliobolus sativus) EM SEMENTES DE
CEVADA: DETECÇÃO, TRANSMISSÃO E CONTROLE. Passo
Fundo, 2001. Dissertação (Mestrado em Agronomia / Fitopatologia) –
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária. Universidade de
Passo Fundo.
Autor: JAVIER TOLEDO BARBA
Orientador: ERLEI MELO REIS
Co-Orientador: CARLOS ALBERTO FORCELINI
RESUMO
O fungo Bipolaris sorokiniana (Cochliobolus sativus),
agente causal da mancha marrom da cevada, tem a capacidade de
infectar e ser transmitido eficientemente pela semente, podendo atingir
níveis de incidência próximos a 100%, o que torna os fungicidas
existentes no mercado incapazes de erradicá-lo nesses níveis. O
presente trabalho objetivou estudar a associação patógeno-semente,
englobando a detecção, transmissão e controle do fungo na semente. O
tamanho, septação e morfologia de conídios do fungo foram afetados
significativamente conforme o tipo de substrato. Os esporos formados
em meios de cultura e sementes foram mais curtos, largos e com
menor número de septos, comparados aos recuperados de tecidos
verdes. Por outro lado, obteve-se uma relação de tendência polinomial
quadrática entre a densidade de inóculo e a intensidade da mancha
marrom. Em experimentos conduzidos em laboratório, compararam-se
sete métodos de detecção de B. sorokiniana na semente, testados com
e sem congelamento das mesmas. Sem congelamento, os meios
seletivos foram mais sensíveis na detecção de B. sorokiniana. Sob
congelamento (– 20 oC), o tratamento térmico anulou o efeito dos
substratos na detecção do fungo, não afetando significativamente na
detecção do fungo. Em geral, o meio de Reis foi mais sensível que o
de papel-filtro + congelamento na detecção de B. sorokiniana em
sementes de cevada com diferentes níveis de incidência. Em
experimentos conduzidos em câmaras climatizadas, determinou-se
que a transmissão foi mais eficiente na faixa térmica de 18 a 25 oC.
Estatisticamente, os pontos máximos de transmissão oscilaram entre
2
18,1 e 21,3 oC, sendo que as relações estudadas seguiram tendências
polinomiais quadráticas. Coleóptilos infectados por B. sorokiniana
tornaram-se evidentes na primeira e segunda semanas após semeadura.
Por mais de 28 dias, o incremento de coleóptilos infectados e da
esporulação seguiu uma tendência ascendente. Finalmente, avaliou-se
in vitro e in vivo o efeito de solventes orgânicos utilizados como
veículos de fungicidas na erradicação do fungo em sementes de
cevada. Os resultados permitiram deduzir que os solventes orgânicos
mostraram potencialidade para melhorar a eficiência da maioria dos
fungicidas testados in vitro, aspecto que não foi corroborado in vivo.
Os fungicidas iminoctadina e difenoconazole foram 100% efetivos em
evitar a transmissão do fungo das sementes para os coleóptilos, sendo
que a testemunha registrou níveis de transmissão de 89,7% para os
coleóptilos. Concluiu-se que a erradicação in vitro de B. sorokiniana
da semente de cevada é difícil de ser alcançada, e nem sempre
necessária, uma vez que a simples presença do fungo na semente
(especialmente quando tratada com fungicida) não garante a sua
transmissão para os órgãos aéreos de plântulas de cevada.
Recomendou-se priorizar trabalhos que objetivem determinar o limiar
numérico de transmissão, considerando semente com e sem fungicida,
assim como a inclução de testes in vivo rotineiros em provas de
eficiência de fungicidas, com a finalidade de se estabelecer o
verdadeiro potencial de controle dos mesmos, sob condições
favoráveis, e, dessa maneira economizar esforços na procura de
métodos químicos eficientes na erradicação in vitro do fungo.
Palavras-chave: Hordeum vulgare, patologia de sementes, fungicida.
Bipolaris sorokiniana (Cochliobolus sativus) IN BARLEY SEEDS:
DETECTION, TRANSMISSION AND CONTROL. Passo Fundo,
2001. Dissertation (Mestrado em Agronomia / Fitopatologia) –
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária. Universidade de
Passo Fundo.
Author: JAVIER TOLEDO BARBA
Adviser: ERLEI MELO REIS
Co-Adviser: CARLOS ALBERTO FORCELINI
ABSTRACT
The fungus Bipolaris sorokiniana (Cochliobolus sativus),
the causal agent of barley brown spot, is efficiently transmitted
trhough barley seeds, which makes its control very difficult with the
currrent available fungicides. The present work aimed to study the
fungus detection, transmission, and control in barley seeds. The size,
septation, and morphology of the conidia were influenced by the
substrate used for seed testing. The conidia formed on leaf lesions
were longer, narrower, less dark, and with more septa than those in
culture media. The relationship of inoculun density to brown spot
intensity was represented by a quadratic model equation. Among
seven methods tested for seed testing in laboratory, the selective
media were more sensitive regarding the fungus detection, especially
when the seeds were not frozen at – 20 oC. Overall, the seed freezing
did not influence the fungus detection significantly. The Reis selective
medium was more efficient to detect the fungus in low infected seeds.
The observed and estimated seed-to-plant transmission were higher at
18 – 25 oC and 18,7 – 21,8 oC, respectively. The fungus sporulation
was also influenced by the temperature, being maximum at 19,7 oC.
Although the infection of coleoptiles by B. sorokiniana was early
detected at the first and second week after sowing, both the fungus
infection and sporulation increased for more than 28 days. Organic
solvents added to fungicides used for seed dressing improved the in
vitro but not the in vivo control of B. sorokiniana. The fungus
transmission from non-treated seeds was 89,7% to coleoptile and
12,3% to plumule. Such transmission was completely avoided by the
4
fungicides iminoctadina and difenoconazole. In conclusion, its very
difficult to erradicate the seed-borne inoculum of B. sorokiniana,
which is due to several factors including the seed morphology.
Instead, it could be possible to establish transmission thresholds
based on levels of seed infection, which requires further studies.
Key words: Hordeum vulgare, seed pathology, fungicide
CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO
A cevada (Hordeum vulgare L.) ocupa o quarto lugar em
importância entre os cereais, depois do trigo, do milho e do arroz.
Acredita-se que tenha sido uma das primeiras plantas domesticadas
pelo homem. A razão pela qual a cevada continua sendo um cereal
importante após tantos séculos de cultivo é a sua ampla adaptação
ecológica, a sua utilização tanto para a alimentação animal como para
a humana e a alta qualidade do malte para a fabricação de cerveja
(Lopez Bellido, 1991).
Nas últimas décadas, a área cultivada com cevada no
mundo tem se incrementado mais rapidamente que a do trigo,
alcançando uma superfície aproximada de 91 milhões de hectares; as
regiões temperadas são as que apresentam a maior área cultivada com
este cereal (Mathre, 1997).
No Brasil, a produção de cevada está concentrada nos
estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, para fins
exclusivamente cervejeiros. Atualmente, é uma cultura técnica e
economicamente consolidada, ocupando o segundo lugar em
importância entre as culturas de inverno depois do trigo. Esse
6
progresso foi obtido, sobretudo, graças ao incentivo e ao fomento
dado pela indústria cervejeira, que em alguns lugares passou a ser uma
opção tão importante quanto o trigo, chegando a superar a área de
130.000 ha nos últimos anos (Minella, 1999; Minella, 2000).
As regiões produtoras de cevada caracterizam-se por
apresentar condições climáticas favoráveis ao desenvolvimento de
doenças de importância econômica para a cultura, das quais as
principais são: a mancha reticular [Pyrenophora teres (Died.) Drech.,
anamorfo Drechslera teres (Sacc.) Shoem.], a mancha marrom
[Cochliobolus sativus (Ito & Kurib.) Drech. ex Dastur, anamorfo
Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem], o oídio [Blumeria graminis
(DC) Speer f.sp. hordei E. Marchal, anamorfo Oidium monilioides
(Ness.) Limk.], a giberela [Gibberella zeae (Schw.) Petch, anamorfo
Fusarium graminearum Schwabe], o vírus do nanismo amarelo da
cevada ou VNAC (Barley Yellow Dwarf Virus – BYDV), a ferrugem
da folha (Puccinia hordei Otth) e as podridões radiculares (B.
sorokiniana e F. graminearum) (Luz, 1982; Forcelini & Reis, 1997;
Anônimo, 1999; Casa et al., 2000); além de um complexo de fungos
patogênicos presentes nas sementes, sendo D. teres e B. sorokiniana
os patógenos mais freqüentes (Luz, 1982; Anônimo, 1999).
A mancha marrom ou helmintosporiose é considerada uma
doença potencialmente importante para a cultura da cevada no sul do
Brasil, sobretudo em condições de primaveras quentes e úmidas, nas
que pode causar prejuízos significativos nos rendimentos e na
qualidade da semente e do malte (Vieira, 1985; Forcelini & Reis,
1997). Outro aspecto que torna B. sorokiniana um fungo de
importância para a cevada é a capacidade que tem de ser transmitido
pela semente. Sementes infectadas por este fungo chegam a atingir
7
níveis de incidência próximos a 100%, de tal modo que os fungicidas
existentes no mercado se tornam incapazes de erradicar o patógeno
com níveis de incidência tão elevados e de impedir a passagem do
fungo para a parte aérea da planta. Esse problema onera o custo de
produção da cultura pela necessidade de aplicação antecipada de
fungicidas foliares.
Considerando que as sementes constituem a principal
fonte de inóculo primário em lavouras com rotação de culturas,
tornam-se necessários e imprescindíveis estudos detalhados de
transmissão e de métodos de controle de B. sorokiniana, visando a sua
erradicação da semente de cevada. Para isso, é preciso contar com
métodos de detecção mais sensíveis e que permitam quantificar com
maior precisão a incidência do fungo veiculado pela semente.
Em tal sentido, o presente trabalho teve como objetivos: a)
estudar o efeito de diferentes substratos no tamanho e na morfologia
de conídios do fungo B. sorokiniana; b) estudar o efeito da densidade
de inóculo na intensidade da mancha marrom em plântulas de cevada;
c) comparar e avaliar diferentes meios de cultura e métodos usados em
laboratório, com a finalidade de selecionar o mais sensível na
detecção de B. sorokiniana associado a sementes de cevada; d) avaliar
o efeito da temperatura na transmissão de B. sorokiniana das sementes
para os órgãos aéreos e radiculares de plântulas de cevada; e) avaliar e
quantificar a evolução da transmissão do fungo em função do tempo e
o potencial de esporulação nas extremidades apicais dos coleóptilos; f)
avaliar in vitro e in vivo o efeito de solventes orgânicos utilizados
como veículos de fungicidas na erradicação de B. sorokiniana em
sementes de cevada.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Importância econômica de Bipolaris sorokiniana na cultura
da cevada
O fungo B. sorokiniana caracteriza-se por infectar os
tecidos vegetais em qualquer estádio de desenvolvimento, assim como
por causar um complexo quadro sintomatológico na cevada, o qual
pode ser agrupado em três fases principais: a) podridão comum de
raízes e crestamento de plántulas, b) mancha marrom ou
“helmintosporiose” e c) ponta preta do grão (Luz, 1982; Kiesling,
1985; Mathre, 1997).
2.1.1 Podridão comum de raízes (PCR)
Os danos provocados pela PCR devem-se principalmente
à redução do poder germinativo da semente, tombamento de plântulas,
presença de plantas com moderadas a severas lesões subcoronais e
podridões de raízes, que causam redução no número de perfilhos e
folhas, na altura da planta e, em alguns casos, provocam o
desenvolvimento de espigas mais pequenas e grãos enrugados
(Ghobrial, 1975; Duczek & Jones-Flory, 1993; Piening, 1997).
Danos no rendimento causados pela PCR, incluindo
crestamento de plântulas, têm sido determinados em alguns países da
Europa
e
da
América
do
Norte,
onde
o
fungo
atinge
significativamente o rendimento da cevada (Piening, 1997).
Nos Estados Unidos, em experimentos conduzidos no
estado de Montana, demonstrou-se que B. sorokiniana pode reduzir o
número de perfilhos e o peso dos grãos. Nos anos 80, estudos
9
realizados nas Grandes Planícies do norte dos Estados Unidos
revelaram danos significativos no rendimento, de até 9,5% em solos
naturalmente
infectados
(Piening,
1997).
Frank
(1985),
na
Pennsylvania, sob condições de solo artificialmente infestado,
observou reduções de até 20% no rendimento de grãos e de 27 a 62%
na população de plantas estabelecidas na lavoura.
No Canadá, Piening et al. (1976) estimaram danos médios
de 10,3% por ano (condições de solos naturalmente infestados), os
quais oscilaram entre 5 e 42%. Tinline & Ledingham (1979) relataram
reduções no rendimento que oscilaram entre 1,7 e 32,3%, dependendo
da cultivar estudada. Durante os anos de 1977 e 1978, os danos
produzidos pela PCR foram de 39% e 33%, respectivamente (Pua et
al., 1985). Entre 1978 e 1980, as reduções no peso dos grãos
oscilaram entre 36 a 46%, não existindo diminuições significativas em
1981 e 1982 (Kidambi et al., 1985). Recentemente, Bailey et al.
(1997) relataram danos de até 11% em diferentes cultivares.
Na Escócia, infecções severas por B. sorokiniana
resultaram em danos médios de 15% devido à redução do rendimento
por espigas e da densidade de plántulas no estabelecimento da lavoura
(Whittle & Richardson, 1978). Na Finlândia, foram estimados danos
que oscilaram entre 7,2 e 38,5% em casa-de-vegetação, sendo que, no
campo, variou de 5 a 11% (Kurppa, 1985a) e de 3 a 33% (Kurppa,
1985b). Na Polônia, Lacicowa & Pieta (1994a) relataram reduções de
até 50% no rendimento em cultivares de cevada em condições de
solos naturalmente infestados com B. sorokiniana, Fusarium
avenaceum e F. culmorum. Na Rússia, existem relatos de danos
causados pela PCR de até 30% (Randalu apud Richardson, 1979).
10
No Brasil, não existem informações sobre os danos que a
PCR causa na cultura da cevada. No trigo, a doença pode ocasionar
danos elevados, sendo 19% a média estimada (Diehl, 1980; Diehl,
1982; Diehl et al., 1983).
2.1.2 Mancha marrom ou helmintosporiose e ponta preta
do grão
A helmintosporiose causa danos significativos em áreas
com clima quente e úmido, mas raramente é um problema em cevada
cultivada sob condições semi-áridas. A severidade desta doença em
cevada pode variar de ano para ano porque o patógeno é sensível a
condições ambientais. Steffenson (1997) relata que danos entre 1030% podem ocorrer quando as condições ambientais são favoráveis
após o espigamento.
Diminuições no rendimento de até 37% têm sido relatadas
em cultivares suscetíveis no Canadá, podendo também reduzir o peso
dos grãos em até 10% (Clark, 1979). Na Finlândia, sob condições de
casa-de-vegetação, danos de até 43% são relatados, sendo inferiores
no campo (28%) (Kurppa, 1985c).
Na América Latina, danos em nível experimental de até
36% foram relatados no Uruguai (Servicio de Protección Agrícola,
1992). No Brasil, estudos sob condições de inoculação artificial em
casa-de-vegetação demonstraram que o rendimento da cevada pode
ser severamente diminuído pela helmintosporiose, em níveis que
oscilaram entre 11 a 68%, dependendo da cultivar (Luz, 1976).
Picinini & Fernandes (1996), em trabalhos de controle químico de
doenças da cevada, entre as quais a mancha marrom prevaleceu,
estimaram reduções de até 22% no rendimento sob condições de
11
ocorrência tardia da doença. Segundo esses autores, os danos podem
ser maiores se a presença de B. sorokiniana ocorrer nos estádios
iniciais de desenvolvimento da cultura.
A importância de B. sorokiniana não se deve apenas às
reduções no rendimento de grãos que provoca, mas também à sua
capacidade de reduzir a qualidade das sementes, comprometendo
seriamente, em muitos casos, a germinação ou originando plantas
doentes, que servem de fontes de inóculo primário dentro da lavoura
(Reis, 1987).
Reduções na germinação, na emergência e decréscimo da
viabilidade em sementes de trigo foram relatados por Rana & Sen
Gupta (1982); Kaur & Aulakh (1988); Zhang et al. (1990); Diao-Guo
& Su-Mei (1995); Rashid (1998). Quanto que na cevada, a presença
de sementes com sintomas de ponta preta (D. teres, B. sorokiniana e
Alternaria spp.) pode também ocasionar reduções no índice da
germinação e consequentemente, reduções na qualidade do malte
(Vieira, 1985).
2.2 Distribuição geográfica de Bipolaris sorokiniana no mundo
O fungo B. sorokiniana, agente causal da podridão comum
de raízes e da helmintosporiose dos cereais, encontra-se amplamente
distribuído no mundo, particularmente nas regiões temperadas e
tropicais da América, Europa, Ásia, Austrália e África (Dickson,
1963; Stubbs et al., 1986; Zillinsky, 1984; Sivanesan, 1987; Agrios,
1997). É comum em todas as regiões onde o trigo e a cevada são
cultivados (Piening, 1997; Sttefenson, 1997).
Por outro lado, Dickson (1963) informa que os danos
produzidos em plântulas e as podridões de raízes são comuns em áreas
12
relativamente secas e temperadas, como nas pradarias do Canadá, nas
Grandes Planícies dos Estados Unidos, na Federação Russa (Piening,
1997) e no sul da Austrália (Fedel-Moen & Harris, 1987); já, nas
regiões temperadas e tropicais úmidas, são mais freqüentes as lesões
nos órgãos aéreos (Dickson, 1963).
Hetzler (1991) relata que B. sorokiniana é considerado um
patógeno de importância para o trigo nas regiões quentes onde este
cereal não é uma cultura tradicional, como no Paraguai, em algumas
regiões do Brasil, em Bangladesh, Índia, Nepal e noutros países
tropicais, como a Bolívia (Toledo & Guzman, 1998); Marrocos,
Tanzânia, Zâmbia, África do Sul e Madagascar, na África; Tailândia,
Filipinas, Indonésia, Vietnã e China, na Ásia (Maraite, 1998; Van
Ginkel & Rajaram, 1998). Outros países da América Latina onde o
fungo foi assinalado são México, Argentina (Maraite, 1998) e Chile
(Mehta, 1993), nos quais o fungo é considerado de importância
relativa.
2.3 Etiologia
O agente causal da mancha marrom ou helmintosporiose
da cevada é o fungo Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem., anamorfo
de Cochliobolus sativus (Ito & Kurib.) Drechsler ex Dastur.
2.3.1 Antecedentes
Fase anamórfica: Bipolaris sorokiniana
O nome Helminthosporium sorokinianum foi mencionado
pela primeira vez por Sorokin, em 1890, para designar o fungo que
13
detectara em espigas de trigo e centeio na região sul da Ussuria,
Rússia. Em 1892, Saccardo voltou a descrever o fungo com o mesmo
binômio. Mais tarde, em 1909, Pammel, King e Bakke descreveram a
espécie H. sativum, parasita desses mesmos hospedeiros (Drechsler,
1923; Luttrell, 1955; Dickson, 1963).
Em 1918, Lindfors descreveu um fungo encontrado na
Suécia como H. acrothecioides, presente sobre sementes de cevada
que tinham sido germinadas sobre papel-filtro (Drechsler, 1923).
Drechsler (1923) discutiu a possível sinonímia dos binômios de
Sorokin e Pammel, King e Bakke, mas sem comparação dos tipos
originais, razão pela qual não os colocou na categoria de sinônimos.
Em 1924, Mouranshkinski considerou pela primeira vez a H. sativum
como um sinônimo do fungo descrito na Ussuria (Luttrell, 1955;
Dickson, 1963).
Mackie e Paxton, em 1924, diferenciaram H. californicum
de H. sativum pela largura e morfologia reta dos conídios,
considerando-o uma nova espécie. Em 1950, Sprague considerou H.
californicum um sinônimo de H. sativum (Luttrell, 1955). Luttrell
(1955) examinou os espécimes tipo de H. sativum, H. acrothecioides e
H. californicum e concluiu que todos eram sinônimos de H.
sorokinianum.
Shoemaker (1959), ao propor a substituição do nome
genérico Helminthosporium por Bipolaris, mudou o binômio do
agente causal da helmintosporiose, sugerindo a nova denominação de
B. sorokiniana (Mehta, 1993; Maraite, 1998). Esta denominação é a
mais amplamente adotada na atualidade (Maraite, 1998).
14
Fase teleomórfica: Cochliobolus sativus
Drechsler, em 1925, descreveu pela primeira vez um
teleomorfo para um Helminthosporium sp. (Bipolaris sp.), que
causava mancha foliar em milho, e provisoriamente o denominou
como uma nova espécie de Ophiobolus (gênero criado por Riess em
1854, segundo Drechsler, 1934), O. heterostrophus (Sivanesan, 1987).
Ito e Kuribayashi, em 1929, descreveram um fungo
ascógeno obtido artificialmente como o estado perfeito de H. sativum
e o denominaram com o binômio Ophiobolus sativus (Tinline, 1951;
Maraite, 1998).
Drechsler, em 1929, comparou O. heterostrophus com O.
graminis (sinônimo de Gaeumannomyces graminis) e O. herpotrichus,
encontrando diferenças entre eles e seus anamorfos (Sivanesan, 1987).
Em 1934, Drechsler criou o novo gênero Cochliobolus para incluir as
espécies ascógenas com esporos helicoidais e com anamorfos
pertencentes ao gênero Helminthosporium, que previamente haviam
sido referidos no gênero Ophiobolus (Drechsler, 1934; Tinline, 1951),
porém não transferiu O. sativus para o novo gênero (Tinline, 1951).
Em 1942, Dastur transferiu a referida espécie para o novo gênero,
usando o binômio Cochliobolus sativus (Tinline, 1951; Maraite,
1998).
Em 1946, o periódico Review of Applied Mycology
publicou oficialmente a nomenclatura do binômio como Cochliobolus
sativus (Ito & Kurib.) Drechsler ex Dastur (Tinline, 1951).
No Canadá, Tinline (1951) obteve o estado perfeito
mediante a conjugação de isolados compatíveis do fungo, estudando o
seu ciclo biológico completo no hospedeiro. O autor usou o binômio
15
C. sativus e confirmou a descrição dada por Kuribayashi em 1929 e
Ito & Kuribayashi em 1931.
2.3.2 Sinônimos
Sivanesan (1987) relaciona os seguintes sinônimos para o
agente causal da mancha marrom ou helmintosporiose:
a. Fase teleomórfica, sexual ou perfeita:
Ophiobolus sativus Ito & Kuribayashi, 1929
Cochliobolus sativus (Ito & Kurib.) Drechsler ex Dastur,
1942
b. Fase anamórfica, assexual ou imperfeita:
Helminthosporium sorokinianum Saccardo in Sorokin, 1890
Helminthosporium sativum Pammel, King & Bakke, 1910
Helminthosporium acrothecioides Lindfors, 1918
Helminthosporium californicum Mackie & Paxton, 1923
Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker, 1959
Drechslera sorokiniana (Sacc.) Subramanian & Jain, 1966
2.3.3 Características morfológicas
Fase anamórfica: Bipolais sorokiniana
O micélio é septado e geralmente de cor marrom-olivaescura. Apresenta conidióforos septados, solitários ou em pequenos
grupos, retos a flexuosos, algumas vezes geniculados, pálidos a
medianamente marrom-escuros, com dimensões de 110 – 220 × 6 – 10
m, contendo conídios normalmente em grupos de três (1 – 6),
16
desenvolvidos lateralmente a partir de um poro em cada septo do
conidióforo (inserção acropleurógena) (Ellis, 1971; Sivanesan, 1987).
Apresenta células conidiógenas, politrética, terminal, simpodial,
cilíndrica e cicatrizada (Sivanesan, 1987). Os conídios são produzidos
em sucessão acropetal, formados na parte terminal e deslocados
lateralmente por elongação do conidióforo (Malone & Muskett, 1964);
são de cor marrom-oliva-escura, curvados e geralmente retos quando
cultivados artificialmente, fusóides a largamente elipsoidais, com
paredes espessas no centro e mais delgadas em direção aos ápices,
mais largos no centro, ápices arredondados e com cicatriz proeminente
na célula basal, lisos, 3 – 12 (geralmente 6 – 10) distoseptos e
dimensões de 40 – 134 m (geralmente 60 – 100) de comprimento e
15 – 30 m (geralmente 18 – 23) de largura na parte mais larga do
conídio (Ellis, 1971; Sivanesan, 1987). O tubo germinativo é do tipo
semi-axial e origina-se a partir de uma ou de ambas as células polares
do conídio (Muchovej et al., 1988; Barnett & Hunter, 1998).
Fase teleomórfica: Cochliobolus sativus
Apresenta ascoma unilocular, pseudotécios peritecióides,
pardo-escuros, globosos a elipsoidais, 340 – 470 m de altura e 370 –
530 m de largura; com bico ostiolar parabolóide a cilíndrico (90 –
150 × 80 – 110 m), presença de setas curtas na superfície superior;
pseudoparáfises filiformes, hialinas, septadas e ramificadas. Ascas
cilíndricas a cilíndrico-clavadas, curtamente pedunculadas, um a oito
ascósporos, vestígios bitunicados, retos a ligeiramente curvados,
arredondados no ápice, 110 – 225 × 32 – 45 m. Ascósporos hialinos,
filiformes ou flageliformes, pontiagudos ou mais finos nos extremos,
17
6 a 14 septos, estreitos nos septos (constrição), dispostos
apertadamente em espiral (helicoidalmente) dentro da asca, 16 – 360 ×
6 – 10 m, geralmente rodeados por uma cobertura musilaginosa fina
e hialina (Sivanesan, 1987; Hanlin, 1997).
A fase teleomórfica, C. sativus, raramente ocorre na
natureza, existindo somente dois relatos na literatura sobre a presença
de pseudotécios em tecidos vegetais de trigo na Zâmbia (Javaid &
Ashraf, 1977; Raemaekers, apud Maraite, 1998), onde a cultura se
desenvolve sob condições de estações chuvosas e úmidas.
2.3.4 Taxonomia
O fungo B. sorokiniana (fase assexuada, imperfeita ou
anamórfica) pertence à divisão Deuteromycota, classe Hyphomycetes,
ordem Moniliales, e à família Dematiaceae. A fase sexuada, perfeita
ou teleomórfica, C. sativus, pertence à divisão Ascomycota, classe
Loculoascomycetes, ordem Pleosporales, e à família Pleosporaceae
(Noyd, 2000).
Uma
outra
classificação
bastante
aceita
pelos
fitopatologistas é a proposta por Alexopoulos & Mims (1985) e
Menezes & Oliveira (1993). Esses autores classificam o gênero
Cochliobolus na família Pleosporaceae, ordem Pleosporales, subclasse
Loculoascomicetidae, classe Ascomycetes e divisão Amastigomycota.
Já o gênero Bipolaris é classificado dentro da família (família-forma)
Dematiaceae, ordem (ordem-forma) Moniliales, subclasse (subclasseforma) Hyphomycetidae, classe (classe-forma) Deuteromycetes,
subdivisão Deuteromycotina e divisão Amastigomycota.
18
2.4 Sintomatologia causada por Bipolaris sorokiniana na cevada
2.4.1 Podridão comum de raízes
Os sintomas manifestam-se como lesões pequenas, ovais e
de coloração marrom-escura, que, sob condições favoráveis, se
estendem por todo o sistema radicular e base do colmo, atingindo
vários centímetros acima da linha da coroa, podendo chegar à bainha
da primeira folha causando clorose. As lesões nas raízes podem
aumentar de tamanho e coalescer, necrosando parcial ou totalmente o
mesocótilo (coloração marrom a quase-preta). Quando o inóculo é
proveniente de sementes infectadas, os primeiros sintomas geralmente
ocorrem no mesocótilo e em raízes primárias, estendendo-se, após,
para as outras partes da raiz. O ataque da doença em estádios iniciais
de desenvolvimento das plântulas pode causar a sua morte, reduzindo
a densidade de plantas na lavoura (Diehl, 1980; Diehl, 1982; Piening,
1997).
Os sintomas secundários na parte aérea das plantas são
pouco visíveis, caracterizando-se principalmente pela redução do
vigor das plantas e pela conseqüente redução do seu tamanho, pelo
menor tamanho das espigas e pela morte de perfilhos. Lavouras
severamente infectadas são menos densas que as sadias em virtude da
morte de plântulas logo após o plantio e da morte dos perfilhos
secundários, resultando um menor número de espigas. As plantas
infectadas apresentam um aspeto de deficiência nutricional, menor
porte e colmos finos, com facilidade de se acamar (Diehl, 1980; Diehl,
1982).
19
2.4.2 Mancha marrom ou helmintosporiose
Os sintomas manifestam-se, primeiramente, nas plântulas
originadas de sementes infectadas. O fungo cresce a partir da semente
e coloniza o coleóptilo, no qual aparecem lesões castanho-escuras. Se
o micélio penetrar e se desenvolver no interior do coleóptilo, as
manchas poderão ser observadas sobre a plúmula (Wiese, 1977; Reis,
1988).
Em planta adulta, as manchas podem se desenvolver sobre
folhas, bainhas, nós (lesões castanhas) e, às vezes, nos entrenós. Os
sintomas, nas folhas, apresentam-se tipicamente na forma de pequenas
manchas foliares arredondadas a oblongas ou fusiformes, chegando a
medir até um pouco mais de 2 × 20 mm, de coloração marrom a
marrom-escura e presença de margens cloróticos. As manchas
geralmente estão restritas às nervuras das folhas, porém, em alguns
casos, podem continuar crescendo e coalescer, formando grandes
lesões que cobrem grandes áreas da folha. Alta infecção provoca a
senescência prematura das folhas. Manchas velhas apresentam,
geralmente, aparência de cor preto-olivácea no centro da lesão, que
corresponde à esporulação do fungo. Em plântulas, as lesões são
similares às encontradas em planta adulta, mas geralmente são mais
arredondadas. Em genótipos de cevada altamente suscetíveis, as
plântulas podem desenvolver manchas de até 2 × 10 mm, com grandes
halos amarelos (Reis & Forcelini, 1993; Steffenson, 1997).
Nas espigas, as espiguetas infectadas apresentam cor
palha, tornando-se pretas quando há frutificação do fungo.
Escurecimento parcial ou total dos grãos (ponta preta) também pode
ser visualizado no caso de infecções mais intensas (Mehta, 1978;
20
Zillinsky, 1984; Reis & Forcelini, 1993), o qual pode rodear o grão e
estender-se até a base da lema (Johnston, 1997).
2.5 Epidemiologia: ambiente e doença
Dentre os fatores ambientais que podem afetar as relações
patógeno-hospedeiro, a umidade e a temperatura são os mais
importantes (Reis et al., 1988). A umidade é o fator determinante e
essencial à ocorrência das doenças, ao passo que a temperatura age
como um catalisador, retardando ou acelerando o processo infeccioso
e de reprodução do patógeno (Reis et al., 1988).
O fungo B. sorokiniana requer entre 9 a 24 horas de
molhamento foliar para produzir infeção dos órgãos foliares (Couture
& Sutton, 1978a) e com um ótimo de 20 a 24 horas (Filippova &
Kashemirova, 1991). O desenvolvimento da doença é acelerado sob
condições de alta umidade relativa e precipitações pluviais freqüentes
(Zillinsky, 1984; Dehne & Oerke, 1985).
A velocidade do processo de germinação, de penetração e
de estabelecimento parasitário é função da temperatura, havendo um
requerimento térmico mínimo, um ótimo e um máximo. É assim que
B. sorokiniana requer temperaturas superiores a 18 oC (Couture &
Sutton, 1978a) para produzir infeção nos órgãos verdes; evolui mais
rapidamente com temperaturas acima de 20
C (Zillinsky, 1984;
Dehne & Oerke, 1985) e atinge o ótimo com 22 a 30 oC (Filippova &
Kashemirova, 1991 e Khanna & Shukla, 1981).
Clark & Dickson (1957) observaram crestamento de
plântulas e podridão radicular severa em uma faixa térmica de 8 a 28
o
C; em planta adulta, o desenvolvimento de lesões foliares é lento
21
quando as temperaturas são inferiores a 20 e 16 oC, acelerando-se com
24 oC e com um ótimo de 28 oC (máximo desenvolvimento de lesões
necróticas). De igual forma, Luz & Bergstrom (1986) observaram que
os períodos de incubação da helmintosporiose foram mais curtos em
temperaturas superiores a 18 oC, sendo que, entre 24 e 28 oC,
mostraram-se similares.
Por outro lado, Dehne & Oerke (1985) observaram que a
alta intensidade de luz favorece a formação de manchas nas folhas, ao
passo que, sob condições de incubação com baixa intensidade de luz,
os tecidos inoculados com C. sativus não sofrem necrose, mas, sim,
clorose e rápida senescência das folhas.
2.5.1 Esporulação e germinação
Segundo Andersen (1952) e Clark & Dickson (1958), a
temperatura ótima para a germinação de conídios, crescimento
micelial e esporulação de H. sativum encontra-se na faixa de 24 a 28
o
C. De igual forma, Patil et al. (1987) informam que o máximo ponto
de esporulação ocorre com 25 oC, sendo nula a 7 ou 45 oC. Já, para
Kararah et al. (1981), a temperatura ótima para o crescimento micelial
e germinação dos conídios seria de 25 oC, sendo que a esporulação
ocorre com temperaturas menores, em torno de 20 oC. Por outro lado,
Khan et al. (1992), utilizando como substrato o meio ágar-água,
observaram que a germinação dos esporos é mais rápida quando
incubados sob temperaturas de 15 e 20 oC (> 12 h) do que a 25 oC (>
16 h).
Estudos feitos por Couture & Sutton (1978b), sobre a
relação de fatores ambientais e a incidência de esporos de B.
sorokiniana no hospedeiro, demonstraram que a produção de esporos
22
está relacionada com a presença de água líquida na superfície das
folhas, alta umidade relativa do ambiente e temperaturas superiores a
15 oC.
2.6 Ciclo da doença
2.6.1 Fontes de inóculo
As principais fontes de inóculo de B. sorokiniana são
sementes infectadas (Shaner, 1981), restos culturais infectados
(Shaner, 1981), plantas voluntárias (Reis, 1982b), hospedeiros
secundários (Reis, 1982b; Reis et al., 1985a) e conídios dormentes
livres no solo (Chinn & Tinline, 1964), a partir das quais o fungo é
disseminado aos órgãos verdes da planta.
a. Sementes
A semente infectada por B. sorokiniana é uma das mais
importantes fontes de inóculo deste patógeno, constituindo fonte de
inóculo primário para podridões radiculares seminais, mesocótilos,
raízes secundárias ou coronais, coleóptilos (Reis, 1981; Reis, 1982a) e
para lesões nas primeiras folhas (Reis, 1988).
Levantamentos de sanidade de sementes de trigo e cevada
comercializadas no Brasil têm demonstrado a presença constante de B.
sorokiniana em percentual variável de infecção de acordo com os
anos, cultivares e locais e, em alguns casos, apresentando níveis de
infecção entre 90 e 100% (Goulart & Paiva, 1992; Goulart, 1996a;
Lima et al., 1999).
23
b. Resíduos culturais
Uma vez introduzido numa nova área através da semente,
o fungo parasitará a cultura para, posteriormente, após a colheita,
permanecer nutrindo-se dos restos culturais de cereais de inverno
suscetíveis (Reis & Baier, 1983; Reis & Santos, 1987), onde produzirá
abundante inóculo. Assim, constituirá a fonte de inóculo mais
abundante do patógeno na cultura recém-estabelecida, nas áreas onde
é praticada a monocultura e, sobretudo, sob plantio direto. Os restos
culturais de plantas voluntárias constituem também fonte importante
de inóculo (Reis, 1988).
Nos anos de 1983 e 1984, detectou-se a presença de
propágulos de B. sorokiniana em restos culturais de soja, que foram
relacionados com a presença de resíduos culturais infectados de trigo a
partir dos quais o fungo foi levado aos tecidos da soja, principalmente
pelo vento e/ou respingos de chuva, onde conseguiu se multiplicar
(Reis, 1984a; Reis et al., 1985a; Reis et al., 1985b). Outros relatos
sobre a presença de esporos de B. sorokiniana em restos culturais de
soja são feitos por Fernandez & Fernandes (1990) e Fernandez et al.
(1993), que também relatam a presença desses propágulos em restos
culturais do milho. Contudo, é importante salientar que a densidade de
inóculo e a capacidade de multiplicação de B. sorokiniana são maiores
nos restos culturais de gramíneas, principalmente de trigo e cevada, do
que nas espécies de folhas largas (Reis & Wünsche, 1984; Fernandez
& Fernandes, 1990).
c. Hospedeiros secundários
O fungo B. sorokiniana tem sido isolado de manchas
foliares e detectado em tecidos senescentes de algumas gramíneas
24
invasoras de verão (Reis, 1982a; Diehl, 1983). Provavelmente, de tais
resíduos, o inóculo do fungo, que não deve ser muito numeroso, possa
também ser levado às novas plântulas e ao solo (Reis, 1988).
d. Conídios dormentes no solo
Outra fonte de inóculo de B. sorokiniana é o solo
contendo
conídios
dormentes
de
forma
livre,
originados
principalmente dos restos culturais deixados na superfície do solo
(Chinn, 1976; Reis & Abrão, 1983; Reis, 1984b; Reis & Wünsche,
1984). Existem relatos que relacionam esse tipo de inóculo como a
principal causa da PCR (Chinn, 1976; Piening, 1997). Os esporos
sobre o solo podem ser disseminados às plântulas do novo plantio,
especialmente às bainhas e às folhas basais próximas ou que entram
em contato com o solo. A doença, posteriormente, desenvolve-se das
folhas basais às superiores. Para Reis (1988), os conídios dormentes
sob a fungistase do solo também podem ser uma importante fonte de
inóculo para as infestações de órgãos aéreos.
Um aspecto importante a salientar é a distribuição dos
conídios no perfil do solo. Segundo Duczek (1981) e Reis & Abrão
(1983), 90% dos propágulos viáveis foram encontrados nos primeiros
10 cm de profundidade e somente 1%, entre 20 e 30 cm (Duczek,
1981).
2.6.2 Disseminação
O
fungo
B.
sorokiniana
pode
ser
disseminado
passivamente por propágulos aderidos externamente, “infestando” a
superfície da semente, ou levados internamente, “infectando” os
tecidos da semente, através do micélio dormente no pericarpo, no
25
endosperma e/ou no embrião (Reis, 1987; Rashid et al., 1997), razão
pela qual é considerado o mais importante e eficiente veículo de
transmissão e disseminação passiva direta dos patógenos (Reis, 1988;
Machado, 1982). Através desse veículo, o patógeno é transportado a
longas distâncias, entre países, estados, regiões ou campos (Carmona
et al., 1999) e, conseqüentemente, introduzido em lavouras livres do
patógeno ou de raças mais virulentas ainda não existentes (Reis, 1988;
Tanaka & Machado, 1985).
Na lavoura, o principal agente de disseminação passiva
indireta é o vento (Reis, 1984a; Reis, 1988), porém, como os esporos
são relativamente pesados, o transporte ocorre a distâncias curtas, que
oscilam entre 50 e 200 m (Reis, 1994). Para Mehta (1993), a
disseminação de B. sorokiniana através do vento a distâncias
relativamente grandes é possível porque seus conídios são
normalmente secos. Em condições de ambiente úmido, os respingos
de chuva constituem-se em importantes agentes de disseminação, que,
juntamente com o vento, são os responsáveis pelo transporte dos
conídios das lesões iniciais para outras folhas, plantas e o solo. A água
de enxurradas e os implementos agrícolas podem também contribuir
para a disseminação do patógeno na superfície do solo da lavoura
(Reis, 1988).
2.6.3 Transmissão
Uma vez introduzido o patógeno numa determinada área,
imediatamente após o plantio a semente hidrata-se, dando início aos
processos de germinação e emergência das plântulas. Ao mesmo
tempo, o patógeno, que se encontrava no pericarpo, no embrião
(Rashid et al., 1997) e/ou no endosperma da semente (Reis, 1988;
26
Rashid et al., 1997), passa do estádio de dormência ao de crescimento
vegetativo, exteriorizando-se na superfície da cariopse (Reis, 1988;
Reis & Casa, 1998). O micélio atinge o coleóptilo, crescendo em sua
superfície até alcançar a extremidade localizada fora do solo. A
plúmula pode ser infectada pela penetração do micélio no coleóptilo.
Quando a plúmula é infectada, lesões características são observadas
em seu limbo, podendo ocorrer, às vezes, deformações ou anomalias
das plântulas emergidas oriundas de sementes infectadas (Reis, 1988;
Rashid et al., 1997; Rashid, 1998). Dessa forma, o patógeno é
introduzido e estabelecido numa nova área.
Na parte subterrânea, durante a germinação e emergência,
o micélio do fungo cresce na superfície da semente até atingir as
raízes seminais, que são colonizadas, e também o coleóptilo, no qual
produz lesões (Reis, 1981; Reis, 1982b). Quando o coleóptilo é
destacado, podem-se facilmente observar lesões no mesocótilo ou no
entrenó subcoronal. À medida que as plantas se desenvolvem e sob
condições de alta umidade e temperatura (18-30 oC, segundo Piening,
1997), a colonização prossegue, havendo infecção das coroas até
atingir as bainhas das folhas basais, as quais morrem prematuramente.
Na literatura, existem poucos relatos sobre a eficiência de
transmissão de B. sorokiniana das sementes aos órgãos foliares e/ou
radiculares da cevada, visto que todos se referem ao trigo (Tabela 1).
Nessa cultura, é possível observar a importância do patógeno como
fonte primária de inóculo no estabelecimento de focos de infecção
(Reis & Forcelini, 1993), que, sob condições ambientais favoráveis
(períodos críticos), poderão desencadear epidemias no início do
desenvolvimento do trigo.
27
Tabela 1. Eficiência de transmissão de Bipolaris sorokiniana de
sementes para órgãos radiculares e aéreos do trigo
Órgão
Coleóptilo
Eficiência (%)
71,5
87,8
83,0
66,0
65,0
Plúmula
Raízes seminais
Mesocótilo
A
61,0
66,0
20,1
9,2
38,0
32,9
68,7
simples
Autor (s)
Forcelini (1992)
Reis & Forcelini (1993)
Utiamada & Yorinori (1995)
Goulart (1996b)
Forcelini & Menten, citado por
Menten (1996)
Pessoa et al. (1991)
Toledo et al. (1996)
Forcelini (1992)
Reis & Forcelini (1993)
Toledo et al. (1996)
Reis & Forcelini (1993)
Forcelini (1992)
constatação
da
presença
de
um
microorganismo, mesmo que patogênico, em determinada semente
não é suficiente para garantir a passagem do patógeno para a plântula
proveniente da semente infectada (Menten & Bueno, 1987).
Entretanto, a associação patógeno-semente indica o potencial de
transmissão e conseqüente estabelecimento da doença por ocasião da
semeadura no campo. Segundo Neergaard (1983) e Agarwal &
Sinclair (1997), a transmissão de um patógeno pela semente pode ser
influenciada por uma série de fatores, como espécie cultivada
(resistência do cultivar), condições ambientais (umidade ambiental e
do solo, temperatura, vento, chuva e luz), inóculo (viabilidade,
localização na semente, tipo), práticas culturais (tipo de solo, pH,
densidade, profundidade e época de plantio, fertilização, etc.),
sobrevivência do inóculo, vigor da semente, microflora do solo e da
semente, e outros. Tais fatores podem reduzir ou incrementar
significativamente a passagem do patógeno para os órgãos foliares
e/ou radiculares da planta hospedeira, refletindo na epidemiologia da
28
doença. Entretanto, Menten & Bueno (1987) salientam que uma
plântula com sintomas proveniente de uma semente infectada
constitui-se apenas na fonte de inóculo responsável pelo início de uma
epidemia, que terá uma determinada taxa de desenvolvimento sob
condições de campo, causando certa quantidade de doença nas fases
críticas da cultura, com a conseqüente perda na quantidade e na
qualidade da produção.
Forcelini (1992), em estudos sobre a influência de alguns
desses fatores na transmissão de B. sorokiniana em sementes de trigo,
concluiu que a temperatura apresenta efeito marcante na passagem do
fungo para as raízes ou órgãos aéreos da planta; observou que a
transmissão ao coleóptilo foi mais acentuada entre 20 e 25 oC, ao
passo que, abaixo, a passagem foi maior ao sistema radicular. Outros
fatores estudados, tais como a profundidade de semeadura, o tempo de
armazenamento e a microflora do solo, tiveram pouca ou nenhuma
influência. Por outro lado, o autor salienta que a passagem do
patógeno da semente à plântula ocorreu a partir do inóculo presente no
interior da semente.
2.6.4 Germinação, penetração e colonização
O processo de infecção inicia-se com a germinação bipolar
do conídio, seguida pelo alongamento do tubo germinativo e pela
formação do apressório (Carmona et al., 1999). Segundo Bisen &
Channy (1983), a germinação do esporo é completada num período de
tempo de quatro horas, sob condições controladas de umidade, ao
passo que o apressório é formado após de oito horas, freqüentemente
acima da juntura das células epidérmicas. Para Khan et al. (1992), o
processo de germinação, emissão do tubo germinativo e penetração
29
pode levar mais tempo (> 36, > 48 e > 96 h, respectivamente),
dependendo da resistência genética do cultivar. Ao mesmo tempo, os
autores sugerem que, além da penetração direta via apressórios
(Mumfor, 1966), o fungo pode também utilizar as aberturas
estomáticas na penetração.
O fungo geralmente penetra nas células a partir do
apressório, mediante um fino tubo de penetração, o qual,
internamente, produz uma vesícula. A partir desta vesícula, formam-se
hifas secundárias que invadem o mesófilo intercelular (Larenz et al.,
1986; Piening, 1997). Segundo Bisen & Channy (1983), o citoplasma
da célula torna-se granular 24 horas após a patogênese. Durante a
colonização, o micélio invade as células extraindo nutrientes e
provocando a morte pela ação parasitária e pela produção de toxinas
(Carmona et al., 1999). Em conseqüência, sobre os órgãos infectados
observam-se os sintomas da doença.
2.6.5 Esporulação
O fungo B. sorokiniana é um patógeno necrotrófico, isto é,
utiliza-se de tecidos mortos como fonte de nutrientes e, por isso,
somente esporula em tais tecidos (Reis, 1987; Reis et al., 1988; Reis
& Casa, 1998; Reis et al., 1998).
Nesse sentido, a esporulação em órgãos aéreos é
inexistente nos estádios iniciais de desenvolvimento da cultura,
quando não ocorrem ainda tecidos necrosados. Porém, à medida que
surgem, devido à ação do patógeno, inicia-se a multiplicação do
fungo. Segundo Mehta (1981), a máxima produção de conídios
acontece 22 a 32 dias após a inoculação sob condições climáticas
favoráveis, sendo que, na fase de maturação, o inóculo no ar torna-se
30
abundante (Reis & Santos, 1985), o que leva a infecção das folhas
superiores, glumas e sementes em desenvolvimento (Reis, 1988). O
pico máximo de esporulação é atingido durante e após a colheita (Reis
& Santos, 1987); completado o ciclo da planta, o patógeno reencontra
novamente as sementes. As sementes infectadas, após a colheita, são
armazenadas, garantindo a sobrevivência segura do patógeno junto
aos órgãos do hospedeiro (Reis, 1988).
A esporulação continuará sobre os restos culturais,
declinando posteriormente em conseqüência da baixa habilidade de
competição saprofítica que apresenta B. sorokiniana no solo (Reis,
1988; Reis & Medeiros, 1995).
2.6.6 Sobrevivência
Os patógenos necrotróficos de culturas anuais, incluindo
B. sorokiniana, para garantir sua sobrevivência na ausência de tecido
suscetível do hospedeiro, desenvolveram várias estratégias de
sobrevivência.
a. Sementes
A associação patógeno-semente representa a maneira mais
evoluída e, portanto, o abrigo mais seguro e eficiente para garantir a
sobrevivência dos fitopatógenos (Reis, 1987; Reis & Casa, 1998). O
fungo B. sorokiniana sobrevive no período entressafras em sementes
infectadas armazenadas, onde permanece em estado de dormência
devido ao baixo conteúdo de água na semente (12 a 13%); durante
esse período, que dura aproximadamente seis meses, o patógeno perde
parcialmente sua viabilidade (Vechiato et al., 1987; Reis, 1988).
31
Estudos do efeito do armazenamento de sementes de trigo
sobre a viabilidade do inóculo (incidência) de B. sorokiniana
demonstraram que o armazenamento à temperatura ambiente (25 oC)
pode provocar uma redução significativa na viabilidade do inóculo do
fungo após o oitavo mês de armazenamento (Vechiato et al., 1987;
Forcelini, 1992); já, sob condições mais frias de armazenamento (5
o
C), a viabilidade do fungo pode se manter estável por mais de 27
meses (Vechiato et al., 1987), podendo diminuir significativamente a
partir do oitavo mês quando as sementes são armazenadas a 10 oC
(Forcelini, 1992). Em sementes de cevada, Christensen (1963)
observou queda na percentagem de infecção por B. sorokiniana em
sementes armazenadas à temperatura ambiente somente após de trinta
meses de armazenamento, sendo que, a partir de quatro anos, a queda
foi considerável.
Lutey & Christensen (1963) mostraram que a longevidade
de B. sorokiniana é altamente dependente das condições de umidade
da semente e da temperatura ambiente. Sementes de cevada
armazenadas com 14% de umidade a 20 e 30 oC sofreram uma queda
total da viabilidade do fungo em 24 e 16 semanas, respectivamente, ao
passo que, com 12% de umidade a 30 oC, o fungo sobreviveu por 53
semanas. Valores extremos de longevidade de B. sorokiniana na
semente, na forma de micélio dormente, são mencionados por
Machacek & Wallace (1952) e Russell (1958), com 9 e 15 anos,
respectivamente.
Além da aveia, centeio, cevada, trigo e triticale, B.
sorokiniana tem sido recuperado em sementes de outras espécies
graminícolas (Richardson, 1979). De igual forma, B. sorokiniana tem
sido recuperado de sementes de outras espécies não graminícolas de
32
importância agrícola, tais como beterraba, cenoura, soja, girassol,
alface, feijão, rabanete, etc. (Neergaard, 1983); outras espécies citadas
são Allium spp., (Richardson, 1979) e alfafa (ChunJie & ZhiBiao,
2000).
b. Restos culturais
O fungo B. sorokiniana é um parasita necrotrófico e,
portanto, esporula somente sobre tecidos mortos, isto é, sobre os
restos culturais infectados, onde ocorre abundante produção de
inóculo. Com o transcorrer do tempo, a esporulação declina em
conseqüência da baixa (Garrett apud Sussman, 1968) ou “parcial”
habilidade de competição saprofítica do fungo no solo (Ghurde,
1966). Referência é feita de que a colonização pelo fungo é mais bem
sucedida sobre tecidos verdes do hospedeiro que sobre tecidos
necrosados (Khatskevich & Benken, 1987).
A sobrevivência do fungo nos restos culturais é garantida
em lavouras onde é praticada a monocultura, especialmente em
semeadura direta, sistema no qual a totalidade dos resíduos permanece
na superfície do solo por mais tempo até a completa mineralização,
favorecendo a ocorrência e a intensidade deste parasita necrotrófico
(Kohli & Reis apud Reis et al., 1998). Segundo Khatskevich &
Benken (1987), a intensidade da esporulação de B. sorokiniana sobre
os restos culturais depende da temperatura, da umidade relativa, da
aeração e de fatores bióticos do solo.
Nas condições do Rio Grande do Sul, estudos sobre a
sobrevivência saprofítica de B. sorokiniana em restos culturais do
trigo mantidos na superfície do solo evidenciaram que a sua
esporulação acompanhou a curva de decomposição dos restos
33
culturais, mostrando a dependência nutricional do fungo do substrato.
A descomposição dos restos culturais completou-se em vinte meses,
ao passo que a presença de conídios do fungo no substrato foi
detectada até 17 meses após o início do experimento (Reis et al.,
1998). No Canadá, estudos com objetivos semelhantes, demonstraram
que o fungo pode sobreviver nos restos culturais de trigo e cevada por
até dois invernos consecutivos (Duczek et al., 1999). Na Austrália,
existem relatos de sobrevivência do fungo por um período de, pelo
menos, 24 meses (Buttler apud Whittle, 1977).
Por outro lado, B. sorokiniana tem a capacidade de
sobreviver sobre restos culturais de outras espécies vegetais de
importância econômica utilizadas em rotação de culturas com cereais
de inverno, tais como a soja (Reis et al., 1985a; Reis et al., 1985b;
Fernandez & Fernandes, 1990; Fernandez et al., 1993) e o milho
(Francis & Burgess, 1975; Fernandez et al., 1993), assim como em
resíduos culturais de linho e canola (Sturz & Bernier, 1987). Contudo,
segundo Sturz & Bernier (1987) e Fernandez et al. (1993), o tempo de
sobrevivência do fungo sobre os restos culturais de cereais de inverno
é maior que sobre os resíduos das outras espécies (< 14 meses).
c. Hospedeiros secundários
Além dos principais cereais de inverno cultivados (aveia,
centeio, cevada, trigo e triticale), dos quais B. sorokiniana tem sido
isolado de órgãos foliares e radiculares (Sivanesan, 1984; Reis, 1988),
o fungo pode ser também encontrado produzindo lesões em órgãos
radiculares e tecidos foliares senescentes de algumas gramíneas
forrageiras, invasoras e nativas onde os cereais de inverno são
cultivados (Reis 1982b; Diehl, 1983; Reis et al., 1985a).
34
Sampson & Watson (1985), Sivanesan (1987) e Smiley et
al. (1996) relacionam gêneros de gramíneas como hospedeiros
secundários de B. sorokiniana. O fungo também tem sido encontrado
parasitando tecidos foliares em outros cereais de importância
econômica, como o arroz (Kodama et al., 1979), o milho (Mensah &
Zwatz, 1975; Ivanovic & Pencic, 1987; Leonard et al., 1988) e o sorgo
(Frezzi, 1978).
O fungo B. sorokiniana não é um parasita exclusivo das
gramíneas, tendo a possibilidade de parasitar outras espécies não
graminícolas, como é o caso das dicotiledóneas, entre elas, a cenoura
(Nowicki, 1995), a salsa (Nowicki, 1997), o feijoeiro (Lacicowa &
Machowicz, 1974), a alfafa e espécies de trevo (Renfro apud Tinline,
1988).
Na Índia, um caso raro foi reportado pela primeira vez por
Kamanna e Ponnappa (1991), sobre o isolamento de B. sorokiniana de
manchas foliares em uma espécie de samambaia ou pteridófita
(Nephrolepis biserrata).
d. Conídios dormentes no solo
Os conídios no solo constituem-se nas principais
estruturas de sobrevivência de B. sorokiniana (Chinn & Tinline,
1964). A baixa habilidade de competição saprofítica impede sua
sobrevivência como micélio, colonizando saprofiticamente, com
sucesso, os restos culturais (Garrett apud Sussman, 1968; Reis, 1988).
A maioria dos esporos que caem no solo tornam-se dormentes devido
à micostase do solo (Chinn & Tinline, 1964; Old, 1967), fenômeno
que evita a germinação dos conídios na ausência do hospedeiro.
35
Experimentos
visando
estabelecer
a
duração
da
sobrevivência intrínseca de esporos de B. sorokiniana no solo
demonstraram que eles podem permanecer dormentes (viáveis) por até
37 meses nas condições do sul do Brasil (Reis, 1989). Chinn &
Ledingham (1958) observaram que o período de dormência pode ser
longo, chegando a superar os vinte meses; já, para Boosalis (1962), o
período é mais curto, oscilando entre 300 e 490 dias.
Duczek (1994), em estudos de laboratório, observou que
períodos secos no solo induzem à dormência em alguns conídios de B.
sorokiniana, concluindo que a dormência pode ser um mecanismo que
favorece o incremento do tempo de sobrevivência do fungo durante
períodos secos. Tal fenômeno já tinha sido reportado por Khatskevich
& Benken (1987) na Rússia, os quais observaram que a duração da
sobrevivência dos conídios no solo é determinada pela duração dos
períodos úmidos e secos que acontecem. Esses podem sobreviver por
mais de nove meses sob condições de solos com 18% de capacidade
de retenção de água, ou por um tempo menor quando o teor de água
no solo é de 88% (Chinn & Ledingham, 1958). Na China, Wu & Le
(1983) observaram que os conídios de B. sorokiniana permaneceram
viáveis por mais de 281 dias em solo seco e até 80 dias em solos
encharcados, razão pela qual, em regiões onde a seqüência de culturas
é trigo-arroz-arroz, os solos não apresentam infestação.
Em geral, a longevidade dos conídios dormentes no solo
depende de fatores ambientais (Old, 1967; Khatskevich & Benken,
1987), fatores edáficos (Old & Robertson, 1970; Durynina et al.,
1980; Fradkin & Patrick, 1985) e fatores bióticos inerentes ao solo
(Old, 1967; Anderson & Patrick, 1980; Chakraborty & Old, 1982;
36
Duczek, 1983; Fradkin & Patrick, 1985; Duczek & Wildermuth, 1991;
Pakzad & Schlosser, 1998).
e. Plantas voluntárias
As plantas de espécies cultivadas originadas de sementes
deixadas
na
lavoura
durante
a
colheita
e
que
vegetam
espontaneamente, sem o controle humano direto, recebem várias
denominações, como extemporâneas, guachas ou voluntárias (Reis,
1988).
As plantas de trigo voluntárias alcançam populações
variáveis, porém são mais numerosas em lavouras nas quais se
precede a semeadura direta da soja sobre a resteva de trigo, chegando,
algumas vezes, quase ao nível de plantas daninhas, o que requer a sua
eliminação mecânica ou química (Reis, 1988). Estas plantas
desempenham papel fundamental na biologia dos fitopatógenos do
trigo visto que, para os necrotróficos (ex. B. sorokiniana), constituemse numa opção a mais, porém preferencial, pois, na presença dessas
plantas e sob condições ambientais favoráveis, os necrotróficos não
precisam passar à fase saprofítica ou de esporos de descanso no solo.
A eliminação completa das plantas voluntárias priva os patógenos
necrotróficos do substrato alimentício e os expõe à competição
saprofítica, na qual, geralmente, levam desvantagem em virtude da
forte competição microbiana do solo (Reis, 1988).
f. Estruturas de resistência: clamidosporos
Os clamidosporos são esporos produzidos assexuadamente
como resultado de modificações estruturais de segmentos hifálicos
vegetativos ou de células conidiais, possuindo parede celular espessa,
37
constituída
principalmente
de
parede
celular
com
material
ressintetizado; sua função, a sobrevivência no solo (Reis, 1987).
Meronuck & Pepper (1968) reportaram a formação de
clamidosporos nas células internas de alguns conídios de B.
sorokiniana quando são depositados no solo. Observaram também que
essas estruturas têm a capacidade de germinar (emissão de tubo
germinativo) depois de alguns meses (três a cinco meses) de terem
permanecido no solo. Recentemente, Valim-Labres et al. (1998), em
condições de laboratório, relataram pela primeira vez a formação de
clamidosporos em hifas de B. sorokiniana, quando o fungo foi
cultivado em meios pouco nutritivos. Em ambas as situações, os
autores sugerem que a formação de clamidosporos poderia ser um
mecanismo de sobrevivência do fungo sob condições desfavoráveis ou
na ausência de um hospedeiro suscetível. Contudo, é importante
salientar que a formação de estruturas de resistência por B.
sorokiniana é, ainda, um fenômeno pouco esclarecido e, até hoje, não
reportado sob condições naturais.
2.8 Detecção de Bipolaris sorokiniana em sementes
Os testes de sanidade de sementes têm como fundamento
fazer com que os patógenos, uma vez associados a essas estruturas,
sejam direta ou indiretamente detectados, permitindo a sua
identificação rápida e segura (Machado, 1988). O objetivo central de
um teste de sanidade de sementes é informar os tipos, a freqüência e o
potencial de ocorrência de agentes fitopatogênicos em uma
determinada amostra de sementes. De maneira geral, os testes são de
extremo valor em inúmeras atividades dentro da proteção de plantas,
entre as quais se podem citar: quarentena, programas de certificação,
38
avaliações de eficiência de fungicidas, conveniência do tratamento de
sementes, etc. (Machado, 1988).
A análise patológica das sementes pode ser feita mediante:
a) métodos sem incubação, b) métodos com incubação (Lucca Filho,
1987; Machado, 1988; Henning, 1997), c) imunologia (Richardson,
1985) e d) técnicas moleculares (Carvalho et al., 2000). Por outro
lado, Ball & Reeves (1992) listam seis requerimentos principais para
um teste de sanidade de sementes: ser específico, sensível, rápido,
simples, econômico e confiável.
2.8.1 Métodos sem incubação
2.8.1.1 Detecção por observação direta (semente seca)
A observação direta é pouco útil quando se objetiva obter
informação quantitativa e resultados reproduzíveis sobre a incidência
existentes em um lote de sementes, assim como a viabilidade do
agente causal. Porém, é uma alternativa recomendável em
determinações preliminares para detectar lotes altamente infectados
(Richardson, 1985; Lucca Filho, 1987).
No caso de sementes com “ponta preta”, geralmente só as
mais infectadas mostram sinais de infecção (descoloração e/ou
manchas necróticas), podendo-se encontrar sementes sem sintomas,
mas com diferentes níveis de infecção e que não serão detectadas
(Richardson, 1985; Lucca Filho, 1987). Por outro lado, é válido
ressaltar também que, em algumas circunstâncias, determinados
fatores, incluindo outros microrganismos, podem causar sintomas
semelhantes, o que pode levar a subrestimar o verdadeiro nível de
infecção de um lote de sementes (Machado, 1988). A esse respeito,
39
Lucca Filho (1987) afirma que um complexo de fungos, entre eles
patógenos e saprófitas, é o responsável pelo dano conhecido por
“ponta preta”,
destacando espécies dos
gêneros
Curvularia,
Alternaria, Helminthosporium (Drechslera e Bipolaris) e Fusarium
como os agentes mais comuns.
Entretanto, os resultados obtidos nesse tipo de análise só
devem ser empregados como um indicador da presença de um
determinado patógeno, nunca como índice de sanidade (Richardson,
1985), visto que é necessária a condução de outros métodos mais
elaborados para a obtenção de dados precisos sobre o verdadeiro
estado sanitário da semente.
2.8.2 Métodos com incubação
2.8.2.1 Método do papel-filtro
O interesse por técnicas para a detecção de fungos
associados às sementes data de 1929, na Irlanda do Norte, onde foram
feitas investigações sobre o uso de fungicidas organo-mercuriais como
desinfectantes contra fungos presentes nas sementes de aveia (Malone
& Muskett, 1964).
Em 1938, Muskett desenvolveu o primeiro método de
detecção de fungos para Pyrenophora avenae Ito & Kurib., que
consistia na incubação de sementes de aveia à temperatura de 22 oC,
em placas de petri com papel-filtro umedecido, para posteriormente
examiná-las sob microscópio, mediante a identificação do fungo em
função da produção de conídios típicos (Malone & Muskett, 1964).
No mesmo ano, Doyer descreveu um método de papel absorvente
mediante o qual espécies patogênicas de Fusarium presentes sobre
40
sementes de cereais de inverno poderiam ser evidenciadas causando
descoloração nas radículas de plântulas. Mais tarde, em 1958, Tempe
demonstrou que B. sorokiniana também pode ocasionar descoloração
de raízes (Jørgensen, 1983).
Por muito tempo, a incubação de sementes em papel
umedecido teve como princípio básico estimular o patógeno a
produzir sintomas típicos na plântula por ocasião da germinação
(método tipicamente patogênico). Uma vez constatado que um grande
número de patógenos nem sempre é capaz de produzir sintomas na
fase inicial de desenvolvimento do hospedeiro, o método teve de
sofrer algumas modificações, de tal forma que a avaliação passou a se
basear sobretudo na presença de estruturas típicas do patógeno sobre
as sementes, sendo necessário o uso de microscópio estereoscópico
(Tempe, 1979; Neergaard, 1983).
Segundo Richardson (1985), as sementes podem ou não
ser previamente desinfestadas, dependendo do seu lugar de origem.
De modo geral, as sementes procedentes de regiões tropicais são
muito contaminadas, devendo, portanto, ser tratadas com uma solução
de hipoclorito de sódio (NaClO) antes da incubação.
Por outro lado, quando a germinação resulta desnecessária
e o desenvolvimento de plúmula e raízes pode inibir ou dificultar a
observação do patógeno, o método do papel-filtro pode sofrer algumas
variantes com a finalidade de evitar esse processo. Para isso, dispõe-se
dos recursos da aplicação de 2,4-D (em solução aquosa) e do
congelamento da semente (Neergaard, 1983; Richardson, 1985; Lucca
Filho, 1987). Desses, o método do congelamento, desenvolvido por
Limonard em 1966, é o mais amplamente usado nos testes de sanidade
(Neergaard, 1983; Richardson, 1985). Segundo Lucca Filho (1987), a
41
percentagem de infecção obtida com essa modificação é bastante
próxima à observada em meios de cultura. O autor salienta que a
técnica é bastante útil, especialmente para semente de cereais, pois,
além de facilitar a avaliação do teste, favorece o surgimento de certos
fungos, tais como Drechslera, Bipolaris, Fusarium, Septoria, Phoma
e outros.
Segundo Neergaard (1973) e Neergaard (1983), vários
fatores devem ser considerados nos testes de sanidade durante a
incubação das sementes, dos quais os mais importantes são o meio de
cultura ou substrato de crescimento, a temperatura, a umidade, a luz e
o período de incubação, além dos fatores bióticos, como a presença de
organismos antagonistas e sinergistas na microflora das sementes, que
podem influenciar significativamente na detecção de patógenos.
Em relação à umidade, Kolk & Karlberg (apud Neergaard,
1973) salientam a importância do volume de água disponível durante
o período de incubação, de modo a propiciar um ambiente favorável à
esporulação. Esses autores, mediante estudos de comparação com
diferentes volumes de água (15 a 35 mL) adicionados ao papel
absorvente (400 g/m2), demonstraram que a quantidade ótima varia
em função do fungo alvo do estudo, sendo que, para B. sorokiniana,
F. avenaceum e D. teres (todos em cevada), o ótimo foi de 25 mL por
disco de papel-filtro, acondicionados em placas de petri de 17 cm de
diâmetro e 4 cm de altura. Contrariamente, Limonard, em 1966,
observou que o excesso de umidade no substrato pode reduzir a
incidência de alguns patógenos, efeito inicialmente relacionado ao
antagonismo provocado por bactérias (Neergaard, 1973). Esse
inconveniente também foi reportado por Tempe (1970) em testes de
rotina no método de papel-filtro com congelamento, evidenciando
42
que, além das bactérias, os fungos contaminantes também interferem
na detecção de fungos patogênicos, não permitindo a frutificação e
dificultando a quantificação dos mesmos. Segundo Reis et al. (1999),
isso ocorre porque os organismos contaminantes crescem mais
rapidamente que os patogênicos.
Wilson & Murphy (1964) relatam que temperaturas
próximas a 25 oC são consideradas ótimas para o crescimento de B.
sorokiniana em meios de cultura, discordando de Tempe (1964), o
qual recomenda que, para a detecção do fungo em sementes de
cevada, a incubação deve ser feita a 20 oC. Por outro lado, segundo
Leach (1962), a esporulação máxima é obtida tanto em condições de
escuro como com luz próxima a ultravioleta (UV de 3200 a 4000 Ao),
ao
passo
que
o
processo
de
incubação
deve
ser
feito,
preferencialmente, em um ciclo alternado de 12 horas luz e 12 horas
de escuridão (Leach apud Tempe, 1970).
2.8.2.2 Detecção através de meios de cultura
O fundamento da incubação de sementes em meio ágar
enriquecido consiste no estímulo à formação de colônias típicas por
parte dos fungos a partir de sementes (Machado, 1988), empregando,
para sua identificação, características macroscópicas das colônias e,
em alguns casos, sem a necessidade de observações microscópicas
(Neergaard, 1983; Richardson, 1985).
Para Richardson (1985), o método de plaqueamento em
meios de cultura é, provavelmente, o mais confiável para a detecção
da maioria dos fungos transmitidos pela semente. Apesar de ser mais
custoso e demorado que o teste do papel-filtro, a rapidez com que se
pode avaliar uma amostra recompensa essa desvantagem.
43
O uso de substrato nutritivo exige cuidados de assepsia
uma vez que a preparação e a manipulação indevidas de meios
microbiológicos como BDA (extrato de batata + dextrose + ágar) e
MA (extrato de malta + ágar), que são apropriados para o cultivo de
um grande número de fungos, podem comprometer a validade do teste
pela interferência de contaminações indesejáveis (Neergaard, 1983;
Machado, 1988). O pré-tratamento ou desinfestação das sementes
antes do plaqueamento pode ser realizado para prevenir o profuso
desenvolvimento
de
saprófitas,
sendo,
em
alguns
casos,
necessariamente requerido (Neergaard, 1983). Segundo Machado
(1988), os resultados do pré-tratamento indicam uma associação mais
íntima dos patógenos com as sementes. O pré-tratamento das sementes
veio “melhorar” o método pioneiro de Ulster, usado rotineiramente em
testes de sanidade de sementes de linho (Muskett & Malone, 1941).
À semelhança do método do papel-filtro, quando a
germinação se faz desnecessária, podendo inibir ou dificultar a
observação do patógeno, o emprego de técnicas como o congelamento
da semente ou a utilização de 2,4-D em solução aquosa são também
recomendáveis (Neergaard, 1983; Lucca Filho, 1987).
Segundo Richardson (1985), quando a análise patológica
das sementes objetiva detectar a presença de patógenos específicos, o
emprego de meios seletivos ou semi-seletivos torna-se uma ferramenta
de extremo valor para o fitopatologista, pois evita o desenvolvimento
de
contaminantes,
favorecendo
eficientemente
a
detecção
e
identificação do patógeno-alvo. Os meios seletivos ou semi-seletivos
são obtidos a partir da adição de substâncias químicas específicas,
antibióticos ou fungicidas (Maude, 1996).
44
O desenvolvimento de diferentes meios seletivos ou semiseletivos para a detecção de conídios dormentes de B. sorokiniana no
solo (Stack, 1977; Kulkarni et al., 1978a; Kulkarni et al., 1978b;
Dodman & Reinke, 1982; Reis, 1983; Filippova & Kashemirova,
1990) tem aberto a possibilidade de serem utilizados na detecção do
fungo em análises rotineiras de patologia de sementes. Estudos
pioneiros de comparação entre meios recomendados (empregados
rotineiramente em testes de sanidade de sementes) e meios seletivos,
executados por Reis et al. em 1994 (Reis & Reis, 1994; Reis et al.,
1999), demonstraram que os meios seletivos [no caso, meio seletivo
de Reis (Reis, 1983)] se comportam estatisticamente igual ou mais
eficientemente que os métodos comumente usados na detecção de B.
sorokiniana em sementes de trigo.
2.8.3 Detecção através da análise de pigmentos
Algumas espécies de Bipolaris e de Drechslera produzem
pigmentos
no
ágar
ou
no
papel-filtro
denominados
de
“antraquinonas”, que variam de cor de acordo com o isolado e o
substrato utilizado (Ellis, 1971; Kulik, 1973; Sivanesan, 1987;
Brishammar, 1993; Engstrom et al., 1993). Em função da produção
desses metabolitos, Knudsen (1982) testou isolados monospóricos de
P. graminea e P. teres, tendo observado diferenças quanto à produção
de pigmentos, porém não conseguiu distinguir as duas espécies com
base nessas características. De modo semelhante, Brodal (apud
Lângaro, 1998) concluiu não ser possível distinguir entre os
pigmentos produzidos por D. graminea e os produzidos por D. teres.
45
2.8.4 Detecção por técnicas imunológicas
Os testes imunológicos constituem métodos práticos e
precisos de detecção e de diagnose de grande número de patógenos
vegetais, incluindo bactérias, fungos e vírus. Segundo van Wuurde et
al. (1983), muitos organismos patogênicos podem ser detectados
diretamente em extratos de sementes, por meio de microscopia
imunofluorescente (IF) e Elisa.
Estudos feitos por Guimarães et al. (1997), objetivando
verificar a eficácia do uso de extrato de sementes na imunodetecção
de B. sorokiniana em trigo e a viabilidade do mesmo como antígeno,
observaram grandes pontos de fluorescência na superfície das hifas,
especialmente nas extremidades, evidenciando a presença de
antígenos de superfície. Os autores concluíram que é possível a
detecção de B. sorokiniana em trigo por imunofluorescência,
utilizando como antígeno reagente o extrato de sementes.
Outros estudos inumológicos desenvolvidos recentemente
relatam a possibilidade de se usar as técnicas de DOT-Elisa (Lopes et
al., 1998) e DAS-Elisa (Lopes et al., 1999) na detecção de B.
sorokiniana em sementes de trigo, através do emprego de anti-soro
policlonal e anti-soro monoclonal, respectivamente. Os autores
salientam que a detecção do patógeno em extratos de sementes através
de DAS-Elisa foi mais sensível, tendo sido possível detectar níveis de
incidência de até 0,03%.
2.8.5 Detecção através de técnicas moleculares
Técnicas moleculares baseadas na análise de ácidos
nucléicos têm sido aplicadas em diversas áreas da micologia, o que
46
tem gerado grandes perspectivas para o desenvolvimento de métodos
rápidos, sensíveis e específicos nos diagnósticos de patógenos de
plantas, comumente transmitidos por sementes.
Segundo Carvalho et al. (2000), as isoenzimas e proteínas
foram os marcadores moleculares mais utilizados nos últimos anos.
Recentemente, com o advento cada vez mais rápido do conhecimento
científico, outras técnicas baseadas nas moléculas de DNA e RNA
foram disponibilizadas.
Estudos preliminares utilizando técnicas moleculares,
como o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e a PCR
(Polymerase Chain Reaction), têm permitido diferenciar isolados de
D. teres, D. graminea e B. sorokiniana (Peltonen et al., 1996), assim
como isolados de B. sorokiniana, procedentes de diferentes
hospedeiros (Bulat & Mironenko, 1993).
No Brasil, Santos et al. (1999), mediante a técnica de
PCR-RFLP
(Restriction
Fragment
Length
Polymorphism),
observaram similaridade genômica (“banda comum”) entre diferentes
isolados de B. sorokiniana, sugerindo que a “banda” obtida possa
servir como característica da espécie.
2.9 Controle de Bipolaris sorokiniana: tratamento de sementes
O conhecimento da eficiência de transmissão ou da
passagem dos patógenos das sementes aos órgão radiculares ou aéreos
leva à necessidade de controlá-los sob um novo enfoque: a erradicação
mediante tratamento direto a fim de reduzir o inóculo primário na
lavoura (Reis, 1987).
O sucesso do tratamento de sementes depende de
inúmeros fatores, dos quais o tipo e a localização do patógeno nas
47
sementes e o vigor dessas por ocasião do tratamento são de suma
importância (Machado, 1988). Nesse sentido, segundo Maude (1983),
através do micélio, alguns fungos podem penetrar profundamente nos
tecidos da semente, nas quais causam danos e reduzem a germinação,
tornando mais difícil o seu controle.
A eliminação ou a redução de inóculo em sementes pode
ser eficientemente alcançada através de métodos físicos, biológicos e
químicos.
2.9.1 Tratamento físico (termoterapia)
O princípio básico da termoterapia (uso controlado de
calor) fundamenta-se na sensibilidade diferencial entre patógeno e
hospedeiro em relação ao tipo e à intensidade de calor; neste caso,
quanto maior for a diferença entre a sensibilidade térmica do
hospedeiro e do patógeno, maiores serão as chances de sucesso da
termoterapia (Ghini & Bettiol, 1995).
Três modalidades de calor podem ser utilizadas no
tratamento de sementes: a) água quente; b) calor seco e c) vapor
arejado (Dhingra et al., 1980; Machado, 1988). Além dessas
modalidades, Menten (1996) menciona outras possibilidades de se
utilizar agentes físicos, como energia solar, microondas e ultra-som.
Na literatura, poucos trabalhos relatam a utilização da
termoterapia no controle de B. sorokiniana em sementes de cereais de
inverno. Em 1920, Atanasoff & Johson reportaram um bom controle
deste patógeno através da exposição das sementes (cevada) a
temperaturas de 100 oC e por períodos de 15 a 30 horas, sem uma
redução drástica da germinação (73 e 89%) (Couture & Sutton, 1980).
Em contraposição, Couture & Sutton (1980) observaram que a
48
termoterapia pode afetar significativamente a viabilidade da semente
quando o objetivo é erradicar o patógeno da semente. Esses autores
relatam que, quando as sementes são mantidas a 90 oC por espaço de
60 horas, o fungo é erradicado, porém há uma forte redução na
germinação, que pode chegar a até 68%. Para Winter et al. (1996) e
Winter et al. (1997), o controle de B. sorokiniana através da
termoterapia pode ser difícil ou parcialmente efetivo quando se intenta
evitar danos significativos à germinação das sementes.
Segundo Harman & Nash (apud Lângaro, 1998), o
tratamento de sementes com água quente apresenta desvantagens
porque a temperatura deve ser aumentada rapidamente; por isso,
somente quantidades pequenas de sementes podem ser tratadas ao
mesmo tempo, de forma que a germinação não seja afetada.
Métodos modernos de controle físico, como o uso de raios
laser, podem também ser utilizados no controle de B. sorokiniana, no
tratamento de sementes de cevada (Bel’skii & Mazulenko, 1985).
2.9.2 Tratamento biológico
Tratamento biológico é a incorporação artificial de agentes
de controle biológico às sementes. O seu princípio básico é a ação de
“controle biológico” exercida por determinados microrganismos, que
eliminam, impedem ou reduzem o desenvolvimento de patógenos
transportados
microrganismos
pela
semente
atuam
ou
basicamente
presentes
no
solo.
Esses
através
de
antagonismo,
hiperparasitismo e competição (Menten, 1996).
A técnica da utilização de antagonistas isolados da
filosfera, da rizosfera e da espermosfera de trigo tem se mostrado
promissora na inibição in vitro de patógenos economicamente
49
importantes dessa cultura (Luz, 1989; Alves et al., 1990; Luz, 1990a;
Luz, 1990b).
Em trabalhos pioneiros de microbiolização de sementes de
trigo desenvolvidos no Brasil por Luz (1989), foi possível observar
que, além do controle eficiente dos patógenos veiculados pela semente
(in vitro), outras vantagens em nível de casa-de-vegetação e de campo
foram
constatadas.
Entre
os
microrganismos
com
potencial
antagônico, Bacillus subtilis tem mostrado eficiência igual ou superior
ao tratamento in vitro com os mais eficientes fungicidas usados em
sementes de trigo infectadas por B. sorokiniana (Luz, 1989; Luz,
1994; Lazzaretti et al., 1994; Lazzaretti et al., 1995; Luz, 1998),
demonstrando que o tratamento biológico é promissor no controle
desse fungo.
Outros microrganismos potencialmente antagônicos a B.
sorokiniana na semente são: Rhodotorula sp., Sporobolomyces roseus,
Pseudomonas fluorescens, Bacillus sp. (Luz, 1994), Streptomyces
griseoviridis (Tahvonen et al., 1995), Trichoderma harzianum
(Vannacci & Pecchia, 1986; Fernandez, 1992) e Chaetomium
globosum (Vannacci & Pecchia, 1986).
Segundo Menten (1996), a grande vantagem deste método
é que, além de não ser poluente, pode contribuir para um controle
mais estável das doenças, já que organismos desejáveis estarão sendo
constantemente adicionados ao agroecossistema, alterando seu
equilíbrio em favor do homem e sem grande impacto no ambiente.
50
2.9.3 Tratamento químico
Entende-se por tratamento químico a aplicação de
fungicidas, antibióticos e nematicidas às sementes. É o método mais
comum de se tratar sementes, sendo de grande valor prático.
O príncipio do tratamento químico é bastante simples e
baseia-se na existência de produtos eficientes contra o(s) patógeno(s),
que apresentem baixa fitotoxicidade e sejam pouco tóxicos ao homem
e ao ambiente (Menten, 1996).
Segundo Picinini & Fernandes (1999), em cevada, o
tratamento químico de sementes visa, sobretudo, impedir a passagem
de fungos para o sistema radicular e para a parte aérea das plantas,
como B. sorokiniana e D. teres, evitando, com isso, a dispersão da
doença. É assim que, para Maude (1983), a eliminação completa ou a
erradicação do patógeno é difícil e, às vezes, nem sempre é necessária,
pois, em muitos casos, a redução do número de sementes infectadas
até um nível extremadamente baixo, ou abaixo do qual a doença não
cause perdas econômicas, já seria suficiente.
O controle de B. sorokiniana em sementes de cevada tem
sido bem sucedido, principalmente pelo tratamento com fungicidas
sistêmicos em detrimento dos protetores (Luz & Linhares, 1983). É
assim que trabalhos realizados por Luz & Vieira (1982) e Luz &
Linhares (1983) concluíram que os fungicidas mais eficientes no
controle de B. sorokiniana foram nuarimol e fenapanil, que
erradicaram o fungo das sementes, ao passo que o imazalil, a mistura
carbendazin + manebe e o triadimenol apresentaram efeito razoável no
controle do organismo. Por outro lado, os produtos com ação
protetora, por exemplo o tiram, embora sejam efetivos no controle do
fungo, matando os esporos superficiais e retardando o crescimento ou
51
erradicando o micélio (in vitro), às vezes não são efetivos quando este
se localiza internamente na semente (Luz & Linhares, 1983). No
entanto, para Maude (1983), o tratamento químico, sobretudo com
fungicidas protetores, é largamente utilizado no controle de patógenos
associados às sementes. Fungicidas protetores, como iprodiona (em
mistura com o carbendazim), mancozebe, manebe, captam e tiram, são
reportados na literatura como “efetivos” ou de “bom controle” (Lim &
Tamang, 1985; Benada, 1985), porém não como “erradicantes”.
Em experimentos de laboratório e campo, Lacicowa &
Pieta (1994b), usando fungicidas em mescla e individuais (sistêmicos
e protetores), observaram que triadimenol + imazalil e tebuconazole +
imazalil foram as combinações que apresentaram o melhor controle de
B. sorokiniana, resultados que corroboram os obtidos por Lacicowa et
al. (1993), principalmente no relacionado com triadimenol + imazalil
e triadimenol. É importante, contudo, salientar que em nenhum dos
trabalhos anteriormente citados foi possível erradicar o fungo da
semente.
Reis & Casa (1998) e Reis et al. (1999) afirmam que a
erradicação de patógenos em sementes é uma tarefa difícil, pois, para
que o tratamento seja efetivo, o fungicida deve ser capaz de eliminar a
infecção interna da semente sem injuriar os seus tecidos e,
adversamente, afetar a germinação. Os autores acrescentam que a
sutura longitudinal da semente de trigo, centeio e cevada é um
empecilho físico-morfológico à ação fungicida erradicante da maioria
dos produtos.
Recentes
Fernandes
trabalhos
desenvolvidos
(1999), sob condições
por
de laboratório
Picinini
(in
&
vitro),
demonstraram que os fungicidas difenoconazole, difenoconazole +
52
iprodiona e triadimenol + iprodiona foram eficientes em reduzir ou
erradicar o fungo B. sorokiniana de sementes de cevada (96 a 100%
de controle), ao passo que o fungicida triadimenol mostrou um
comportamento variável na sua eficiência, oscilando entre 40 e 80%.
2.9.3.1 Uso de solventes orgânicos como veículo de
fungicidas
Uns dos avanços no tratamento químico de sementes
refere-se às possibilidades de se utilizar solventes orgânicos para tratar
a semente, aumentando a penetração do fungicida (tanto sistêmico
como protetor) e diminuindo os problemas devidos à cobertura
inadequada da semente (Menten, 1996).
O tratamento de sementes com solventes orgânicos tem
sido recomendado para sementes de oleaginosas (Dhingra &
Muchovej, 1980; Dhingra & Muchovej, 1982; Muchovej, 1987;
Muchovej & Dhingra, 1979; Muchovej & Dhingra, 1980), como
também para sementes de hortaliças (Muchovej et al., 1980).
Segundo Dhingra & Acuña (1997), o uso de solventes
orgânicos apresenta várias vantagens sobre os métodos convencionais:
as sementes permanecem secas, não necessitando de nova secagem;
por não serem aquosos, os solventes não estimulam o processo da
germinação; evitam a imbibição e o aumento de volume das sementes,
e, o mais importante, favorecem a penetração do fungicida na
semente, o que evita a remoção por manipulação e a sua diluição em
solos muito úmidos. Como desvantagens, os autores citam o custo
elevado dos solventes e a toxicidade dos mesmos. Hepperley &
Sinclair (1977) usaram solução aquosa de polietileno glicol (PEG –
6000) para introduzir antibióticos nas sementes de soja, cuja grande
53
vantagem é não ser tóxico nem inflamável.
Outros solventes
orgânicos reportados na literatura para o tratamento de sementes são
acetona,
benzeno,
tetracloreto
de
carbono,
clorofórmio,
diclorometano, etanol (Ellis et al. apud Muchovej & Dhingra, 1979;
Dhingra & Maffia, 1978; Muchovej & Dhingra, 1979; Muchovej &
Dhingra, 1980; Dhingra & Muchovej, 1980). Porém, segundo Menten
(1996), as substâncias mais promissoras
são diclorometano,
clorofórmio e tetracloreto de carbono, acetona, benzeno e etanol não
são eficientes.
O controle de fungos de sementes de cereais através do
uso de fungicidas veiculados por solventes orgânicos tem sido pouco
ou escassamente investigado no mundo. Vidhyasekaran (1980), em
trabalhos de controle químico de Drechslera oryzae (Breda de Haan)
Subram. & Jain. em sementes de arroz, chegou a concluir que o
fungicida guazatina misturado com diclorometano erradicou o
patógeno de todas as partes da semente quando essas foram imersas na
mistura pelo espaço de uma hora.
No Brasil, Purchio & Muchovej (1990) relataram que a
viabilidade de sementes de trigo sadias não foi reduzida quando
tratadas por 1,5 horas ou menos em acetona, benzeno, diclorometano
ou tetracloreto de carbono. Quando sementes infectadas foram
tratadas com captam, triadimenol, benomil, ou tiofanato metílico, com
ou sem solventes, todos os fungicidas permitiram algum controle,
exceto quando tratados em combinação com etanol, o qual reduziu
severamente a germinação. As misturas captam + benzeno e
triadimenol + acetona reduziram significativamente a percentagem de
B. sorokiniana sem terem efeito negativo sobre a germinação. Neste
54
trabalho, contudo, nenhuma das combinações (fungicida + solvente)
logrou erradicar o fungo alvo de controle.
55
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CAPÍTULO II
EFEITO DO SUBSTRATO NA MORFOLOGIA DE CONÍDIOS
DE Bipolaris sorokiniana E DA DENSIDADE DE INÓCULO NA
INTENSIDADE DA MANCHA MARROM EM CEVADA
Javier Toledo Barba, Erlei Melo Reis & Carlos A. Forcelini
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária
Universidade de Passo Fundo
C. P. 611, 99001-970 Passo Fundo, RS
RESUMO
________________________________________________________
TOLEDO, J.; REIS, E.M. & FORCELINI, C.A. Efeito do substrato na
morfologia de conídios de Bipolaris sorokiniana e da densidade de
inóculo na intensidade da mancha marrom em cevada.
O fungo Bipolaris sorokiniana causa a mancha marrom da
cevada, doença foliar amplamente distribuída no mundo. A sua
identificação ou diferenciação de outras espécies baseia-se
principalmente na variação morfológica dos esporos. Porém, muitos
fatores podem alterar o tamanho e a septação dos conídios dentro da
espécie. O presente trabalho objetivou estudar o efeito de diferentes
substratos no tamanho, septação e morfologia de conídios de B.
sorokiniana, assim como o efeito da densidade de inóculo na
intensidade da mancha marrom em plantas de cevada. Os substratos
81
constaram de seis meios de cultura diferentes, de sementes e folhas
verdes de cevada, trigo, centeio e triticale. O tipo de substrato afetou
significativamente o comprimento, a largura e o número de
pseudoseptos de B. sorokiniana. Os esporos desenvolvidos em meios
de cultura (68,2 × 21,9 m; 5,7 pseudoseptos) e em sementes
sementes (78,3 × 20,4 m e 7,2 pseudoseptos) foram mais curtos,
largos e com menor número de pseudoseptos, além de serem mais
escuros e retos, com relação aos recuperados de tecidos verdes(92,9 ×
18,2 m e 7,7 pseudoseptos). O efeito da densidade de inóculo foi
testado através da aplicação de suspensões de esporos contendo 2.500,
5.000, 10.000, 15.000 e 20.000 conídios/mL a plantas de cevada do
cultivar BR-2. A relação com a intensidade da mancha marrom seguiu
uma tendência polinomial quadrática, na qual os pontos máximos
corresponderam a 183 manchas/folha (16.500 esporos/mL) e 79% de
severidade (14.000 esporos/mL). Finalmente, estimou-se que 50 a 90
esporos foram necessários para produzir uma lesão.
Palavras-chave: Hordeum vulgare, concentração de esporos,
nutrição.
ABSTRACT
________________________________________________________
TOLEDO, J.; REIS, E.M. & FORCELINI, C.A. Effect of growing
substrates on the morphology of Bipolaris sorokiniana conidia and the
relationship of inoculum density to disease intensity for brown spot of
barley.
The fungus Bipolaris sorokiniana causes the brown spot, a
barley disease worldwide. The fungus identification is based mainly
on the morphology of its conidia, which may have their size and
septation altered by many factors. In this research, the effect of
growing substrates on the size, septation, and morphology of conidia,
as well as the relationship of inoculum density to disease intensity
were studied. The varius substrates included six culture media, seeds,
and fresh leaves of barley, wheat, rye, and triticale. In addition to
their less dark color and higher number of septa (7.7), conidia formed
on fresh tissues were longer and narrower (92.9 × 18.2 m) than those
found on seeds (78.3 × 20.4 m; 7.2 pseudosepta) or in culture media
(68.2 × 21.9 m; 5.7 pseudosepta). The effect of inoculum density
82
(ID) on disease intensity (DI) was tested by applying spore
suspensions (2,500, 5,000, 10,000, 15,000, and 20,000 conidia/mL) to
plants of the barley cultivar BR-2. The ID/DI relationship was
represented by a quadratic model equation, in which the maximum
values of 183 lesion/leaf and 79 % disease severity were obtained with
16,500 and 14,000 conidia/mL, respectively. The number of conidia
required for one leaf lesion was estimated in 50 to 90.
Key words: Hordeum vulgare, inoculum density, nutrition.
INTRODUÇÃO
A mancha marrom, mancha foliar ou helmintosporiose da
cevada, causada pelo fungo Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem.
[sinônimos: Helminthosporium sativum Pammel, King & Bakke;
Drechslera sorokiniana (Sacc.) Subram. & Jain, H. californicum
Mackie & Paxton e H. sorokinianum Saccardo in Sorokin], anamorfo
de Cochliobolus sativus (Ito & Kurib.) Drechs. ex Dastur, é uma
doença amplamente distribuída no mundo, sendo encontrada em todas
as regiões onde o cereal é cultivado (Sivanesan, 1987; Steffenson,
1997).
Segundo Lutrell (1955), uma das causas pelas quais o
fungo B. sorokiniana apresentou diferentes denominações ou
sinônimos durante os primeiros 25 anos após a sua primeira descrição,
em 1890, foi principalmente por causa das variações morfológicas dos
conídios, originados de diferentes regiões geográficas e substratos.
Estudos feitos por Dosdall (1923) revelaram que os conídios de B.
sorokiniana apresentam variações morfológicas no tamanho e forma
quando são produzidos em diferentes substratos, observações também
83
relatadas por Ellis (1971) e Sivanesan (1987). Em geral, o fungo
caracteriza-se por apresentar grande variabilidade, tanto morfológica
quanto fisiológica (Tinline, 1988; Matsumura, citado por Oliveira et
al., 1998). Nesse sentido, Ruppel (1974) indica que a identificação ou
diferenciação de espécies da maioria dos fungos baseia-se sobretudo
na variação do tamanho das estruturas que eles produzem. Porém,
muitos fatores podem alterar o tamanho dos conídios dentro da mesma
espécie, dos quais os mais comuns são o meio de cultura sobre o qual
o fungo é cultivado, a idade da cultura e a temperatura.
Durante o processo de identificação de uma doença, a
inoculação artificial é efetuada como parte dos postulados de Koch.
Segundo FAO (1985), a inoculação pode ser utilizada em diversos
estudos fitopatológicos, dependendo do objetivo do trabalho.
Em
alguns casos, é necessário determinar a densidade, ou concentração
ideal, e o potencial do inóculo (Baker apud FAO, 1985), isso com a
finalidade de conseguir resultados satisfatórios e reproduzíveis
(padronização), assim como para conhecer aspectos biológicos do
patógeno e epidemiológicos da doença (Fernandes et al., 1991).
Nesse sentido, o presente trabalho objetivou estudar o
efeito de diferentes substratos no tamanho e morfologia de conídios do
fungo B. sorokiniana, bem como o efeito da densidade de inóculo na
intensidade da mancha marrom em plântulas de cevada.
MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi conduzido na Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo –
RS no período de setembro/1999 a fevereiro/2000.
84
Substratos vs. morfologia de conídios
Substratos. Conídios de B. sorokiniana foram obtidos de
três diferentes tipos de substratos: a) meios de cultura: batatadextrosa-ágar (BDA), V-8 ágar (V-8), ágar-água (AA), extrato de
tomate-ágar (ETA), papel-filtro (PF) e meio seletivo de Reis (MSR);
b) sementes: cevada (SCv), trigo (STg), centeio (SCt) e triticale (STt),
e c) folhas: cevada (FCv), trigo (FTg), centeio (FCt) e triticale (FTt).
Para o desenvolvimento do fungo, as sementes foram acondicionadas
em placas de petri com três discos de papel filtro umedecido (3,5 mL
de água destilada esterilizada/disco), utilizando-se dez sementes com
sintomas de ponta preta, incubadas por um período de sete dias. No
caso dos conídios provenientes de tecidos verdes, folhas com sintomas
avançados (lesões velhas com aparente esporulação natural) de
mancha marrom ou helmintosporiose, das espécies especificadas,
foram coletadas diretamente no campo.
Mensuração dos conídios. Foi realizada a partir de
suspensão de esporos do fungo em água destilada esterilizada (2 mL),
da qual se pipetou uma amostra de 30
L sobre lâmina de
microscopia. A medição foi feita em microscópio ótico, com régua
graduada acoplada, na magnitude de 40×.
Características avaliadas e análise estatística. Foram
determinados o comprimento, a largura (região mais larga do conídio)
e o número de pseudoseptos de 25 conídios, aleatoriamente, em cada
uma das quatro repetições (total de cem conídios). Posteriormente, o
comprimento e a largura foram transformados em função da equação:
y = 2,5 (x), para se obter os valores reais das características medidas.
O delineamento experimental foi completamente casualizado. As
variáveis comprimento, largura e número de pseudoseptos foram
85
submetidas à análise de variância (P < 0,05), comparando-se as
médias pelo teste de Scott & Knott (5%) e contrastes ortogonais (5%).
Previamente à análise de variância, os valores foram submetidos ao
teste de Kolmogorov & Smirnov para testar a sua normalidade.
Densidade de inóculo vs. intensidade de doença
Cultivo das plantas. Sementes de cevada do cultivar BR 2
foram distribuídas em vinte vasos de plástico (cinco sementes por
vaso), correspondentes a quatro repetições por densidade de inóculo,
com capacidade de 1 a 2 kg de substrato, contendo solo de horta
peneirado e pH corrigido a 6. O solo foi umedecido com água + adubo
para fertirrigação (Niphokan 1 mL/L de água). A semeadura foi feita a
2 cm de profundidade. Cinco dias após a emergência, as plântulas
foram raleadas, deixando-se cinco por vaso. Os vasos permaneceram
em casa-de-vegetação por quinze dias, sendo, então, transferidos para
uma câmara climatizada (20
1 oC e fotoperíodo de 12 horas) por
mais 12 dias. No estádio de 2 – 3 folhas verdadeiras (além da
plúmula), as plantas foram inoculadas com B. sorokiniana.
Obtenção do inóculo. O inóculo foi obtido a partir de
colônias monospóricas com 14 dias, desenvolvidas em meio de batatasacarose-ágar + antibiótico (BSA + A). O fungo B. sorokiniana foi
isolado de sementes de cevada (cultivar BR–2) naturalmente
infectadas, as quais foram desinfestadas em solução aquosa de
hipoclorito de sódio a 0,5%, durante cinco minutos, e após
enxaguadas com água destilada esterilizada. Dez sementes foram
dispostas em cada placa de petri contendo meio seletivo de Reis (Reis,
1983), em um total de cinco placas. A seguir, as placas foram
incubadas em sala de crescimento com fotoperíodo de 12 horas e
86
temperatura de 25
sementes
foram
2 oC, durante sete dias. Após a incubação, as
examinadas
sob
microscópio
estereoscópico
(magnitude de 50×) quanto à formação de conídios de B. sorokiniana.
Com a ajuda de uma agulha histológica flambada (esterilizada),
micélio e conídios (na superfície da cariopse) foram transferidos para
uma placa de petri contendo meio ágar-água e distribuí em sua
superfície. Conídios individuais foram, então, transferidos para o meio
de cultura definitivo (BSA), sendo um esporo por placa e cinco
repetições. A incubação ocorreu por dez dias, nas mesmas condições
descritas anteriormente.
Após a incubação, procedeu-se à escolha de uma das
colônias desenvolvidas (com características representativas do fungo),
com a qual se trabalhou no transcurso do experimento. Decorridos dez
dias, pequenas porções da colônia foram transferidas para tubos de
ensaio contendo BSA, incubadas nas mesmas condições durante sete
dias e armazenadas em refrigerador (10
1 oC). Outra parte da cultura
pura foi colocada em placas de petri com BSA e incubada nas mesmas
condições durante sete dias para o aumento de inóculo.
Preparo da suspensão de inóculo: A partir das culturas
produzidas, preparou-se uma suspensão de esporos em água estéril +
tween 20 (2 gotas/L), cuja densidade de inóculo foi determinada
contando-se o número de esporos contidos em uma gota de volume
conhecido por varredura ao microscópio (lamínula de 24 × 32 mm). A
concentração final foi ajustada para 2 × 104 conídios/mL, conforme
utilizado por Frank & Christ (1988). A partir dessa concentração, e
por diluição, obtiveram-se concentrações de 1,5 × 104, 1 × 104, 5 × 103
e 2,5 × 103. As diferentes suspensões foram armazenadas por algumas
87
horas (2 – 8 horas) em refrigerador (10
1 oC), prévio à inoculação,
para evitar a germinação dos esporos.
Inoculação e incubação das plantas. Plantas com 27 dias
de idade foram inoculadas com as cinco concentrações de inóculo
(descritas no parágrafo anterior). Para isso, preparou-se um volume de
300 mL de suspensão de conídios em água para cada uma das
concentrações. O volume final utilizado variou de 200 a 230 mL por
tratamento (cinco repetições ou vasos com 4 – 5 plantas), sendo
aplicado através de um atomizador manual comum (plástico). Plantas
de cinco vasos foram inoculadas com água destilada estéril como
testemunha. A inoculação foi iniciada com a testemunha e, na
seqüência, da menor para a maior concentração (2 × 104).
As plantas inoculadas foram protegidas com câmaras
plásticas (armações de madeira cobertas com plástico transparente)
previamente atomizadas com água nas suas paredes internas, para
assegurar alta percentagem de umidade relativa (aproximadamente >
95%) e manter o molhamento foliar das plantas. O solo dos vasos foi
umedecido pela adição de 500 mL de água nas bandejas. As câmaras
plásticas foram vedadas com fita adesiva. As plantas foram mantidas
nessas condições por 48 horas, à temperatura de 25
1 oC. Após da
remoção da proteção, as plantas foram mantidas na câmara
climatizada até a manifestação dos sintomas da doença.
Características avaliadas e análise estatística. Quando do
aparecimento dos sintomas e antes das manchas coalescerem (lesões
de 0,2 a 0,5 mm), procedeu-se à contagem do número de lesões por
folha (4 dias após da inoculação) e à avaliação da severidade por folha
ou percentagem da área foliar afetada (% AFA) (7 dias após da
inoculação). As avaliações foram feitas na primeira e segunda folhas
88
desenvolvidas após a plúmula. O delineamento experimental
empregado foi completamente casualizado. Os valores obtidos foram
submetidos à análise de distribuição normal, análise de variância e à
regressão polinomial.
RESULTADOS
Substratos vs. morfologia de conídios. As características
conidiais de B. sorokiniana, relativas ao comprimento, largura e
número de pseudoseptos, além de outros aspectos importantes não
mensuráveis, como a forma e a coloração dos conídios, foram afetadas
significativamente pelos diferentes substratos utilizados.
Na Tabela 1, pode-se observar que, entre os meios de
cultura utilizados, os conídios desenvolvidos no MSR apresentaram os
maiores valores médios de comprimento (76,6 m), enquanto que os
esporos mais largos foram encontrados nos meios BDA, PF, AA e
MSR (22,1 a 22,8
m), característica que evidenciou a menor
variabilidade entre os meios de cultura.
Em relação ao número de pseudoseptos, o meio ETA
evidenciou o valor mais alto (6,8). Em relação aos conídios
desenvolvidos em sementes, os provenientes de SCt e STg foram os
mais compridos (82,6 e 81,3 m), ao passo que os desenvolvidos em
SCv e SCt, os mais largos (21,6 e 21,8 m, respectivamente). O maior
número de pseudoseptos foi encontrado nos conídios recuperados de
STg (7,7).
Quanto aos conídios desenvolvidos em folhas verdes, as
diferenças estatísticas são menores, principalmente quando se referem
a comprimento (92,8 – 95,7
m), no qual apenas os conídios
89
provenientes de FTt apresentaram o menor valor médio (88,5
m),
estatisticamente diferente aos demais. Os conídios mais largos foram
os desenvolvidos em FCt (19,5 m), sendo que os provenientes das
folhas dos outros cereais, foram mais uniformes. O maior número de
pseudoseptos ocorreu nos conídios recuperados de FCt (8,2) e FCv
(8,0).
Tabela 1. Comprimento, largura e número de pseudoseptos de
conídios de Bipolaris sorokiniana desenvolvidos em
diferentes substratos
Substrato1
Meios de cultura
BDA2
V-82
AA2
ETA2
PF
MSR
Sementes
SCv
STg
SCt
STt
Folhas
FCv
FTg
FCt
FTt
Média
Comprimento
( m)
Largura
( m)
Número de
pseudoseptos
65,28 f 3
59,98 g
65,93 f
70,10 e
71,08 e
76,60 d
22,78 a
21,03 b
22,33 a
20,73 b
22,53 a
22,15 a
4,83 d
5,30 d
5,83 c
6,80 b
5,93 c
5,73 c
73,95 d
81,30 c
82,63 c
75,65 d
21,65 b
19,33 c
20,83 b
19,85 c
6,40 c
7,75 a
7,40 b
7,25 b
94,70 a
92,78 a
95,73 a
88,53 b
78,16
17,75 d
17,70 d
19,48 c
18,05 d
20,44
8,03 a
7,18 b
8,25 a
7,45 b
6,72
13,51
0,45
0,17
QME
39,19 **
28,43 **
26,49 **
FC
4,70
3,27
6,15
C.V. (%)
5,25
0,95
0,59
D.M.S. (5%)
(1) Meios de cultura: batata-dextrosa-ágar (BDA), V-8 ágar (V-8), ágar-água (AA),
extrato de tomate ágar (ETA), papel-filtro (PF) e meio seletivo de Reis (MSR).
Sementes: cevada (SCv), trigo (STg), centeio (SCt) e triticale (STt).
Folhas: cevada (FCv), trigo (FTg), centeio (FCt) e triticale (FTt).
(2) Meios de cultura + 0,2 g de estreptomicina por litro de água
(3) Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si pelo teste de
Scott & Knott (5%)
90
Na Tabela 2, apresentam-se os valores extremos de
comprimento, de largura e do número de pseudoseptos encontrados
em conídios de B. sorokiniana recuperados de diferentes substratos,
na qual é possível observar que os valores máximos oscilaram entre
88 e 128 m de comprimento, 21 a 33 m de largura e um número de
8 a 12 pseudoseptos; os valores mínimos tiveram uma variação de 25
a 71 m no comprimento, 14 a 18 m na largura e 1 a 5 pseudoseptos.
Por outro lado é possível notar que os conídios desenvolvidos sobre
folhas verdes, independentemente da espécie de cereal de onde foram
recuperados,
apresentaram
os
maiores
valores
extremos
de
comprimento (máximo e mínimo), sendo marcadamente superiores
aos demais.
Em função da diferença acentuada no comprimento dos
conídios produzidos em folhas verdes, realizaram-se comparações
através de contrastes ortogonais, com a finalidade de estabelecer
diferenças estatísticas gerais nas características avaliadas entre os
esporos desenvolvidos nos três tipos de substratos (Tabela 2). O
resultado da análise de contrastes ortogonais dos valores médios,
evidenciou uma marcada diferença significativa em tamanho
(comprimento e largura) e número de pseudoseptos, entre os conídios
desenvolvidos em meios de cultura, sementes e tecidos verdes
(folhas).
Em geral, é possível deduzir que os esporos desenvolvidos
em folhas verdes foram estatisticamente os mais compridos e, ao
mesmo tempo, os mais estreitos (92,9 × 18,2 m), situação oposta à
que ocorreu com os conídios desenvolvidos em meios de cultura (68,2
91
× 21,9 m). Por outro lado, os esporos desenvolvidos sobre sementes
ocuparam uma posição intermediária (78,3 × 20,4 m).
Tabela 2. Valores extremos de comprimento × largura (em m) e
número de pseudoseptos encontrados em conídios de
Bipolaris sorokiniana desenvolvidos em diferentes
substratos
Substrato1
Valores
Máximos
Valores
Mínimos
Valores
Médios
100 × 28 (8)
88 × 25 (8)
95 × 28 (8)
91 × 25 (9)
98 × 30 (10)
108 × 33 (9)
96,7 × 28,2 (8,7)
29 × 15 (1)
25 × 14 (1)
28 × 15 (1)
38 × 14 (2)
35 × 15 (2)
35 × 18 (1)
31,7 × 15,2 (1,3)
65,3 × 22,8 (4,8)
60,0 × 21,0 (5,3)
65,9 × 22,3 (5,8)
70,1 × 20,7 (6,8)
71,1 × 22,5 (5,9)
76,6 × 22,1 (5,7)
68,2 × 21,9 (5,7)
100 × 31 (11)
38 × 18 (1)
106 × 23 (11)
43 × 15 (4)
120 × 28 (12)
33 × 15 (2)
108 × 23 (11)
39 × 15 (4)
108,5 × 26,2 (11,2) 38,2 × 15,8 (2,8)
73,9 × 21,6 (6,4)
81,3 × 19,3 (7,7)
82,6 × 20,8 (7,4)
75,6 × 19,8 (7,2)
78,3 × 20,4 (7,2)
125 × 20 (11)
66 × 15 (4)
123 × 21 (11)
53 × 15 (4)
125 × 21 (10)
53 × 15 (3)
128 × 30 (12)
71 × 15 (5)
125,2 × 23,0 (11,0) 60,7 × 15,0 (4,0)
94,7 × 17,7 (8,0)
92,8 × 17,7 (7,2)
95,7 × 19,5 (8,2)
88,5 × 18,0 (7,4)
92,9 × 18,2 (7,7)
Média Geral 108,2 × 26,1 (10,1) 41,8 × 15,3 (2,5)
78,1 × 20,4 (6,7)
Meios
BDA2
V-82
AA2
ETA2
PF
MSR
Média
Sementes
SCv
STg
SCt
STt
Média
Folhas
FCv
FTg
FCt
FTt
Média
Contrastes ortogonais
Comprimento:
(Meios de cultura + Sementes) vs. Folhas
Meios de cultura vs. Sementes
Largura:
(Meios de cultura + Sementes) vs. Folhas
Meios de cultura vs. Sementes
Número de pseudoseptos
(Meios de cultura + Sementes) vs. Folhas
Meios de cultura vs. Sementes
3
Error
F
0,155
1,237
361,83**
74,25**
0,028
0,043
241,61**
48,87**
0,017
0,027
131,88**
120,71**
(1) Meios de cultura: batata-dextrosa-ágar (BDA), V-8 ágar (V-8), ágar-água (AA), extrato de tomate
ágar (ETA), papel-filtro (PF) e meio seletivo de Reis (MSR).
Sementes: cevada (SCv), trigo (STg), centeio (SCt) e triticale (STt).
Folhas: cevada (FCv), trigo (FTg), centeio (FCt) e triticale (FTt).
(2) Meios de cultura + 0,2 g de estreptomicina por litro de água.
(3) Análise de contraste ortogonal dos volores médios.
92
No relacionado com o número de pseudoseptos, a análise
de contrates ortogonais demonstrou que os esporos provenientes de
tecidos verdes (folhas) foram estatisticamente superiores (7,7) aos
desenvolvidos sobre sementes (7,2) e em meios de cultura (5,7).
Também
foi
possível
observar
que
os
conídios
desenvolvidos em tecidos verdes (folhas) apresentam uma coloração
marrom-oliva-clara e são ligeiramente curvados, ao passo que os
esporos desenvolvidos em sementes ou meios de cultura mostram-se
mais escuros (marrom-oliva-escuros) e retos.
Densidade de inóculo vs. intensidade de doença.
Decorridas 36 a 48 horas da inoculação, as folhas de cevada, cultivar
BR-2, passaram a evidenciar os primeiros sintomas: pequenas lesões
cloróticas arredondadas, que evoluíram para pequenos pontos
castanho escuros no centro da lesão, rodeados por um extenso halo
amarelo. Posteriormente, essas lesões pequenas se desenvolveram
formando manchas alongadas ovaladas, de cor castanho-clara (no
centro com um ponto escuro) com bordos difusos e halo amarelo
proeminente (96 horas após a inoculação); nesse momento, as
manchas mediam de 0,5 a 3 mm. Algumas manchas apresentaram, na
parte central, uma área esbranquiçada rodeada por um halo castanhoescuro.
As relações entre a densidade de inóculo e a intensidade
de
doença,
número
de
manchas/folha
e
severidade
foram
representadas por equações polinomiais quadráticas (Figura 1). Os
dados demonstram um aumento crescente da intensidade da mancha
marrom com o aumento da concentração de inóculo de B. sorokiniana
atingindo o nível mais alto (ponto máximo) do número de manchas
93
por folha e de severidade da doença %AFA, com 1,65 × 104 e 1,4 ×
104 conídios/mL, respectivamente, para, posteriormente, diminuir. Os
pontos máximos corresponderam a 182 manchas/folha e 79% de
severidade (AFI), valores equivalentes à média de duas folhas (folhas
primárias emergidas após da plúmula). Em função desses resultados, é
possível estimar que uma quantidade de 50 a 90 esporos sejam
necessários para produzir uma lesão.
Número de manchas
Severidade (%AFA)
200
175
y = -7E-07x2 + 0.023x - 7.8541
R2 = 0.974
P = 0.000**
Intensidade
150
125
100
75
y = -4E-07x2 + 0.0112x + 0.2699
R2 = 0.9054
P = 0.000**
50
25
0
0
5000
10000
15000
20000
25000
Densidade de inóculo (conídios/mL)
Figura 1. Efeito da densidade de inóculo de Bipolaris sorokiniana
no número de lesões por folha e na severidade da
mancha marrom em folhas de plântulas de cevada.
94
DISCUSSÃO
Substratos vs. morfologia de conídios. Os gêneros e as
espécies dos fungos imperfeitos são diferenciados através de
características morfológicas como cor, tamanho e septação de
conídios e conidióforos, com considerações adicionais sobre a classe
de hospedeiros (Kafi & Tarr, 1966). Dentro do grupo dos fungos
dematiáceos
hyphomycetes
(como
Bipolaris,
Drechslera
e
Exserohilum), o tamanho dos conídios e o número de septos por
conídios constituem-se num critério importante para a separação de
espécies (Harding, 1975a). Porém, segundo Harding (1975a), essas
características podem ser afetadas pelo meio de cultura utilizado na
produção dos esporos.
Os
resultados
obtidos
neste
trabalho
(Tabela
1)
corroboram o proposto por Harding (1975a), pois foram encontradas
diferenças estatisticamente significativas (P < 0,01) não só entre os
quatorze substratos comparados, mas também quando eles foram
agrupados em três tipos (Tabela 3). O agrupamento permitiu definir
diferenças marcantes entre os conídios desenvolvidos em meios de
cultura: 68,2 × 21,9 m (5,7), como os mais pequenos, largos e com
menor septação; sementes: 78,3 × 20,4
m (7,2), intermediários; e
folhas verdes: 92,9 × 18,2 m (7,7), os mais compridos, estreitos e
com maior septação. Já em 1923, Dosdall reportou diferenças no
comprimento entre esporos produzidos sobre diferentes substratos, dos
quais aqueles produzidos sobre folhas verdes de cevada foram 23 a
26% maiores aos produzidos no meio batata-dextrose-ágar e em
espigas maduras de cevada (autoclavadas). Por outro lado, o autor
95
observou que temperaturas altas (28 oC) induzem a formação de
conídios pequenos, ao passo que temperaturas baixas (14 oC) são
responsáveis pela produção de conídios mais longos, variações que
também foram reportadas por Ruppel (1974).
Segundo Elliott (1949), o comprimento e o número de
septos dos conídios podem variar com a concentração de glicose
adicionada ao meio de cultura, exercendo um marcado efeito sobre
essas características. As fontes de carbono constituem-se num fator
que afeta as dimensões conidiais, porém menos significativo que o
efeito da glicose (Kafi & Tarr, 1966). Outros fatores, como o pH
inicial do meio (Tarr & Kafi, 1968; Harding, 1975a), as fontes de
nitrogênio (Harding, 1975b) e a idade do meio de cultura (Ruppel,
1974), podem também afetar tais características. Em relação a esses
fatos, é possível afirmar que os conídios desenvolvidos em tecidos
verdes apresentam o maior comprimento em virtude à interação do
substrato e do ambiente (temperatura e, possivelmente, da
luminosidade).
Com relação aos valores extremos máximos, mínimos e
médios (Tabela 2), as características conidiais estudadas, em geral,
encontram-se dentro da descrição morfológica reportada por Ellis
(1971), Sivanesan (1987) e Mehta (1993), que são: comprimento de
40-134 m (geralmente 60-100), largura de 15-30 m (geralmente 1823), na parte mais larga do conídio, e 3 a 12 (geralmente 6 a 10)
distoseptos ou pseudoseptos. Os poucos esporos encontrados com um
só septo possivelmente são imaturos.
Portanto, em razão dessas variações na morfologia dos
conídios e de outras características culturais e fisiológicas, o fungo B.
sorokiniana é considerado um patógeno que apresenta grande
96
variabilidade, tanto morfológica quanto fisiológica (Tinline, 1988;
Valim-Labres et al., 1997; Matsumura apud Oliveira et al., 1998). Por
essa razão, em trabalhos de identificação ou reconhecimento do
patógeno, devem-se padronizar as características conidiais em função
do substrato onde o fungo foi cultivado ou recuperado para, assim,
evitar possíveis erros na sua identificação. Sempre que possível, as
dimensões padrões deveríam ser tomadas a partir de conídios
formados sobre o substrato natural do hospedeiro.
Densidade de inóculo vs. intensidade de doença. As
condições ambientais altamente favoráveis à mancha marrom (25
1
o
C e 95 a 100% de UR por 48 horas) propiciaram a manifestação
precoce dos sintomas da doença entre 36 e 48 horas após a inoculação.
Neste particular, Couture & Sutton (1978) relatam que o fungo B.
sorokiniana requer entre 9 a 24 horas de molhamento foliar para
produzir infeção dos órgãos foliares, sendo o ótimo de 20 a 24 horas
(Filippova & Kashemirova, 1991). Por outro lado, o desenvolvimento
da doença é acelerado sob condições de alta umidade relativa e
períodos longos de molhamento (Zillinsky, 1984; Dehne & Oerke,
1985), situação que vem corroborar a pronta manifestação e
caracterização dos sintomas observados no presente experimento.
Num período de dois a sete dias, os sintomas manifestaram-se em sua
plenitude, ocasionando, em alguns casos (densidades de 1,5 × 104 e 2
× 104), necrose completa das folhas (95 a 100% de severidade), por
causa do elevado número de lesões por folha e do seu
desenvolvimento rápido, coalescendo e ocasionando a morte
prematura das mesmas.
Quanto à temperatura, Filippova & Kashemirova (1991) e
Khanna & Shukla (1981) mencionam que o ótimo para o
97
desenvolvimento da doença oscila entre 22 e 30 oC, acelerando-se
com 24 oC e produzindo maior número de lesões necróticas a 28 oC
(Clark & Dickson, 1957; Luz & Bergstrom, 1986).
A determinação da concentração ótima de inóculo, assim
como do seu potencial, é necessária quando se objetiva obter dados
reproduzíveis e, portanto, padronizados, assim como para elucidar
aspectos biológicos do patógeno-alvo do estudo ou epidemiológicos
da doença (Fernandes et al., 1991). Em função da tendência da curva
quadrática representada na Figura 1, verificou-se um incremento
significativo da intensidade da doença até atingir 1,65 × 104 (número
de manchas por folha) e 1,4 × 104 conídios/mL (severidade da
doença), quando tendeu a diminuir. Isso pode ser atribuído ao fato de
que altas densidades de inóculo podem produzir um efeito antagônico
na germinação dos esporos e/ou vários esporos podem participar de
uma única infecção (Van Der Plank, 1963; Van Der Plank, 1975).
Segundo Van Der Plank (1975), a severidade de doenças pode
aumentar proporcionalmente com a concentração de esporos do
patógeno até uma determinada concentração, acima da qual,
dependendo do patossistema, pode ocorrer uma redução na
intensidade da doença, causada, provavelmente, pela auto-inibição da
germinação dos esporos, assim como, pela existência de um número
limitado de sítios de infecção Não se encontrou, na literatura
pesquisada, qualquer informação específica sobre esses fenômenos
para B. sorokiniana, sendo, portanto, necessária a confirmação desta
hipótese. Quanto à quantidade de esporos necessários para produzir
uma lesão (50 a 90 conídios), o desconhecimento da viabilidade dos
mesmos (% germinação), não permite precisar com exatidão o número
ótimo.
98
Por outro lado, em fitomelhoramento, a definição da
densidade ótima e do potencial do inóculo para uso em trabalhos de
seleção é de vital importância. Como indicam Carvalho et al. (1981),
quando se trata da verificação de níveis de resistência ou seleção de
plantas resistentes à enfermidade, altas ou baixas concentrações
poderiam comprometer a reação do material testado. Neste sentido,
em trabalhos rotineiros de melhoramento de cevada desenvolvidos em
Minnesota nos Estados Unidos, concentrações de esporos que oscilam
entre 5 × 104 e 1 × 105 são utilizadas (Miles et al., 1987; Miles et al.,
1989; Wilcoxson et al., 1990). Essas concentrações superam em 300 a
600% as determinadas neste trabalho, o que, conseqüentemente, pode
determinar a eliminação de materiais em programas de melhoramento,
a necessidade de muita mão-de-obra na multiplicação de inóculo,
especialmente quando se trata de programas de melhoramento em
grande escala.
CONCLUSÕES
O substrato afetou significativamente o comprimento, a
largura e o número de pseudoseptos de conídios do fungo B.
sorokiniana.
Os esporos desenvolvidos em meios de cultura e em
sementes foram mais curtos, largos e com menor número de
pseudoseptos, além de serem mais escuros e retos, com relação aos
recuperados de tecidos verdes.
Quanto ao efeito da densidade de inóculo na intensidade
da mancha marrom, o modelo de regressão seguiu uma tendência
polinomial quadrática.
99
Em trabalhos de identificação ou reconhecimento do
patógeno, sempre que possível, as dimensões padrões deveríam ser
tomadas a partir de conídios formados sobre o substrato natural do
hospedeiro.
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CAPÍTULO III
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE
Bipolaris sorokiniana EM SEMENTES DE CEVADA
Javier Toledo Barba, Erlei Melo Reis & Carlos A. Forcelini
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária
Universidade de Passo Fundo
C. P. 611, 99001-970 Passo Fundo, RS
RESUMO
________________________________________________________
TOLEDO, J.; REIS, E.M. & FORCELINI, C.A. Comparação de
métodos para detecção de Bipolaris sorokiniana em sementes de
cevada.
O fungo Bipolaris sorokiniana, agente causal da
helmintosporiose da cevada, sobrevive como micélio em sementes
infectadas e saprofiticamente nos restos culturais de seus hospedeiros.
Em experimentos conduzidos em laboratório, diferentes métodos
[papel filtro, papel filtro + componentes líquidos do meio seletivo de
Reis (MSR), batata dextrose ágar (BDA), extrato de tomate, V-8, meio
seletivo de Reis (MSR) e meio seletivo de Dodman & Reinke] foram
comparados visando selecionar o mais sensível para detecção de B.
sorokiniana em sementes de cevada. Os meios foram testados com e
sem congelamento das sementes. Sem congelamento, os meios
seletivos foram mais sensíveis na detecção de B. sorokiniana,
104
seguidos pelo meio de BDA. O método de papel-filtro padrão ocupou
uma posição intermediária, estatisticamente inferior aos demais. Sob
congelamento a – 20 oC (durante 16 horas), o tratamento térmico
anulou o efeito dos substratos na detecção do fungo, de tal modo que
todos apresentaram comportamento estatisticamente semelhante. Esse
procedimento não afeta positivamente a detecção do fungo-alvo deste
estudo. Por outro lado, o meio de Reis foi mais sensível que o de
papel-filtro + congelamento na detecção de B. sorokiniana em
sementes com diferentes níveis de incidência.
Palavras-chave: Hordeum vulgare, patologia sementes, análise,
helmintosporiose.
ABSTRACT
________________________________________________________
TOLEDO, J.; REIS, E.M. & FORCELINI, C.A. Comparison of
methods for the detection of Bipolaris sorokiniana in barley seeds.
The fungus Bipolaris sorokiniana, the causal agent of the
brown spot of barley, survives as micelium in infected seeds or
saprofiticaly on host plant debris. In lab experiments, various methods
for seed testing [blotter test; blotter test + liquid components of the
Reis selective medium; PDA medium; tomato paste medium; V-8
medium; Reis selective medium, and the Dodman & Reinke selective
medium] were compared regarding the detection of B. sorokiniana in
barley seeds. The selective media (especially the Reis medium) were
more sensitive than the PDA and the blotter tests. Seed freezing (-20
C for 16 hours) prior to incubation did not improve the fungus
detection and determined similar results for all methods.
Key words: Hodeum vulgare, seed pathology, seed testing, spot
blotch.
105
INTRODUÇÃO
Sementes de cevada, freqüentemente, encontram-se
infectadas por fungos patogênicos como Bipolaris sorokiniana (Sacc.)
Shoem., Drechslera teres (Sacc.) Shoem. e Fusarium graminearum
Schwabe, agentes causais de doenças que limitam a produtividade
dessa cultura no sul do Brasil, especialmente nos estados do Rio
Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná.
Através das sementes infectadas, fungos como B.
sorokiniana são introduzidos em áreas novas de cultivo ou em
lavouras sob rotação de culturas, sendo posteriormente transmitidos
para os órgãos radiculares (mesocótilo e raízes seminais) e aéreos
(coleóptilo e plúmula).
No trigo, estudos sobre a eficiência de
transmissão desse fungo relatam valores de até 88% ao coleóptilo
(Reis & Forcelini, 1993), 68% ao mesocótilo (Forcelini, 1992) e 38%
à plúmula (Toledo et al., 1996). Por causa da elevada transmissão que
B. sorokiniana apresenta, Reis (1987) considera que o controle desse
fungo deve ser orientado à erradicação na semente a fim de reduzir o
inóculo primário na lavoura. Para isso, torna-se necessário contar com
métodos de detecção mais sensíveis que permitam revelar o máximo
de incidência do patógeno, proporcionando maior precisão na
quantificação do fungo veiculado pela semente, sobretudo quando se
trata de testes de eficácia de fungicidas ou outros métodos de
erradicação.
Entre os vários métodos disponíveis para detecção de
fungos em sementes, os testes com papel-filtro são os mais conhecidos
e utilizados, dentre os quais se destaca o de congelamento
desenvolvido por Limonard (1966). Esse método é o mais amplamente
106
usado nos testes rotineiros de sanidade de sementes (Mathur, 1983;
Neergaard, 1983), embora a incidência de muitos fungos e bactérias
contaminantes, que crescem rapidamente neste substrato, possa
impedir
a
frutificação
dos
fungos-alvo,
dificultando
a
sua
identificação e quantificação, sobretudo os de crescimento lento.
Nesse último caso, a incidência pode ser subestimada (Tempe, 1970;
Neergaard, 1973; Reis et al., 1999).
O desenvolvimento de meios seletivos ou semi-seletivos
para a detecção de conídios dormentes de B. sorokiniana no solo
(Stack, 1977; Kulkarni et al., 1978; Dodman & Reinke, 1982; Reis,
1983; Filippova & Kashemirova, 1990) tem aberto a possibilidade de
seu uso na detecção desse fungo em análises rotineiras de patologia de
sementes, como concluem e recomendam Reis et al. (1999).
O presente trabalho teve por objetivo comparar e avaliar
diferentes meios de cultura e métodos usados em laboratório, com a
finalidade de selecionar o mais sensível na detecção de B. sorokiniana
associado a sementes de cevada.
MATERIAL E MÉTODOS
Os trabalhos foram conduzidos no Laboratório de
Fitopatologia da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da
Universidade de Passo Fundo - RS, no período de dezembro/2000 a
fevereiro/2001. Considerando-se o número de tratamentos e o tempo
requerido nas avaliações, optou-se por conduzir o trabalho em dois
grupos de experimentos: a) semente sem congelamento e b) semente
com congelamento. Cada experimento foi desenvolvido com lotes de
sementes diferentes.
107
Em cada experimento foram testados sete métodos de
detecção, empregando-se sementes de cevada do cultivar BR-2,
naturalmente infectadas com B. sorokiniana. Os métodos comparados
foram: 1) papel-filtro (Tempe, 1970); 2) papel-filtro + componentes
líquidos do meio seletivo de Reis; 3) meio batata-dextrose-ágar
(BDA) (preparado de acordo com Fernandez, 1993); 4) meio extratotomate-ágar (Fernandez, 1993); 5) meio V-8 ágar (Fernandez, 1993);
6) meio seletivo de Reis (Reis, 1983); e 7) meio seletivo de Dodman
& Reinke modificado (Dodman & Reinke, 1982).
O método 2 (papel-filtro + MSR) utilizou uma solução
composta por estreptomicina (0,5 g) dissolvida em 50 mL de água
destilada esterilizada (ADE), neomicina (0,3 g) em 50 ml de ADE,
benomil (0,06 g) em 32 mL de ADE, botram (5 mL de suspensão
estoque) e captam (3 mL de suspensão estoque), em um volume total
de 140 mL. Desta suspensão final, pipetou-se uma alíquota de 3,5 mL
por placa de petri contendo três discos de papel filtro (total de placas:
40). O mesmo volume foi empregado no método 1 (3,5 mL de água
destilada esterilizada/placa).
Os meios seletivos sofreram algumas modificações. O
meio de Reis teve sua quantidade de benomil incrementada de 0,05
para 0,06 g. No meio de Dodman & Reinke, o hidrocloreto de
clorotetraciclina e o captafol foram substituídos por hidrocloreto de
tetraciclina e por captam. Para os outros meios (métodos 3, 4 e 5),
empregou-se 0,2 g de sulfato de estreptomicina por litro de meio.
No experimento 1 (semente sem congelamento), as
sementes foram plaqueadas de forma eqüidistante, mediante o uso de
pinça esterilizada. Previamente, as sementes foram desinfestadas com
hipoclorito de sódio 0,5% durante três minutos. Os trabalhos foram
108
realizados em câmara de isolamento de fluxo laminar, principalmente
para os métodos 3, 4 e 5. Utilizaram-se dez sementes por placa. Após
o plaqueamento das sementes, as placas de petri (9 cm de diâmetro)
foram vedadas com papel parafinado (“parafilm”) para evitar a perda
de umidade durante a incubação. Cada tratamento contou com quatro
repetições. A seguir, as sementes foram incubadas em câmara de
crescimento com fotoperíodo de 12 horas e temperatura de 25
2 oC.
No experimento 2 (semente com congelamento), as
sementes foram desinfestadas com hipoclorito de sódio a 0,5%, por
três minutos, e plaqueadas de forma eqüidistante em caixas Gerbox
contendo três folhas de papel-filtro esterilizadas, umedecidas com 7
mL de água destilada esterilizada, onde foram acondicionadas 100 a
120 sementes. Nessas condições, as sementes foram mantidas em
câmara de crescimento com fotoperíodo de 12 horas e temperatura de
25
2 oC durante 24 horas, para induzir a germinação; após esse
período, as sementes foram congeladas a – 20
1 oC, por 16 horas,
para interromper a germinação, segundo a metodologia empregada por
Pryor et al. (1994). Finalmente, transcorrido esse período, as sementes
foram plaqueadas com ajuda de uma pinça esterilizada (flambada cada
vez que se tomava uma semente), para os diferentes métodos de
detecção testados, sendo as placas vedadas com “parafilm”. Em cada
placa foram colocadas dez sementes. Cada tratamento contou com
quatro repetições.
Em ambos os experimentos, o tempo de incubação variou
em função do método usado: cinco dias para os métodos de extrato de
tomate e V-8-ágar; sete dias para batata-dextrose-ágar; oito dias para
papel-filtro e papel-filtro + MSR; onze dias para os meios seletivos.
Finalizado o período de incubação, as sementes e/ou as colônias
109
desenvolvidas foram examinadas sob microscópio estereoscópio (lupa
binocular Zeiss 50×) para a identificação do fungo através da
observação das suas estruturas reprodutivas. Foram consideradas
infectadas as sementes com conidióforos e conídios de B. sorokiniana,
conforme descrição por Ellis (1971) e Sivanesan (1987).
Em função dos resultados obtidos nos dois experimentos
anteriores, e com a finalidade de estudar o possível efeito do
congelamento (– 20 oC) na detecção de B. sorokiniana na semente,
planejou-se um terceiro experimento, no qual se compararam quatro
métodos ou tratamentos: 1) papel-filtro; 2) meio seletivo de Reis; 3)
papel-filtro + congelamento; e 4) meio seletivo de Reis +
congelamento. Neste experimento, foram conduzidos dois ensaios: o
primeiro com sementes de cevada (cultivar BR-2), com incidência
inferior a 20%; o segundo com sementes de trigo (cultivar Sonalika),
com incidência superior a 70%. O período de incubação foi de dez
dias para todos os tratamentos. Cada tratamento constou com cinco
repetições.
Nos três experimentos, o delineamento experimental
empregado foi de tratamentos completamente casualizados. Para cada
método, empregaram-se cem sementes por repetição, distribuídas em
dez placas. Os dados obtidos foram expressos em percentagem de
sementes infectadas com B. sorokiniana ou incidência do fungo,
sendo submetidos à análise de variância (P < 0,05), comparando-se as
médias pelo teste de Tukey (5%) e por contrastes ortogonais a 5% de
probabilidade (experimento 3). Antes de se proceder à análise de
variância, os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov &
Smirnov para testar a sua normalidade.
110
RESULTADOS
A incidência de B. sorokiniana em sementes de cevada foi
afetada significativamente (P < 0,01) pelos diferentes métodos de
detecção
que
não
envolveram
congelamento
das
sementes
(Experimento 1). Por outro lado, nas sementes submetidas ao
congelamento (Experimento 2), os métodos comparados não
evidenciaram diferenças estatísticas entre si (Tabela 1).
Tabela 1. Incidência média de Bipolaris sorokiniana em sementes
de cevada analisadas por diferentes métodos de
sanidade, sem ou com congelamento
Métodos
1. Papel-filtro
2. Papel-filtro + MSR (2)
3. Batata-dextrose-ágar (3)
4. Extrato tomate-ágar (3)
5. V-8-ágar (3)
6. M.S. de Reis (4)
7. M.S. de Dodman & Reinke (4)
Incidência (%)
Sem
Com
congelamento
congelamento
(experimento 1)1
(experimento 2)1
5
28,25 c
15,25
13,75 d
12,25
38,50 ab
15,25
30,50 bc
15,50
32,25 bc
16,75
43,00 a
16,50
42,75 a
18,00
16,20
7,38
Q.M.E.
25,06**
1,75 n.s.
FC
12,46
17,37
C.V. (%)
5,99
3,99
D.M.S. (5%)
(1) Experimentos desenvolvidos com lotes de sementes diferentes (cv. BR –2).
(2) Papel-filtro + componentes líquidos do meio seletivo de Reis.
(3) Meio de cultura + 0,2 g de sulfato de estreptomicina.
(4) M.S. = meios seletivos para recuperar B. sorokiniana do solo.
(5) Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si pelo teste de
Tukey (5%)
Em função dos resultados expressos na Tabela 1, é
possível deduzir que os métodos de incubação que utilizaram meios
seletivos (métodos 6 e 7) foram os mais sensíveis na detecção de B.
111
sorokiniana (43 e 42,8% de incidência), sem diferenças estatísticas
entre si. O meio BDA (incidência de 38,5%) evidenciou um
comportamento estatisticamente similar aos meios seletivos, ao passo
que os métodos V-8-ágar, extrato de tomate-ágar e papel-filtro foram
menos eficazes. O método de papel-filtro + MSR (método 2)
demonstrou ser o menos sensível, pois nele se detectou a menor
incidência do fungo.
Tabela 2. Incidência média de Bipolaris sorokiniana a partir de
sementes de cevada e trigo analisadas por diferentes
métodos de sanidade
Métodos
1. Papel-filtro sem congelamento
2. Meio seletivo de Reis sem congelamento
3. Papel-filtro com congelamento
4. Meio seletivo de Reis com congelamento
Incidência (%)
Cevada1
Trigo2
9,2
72,2
14,4
75,2
9,6
78,0
12,0
78,2
Q.M.E.
FC
C.V. (%)
D.M.S. (5%)
6,70
4,33 *
22,91
3,47
Contrastes ortogonais
Cevada
1 + 3 vs. 2 + 4
1 vs. 3
2 vs. 4
Trigo
1 + 3 vs. 2 + 4
1 vs. 3
2 vs. 4
Erro
15,90
2,50 n.s.
5,25
5,34
F
0,579
0,819
0,819
10,78 **
0,06 n.s.
2,15 n.s.
0,892
1,261
1,261
0,81 n.s.
5,29 *
1,42 n.s.
(1) Cultivar BR-2
(2) Cultivar Sonalika
No Experimento 3, no qual se objetivou estudar o efeito
do congelamento (–20
o
C) na detecção de B. sorokiniana em
sementes, os resultados apresentados na Tabela 2 mostram diferença
112
estatística (P < 0,05) apenas no ensaio com sementes que
apresentaram incidência baixa do fungo (semente de cevada). Neste
ensaio, segundo a análise de contrastes ortogonais, os métodos com
papel-filtro (com e sem congelamento) mostraram-se estatisticamente
inferiores aos métodos com meio de Reis (com e sem congelamento).
Por outro lado, entre os tratamentos com e sem congelamento do
papel-filtro e do meio de Reis em separado, não foi possível encontrar
diferenças estatísticas para nenhuma das comparações.
No caso do ensaio com sementes de trigo (incidência alta
do fungo), a análise de contrastes ortogonais, evidenciou que os
métodos com papel-filtro (com e sem congelamento) não diferiram do
meio de Reis (com e sem congelamento). O efeito do congelamento
foi significativo apenas no método do papel-filtro, resultando em
maior detecção do fungo.
DISCUSSÃO
Métodos
sem congelamento.
Quando em
análise
patológica das sementes objetiva-se detectar a presença de patógenos
específicos, o emprego de meios seletivos ou semi-seletivos torna-se
uma ferramenta de grande valor para o fitopatologista, pois evita o
desenvolvimento de contaminantes, favorecendo a detecção e
identificação do patógeno-alvo (Richardson, 1985). Essa eficiência foi
refletida nos resultados do experimento sem congelamento (Tabela 1),
no qual os meios seletivos de Reis e de Dodman & Reinke foram os
mais sensíveis na detecção de B. sorokiniana. Em trabalhos de similar
envergadura, Reis & Reis (1994) e Reis et al. (1999) não encontraram
diferencia estatisticamente significativa entre o método do papel-filtro
113
tradicional recomendado pelo ISTA (Neergaard, 1973), e o meio
seletivo de Reis (Reis, 1983), na detecção do fungo em sementes de
trigo, sendo, segundo esses autores, os métodos mais sensíveis na
detecção de B. sorokiniana.
Quanto ao meio BDA, que manifestou um comportamento
estaticamente similar aos meios seletivos, é importante salientar que
esse desempenho pode ser inferior quando ocorrer a presença de
contaminantes de crescimento rápido, como Trichoderma spp.,
Rhizopus spp., Mucor spp. e Fusarium spp. Esses fungos podem, em
pouco tempo, cobrir completamente a placa de petri (cinco a seis
dias), dificultando a identificação e detecção do fungo-alvo,
principalmente quando a semente não for desinfestada. Esses
inconvenientes podem ser ainda mais acentuados quando são
empregados substratos mais nutritivos, como os meios de extrato de
tomate-ágar e V-8-ágar, onde os fungos oportunistas mostram uma
maior taxa de crescimento, como foi observado no presente trabalho.
No caso dos métodos em que foi empregado o papel-filtro
como substrato (métodos 1 e 2), observou-se um baixo nível de
esporulação na semente. Esse fato dificultou e retardou a avaliação,
situação que foi ainda mais acentuada no método em que se combinou
o papel-filtro com os componentes líquidos do meio seletivo de Reis.
Além do inconveniente anteriormente citado, acrescenta-se o
problema da formação de conídios com morfologia diferente (mais
fusiformes) e coloração menos escura (ligeiramente hialinos). Essas
alterações morfológicas dificultam a identificação do fungo e,
possivelmente, a sua quantificação. As alterações podem ter sido
causadas pelos fungicidas e, talvez, pelos antibióticos usados, que, ao
114
entrarem em contato com a semente, podem ser fungitóxicos a B.
sorokiniana.
Em função do exposto anteriormente, é possível deduzir
que tanto os meios seletivos (especialmente o meio de Reis) como o
meio BDA poderiam ser usados rotineiramente nos testes de patologia
de sementes de cevada, porém, considerando que o preparo dos meios
seletivos toma muito tempo e demanda de reagentes não sempre
disponíveis, é que o meio BDA seria o mais adequado para dita
finalidade; não sem antes salientar que o emprego dos meios seletivos
desempenharia um papel importante em trabalhos de controle
químico, especialmente quando se objetiva erradicar o patógeno da
semente, situação na que a sua sensibilidade e seletividade teria um
papel preponderante, ao considerar-se que se trabalha com níveis de
incidência muito baixas.
Métodos + congelamento. No experimento em que a
semente foi submetida ao congelamento (Tabela 1), não se detectou
diferença estatística entre os métodos. Essa situação que pode ser
atribuída à inibição da germinação da semente, pois, mediante esse
procedimento, foi possível obter um maior contato da semente com o
substrato, ao evitar o desenvolvimento da plúmula e de raízes que, de
uma ou outra maneira, podem inibir ou dificultar o desenvolvimento e
observação do patógeno. Esse melhor contato entre a semente e o
substrato pode ter criado condições mais favoráveis, especialmente de
umidade (presença de água líquida na superfície da semente), para
estimular a esporulação do fungo, facilitando desse modo, a sua rápida
detecção e quantificação, como mencionam Neergaard (1983) e
Machado (1988).
115
Um aspecto negativo observado em todos os métodos com
congelamento foi a proliferação de bactérias, aspecto também
reportado por Tempe (1970). Limonard (1966) e Tempe & Limonard
(1973) mencionam que o excesso de água no substrato (papel filtro)
pode reduzir a incidência de alguns patógenos, efeito inicialmente
relacionado ao antagonismo provocado por bactérias. Esse aspecto
não se encontra diretamente relacionado com o observado neste
trabalho, pois a proliferação de bactérias foi detectada em todos os
métodos testados. Com relação ao volume de água empregado por
placa de petri (3,5 mL/placa), nos métodos com papel-filtro (métodos
1 e 2), diferiu daquele determinado por Kolk & Karlberg (apud
Neergaard, 1973), os quais determinaram que, para B. sorokiniana, o
volume ótimo é de 25 mL por disco de papel-filtro, acondicionados
em placas de petri de 17 cm de diâmetro e 4 cm de altura. Porém, o
volume empregado mostra mais relação com o volume de água (5,25 a
5,75 mL) estabelecido por Jørgensen (1982a) para trabalhos de
quantificação de Pyrenophora graminea Ito & Kurib. e P. teres
(Sacc.) Shoem.
Um aspecto positivo que deve ser salientado no processo
do congelamento foi a formação de colônias características e
facilmente diferenciáveis do fungo, que permitiram maior eficiência
na sua detecção e quantificação. Por outro lado, os meios que
favoreceram um rápido desenvolvimento de colônias típicas foram os
mais nutritivos, como o extrato de tomate e o V-8 (Figuras 1a e 1b),
que apresentaram colônias maiores (2 – 4 cm de diâmetro em cinco
dias de incubação) e uma maior taxa de crescimento (> 9 mm/dia).
116
Figura 1. Colônias de Bipolaris sorokiniana desenvolvidas a partir
de sementes infectadas, em: a) meio extrato de tomate;
b) meio V-8; c) papel-filtro padrão; d) papel-filtro +
MSR.
117
Quanto à coloração nesses substratos, as colônias apresentaram centro
de cor preto-cinza, com anéis concêntricos difusos (abundante
esporulação) e bordas esbranquiçadas, sendo mais proeminente no
meio V-8.
No caso do BDA, as colônias desenvolvidas mostraram
características visuais semelhantes às descritas anteriormente, mas
diferenciaram-se por apresentar taxas de crescimento inferiores a 9
mm/dia, o que permitiu manter o processo de incubação por mais
tempo (sete dias).
Os meios em que foi empregado o papel-filtro como
substrato, as sementes desenvolveram colônias pretas ou ligeiramente
cinzas e com anéis concêntricos sobre o papel (abundante
esporulação), sobretudo no papel-filtro + água (Figura 1c),
corroborando o reportado por Garrett (1980). Algo singular foi
observado na combinação papel filtro + MSR, na qual as colônias
apresentaram-se mais claras que no papel-filtro + água, com formação
de colônias de cor rosa em alguns casos (Figura 1d).
Nos meios seletivos de Reis e de Dodman & Reinke, o
desenvolvimento das colônias foi lento, com taxa de crescimento
inferior a 1 mm/dia. Porém, isso não representou nenhum
inconveniente, pois a seletividade que os meios evidenciaram não
permitiu o desenvolvimento de outros fungos que pudessem interferir
na identificação e quantificação de B. sorokiniana, excetuando-se
Alternaria spp., Bipolaris spp., Curvularia spp. e Drechslera spp.
Para caracterizar as colônias desenvolvidas nos meios
seletivos, foi necessário incubá-las por períodos de tempo superiores a
20 – 30 dias. No caso do meio de Dodman & Reinke, as colônias
apresentaram anéis marcadamente diferenciáveis, de coloração
118
completamente preta (abundante esporulação) e pouco (na parte
central) ou nenhum crescimento vegetativo superficial, mas, sim,
internamente no substrato (Figura 2), contrastando com a cor do meio.
Colônias no meio de Reis mostraram uma coloração pretoavermelhada com a presença de tufos branco-rosa na parte central da
colônia (Figura 3a).
No presente trabalho, não foi testado o herbicida 2,4-D
para inibir a germinação das sementes como sugerido por alguns
autores (Neergaard, 1983; Lucca Filho, 1987; Reis, 1987; Machado,
1988; Reis & Casa, 1998), pelo fato que outros investigadores, como
Kharchenko & Shklyar (1976), apontarem que o produto apresenta
atividade altamente antifúngica sobre B. sorokiniana.
Efeito do congelamento sobre B. sorokiniana. Em vista
dos resultados obtidos em ambos os ensaios do Experimento 3, deduzse que o processo de congelamento a – 20
o
C não afetou
significativamente a detecção do fungo na semente. Estudos feitos por
Duczek & Wildermuth (1992) sobre o efeito do período de
congelamento na esporulação de C. sativus em colmos maduros de
trigo demonstraram que a esporulação do fungo pode ser reduzida
quando os órgãos infectados são submetidos a temperaturas menores
do que 1 oC, não importando o período de congelamento. De igual
modo, Duczek (1995) concluiu que o congelamento (– 18 oC) não
afeta a sobrevivência do fungo em colmos de trigo naturalmente
infectados, mas pode reduzir sua esporulação.
119
Figura 2. Colônias de Bipolaris sorokiniana desenvolvidas a partir
de sementes infectadas, em meio seletivo de Dodman &
Reinke modificado (1982).
120
O meio de Reis demostrou ser sensível e eficiente na
detecção de B. sorokiniana, tanto em níveis altos como em níveis
relativamente baixos de incidência do fungo na semente, ao passo que
o comportamento do papel-filtro tende a ser variável. É importante
salientar que o fato de se ter trabalhado com um número reduzido de
amostras e, sobretudo, com sementes de diferentes espécies (cevada e
trigo) pode ter influenciado os resultados, segundo o relato de
Jørgensen (1982b). Contudo, trabalhos desenvolvidos por Reis & Reis
(1994), Da Silva (1998), Lângaro (1998) e Reis et al. (1999)
corroboram os resultados obtidos no presente trabalho. Por outro lado,
quanto ao papel-filtro + congelamento, diversos estudos reportam a
sua maior eficiência na detecção de B. sorokiniana e de outros fungos
com relação ao papel filtro-padrão (Lasca et al., 1987; Diekmann &
Assad, 1989; Shaarawy et al., 1991)
Em geral, tanto o meio seletivo de Reis como o papelfiltro + congelamento apresentaram-se vantajosos quanto à eficiência
de detecção e quantificação de B. sorokiniana em sementes, pois
facilitaram a visualização das estruturas do fungo. No caso do meio de
Reis, a presença de abundante esporulação preta na superfície da
semente e nas raízes seminais, ou a presença de micélio marromavermelhado na parte inferior da semente (parte que entra em contato
com o meio) ou nos extremos das raízes que estão em contato com o
meio (Figura 3b), facilitaram a detecção rápida do fungo. A vantagem
do papel-filtro + congelamento foi a esporulação preta abundante
tanto na superfície da semente como no papel (colônias pretas com
anéis concêntricos). Porém, devido a esse substrato não ser seletivo, o
crescimento rápido de fungos como Fusarium spp. pode cobrir
completamente a semente, formando colônias sobre o papel e
121
Figura 3. Colônias de Bipolaris sorokiniana desenvolvidas a partir
de sementes infectadas, em meio seletivo de Reis
(1983): a) semente com congelamento; b) semente sem
congelamento.
122
interferindo na detecção de B. sorokiniana. Nesse caso, é necessário
virar completamente a semente para examiná-la, especialmente
quando a sutura fica em contato com o papel, para se ter certeza de
que não ocorre nenhuma esporulação do fungo, como foi observado
no experimento com sementes de trigo.
Por último, é importante salientar que a existência de
outros meios seletivos reportados na literatura (Stack, 1977; Kulkarni
et al., 1978; Filippova & Kashemirova, 1990), além dos comparados
no presente experimento, poderiam proporcionar uma base científica
para futuros trabalhos na área da sanidade de sementes de cereais, cujo
objetivo principal seja a detecção de fungos dematiáceos como
Bipolaris, Drechslera, Exserohilum, Alternaria e Curvularia, abrindo
a possibilidade de serem utilizados com vantagem na detecção desses
fungos em análise rotineira de patologia de sementes.
CONCLUSÕES
Os meios seletivos mostraram-se mais sensíveis e
consistentes do que os métodos empregados rotineiramente na
detecção de B. sorokiniana.
O congelamento das sementes não afetou a detecção do
fungo nem influenciou a performance dos métodos, os quais
apresentaram resultados semelhantes.
Em
função
de
sua
sensibilidade
e
simplicidade,
recomenda-se o meio BDA (sem congelamento) para exames
rotineiros em patologia de sementes de cevada.
123
O meio de Reis (sem congelamento) mostra-se mais
apropriado para trabalhos em controle químico, onde a sensibilidade e
seletividade desempenham papel preponderante.
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CAPÍTULO IV
EFEITO DA TEMPERATURA NA TRANSMISSÃO DE
Bipolaris sorokiniana DA SEMENTE PARA
PLÂNTULAS DE CEVADA
Javier Toledo Barba, Erlei Melo Reis & Carlos A. Forcelini
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária
Universidade de Passo Fundo
C. P. 611, 99001-970 Passo Fundo, RS
RESUMO
________________________________________________________
TOLEDO, J.; REIS, E.M. & FORCELINI, C.A. Efeito da temperatura
na transmissão de Bipolaris sorokiniana das sementes para plântulas
de cevada.
A transmissão de patógenos a partir de sementes e seu
estabelecimento e desenvolvimento no hospedeiro são influenciados
pelas condições ambientais, sendo a temperatura e a umidade do solo
os fatores mais importantes. No presente trabalho, avaliou-se o efeito
da temperatura na transmissão de Bipolaris sorokiniana de sementes
para os órgãos aéreos e radiculares de plântulas de cevada. Também
foram quantificadas a transmissão do fungo em função do tempo e o
potencial de esporulação nas extremidades apicais dos coleóptilos.
Compararam-se dois tratamentos: sementes sem e com fungicida
128
(iminoctadina 70 g i.a./100 kg semente), semeadas em solo natural
não esterilizado e mantidas sob diferentes temperaturas (10, 15, 20, 25
e 30 oC). Um trabalho complementar sobre a evolução da transmissão
para coleóptilos (35 dias), em função do tempo, foi conduzido sob
temperatura de 25 oC e substrato de areia. A transmissão foi mais
eficiente na faixa térmica de 18 a 25 oC. A relação temperaturatransmissão foi representada por equações quadráticas com
transmissão máxima entre 18,1 e 21,3 oC, onde as relações estudadas
seguiram tendências polinomiais quadráticas. A esporulação foi
máxima a 19,3 oC. Coleóptilos infectados por B. sorokiniana
tornaram-se evidentes aos dez dias após a semeadura. Por mais de 28
dias, o número de coleóptilos infectados e a esporulação foram
crescentes.
Palavras-chave: Hordeum
helmintosporiose.
vulgare,
patologia
de
sementes,
ABSTRACT
________________________________________________________
TOLEDO, J.; REIS, E.M. & FORCELINI, C.A. Effect of temperature
on the transmission of Bipolaris sorokiniana from seeds to barley
plants.
The transmission of seed-borne pathogens and the
infection of the host plants are influenced by ambient conditions,
mainly temperature and soil moisture. In this research, the effect of
the temperature on the transmission of Bipolaris sorokiniana from
seeds to above and below ground plant parts was studied. The rate of
transmission and the potential for fungus sporulation on the apice of
coleoptiles were also quantified. These studies involved two seed
samples (treated or not treated with the fungicide iminoctadine at 70 g
a.i./100 kg seed) sown in non-sterilized field soil and five
temperatures (10, 15, 20, 25, and 30 oC), with four replications. An
additional trial was conducted in sand soil, at 25 C, to follow the
fungus transmission over a period of 35 days. The relationships of
temperature to transmission were represented by quadratic model
equations. The observed and estimated fungus transmissions were
higher at 18 – 25 oC and 18,1 – 21,3 oC, respectively. The fungus
sporulation was also influenced by temperature and reached its
129
maximum at 19,3 oC. The infection of barley coleoptiles initiated 10
days after planting and increased steadily for more than 28 days.
Key words: Hordeum vulgare, seed pathology, spot blotch.
INTRODUÇÃO
Os parasitas necrotróficos, em sua maioria, servem-se da
semente como veículo de disseminação e como abrigo e meio de
sobrevivência. Por conseguinte, as sementes são importantes fontes de
inóculo primário desses patógenos (Reis, 1987; Reis & Forcelini,
1993). No Brasil, os fungos mais importantes associados às sementes
de cevada, são Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem. [Cochliobolus
sativus (Ito & Kurib) Drech. ex Dastur] e Drechslera teres (Sacc.)
Shoem. [Pyrenophora teres (Died.) Drech.] (Luz, 1982; Luz &
Minella, 1982; Diehl & Minella, 1985). Em algumas situações, a
incidência da infecção em sementes pode alcançar valores próximos a
100% (Picinini & Fernandes, 1999; Lima et al., 1999).
Os danos causados por B. sorokiniana nas sementes de
cevada são devidos a diminuição da germinação, à redução de
rendimento e de qualidade dos grãos e do malte. Além disso, o fato de
o parasita ter a capacidade de infectar e ser transmitido pela semente
torna o fungo de importância potencial para a cultura da cevada,
sobretudo quando as condições ambientais se apresentam favoráveis
ao desenvolvimento da doença. Estudos realizados sobre a eficiência
de transmissão de B. sorokiniana a partir de sementes de trigo relatam
que a passagem do fungo para os órgãos da planta é altamente
eficiente, sendo de até 88% para o coleóptilo (Reis & Forcelini, 1993),
130
de 68% para o mesocótilo (Forcelini, 1992) e de 38% para a plúmula
(Toledo et al., 1996).
A transmissão de um patógeno pela semente pode ser
influenciada por uma série de fatores, como: espécie cultivada
(resistência varietal), condições ambientais (umidade ambiental e do
solo, temperatura, vento, chuva e luz), inóculo (viabilidade,
localização na semente, tipo), práticas culturais (tipo de solo, pH,
população de plantas, profundidade de semeadura e época de plantio,
fertilização, etc.), sobrevivência do inóculo, vigor da semente,
microflora do solo e da semente, entre outros. Tais fatores podem
reduzir ou incrementar significativamente a passagem do patógeno
para os órgãos foliares e/ou radiculares da planta hospedeira,
refletindo no desenvolvimento da doença na lavoura (Neergaard,
1983; Agarwal & Sinclair, 1997).
Forcelini (1992), em estudos sobre a influência de alguns
desses fatores na transmissão de B. sorokiniana em sementes de trigo,
concluiu que a temperatura tem efeito na passagem do fungo para as
raízes ou órgãos aéreos da planta, tendo quantificado que a
transmissão ao coleóptilo foi mais acentuada entre 20 e 25 oC, ao
passo que, a temperaturas inferiores, a passagem do fungo foi maior
para o sistema radicular. Outros fatores estudados, tais como a
profundidade de semeadura, o tempo de armazenamento e a
microflora do solo, tiveram pouco ou nenhum efeito na transmissão.
Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da
temperatura na transmissão de B. sorokiniana das sementes para os
órgãos aéreos e radiculares de plântulas de cevada, além de quantificar
a evolução da transmissão do fungo em função do tempo e o potencial
de esporulação nas extremidades apicais dos coleóptilos.
131
MATERIAL E MÉTODOS
As ações de pesquisa deste trabalho foram
conduzidas em câmaras climatizadas na Faculdade de Agronomia e
Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo – RS, no
período de abril/2000 a novembro/2000.
Temperatura vs. transmissão
Utilizaram-se sementes de cevada da cultivar BR 2, com
aproximadamente 54% de incidência por B. sorokiniana (com uma
variação de 30 a 66%). Dois tratamentos foram avaliados: 1) semente
sem
fungicida
(testemunha)
e,
2)
semente
com
fungicida,
empregando-se a iminoctadina 20% EC (70 g i.a./100 kg de
sementes), misturado via úmida às sementes com 2% de água. Para o
tratamento, foram pesadas100 g de sementes em frascos de
Erlenmeyer de 500 mL de volume. Em seguida, acrescentou-se o
fungicida + água (previamente misturados num vortex por espaço de
30 a 60 segundos) e agitou-se a mistura durante 5 minutos até se obter
cobertura homogênea das sementes. Previamente à semeadura, e com
a finalidade de determinar a infecção do fungo na amostra, foram
distribuídas duzentas sementes (em quatro repetições) em meio
seletivo de Reis (Reis, 1983). As sementes foram incubadas em sala
de crescimento sob fotoperíodo de 12 horas à temperatura de 25 ± 2
o
C, durante dez dias. Decorrido o tempo de incubação, onze dias após
do plaqueamento as sementes foram examinadas sob microscópio
estereoscópico, com magnitude de 50 ×, para se determinar a
percentagem de infecção, mediante a observação da frutificação de B.
132
sorokiniana. Considerou-se infectada a semente sobre a qual o fungo
produziu, no mínimo, um conidióforo com um conídio. Esse mesmo
procedimento foi observado para cada ensaio.
Nos
anteriormente
ensaios
foram
in
vivo,
submetidos
os
a
tratamentos
diferentes
descritos
condições
de
temperatura, com 10 ± 2; 15 ± 0,5; 20 ± 0,5; 25 ± 2 e 30 ± 2 oC,
perfazendo cinco ensaios. A unidade experimental foi constituída de
uma moldura de madeira de 41 × 28 × 10 cm de altura, encaixada
numa bandeja de alumínio de 43 × 30 × 5 cm de altura, contendo solo
sem esterilizar e com pH corrigido para 6,0. Empregou-se solo de
horta, sem o cultivo de cereais de inverno, para evitar a presença de
conídios dormentes no solo (segundo Reis, 1983), de modo que a
semente fosse a única fonte de inóculo. O substrato foi umedecido 24
horas antes da semeadura, com água de torneira + adubo foliar
(Niphokan 1 mL/L de água). Em cada caixa, perfuraram-se cem
orifícios de 2,5 cm de profundidade e 0,7 cm de diâmetro com um
bastão de vidro. Cada orifício recebeu uma semente. No caso do
ensaio com temperatura de 30
o
C, com a finalidade de evitar
problemas de tombamento produzidos por Sclerotium rolfsii Sacc., o
que foi constatado no experimento a 25 oC, logo após a semeadura e
cobertura da semente com solo, colocou-se uma camada de areia de
rio lavada e peneirada, de aproximadamente 0,5 cm, para evitar o
crescimento rápido do fungo indesejável.
As caixas foram mantidas em câmara climatizada, com
temperatura e luminosidade (fotoperíodo de 12 horas) controladas,
mas com a umidade relativa do ar parcialmente controlada (70 –
100%) e medida através de um termo-higrógrafo. A umidade do solo
foi mantida a capacidade de campo mediante irrigações periódicas. A
133
irrigação foi feita por absorção de água pelo substrato através do
fundo da bandeja. Cada tratamento foi repetido três vezes.
Na avaliação da transmissão após a emergência das
plântulas, os coleóptilos, bainhas e plúmulas foram examinados
cuidadosamente a cada cinco dias, tendo sido marcadas com um palito
de dente pintado com cores diferenciadas aquelas que apresentaram
sintomas de descoloração ou de lesões pardas, assim como as
plântulas que morreram prematuramente. Das plântulas mortas foram
feitos isolamentos em meio de cultura para determinar o agente
causal. Finalmente, aos 35 dias após a semeadura, as extremidades
apicais e regiões subterrâneas dos coleóptilos (50% da população de
plântulas), assim como os mesocótilos (os outros 50% da população
de plântulas), bainhas e plúmulas de cada uma das plântulas (100% da
população de plântulas) foram removidos e cortados. As extremidades
apicais dos coleóptilos, bainhas e plúmulas, foram plaqueados
imediatamente e sem desinfestação em meio seletivo de Reis (Reis,
1983). Entre cada operação de remoção de um coleóptilo
desinfestavam-se a pinça e a tesoura em chama de álcool. As partes
subterrâneas dos coleóptilos e mesocótilos foram arrancadas
cuidadosamente, lavadas com água esterilizada e desinfestadas com
hipoclorito de sódio (0,5%), para, finalmente, serem plaqueadas em
placas de petri contendo meio seletivo de Reis. Os coleóptilos
(extremidades apicais e regiões subterrâneas) e mesocótilos removidos
foram classificados em sintomáticos e assintomáticos. As placas
foram mantidas por dez dias em sala de crescimento, com fotoperíodo
de 12 horas. Considerou-se infectado o órgão ou região sobre a qual
ocorreu a esporulação do fungo em exame sob microscópio
estereoscópico (lupa binocular Zeiss 50×). Os dados obtidos foram
134
expressos em percentagem de transmissão, segundo Goulart & Paiva
(1990).
Aproveitando-se uma parte (50%) das plântulas das
unidades experimentais, procedeu-se à quantificação do número de
esporos produzidos na extremidade apical por coleóptilo e a
incidência de coleóptilos com esporulação (%) sobre o número total
de coleóptilos removidos.
Os valores obtidos foram submetidos à análise de
distribuição normal, análise de variância e à regressão polinomial.
Evolução da transmissão e potencial de esporulação
Neste experimento, empregaram-se sementes da cultivar
BR-2, com 30% de infecção por B. sorokiniana. As sementes foram
semeadas individualmente nos mesmos recipientes do Experimento 1.
O substrato empregado foi areia de rio lavada e peneirada sem
esterilizar. Um total de trezentas sementes, distribuídas em três
repetições, foi semeado, de modo a se viabilizar as avaliações a cada
sete dias e por um período de seis semanas. Este experimento foi
conduzido em câmara climatizada, com temperatura (25
2 oC) e
luminosidade (fotoperíodo de 12 horas) controladas e, umidade
relativa parcialmente controlada (80 – 95%). A umidade do substrato
foi mantida mediante irrigação semanal. A irrigação foi feita por
absorção de água pelo substrato através do fundo da bandeja.
Semanalmente, removeram-se, individual e assepticamente, as
extremidades apicais de coleóptilos (50% da população de plântulas),
aproximadamente 1 a 1,5 cm de comprimento acima do nível do solo,
plaqueando-se, imediatamente e sem desinfestação, em meio seletivo
de Reis, do mesmo modo que foi exposto no Experimento 1.
135
Previamente ao plaqueamento, os coleóptilos foram classificados em
assintomáticos e sintomáticos. Os dados foram expressos em
percentagem
de
coleóptilos
colonizados
e
percentagem
de
transmissão. Os valores de transmissão (%) foram ajustados ao
modelo monomolecular (Bergamin Filho & Amorin, 1996), uma vez
que a doença só apresentou ciclo primário com inóculo inicial
proveniente da semente.
Com o restante da amostra de plântulas (50%) de cada
unidade experimental, procedeu-se à remoção dos coleóptilos, que
foram transferidos para tubos de ensaio contendo 5 mL de água
esterilizada (+ 2 gotas de Tween/L), previamente classificados em:
completamente
sintomáticos,
parcialmente
sintomáticos
e
assintomáticos. Antes de serem colocados nos tubos, as extremidades
dos coleóptilos foram examinadas individualmente, com auxílio de
uma lupa binocular (50 ×), com a finalidade de quantificar o número
de coleóptilos com esporulação e, assim, poder estabelecer, com maior
aproximação, o número de esporos por coleóptilo, bem como a
incidência de coleóptilos com esporulação sobre o total de coleóptilos
removidos. Os coleóptilos nos quais foi constatada a presença de
esporos, separadamente segundo a classificação mencionada, foram
levados ao laboratório, onde se procedeu à agitação com ajuda de um
vortex, por 60 segundos, para, em seguida, realizar a contagem do
número de conídios presentes, em cinco gotas da suspensão de volume
conhecido (30 µL), mediante varredura ao microscópio (lamínula de
24 × 32 mm). Procurou-se, dessa maneira, quantificar a esporulação
nos ápices dos coleóptilos expostos à luz, em função do tempo, após a
semeadura. Os dados foram expressos em número de esporos por
coleóptilo e incidência de coleóptilos com esporulação (%).
136
Finalmente, esse dados foram submetidos à análise de distribuição
normal, análise de variância e à regressão linear simples.
RESULTADOS
Temperatura vs. transmissão. Os resultados obtidos nos
diferentes ensaios são apresentados na Tabela 1. Os dados de
transmissão foram calculados em função da incidência de B.
sorokiniana na semente, obtidos em condições de laboratório (Tabela
1).
Os
dados
obtidos
nas
parcelas
com
fungicidas,
independentemente do órgão afetado, apresentaram níveis de
incidência e transmissão de zero em todas as condições de
temperatura, demonstrando o elevado grau de fungitoxicidade que o
fungicida iminoctadina (70 g i.a./100 kg sementes) apresenta contra B.
sorokiniana, independentemente das variações de temperatura. In
vitro, a incidência do fungo na semente tratada oscilou entre 0 e 0,3%.
Em função desse fato, todos os dados expostos a seguir correspondem
às parcelas testemunhas.
Os dados de transmissão, tanto ao coleóptilo (extremo
apical e região subterrânea) como ao mesocótilo, evidenciam a
supremacia da transmissão sintomática sobre a assintomática em todas
as condições de temperatura (Tabela 1). Ao mesmo tempo, todos os
dados de transmissão obtidos nos diferentes órgãos da plântula
(coleóptilo, mesocótilo, bainha e plúmula) demonstram que a mesma
137
138
seguiu um padrão semelhante, incrementando-se progressivamente à
medida que a temperatura aumentou até 25 oC para, posteriormente,
diminuir à medida que a temperatura se aproximou de 30 oC (Tabela
1). Os maiores níveis de transmissão foram obtidos com 25 oC, sendo
o nível mais alto para coleóptilos (40%), intermediário para bainhas
(32%) e relativamente baixo para plúmulas (8%). Em relação aos
órgãos subterrâneos, registrou-se 28% de transmissão para os
mesocótilos. No caso da porção subterrânea dos coleóptilos, o maior
nível foi registrado sob condições de 20 oC de temperatura, com 65%
de transmissão. Em geral, os valores de transmissão registrados na
região subterrânea dos coleóptilos foram maiores do que os
registrados para as extremidades apicais em todas as temperaturas
testadas (Tabela 1).
Em função do comportamento observado entre a
temperatura e a transmissão nos diferentes órgãos da plântula (aéreos
e subterrâneos), as variáveis avaliadas foram submetidas à análise de
regressão, com a finalidade de estabelecer relações estatisticamente
significativas entre elas.
Nos órgãos aéreos (Figura 1), as relações entre
temperatura vs. coleóptilos extremo apical e temperatura vs. bainhas,
foram
representadas
por
equações
polinomiais
quadráticas
significativas (P < 0,05). Na primeira relação, os dados demonstram
um aumento crescente da transmissão de B. sorokiniana ao coleóptilo
com o incremento da temperatura, atingindo o nível mais alto de
transmissão a 20,5 oC. Quanto que na segunda relação, a transmissão
do fungo às bainhas alcançou o ponto máximo de transmissão com
21,3 oC.
139
y = -0.2464x 2 + 10.118x - 69.702
R2 = 0.480
P = 0.020
60
Transmissão (%)
45
30
15
0
0
5
10
15
20
25
30
35
25
30
35
o
Temperatura ( C)
50
y = -0.2024x 2 + 8.6076x - 63.054
R2 = 0.633
P = 0.002
Transmissão (%)
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
Te mpe ratura ( o C)
Figura 1.
Transmissão de Bipolaris sorokiniana, a partir de
sementes naturalmente infectadas, para ápices de
coleóptilos (acima) e bainhas (abaixo) [dados
transformados a arc sen ((x + 1)/100)] de plântulas de
cevada, em função da temperatura.
140
80
Transmissão (%)
60
40
20
y = -0.3206x 2 + 11.606x - 44
R2 = 0.701
P = 0.001
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Te mpe ratura ( o C)
50
y = -0.1916x 2 + 8.1441x - 59.485
R2 = 0.593
P = 0.005
Transmissão (%)
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
o
Te mpe ratura ( C)
Figura 2.
Transmissão de Bipolaris sorokiniana, a partir de
sementes naturalmente infectadas, para a região
suterrânea de coleóptilos (acima) e mesocótilos
(abaixo) de plântulas de cevada, em função da
temperatura.
141
De igual modo, nos órgãos radiculares (Figura 2), as
relações temperatura vs. coleóptilo região subterrânea e temperatura
vs. mesocótilos, foram representadas por equações de tipo polinomial
quadrática, revelando pontos máximos na eficiência de transmissão,
correspondentes a 18,1 oC para os coleóptilos e 21,3 oC para os
mesocótilos, corroborando as margens de temperatura que foram
encontrados nos órgãos aéreos da plântula.
Por outro lado, as Figuras 1 e 2 permitem observar que as
maiores variações entre os dados (três repetições) aconteceram a 25 oC
isto, ao parecer, como conseqüência da presença indesejável de S.
rolfsii, que ao ocasionar a morte prematura de plântulas, influenciou
negativamente na uniformidade dos mesmos.
O número médio de esporos por coleóptilo evidenciou
variações de acordo à temperatura, incrementando-se de 171 esporos,
a 10 oC, até 1046 esporos, a 20 oC, com 1046 esporos, para
posteriormente diminuir pregressivamente, sendo que a menor
quantidade de esporos foi registrada a 30 oC (36 esporos). O número
de esporos registrados a 15 oC (847 esporos) foi maior do que a 25 oC
(485 esporos).
Ao analisar estatisticamente o efeito da temperatura sobre
a esporulação do fungo nos coleóptilos, os dados adaptaram-se a uma
relação de tipo polinomial quadrática significativa (P < 0,01) (Figura
3). Segundo a qual os dados demonstraram um aumento crescente do
número de esporos de B. sorokiniana nas extremidades apicais do
coleóptilo, com o incremento da temperatura, atingindo o nível
máximo (ponto máximo) de esporulação a 19,3 oC, com 952 esporos.
No caso dos coleóptilos procedentes das parcelas com fungicida,
constatou-se a presença de descolorações, porém sem esporulação.
142
1400
y = -8.5948x 2 + 331.15x - 2238.2
R2 = 0.738
P < 0.001
Esporos/cpleóptilo (n o )
1200
1000
800
600
400
200
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Temperatura ( o C)
Figura 3. Esporulação de Bipolaris sorokiniana em extremidades
apicais de coleóptilos, a partir de sementes de cevada
naturalmente infectadas, em função da temperatura.
A incidência de esporulação nos coleóptilos com
descoloração (Tabela 2) sobre o total de coleóptilos removidos (%)
apresentou um comportamento ascendente até os 20 oC, temperatura
na qual ocorreu a maior percentagem de coleóptilos com descoloração
parda e com a presença de frutificação do fungo. Entre as
temperaturas de 20 e 25
o
C, a incidência foi decrescendo
moderadamente para, posteriormente, diminuir de forma drástica à
medida que a temperatura foi se incrementando para 30 oC.
Os ensaios conduzidos permitiram obter informações
adicionais sobre o efeito da temperatura sobre a variabilidade no
tempo requerido para a emergência das plântulas e para o surgimento
dos primeiros coleóptilos com descoloração após da semeadura
143
(Tabela 2). Os dados mostraram uma tendência decrescente à medida
que a temperatura foi incrementada para ambos os casos.
Tabela 2. Efeito da temperatura sobre outras características
avaliadas
Temperatura Emergência
(o C)
(DAS1)
Surgimento
primeiros coleóptilos
manchados
(DAS1)
20 – 22
Incidência de
esporulação em
coleóptilos
(%)2
0,6
10
11 – 12
15
7–8
11 – 13
1,9
20
4–5
8 – 10
9,6
25
3–4
9 – 11
8,7
30
2–3
4–5
1,4
(1) DAS = dias após a semeadura.
(2) Percentagem calculada em função do total de coleóptilos removidos.
Evolução da transmissão em função do tempo e
potencial de esporulação. A presença do patógeno, na extremidade
apical do coleóptilo foi detectada aos dez dias após a semeadura
(DAS) (a emergência ocorreu três a quatro DAS) (Figura 4), sendo
que, entre os 10 a 17 DAS, os valores de transmissão aumentaram
significativamente em aproximadamente 414%, e 36% entre os 17 a
24 DAS. Para nas últimas duas semanas (24 a 38 DAS) registrar
incrementos inferiores a 18%; quando se registrou uma eficiência de
transmissão próxima a 60% (38 DAS).
A evolução da transmissão do fungo aos extremos apicais
dos coleóptilos, quando ajustada ao modelo monomolecular (Figura
4), evidenciou uma taxa de rm = 0,029.
Por outro lado, a classificação dos coleóptilos em três
categorias permitiu observar que o maior número de coleóptilos
144
infectados por B. sorokiniana situou-se dentro do grupo dos
fortemente manchados, nos cinco períodos avaliados (Tabela 3). O
número de coleóptilos assintomáticos foi muito reduzido (< 1
coleóptilo/período).
Es tim a do (m o de lo m o no m o le c ula r)
Real
70
y = 1 - (1.162*Exp (-0.029*T )
R2 = 0.86
P < 0.01
Transmissão ao coleóptilo (%)
60
49
58
50
47
36
40
30
20
10
7
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Dias após a semeadura
Figura 4. Evolução no tempo da transmissão de Bipolaris
sorokiniana da semente à extremidade apical de
coleóptilos.
No decorrer das avaliações, observou-se que o número de
plantas mortas foi se incrementando com o transcorrer do tempo
(Tabela 3), mas os estudos feitos in vitro demonstraram que
aproximadamente 100 a 82% (dependendo do período avaliado) foram
ocasionadas por Fusarium spp. Na última semana, apenas 18% das
plântulas mortas foram causadas por B. sorokiniana. Nas avaliações
anteriores, o fungo predominante foi Fusarium spp.
145
Tabela 3. Evolução da presença de descolorações em coleóptilos
em função do tempo
Dias1
7
Incidência de coleóptilos com
Incidência
B. sorokiniana (%)
plantas
Fortemente Parcialmente Assintomáticos Total
mortas
manchados manchados
(%)2
2,0
0,0
0,0
3,6
2,0
14
6,7
3,3
0,7
10,7
4,2
21
12,7
2,0
0,0
14,7
1,7
28
10,7
2,7
0,7
14,1
6,8
35
16,7
0,7
0,0
17,4
16,0
(1) Após a emergência. Emergência ocorreu três dias após da semeadura.
(2) Percentagem calculada em função do total de plântulas.
A esporulação do fungo iniciou-se a partir dos 17 DAS e,
após, incrementou-se continuamente até a última semana (Figura 5a).
Entre a segunda e terceira semana, ocorreu o maior incremento dentro
do período de avaliação, com mais de 1000%. Na última semana, o
número médio de conídios por coleóptilo foi maior do que 1100. A
incidência de coleóptilos com esporulação do fungo mostrou
tendência similar (Figura 5b).
Ao relacionar o número de conídios por coleóptilo vs.
tempo (Figura 5a) e a incidência de colóptilos com esporulação
(Figura 5b) vs. tempo, observou-se que, no primeiro caso, a
esporulação nos coleóptilos incrementa-se em aproximadamente 43
conídios por dia; enquanto que na segunda relação, a presença de
coléoptilos com esporulação (incidência), aumenta a cada três dias,
aproximadamente.
146
1400
y = 43.314x - 503.14
R2 = 0.940
P = 0.006
Número de conídios/coleóptilo
1200
1157
1000
800
681
781
600
400
200
0
0
5
a
63
0
10
15
20
25
30
35
40
Dias após a semeadura
14
y = 0.3857x - 3.8571
R2 = 0.921
P = 0.009
Coleóptilos com esporulação
(%)
12
12
10
8
6
6
6
4
2
3
b
0
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Dias após a semeadura
Figura 5. Esporulação de Bipolaris sorokiniana em extremidades
apicais de coleóptilos infectados a partir de sementes de
cevada naturalmente infectadas.
147
DISCUSSÃO
Temperatura vs. transmissão. A transmissão dos
patógenos
a
partir
de
sementes
e
seu
estabelecimento
e
desenvolvimento no hospedeiro são influenciados pelas condições
ambientais, sendo a temperatura e a umidade os fatores mais
importantes (Gabrielson, 1987; Agarwal & Sinclair, 1997). Os
resultados obtidos relativos à temperatura nas quais o fungo B.
sorokiniana passa eficientemente da semente para os órgãos aéreos e
radiculares de plântulas de cevada mostraram uma estreita margem
térmica, que oscilou entre 18,7 e 21,8 oC, sendo a média de 19,7 oC (
20 oC). Clark & Dickson (1957) reportam que o desenvolvimento de
plântulas com sintomas de crestamento por B. sorokiniana e podridão
de raízes pode se desenvolver severamente numa ampla faixa de
temperatura (8 a 28
o
C); porém, segundo esses autores, o
desenvolvimento máximo geralmente ocorre com 20 oC. Contudo, a
literatura mostra com bastante freqüência que a temperatura ótima
para que B. sorokiniana infecte os órgãos verdes situa-se na faixa de
22 e 30 oC (Khanna & Shukla, 1981; Luz & Bergstrom, 1986;
Filippova & Kashemirova, 1991, entre outros). Essa faixa corrobora
parcialmente os resultados obtidos no presente trabalho, pois, ao se
observar diretamente esses dados, evidencia-se que, na maioria dos
casos, o maior nível de transmissão foi alcançado com 25 oC,
diminuindo rapidamente à medida que a temperatura aproximou-se de
30 oC. Nesse sentido, é possível deduzir que, para que o processo de
transmissão seja bem sucedido, as condições de temperatura não
necessariamente devem ser as mesmas especificadas para a infecção
dos órgãos aéreos, sendo provavelmente restritas a uma faixa térmica
148
ligeiramente mais estreita e inferior, que poderia situar-se entre 18 e
25 oC. Por outro lado, os resultados alcançados, não permitiram
detectar influência alguma da temperatura na preferência de
transmissão do fungo aos órgãos aéreos e/ou radiculares, como foi
relatado por Forcelini (1992).
Em relação aos níveis máximos de transmissão alcançados
nos diferentes órgãos (8,1 – 65,4%), nenhum valor superou a taxa
encontrada em outros estudos executados por Toledo et al. (no prelo),
nos quais a eficiência da transmissão de B. sorokiniana alcançou
níveis próximos a 90%. As razões que explicariam essa diferença,
considerando que se trabalhou com a mesma semente, poderiam
resumir-se a um aspeto fundamental, o substrato empregado (solo
natural não esterilizado). Conseqüentemente, a microflora natural
(antagonismo e supressão) presente no solo, como manifestam
Ledingham (1949), Baker & Smith (1966), Kamyshko et al. (1976),
Dhingra et al., (1980), Tanaka & Machado (1985), Turhan &
Grossmann (1988), Agarwal & Sinclair (1997), pode reduzir a
passagem do patógeno das sementes para os órgãos da planta. Esses
autores afirmam que a microflora do solo pode inibir ou ser
antagônica aos patógenos veiculados por sementes, quando essas são
semeadas no solo, pois entram em competição direta com os
microorganismos presentes na microflora natural do solo, onde nem
sempre são bem sucedidos, podendo ocorrer uma inibição ou
eliminação deles. Resultados de pesquisa nessa área têm mostrado
claramente que, quando sementes infectadas são semeadas em solo
esterilizado, a incidência de doença é maior do que quando a
semeadura é feita em solo não esterilizado (Tanaka & Machado,
1985). Relatos de antagonismo, por exemplo, entre Fusarium spp. e B.
149
sorokiniana, são reportados por Scardaci & Webster (1981) e
Gutiérrez (1975).
Um aspecto particular que merece consideração foi a
presença de S. rolfsii no ensaio conduzido a 25 oC, onde esse fungo
infectou um número de plântulas de até 10%, ocasionando a morte
prematura e, conseqüentemente, interferindo no processo de
transmissão de B. sorokiniana. Provavelmente, essa seja a causa pela
qual
a
eficiência
da
transmissão
alcançada
nesse
ensaio,
principalmente na parte subterrânea dos coleóptilos, foi inferior à
quantificada a 20 oC.
Com relação à influência da temperatura sobre a
esporulação de B. sorokiniana nos coleóptilos, os resultados
mostraram que o ponto ótimo situou-se em torno de 20 oC, quando foi
alcançado o maior número de esporos por coleóptilos (> 1000
conídios), assim como a maior incidência de coleóptilos com
esporulação (10%). Esses resultados são confirmados pelo trabalho
feito por Kararah et al. (1981), os quais observaram que a esporulação
ocorre com temperaturas que se encontram em torno de 20 oC. Por
outro lado, sob condições de 25 oC, foi possível observar a presença
de alguns coleóptilos com alta incidência de conidióforos, mas sem ou
com poucos conídios, situação que provavelmente seja atribuída à
temperatura.
Evolução da transmissão em função do tempo e
potencial de esporulação. A presença de B. sorokiniana na
extremidade apical dos coleóptilos, registrada a partir da primeira
semana após da emergência das plântulas (10 DAS), demonstra que,
sob condições ambientais favoráveis (25
o
C e UR > 80%), a
transmissão do fungo pode se efetuar eficientemente nos primeiros
150
estádios de desenvolvimento das plântulas de cevada, assegurando,
desde muito cedo, a presença do fungo na lavoura. Em estudos
semelhantes, Reis & Forcelini (1993) relatam que o fungo foi
detectado em coleóptilos de plântulas de trigo, a partir da segunda
semana após da semeadura diferença que provavelmente pode ser
atribuída ao fato de que esse trabalho foi desenvolvido sob condições
semicontroladas, sobretudo de temperatura (casa de vegetação), que
provavelmente contribuíram para o retardamento do surgimento dos
primeiros coleóptilos infectados. Em relação ao incremento ou
evolução da transmissão, a tendência observada no presente
experimento mostra similaridade com os resultados encontrados por
esses autores, nos que o incremento contínuo da transmissão foi
evidente até os 28 dias (quarta semana) após a semeadura para, depois,
manter-se estável entre os 28 e 42 dias e, finalmente, declinar na
última semana (sétima).
Quanto à eficiência máxima de transmissão (58%)
ocorrida aos 35 dias após da emergência, no segundo experimento
(substrato areia), diferiu significativamente do obtido por Toledo et al.
(no prelo) em trabalhos de controle de B. sorokiniana na semente,
através do uso de solventes orgânicos como veículos de fungicida, nos
quais a eficiência da transmissão alcançou níveis próximos a 90%. A
constatação da presença do fungo Fusarium spp. (predominantemente
F. graminearum, teleomorfo Giberella zeae), tanto em plântulas
mortas (incidência > 80%) como em coleóptilos com sintomas
pronunciados de descoloração (em ambos os casos transmitidos pela
semente), parece indicar a razão pela qual o nível de transmissão não
atingiu valores mais elevados. Scardaci & Webster (1981) reportam a
ocorrência de antagonismo entre F. graminearum e B. sorokiniana,
151
quando ambos infectam simultaneamente os tecidos da cevada,
resultando em baixos níveis de crestamento de plântulas e podridões
de raízes. Segundo esses autores, ambos os patógenos competem com
igual eficiência pelo substrato quando conseguem infectar juntamente
os tecidos. Porém, quando um deles infecta primeiro, o seu isolamento
resulta mais freqüente, demonstrando a importância da colonização e
possessão inicial do substrato. Relatos de antagonismo entre F.
culmorum e B. sorokiniana já tinham sido observados por Ledingham
em 1942 (Scardaci & Webster, 1981). Gutiérrez (1975) reporta a
existência de antagonismo entre Fusarium sp. e H. sativum sob
condições de laboratório (in vitro). Por outro lado, a literatura relata a
possibilidade da existência de um tipo de "sinergismo" entre B.
sorokiniana e F. acuminatum, onde o primeiro pode se tornar ainda
mais agressivo na presença do outro (Fernandez et al., 1985).
A presença de esporos do fungo a partir da segunda
semana após a emergência (> 17 DAS), da mesma forma que a
manifestação dos primeiros coleóptilos infectados, parece ter sido
fortemente influenciada principalmente pela temperatura na que se
desenvolveu o ensaio. Segundo Andersen (1952) e Clark & Dickson
(1958), a temperatura ótima para a germinação de conídios,
crescimento micelial e esporulação de H. sativum encontra-se na faixa
de 24 a 28 oC, sendo que o ponto máximo de esporulação a 25 oC
(Patil et al., 1987). Reis & Forcelini (1993) observaram os primeiros
sinais de esporulação a partir da terceira semana após da semeadura.
Segundo esses autores, o ponto máximo foi alcançado na quarta
semana, quando foram quantificados 1509 conídios por coleóptilo,
tendo posteriormente declinado. Tal redução, segundo esses autores,
provavelmente
seja
conseqüência
do
avançado
estado
de
152
decomposição e de exaustão nutricional dos tecidos do coleóptilo. Em
contraste, a tendência observada no presente ensaio foi sempre
ascendente até a última semana de avaliação (quinta), na qual foram
contabilizados aproximadamente 1100 conídios por coleóptilo. O
número de avaliações semanais não permitiu estabelecer o momento
em que a produção de esporos começa a diminuir.
Em geral, Reis & Forcelini (1993) salientam que a
importância da semente como fonte de inóculo primário decorre da
eficiência da transmissão e do potencial de esporulação do parasita, a
partir do momento em que a plântula atinje a superfície do solo.
Finalmente, deve ser mencionado que a transmissão de B. sorokiniana
é tão eficiente que, muitas vezes, supõe-se que o inóculo venha de
fontes de inóculo externas e trazido pelo vento, quando, na verdade,
vem da própria semente.
CONCLUSÕES
A temperatura afetou significativamente a passagem do
fungo das sementes para os órgãos aéreos e radiculares de plântulas de
cevada.
A maior eficiência da transmissão ocorreu na faixa térmica
o
de 18 – 25 C, sendo que os pontos máximos de transmissão oscilaram
entre 18,1 e 21,3 oC, seguindo tendências polinomiais quadráticas. A
esporulação máxima em coleóptilos ocorreu a 19,3 oC.
Sob condições ambientais favoráveis, a presença de
coleóptilos infectados com B. sorokiniana foi evidente a partir de dez
dias após a semeadura, quanto a evolução da transmissão foi
representada matematicamente pelo modelo monomolecular.
153
A infecção e a esporulação em coleóptilos seguiram uma
tendência linear ascendente nos primeiros trinta e oito dias após a
semeadura.
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CAPÍTULO V
EFEITO DE SOLVENTES ORGÂNICOS USADOS COMO
VEÍCULOS DE FUNGICIDAS NO CONTROLE IN VITRO E IN
VIVO DE Bipolaris sorokiniana EM SEMENTES DE CEVADA
Javier Toledo Barba, Erlei Melo Reis & Carlos A. Forcelini
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária
Universidade de Passo Fundo
C. P. 611, 99001-970 Passo Fundo, RS
RESUMO
________________________________________________________
TOLEDO, J.; REIS, E.M. & FORCELINI, C.A. Efeito de solventes
orgânicos usados como veículos de fungicidas no controle in vitro e in
vivo de Bipolaris sorokiniana em sementes de cevada.
Uma característica que torna B. sorokiniana um
importante patógeno na cultura da cevada é a sua capacidade de
infectar e ser transmitido pela semente, podendo atingir níveis de
incidência próximos a 100%, o que torna os fungicidas existentes no
mercado incapazes de erradicar ao fungo. Nesse sentido, o objetivo
deste trabalho foi comparar e avaliar, in vitro e in vivo, o efeito de
solventes orgânicos,utilizados como veículos de fungicidas na
erradicação do fungo em sementes de cevada. Foram empregados o
monoetilenoglicol (MEG) e o propilenoglicol (PPG), ambos a 0,5, 1 e
158
2%. Os fungicidas testados foram a iminoctadina, a iprodiona, o
triadimenol, o triticonazole, o flutriafol e o difenoconazole. A
incidência do fungo foi determinada pelo plaquamento das sementes
em meio seletivo de Reis. A erradicação do fungo da semente foi
obtida nos tratamentos com iminoctadina + MEG; iminoctadina +
PPG (a 1 e 2%) e iprodiona + PPG (2%). A eficiência dos demais
fungicidas foi melhorada substancialmente com o emprego dos
solventes orgânicos, mas sem alcançar a erradicação do fungo. In vivo
(em câmara climatizada a 25 2 oC e 80 a 95% de UR), a testemunha
registrou níveis de transmissão de 89,7% para o coleóptilo e de 12,3%
para a plúmula. Diferentemente dos dados obtidos in vitro, o emprego
do PPG influenciou muito pouco no controle da transmissão, pois os
fungicidas comportaram-se satisfatoriamente (> 90% de controle)
quando misturados com água. Os fungicidas iminoctadina e
difenoconazole foram 100% efetivos em evitar a transmissão do fungo
das sementes para os coleóptilos. Os solventes orgânicos mostraram
potencialidade para melhorar a eficiência da maioria dos fungicidas
testados in vitro, aspecto que não foi corroborado in vivo.
Palavras-chave:
Hordeum
vulgare,
propilenoglicol, patologia de sementes.
monoetilenoglicol,
ABSTRACT
________________________________________________________
TOLEDO, J.; REIS, E.M. & FORCELINI, C.A. Effect of organic
solvents used as vehicles for fungicides on the in vitro and in vivo
control of Bipolaris sorokiniana through seed treatment.
An important pathogenic feature of the fungus Bipolaris
sorokiniana is its capacity to infect and to be transmitted through
barley seeds, sometimes in levels up to 100%, which turns fungus
eradication very difficult with the available fungicides. As an attempt
to improve the control of the seed-borne fungus inoculum, two
organic solvents (monoethyleneglycol – MEG and propyleneglycol –
PPG, both at 0.5, 1, and 2%) were tested as vehicle for fungicides
(iminoctadine, iprodione, triadimenol, triticonazol, flutriafol, and
difenoconazol) used for seed dressing. The in vitro (in Reis selective
medium) fungus eradication was obtained with iminoctadine + MEG,
iminoctadine + PPG (at 1 and 2%), and iprodione + PPG (2%). The
159
other fungicides had their efficacy improved by the organic solvents
but they did not reach 100% control. The fungus in vivo (growth
chamber adjusted to 25 2 oC and 80-95% RU) transmission was
89.7% to coleoptiles and 12.3% to plumules. All fungicides reduced
the fungus transmission by more than 90% and the use of PPG did not
improve fungicide performance significantly. Iminoctadine and
difenoconazol completely inhibited the fungus transmission to
coleoptiles. In conclusion, the positive in vitro effects of the organic
were not confirmed in vivo.
Key words: Hordeum vulgare, monoethyleneglycol, propyleneglycol,
seed pathology.
INTRODUÇÃO
A transmissão de patógenos por sementes é um
mecanismo eficiente pelo qual os fitopatógenos são introduzidos em
novas áreas de cultivo, disseminados a longas distâncias, selecionados
e disseminados como raças específicas a determinados hospedeiros e
distribuídos através da população de plantas como focos de inóculo
primário (Baker & Smith, 1966; Tanaka & Machado, 1985; Maffia et
al., 1988).
Associados a sementes de cevada, cerca de 48 patógenos
já foram relatados no mundo, incluindo não apenas fungos, mas
também bactérias e vírus (Richadrson, 1979; Luz, 1982; Luz &
Minella, 1982). No Brasil, existe uma grande flutuação na prevalência
dos patógenos nas sementes de cevada, de acordo com as regiões e as
safras agrícolas. De modo geral, Cochliobolus sativus (Ito & Kurib.)
Drechs. & Dastur [Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem.] e
Pyrenophora teres (Died.) Drech. [Drechslera teres (Sacc.) Shoem.]
160
são os organismos de maior ocorrência nos grãos de cevada (Luz,
1982; Luz & Minella, 1982; Diehl & Minella, 1985).
Em geral, os danos produzidos por B. sorokiniana nas
sementes de cevada se traduzem na diminuição da germinação,
redução no rendimento e na qualidade dos grãos e do malte; além
disso, o fato de ter a capacidade de infectar e ser transmitido pela
semente torna-o um fungo de importância potencial para a cultura da
cevada, sobretudo quando as condições ambientais se apresentam
favoráveis ao desenvolvimento da doença.
No trigo, estudos feitos sobre a eficiência de transmissão
desse fungo relatam níveis de até 88% ao coleóptilo (Reis & Forcelini,
1993) e 38% à plúmula (Toledo et al., 1996). Em conseqüência,
devido à elevada taxa de transmissão que B. sorokiniana apresenta,
Reis (1987) considera que o controle desse fungo deve ser orientado à
erradicação na semente, a fim de reduzir o inóculo primário na
lavoura. Porém, a constatação de lotes de sementes de cevada
altamente infectadas por este fungo, com níveis de incidência
próximos a 100%, tornam os fungicidas existentes no mercado
incapazes de erradicar esses altos níveis de infeção e impedir a
passagem do fungo para a parte aérea da planta.
Uns dos avanços no tratamento químico de sementes
refere-se às possibilidades de se utilizar solventes orgânicos (Menten,
1996). Segundo Dhingra & Acuña (1997), o seu uso apresenta várias
vantagens sobre os métodos convencionais, tais como: a) as sementes
permanecem secas, não necessitando de nova secagem; b) não
estimula o processo da germinação; c) evita a imbibição e o aumento
de volume das sementes (inchaço) e, o mais importante, d) favorece a
161
penetração de fungicidas na semente, o que evita a remoção por
manipulação e a sua diluição em solos muito úmidos.
O tratamento de sementes com solventes orgânicos tem
sido recomendado para sementes de oleaginosas (Dhingra &
Muchovej, 1980; Dhingra & Muvhovej, 1982; Muchovej, 1987;
Muchovej & Dhingra, 1979; Muchovej & Dhingra, 1980), assim como
para sementes de hortaliças (Muchovej et al., 1980).
O controle de fungos de sementes de cereais, através do
uso de fungicidas veiculados por solventes orgânicos, tem sido pouco
ou escassamente investigado no mundo. Vidhyasekaran (1980), em
trabalhos de controle químico de Drechslera oryzae (Breda de Haan)
Subram. & Jain., em sementes de arroz, conseguiu erradicar o fungo
de todas as partes da semente, através da guazatina + diclorometano,
quando essas foram imersas na mistura pelo tempo de uma hora. No
Brasil, Purchio & Muchovej (1990) relatam que as misturas
de
captam + benzeno e triadimenol + acetona podem reduzir
significativamente a percentagem de B. sorokiniana em sementes de
trigo, porém nenhuma das combinações testadas (fungicida +
solvente) por esses autores logrou a erradicação do fungo-alvo de
controle.
Nesse sentido, o presente trabalho objetivou avaliar in
vitro e in vivo o efeito de solventes orgânicos utilizados como veículos
de fungicidas na erradicação de B. sorokiniana em sementes de
cevada.
162
MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi conduzido nas dependências da
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de
Passo Fundo - RS no período de junho/2000 a fevereiro/2001.
Teste em laboratório (in vitro)
Os fungicidas testados foram: iminoctadina 20% (70 g
i.a./100 kg sementes), iprodiona 50% (50 g i.a./100 kg), triadimenol
15% (40 g i.a./100 kg), triticonazole 20% (45 g i.a./100 kg), flutriafol
2,5% (7,5 g i.a./100 kg) e difenoconazole 15% (30 g i.a./100 kg). Os
solventes orgânicos utilizados foram: monoetilenoglicol (MEG) e
propilenoglicol (PPG), ambos nos volumes de 500, 1000 e 2000
mL/100 kg sementes (0,5, 1 e 2%), comparados com água (2000
mL/100 kg sementes) e uma testemunha (semente misturada com
água). Foram utilizadas sementes do cultivar BR 2, com incidência
aproximada de B. sorokiniana de 58%. Cada fungicida constituiu um
ensaio com oito tratamentos (ver Tabela 1).
Para cada tratamento, 100 g de sementes foram pesadas,
acondicionadas em frascos de Erlenmeyer de 500 mL de volume,
acrescidas do fungicida + solvente (previamente misturados num
vortex por espaço de 30 a 60 segundos) e agitadas durante cinco
minutos, até conseguir uma boa cobertura da semente. A seguir, foram
distribuídas quatrocentas sementes (unidade experimental constituída
por dez placas de Petri com dez sementes cada uma e quatro
repetições) em meio seletivo de Reis (Reis, 1983). As sementes foram
incubadas em sala de crescimento sob fotoperíodo de 12 horas à
temperatura de 25 ± 2 oC, durante dez dias. Decorridos 11 dias após
163
do plaqueamento, as sementes foram examinadas sob microscópio
esteroscópico, com magnitude de 40×, para a observação da
frutificação de B. sorokiniana. Considerou-se infectada a semente
sobre a qual o fungo produziu, no mínimo, um conidióforo com um
conídio.
Tabela 1. Relação dos tratamentos
Misturas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Dose do solvente
(mL/100 kg sementes)
----2000
500
1000
2000
500
1000
2000
Testemunha
Fungicida + água
Fungicida + monoetilenoglicol
Fungicida + monoetilenoglicol
Fungicida + monoetilenoglicol
Fungicida + propilenoglicol
Fungicida + propilenoglicol
Fungicida + propilenoglicol
O
delineamento
experimental
foi
de
parcelas
completamente casualizadas. Os valores obtidos (percentagem de
incidência do fungo) foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) e as médias foram comparadas mediante o teste de Tukey
(P > 0.05). Previamente à análise de variância, os valores foram
submetidos à análise de normalidade.
Teste em câmara climatizada (in vivo)
Efeito dos solventes orgânicos na germinação. Com a
finalidade de detectar provável efeito fitotóxico dos solventes
orgânicos na germinação e emergência das plântulas, executou-se um
ensaio no qual foram comparados três tratamentos: semente + água,
semente + MEG e semente + PPG. Cada solvente foi utilizado no
164
volume de 2000 mL por 100 kg de sementes. Em cada unidade
experimental foram semeadas cinqüenta sementes. O delineamento
experimental foi de tratamentos completamente casualizados, com
oito repetições. A avaliação do número de plântulas emergidas foi
realizada aos 15 dias após da semeadura. A metodologia empregada
foi a mesma detalhada nos testes de transmissão e controle.
Os dados obtidos foram expressos em percentagem de
plantas emersas e submetidos à análise de variância (P < 0,05),
comparando-se as médias pelo teste de Tukey (5%). Previamente à
análise de variância, os valores foram submetidos à análise de
normalidade.
Transmissão e controle. O ensaio foi conduzido em função
dos resultados obtidos no Experimento 1, no qual foram comparados
treze tratamentos, constituídos pelos seis fungicidas testados, cada um
deles misturados com água e com PPG, mais uma testemunha (Tabela
2). Utilizaram-se sementes de cevada, cultivar BR-2, naturalmente
infectadas com B. sorokiniana (aproximadamente 41%).
Antes do ensaio in vivo, os tratamentos foram avaliados
em laboratório (teste in vitro), com a finalidade de comprovar os
resultados do primeiro ensaio e determinar a incidência de B.
sorokiniana nas sementes. A metodologia empregada foi a mesma do
experimento 1, com cem sementes por unidade experimental,
distribuídas ao acaso, em três repetições.
No ensaio in vivo, a unidade experimental foi constituída
de uma moldura de madeira (caixa) de 41
encaixada numa bandeja de alumínio de 46
28
31
10 cm de altura,
5 cm de altura,
contendo areia + solo de horta (3:1), com pH corrigido (6,0). A areia
empregada possuía uma concentração de 6 ppm de manganês. O
165
substrato foi esterilizado em duas oportunidades, em autoclave a 121
o
C e 1,5 atmosferas, por um período de 45 minutos. O substrato foi
irrigado 24 horas antes da semeadura com água de torneira + adubo
foliar (1 mL/L de água). Em cada caixa, perfuraram-se cem orifícios
de 2,5 cm de profundidade e 0,7 cm de diâmetro (com ajuda de um
bastão de vidro), cada qual recebendo uma semente.
Tabela 2. Misturas (fungicida + solvente) e doses utilizadas no
tratamento de sementes de cevada
Misturas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Testemunha (semente s/fungicida)
Iminoctadina + água
Iprodiona + água
Triadimenol + água
Triticonazole + água
Flutriafol + água
Difenoconazole + água
Iminoctadina + PPG
Iprodiona + PPG
Triadimenol + PPG
Triticonazole + PPG
Flutriafol + PPG
Difenoconazole + PPG
Dose do
fungicida1
--70
50
40
45
2,5
30
70
50
40
45
2,5
30
Dose do
solvente2
----2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
(1) g de i.a./100 kg de sementes
(2) mL/100 kg de sementes
As caixas foram mantidas sob condições de câmara
climatizada, com temperatura (25
2 oC) e luminosidade (fotoperíodo
de 12 horas) controladas. A umidade relativa (80 – 95%) foi
monitorada através de termo-higrógrafo. A umidade do solo foi
mantida mediante irrigação periódica para manutenção da capacidade
de campo. A irrigação foi feita pela deposição da água no fundo da
bandeja. Empregou-se o delineamento experimental de tratamentos
completamente casualizados com quatro repetições.
166
Na
avaliação
da
transmissão
sintomática
após
a
emergência das plântulas (três a quatro dias após a semeadura), os
coleóptilos e plúmulas foram examinados cuidadosamente a cada
cinco dias, sendo marcados com um palito de dente aqueles que
apresentaram lesões pardas em plúmulas, assim como as plântulas que
morreram prematuramente. Em alguns casos, foram feitos isolamentos
das plântulas mortas no aparecimento desses sintomas para se
determinar o agente causal. Finalmente, aos 35 dias após a semeadura,
as extremidades apicais dos coleóptilos de cada uma das plântulas,
foram removidos e cortados a 1-1,5 cm acima do nível do solo. Os
segmentos cortados foram plaqueados imediatamente e sem
desinfestação, em meio de cultura seletivo (Reis, 1983). Entre cada
operação de remoção dos coleóptilo, a pinça e a tesoura foram
desinfestadas em álcool e flambadas. Os coléoptilos isolados foram
classificados e separados em sintomáticos e assintomáticos. As placas
contendo o meio e os coleóptilos foram mantidas por dez dias em sala
de crescimento, com fotoperíodo de 12 horas. Considerou-se infectado
o coleóptilo sobre o qual ocorreu a esporulação do fungo, em exame
sob microscópio estereoscópico (lupa binocular Zeiss 50 ). De igual
modo, foram feitos isolamentos a partir das lesões em plúmulas pelo
seu plaqueamento em meio seletivo para confirmar a presença do
fungo-alvo desse estudo.
Os dados obtidos foram expressos em percentagem de
coleóptilos infectados (sintomáticos + assintomáticos). A transmissão
(%) foi calculada de acordo com Goulart & Paiva (1990). Com os
dados gerados, calculou-se o controle com base na redução da
transmissão (%) proporcionada pelos fungicidas em relação à
testemunha não tratada.
167
Finalmente, os valores obtidos (in vitro e in vivo) foram
submetidos à análise de variância (P < 0,05), comparando-se as
médias pelo teste de Scott & Knott (5%). Previamente à análise de
variância, os dados foram transformados para arco seno [
(x +
1)/100]. Outros dados obtidos aos 35 dias após da semeadura foram:
plântulas emergidas (%) e plântulas mortas (%). Dessas avaliações,
apenas a primeira foi analisada estatisticamente, sem necessidade de
transformação.
RESULTADOS
Teste em laboratório (in vitro)
Nas Tabelas 3 e 4, é mostrado o efeito significativo (P <
0,05) do tratamento de sementes de cevada com as diferentes
combinações fungicida + solvente na incidência e na eficiência no
controle de B. sorokiniana. Em geral, a dose alta (2 L/100 kg
sementes) dos solventes testados melhorou substancialmente a
eficiência de controle da maioria dos fungicidas.
Os resultados mostraram haver um efeito mínimo ou quase
nulo dos solventes orgânicos na melhora da eficiência de controle do
fungicida iminoctadina, que, em mistura com água, evidenciou
controle próximo a 100%. Porém, quando o fungicida foi misturado
com as doses superiores dos solventes testados (1 e 2 L), o fungo foi
erradicado das sementes.
Com os demais fungicidas, o efeito dos solventes
orgânicos foi variável (dependendo do fungicida), mas sempre com a
tendência de melhorar a sua eficiência, sobretudo quando foram
usadas as doses mais altas do solvente. Em média, a dose de 1 L
168
proporcionou melhor eficiência do que quando misturados à água, 97
e 133%, quando misturados com MEG e PPG; já a dose mais alta (2
L), melhorou ainda mais a eficiência dos mesmos, em 192 e 201%,
respectivamente.
Tabela 3. Incidência (in vitro) de Bipolaris sorokiniana em
sementes de cevada tratadas com fungicidas +
solventes orgânicos
Solvente
Dose1
ou
veículo
Água
2,0
5
Fungicidas2
13
2
3
4
INCIDÊNCIA (%)
0,3 14,5 bc4 50,5 ab 50,5 bc
16,5 bc
38,5 b
16,5 bc
29,8 c
11,3 c
19,0 d
6
MEG
0,5
0,3 18,5 b 48,8 ab
MEG
1,0
0,0
4,3 d 36,8 bcd 39,8 cd
MEG
2,0
0,0
0,3 d 21,0 d
3,8 d
6,8 ef
5
PPG
0,5
0,3 11,3 c 47,3 abc 52,0 abc 19,8 b
36,5 bc
PPG
1,0
0,0
4,3 d 32,0 cd
30,3 de
12,3 c
13,8 de
PPG
2,0
0,0
0,0 d 21,3 d
20,5 e
3,0 d
2,5 f
57,3 53,0 a 60,5 a
63,8 a
61,3 a
47,0 a
Testemunha
----
54,0 ab
5
20,3 e
---18,03
17,80
13,12
15,26
13,25
CV (%)
---212,2** 16,9**
36,2**
179,9** 100,8**
FC
(1) L/100 kg de sementes
(2) 1. iminoctadina; 2. iprodiona; 3. triadimenol; 4. triticonazole; 5. flutriafol;
6. difenoconazole.
(3) Cada fungicida representa um ensaio com 8 tratamentos, médias comparadas
na vertical.
(4) Médias seguidas pela mesma letra, na vertical, não diferem estatisticamente entre
se pelo teste de Tukey à 5% de probabilidade.
(5) MEG = monoetilenoglicol; PPG = propilenoglicol
Nota: O ensaio do fungicida iminoctadina não foi analisado estatisticamente por não
apresentar distribuição normal.
Em relação ao desempenho dos fungicidas (excetuando a
iminoctadina), é importante salientar que o único produto que
erradicou B. sorokiniana das sementes de cevada foi a iprodiona
quando misturado com 2 L de PPG; mesmo que junto ao flutriafol,
169
foram os fungicidas que evidenciaram os menores incrementos na
eficiência de controle ao serem misturados com os solventes orgânicos
testados, pois, na mistura com água, já apresentavam níveis de
controle superiores a 70%. Controle superior a 90% foi obtido com os
fungicidas flutriafol e difenoconazole quando misturados a dose alta
de PPG, principalmente. Um outro aspecto que deve ser salientado é o
fato da combinação fungicida + água, nos produtos triadimenol,
triticonazole e difenoconazole, ter determinado os níveis de controle
mais baixos (< 21%). Por outro lado, a eficiência foi melhorada
substancialmente com o uso da dose alta dos solventes (média: 298%
para MEG e 312% para PPG), sendo que a melhor resposta foi obtida
com o difenoconazole, com incrementos de 372 (+ MEG) e 417% (+
PPG).
Tabela 4. Controle de Bipolaris sorokiniana (in vitro) pelo
tratamento de sementes de cevada com fungicida +
solvente orgânico
5
6
99,5
Fungicidas2
2
3
4
CONTROLE (%)
72,6
16,5
20,9
73,1
18,1
0,5
99,5
66,1
19,3
15,4
73,1
36,6
MEG
1,0
100,0
91,9
39,2
37,6
81,6
59,6
MEG
2,0
100,0
99,4
65,3
68,2
93,8
85,5
4
PPG
0,5
99,5
78,7
21,8
18,5
67,7
22,3
PPG
1,0
100,0
91,9
47,1
52,5
79,9
70,6
PPG
2,0
100,0
100,0
64,8
67,9
95,1
93,6
Solvente
ou Dose1
veículo
Água
2,0
MEG4
3
1
(1) L/100 kg de sementes
(2) 1. iminoctadina; 2. iprodiona; 3. triadimenol; 4. triticonazole; 5. flutriafol;
6. difenoconazole.
(3) Cada fungicida representa um ensaio com 8 tratamentos, médias comparadas
na vertical.
(4) MEG = monoetilenoglicol; PPG = propilenoglicol
170
Teste em câmara climatizada (in vivo)
Ensaio preliminar in vitro. O efeito do tratamento de
sementes com fungicida + água e fungicida + PPG é apresentado na
Tabela 5. Estatisticamente, os tratamentos testados mostraram
diferença significativa (P < 0,05) entre si. Dentre a combinação
fungicida + água, destacou-se o fungicida iminoctadina, sendo o único
que erradicou a B. sorokiniana das sementes. Os fungicidas iprodiona
e flutriafol ocuparam um segundo grupo, com controles de 83,5 e
87,0%, respectivamente, ao passo que o triadimenol, o triticonazole e
o difenoconazole evidenciaram o mais baixo nível de controle (<
50%). Dentro das combinações fungicida + PPG, todas se mostraram
estatisticamente similares, sendo que iminoctadina, iprodiona e
flutriafol foram as que conseguiram erradicar o fungo da semente. O
restante dos tratamentos apresentou controle superior a 95%. Em
média, o uso do PPG melhorou significativamente a eficiência dos
fungicidas testados, em 84,2%, sem considerar a iminoctadina. Esses
níveis de controle são confirmados pelos dados obtidos no primeiro
ensaio, no qual os fungicidas triadimenol (126%), triticonazole
(100%) e, principalmente, difenoconazole (160%) foram os mais
favorecidos pela mistura com o solvente.
Solventes orgânicos vs. emergência. A análise de
variância evidenciou não existir diferença significativa (P < 0,05)
entre os tratamentos testados. No Tratamento 1 (semente + água),
obteve-se o valor mais alto, com 87,8%; seguido pelo Tratamento 3
(semente + PPG), com 83,3%, e ocupando o último lugar o tratamento
2 (semente + MEG), com 81,3%.
171
172
Transmissão e controle (in vivo). Na Tabela 5, são
apresentados os dados de percentagem de emergência, infecção,
transmissão e eficiência de controle. Para cada uma dessas
características,
registraram-se
diferenças
estatisticamente
significativas (P < 0,05) entre os tratamentos testados.
Em relação à emergência de plântulas, quase todos os
tratamentos
mostraram
um
comportamento similar, sendo o
tratamento 10 (triadimenol + PPG), o único estatisticamente inferior
aos restantes.
Trinta e cinco dias após a semeadura, os tratamentos
mostraram comportamento variável, registrando-se na testemunha
uma taxa de transmissão próxima a 90%. Dentre as combinações, o
tratamento 3 (triadimenol + água) situou-se num segundo grupo,
depois da testemunha, com 28,3% de transmissão, situação que foi
reduzida até 4,91% com o emprego do PPG. Num terceiro grupo,
situaram-se os tratamentos 4 (triticonazole + água) e 5 (flutriafol +
água), sendo que só o flutriafol não sofreu nenhuma melhora quando
misturado ao PPG. Por último, os tratamentos 1 (iminoctadina. +
água), 2 (iprodiona + água), 6 (difenoconazole. + água), 8
(iminoctadina. + PPG), 9 (iprodiona + PPG), 11 (triticonazole + PPG)
e 13 (difenoconazole. + PPG) evidenciaram o melhor comportamento
(estatisticamente semelhantes), com níveis de transmissão que
oscilaram entre zero e 1,23%. Entre eles, os fungicidas iminoctadina e
difenoconazole, em combinação com água ou com PPG, foram os que
impediram totalmente a transmissão do fungo aos coleóptilos (100%
de controle). Em geral, os resultados obtidos in vivo mostram que o
emprego do PPG melhorou pouco a eficiência de controle dos
fungicidas (média 9%, sem levar em conta a iminoctadina), pois, por
173
si só, em mistura com água, foram capazes de reduzir a eficiência da
passagem do fungo para os órgãos aéreos. Porém, é evidente que o
fungicida triadimenol foi o mais favorecido, com 38% de incremento
na sua eficiência.
Em detrimento, sua mistura ao PPG reduziu
significativamente a germinação das sementes.
A metodologia permitiu quantificar o potencial de
transmissão de B. sorokiniana das sementes às plúmulas e folhas
primárias, sendo a eficiência da transmissão, na testemunha, de até
20% (média: 12%). O único tratamento com fungicida no qual ainda
houve a transmissão do fungo a esses órgãos foi o triadimenol com 3,7
(+ água) e 2,5% (+ PPG).
DISCUSSÃO
Teste em laboratório (in vitro)
Segundo Reis & Forcelini (1993), a presença dos
patógenos necrotróficos na semente de cereais de inverno tem
assegurado uma convivência indefinida daqueles com o hospedeiro, o
que ocorre porque a maioria dos métodos de controle recomendados
não é eficiente na sua erradicação. Por isso, existe a necessidade de se
selecionar ou desenvolver métodos eficientes na erradicação desses
patógenos, tarefa que não é fácil, segundo os autores. Os resultados
obtidos nos testes de laboratório (in vitro) confirmam essa afirmação,
pois, apesar de ter-se melhorado a eficiência da maioria dos fungicidas
testados mediante o emprego de solventes orgânicos, em substituição
à água, a erradicação de B. sorokiniana das sementes de cevada só foi
possível com os fungicidas iminoctadina e iprodiona. Estudos
realizados por Vidhyasekaran (1980), nos que se objetivou melhorar a
174
eficiência dos fungicidas na erradicação de D. oryzae em sementes de
arroz, demonstraram que o único fungicida que conseguiu atingir esse
objetivo foi a guazatina em combinação com o diclorometano e
quando as sementes foram imersas na solução por uma hora. Por outro
lado, Purchio & Muchovej (1990) reportaram que a eficiência de
alguns fungicidas no controle de B. sorokiniana em sementes de trigo
foi incrementada com o emprego de solventes orgânicos.
Em relação ao flutriafol + PPG, o fungo foi erradicado
quando o nível de incidência foi próximo a 40%, pois, com 61%, o
controle foi inferior a 96%. Algo semelhante ocorreu com os
fungicidas
difenoconazole
e,
sobretudo,
com
triadimenol
e
triticonazole (os três + PPG), em relação à eficiência, que melhorou
significativamente (95 a 98%) quando a incidência do fungo na
semente diminuiu. Resultados obtidos por Forcelini (1991), Forcelini
(1992), Goulart (1988) e Goulart (1996) demonstram que o controle
de B. sorokiniana em sementes de trigo é mais efetivo em lotes com
infecções menores a 43%, sendo menos eficaz em lotes com infecções
superiores. Essa raciocínio também é válido para o triticale, pois,
segundo Reis & Forcelini (1992), o controle de 100% só é possível em
lotes com incidência de até 33%, quando tratados via úmida
(suspensão em água a 3%), com o fungicida iminoctadina. Nesse
contexto, deduz-se que o ideal, do ponto de vista epidemiológico,
seria fazer o tratamento químico com fungicidas em sementes com
baixos níveis de infecção, pois nelas o controle é mais efetivo e,
portanto, os lotes de sementes muito infectados, acima de 40%,
deveriam ser descartados. Por outro lado, de acordo com os padrões
de tolerância estabelecidos pelo Comitê de Patologia de Sementes
(Copasem), da Associação Brasileira de Sementes (Abrates) no caso
175
do trigo e, especialmente, para B. sorokiniana, a tolerância é de 40%
de incidência para sementes certificadas e fiscalizadas. Nesse caso, a
erradicação não seria facilmente atingida, pois a incidência de 40%
pode ser considerada elevada.
Pode-se deduzir que o objetivo do emprego de solventes
orgânicos como veículos de fungicidas, no presente trabalho, de
melhorar a eficiência dos mesmos através de uma melhor cobertura da
semente, foi alcançado. Os resultados obtidos demonstram que os
solventes testados apresentam potencialidade, principalmente o PPG,
para incrementar a eficiência dos produtos no controle de B.
sorokinian; incremento que, provavelmente, pode ser atribuído à
qualidade da cobertura das sementes, mesmo a sutura do grão, região
difícil de ser coberta com a combinação fungicida + água (problemas
com a tenção superficial). Como indicado por Reis & Casa (1998), a
tarefa de se alcançar a erradicação de fungos veiculados a sementes é
uma tarefa difícil, porém o uso de solvente possa trazer uma grande
contribuição para melhorar a fungitoxicidade dos fungicidas hoje
disponíveis no mercado.
Teste em câmara climatizada (in vivo)
Solventes orgânicos vs. emergência. Como foi exposto nos
resultados, nenhum dos solventes orgânicos empregados (dose: 2
L/100 kg sementes) afetou significativamente a germinação e a
emergência das plântulas. Estudos desenvolvidos por Purchio &
Muchovej (1990) concluíram, de igual modo, que os solventes
benzeno, diclorometano e tetracloreto de carbono não exerceram
nenhum efeito negativo sobre a germinação das sementes de trigo, ao
passo que, quando foram imersas em acetona ou etanol, os efeitos
176
detrimentais na germinação foram evidentes, sobretudo quando foi
empregado o etanol. Por outro lado, Braccini et al. (1996), em estudos
em que objetivaram avaliar o efeito do estresse hídrico induzido por
soluções de cloreto de sódio, manitol e polietilenoglicol sobre a
germinação e vigor de sementes de soja, determinaram que as
características avaliadas podem ser severamente afetadas à medida
que a concentração das soluções osmóticas aumenta, sendo mais
adversas com o polietilenoglicol.
Em vista dessa conclusão, é importante salientar que, em
estudos preliminares, mas sem desenho estatístico, foi possível
observar reduções de até 50% na emergência de plântulas de cevada
quando a semente foi misturada com MEG a 2% e armazenada por
mais de dez dias antes da semeadura, situação que não se evidenciou
com o PPG, razão pela qual esse último foi escolhido para realizar o
ensaio de transmissão e de controle. Além disso, em observações
realizadas nos ensaios de laboratório (in vitro), o efeito sobre a
germinação das sementes foi também constatado, principalmente
quando a semente foi armazenada por alguns dias (5 a 14 dias). Os
resultados obtidos no presente ensaio não refletem o exposto
anteriormente talvez porque a semente empregada foi semeada 24 a 30
horas após de ser tratada com o MEG.
Transmissão e controle (in vivo). Os resultados de
transmissão obtidos na testemunha (89,7%) demonstram a elevada
capacidade que tem B. sorokiniana de se transmitir da semente para o
coleóptilo de plántulas de cevada, aspecto que já tinha sido reportado
em trigo por Forcelini (1992), Reis & Forcelini (1993), Utiamada &
Yorinori (1993), Goulart (1996), Toledo et al. (1996), entre outros.
Tal aapacidade foi favorecida pelas condições proporcionadas, 25
2
177
o
C e 80 a 95% de UR, como afirmam Couture & Sutton (1978),
Khanna & Shukla (1981), Zillinsky (1984), Dehne & Oerke (1985),
Luz & Bergstrom (1986) e Filippova & Kashemirova (1991). Quanto
à incidência e eficiência de controle registradas in vitro, nas que as
combinações fungicidas + PPG melhoraram significativamente a
eficiência dos produtos, essas vantagens não se manifestaram in vivo,
à exceção do triadimenol que foi o grande beneficiado. Os resultados
obtidos mostram que, em alguns casos, não é preciso erradicar o fungo
da semente para evitar a sua passagem para os órgãos aéreos da
planta, como aconteceu com o difenoconazole, o qual, ao que parece,
graças a sua condição sistêmica e a sua fungitoxicidade não necessitou
do emprego do PPG para impedir a transmissão de B. sorokiniana,
ainda com níveis aparentes de infecção relativamente altos (in vitro).
Comportamento semelhante manifestaram os demais fungicidas
sistêmicos, situação que também foi observada por Forcelini (1992).
Em geral, os fungicidas testados (exceto o triadimenol) apresentaram
baixos níveis de transmissão do fungo (controle > 90%) ainda em
condições normais (+ água), contrastando com os níveis de infecção
alcançados in vitro. No caso da iminoctadina, a sua elevada eficiência
registrada in vitro foi fortemente corroborada in vivo. O fungicida
ipodriona não evitou completamente a passagem do fungo aos órgãos
aéreos (98,6% de controle), ao que parece devido à condição de
fungicida protetor, apesar de a sua atividade sistêmica (basipetal e
acropetal) ter sido reportada em plantas de Poa annua (Danneberger
& Vargas, 1982). No caso particular do flutriafol, a capacidade de
erradicação registrada in vitro não foi refletida in vivo, situação que
também foi reportada por Forcelini (1992) em lotes de sementes com
níveis de incidência superiores a 40%.
178
Sobre a necessidade de erradicação dos patógenos das
sementes, Menten & Bueno (1987) manifestam que a simples
constatação da presença de um microorganismo, mesmo que
patogênico, em determinada semente não é suficiente para garantir a
passagem do patógeno para a plântula proveniente da semente
infectada. Entretanto, para esses autores, a associação patógenosemente indica o potencial de transmissão e o conseqüente
estabelecimento da doença por ocasião da semeadura no campo.
Tratando-se de um patógeno que afeta a germinação das
sementes, o controle de B. sorokiniana através do uso de fungicidas
pode resultar em incrementos no percentual de emergência das
plântulas no campo (Barros & Salgado, 1983; Barros et al., 1983;
Lasca et al., 1986). Nesse sentido, em função dos resultados obtidos
neste ensaio, é possível deduzir que o tratamento de sementes com o
emprego de solventes orgânicos permite diminuir significativamente a
incidência do fungo nas sementes (in vitro), mas não afeta
significativamente a percentagem de emergência das plántulas.
Forcelini (1992) observou que a emergência de plântulas de trigo foi
influenciada positivamente a medida que a semente apresentava
menor incidência do fungo (< 50%), aspecto que, na maioria dos
casos, foi melhorado com o tratamento das sementes através do uso de
fungicidas. Outros trabalhos realizados por Barros & Salgado (1983),
Barros et al. (1983) e Lasca et al. (1985) destacam o benefício do
tratamento de sementes sobre a emergência de plântulas de trigo.
Comtudo, Forcelini (1992) manifesta que os incrementos na
emergência são, geralmente, significativos nos lotes com menor
incidência do fungo, pois sementes já debilitadas pelo patógeno não
são recuperadas pelo tratamento. Em tal sentido, considerando o nível
179
de incidência da semente empregada neste experimento (menor a
50%), deduz-se que esse foi o motivo para a ausência de diferenças
entre os tratamentos. A combinação triadimenol + PPG foi o único
tratamento estatisticamente inferior aos demais. Reis (1987) relata que
o fungicida triadimenol pode retardar a velocidade de emergência,
reduzir o crescimento inicial das plântulas e provocar o encurtamento
do entrenó subcoronal, efeitos fitotóxicos que, possivelmente, foram
acentuados pela mescla, reduzindo, dessa maneira, o número de
plántulas emergidas.
Segundo Forcelini (1992), se o objetivo do tratamento de
sementes fosse simplesmente elevar a germinação, todas as sementes
com incidência inferior a 50% não necessitariam ser tratadas. O autor,
ao analisar o papel epidemiológico da semente na formação de focos
primários de infecção na lavoura, concluiu que de objetivar o
tratamento de semente só o incremento da emergência, e não a
redução do nível de incidência do patógeno, um imenso inóculo inicial
na lavoura não seria alvo do tratamento. Por essa razão, Reis et al.
(1988) salientam que a melhoria das qualidades fisiológicas da
semente poderá ser conseqüência, mas não o objetivo do tratamento
de sementes. Contudo, o estabelecimento de padrões para o tratamento
de sementes não deveria considerar o efeito do patógeno sobre a
emergência, mas, sim, o papel epidemiológico do inóculo presente na
semente (Forcelini, 1992).
180
CONCLUSÕES
Os solventes orgânicos utilizados melhoraram a eficiência
in vitro dos fungicidas, porém pouco influenciaram o seu desempenho
in vivo.
Os fungicidas difenoconazole e iminoctadina evitaram a
transmissão do patógeno, independentemente do uso dos solventes
orgânicos.
A erradicação in vitro de B. sorokiniana da semente de
cevada é difícil de ser alcançada, e nem sempre necessária, uma vez
que a simples presença do fungo na semente (especialmente quando
tratada com fungicida) não garante a sua transmissão para os órgãos
aéreos de plântulas de cevada.
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CAPÍTULO VI
CONCLUSÕES
Capítulo II
O substrato afetou o comprimento, a largura e o número
de pseudoseptos de conídios do fungo B. sorokiniana. Os esporos
desenvolvidos em meios de cultura e em sementes foram os mais
curtos, largos e com menor número de pseudoseptos, além de serem
mais escuros e retos, com relação aos produzidos em tecidos verdes.
Em trabalhos de identificação ou reconhecimento do
patógeno, sempre que possível, as dimensões padrões deveríam ser
tomadas a partir de conídios formados sobre o substrato natural do
hospedeiro.
Quanto ao efeito da densidade de inóculo na intensidade
da mancha marrom, o modelo de regressão seguiu uma tendência
polinomial quadrática.
Capítulo III
Os meios seletivos mostraram-se mais sensíveis e
consistentes do que os métodos empregados rotineiramente na
detecção do fungo.
186
O congelamento das sementes não afetou a detecção do
fungo nem influenciou a performance dos métodos, os quais
apresentaram resultados semelhantes.
Em
função
de
sua
sensibilidade
e
simplicidade,
recomenda-se o meio BDA (sem congelamento) para exames
rotineiros em patologia de sementes de cevada.
O meio de Reis (sem congelamento) mostra-se mais
apropriado para trabalhos em controle químico, onde a sensibilidade e
seletividade desempenham papel preponderante.
Capítulo IV
A temperatura afetou significativamente a passagem do
fungo das sementes para os órgãos aéreos e radiculares de plântulas de
cevada.
A maior eficiência da transmissão ocorreu na faixa térmica
de 18 – 25 oC, sendo que os pontos máximos de transmissão oscilaram
entre 18,1 e 21,3 oC, seguindo tendências polinomiais quadráticas. A
esporulação máxima em coleóptilos ocorreu a 19,3 oC.
A presença de coleóptilos infectados com B. sorokiniana
foi evidente a partir de dez dias após a semeadura; quanto a evolução
da transmissão foi representada matematicamente pelo modelo
monomolecular.
A infecção e a esporulação em coleóptilos seguiram uma
tendência linear ascendente nos primeiros trinta e oito dias após a
semeadura.
187
Capítulo V
Os solventes orgânicos utilizados melhoraram a eficiência
in vitro dos fungicidas, porém pouco influenciaram o seu desempenho
in vivo.
Os fungicidas difenoconazole e iminoctadina evitaram a
transmissão do patógeno, independentemente do uso dos solventes
orgânicos.
A erradicação in vitro de B. sorokiniana da semente de
cevada é difícil de ser alcançada, e nem sempre necessária, uma vez
que a simples presença do fungo na semente (especialmente quando
tratada com fungicida) não garante a sua transmissão para os órgãos
aéreos de plântulas de cevada.
Em
função
dos
resultados
e
conclusões
obtidas,
recomenda-se dar continuidade aos estudos de transmissão do fungo
da semente para os órgãos aéreos de plântulas de cevada. Devendo-se
priorizar trabalhos que objetivem determinar o limiar numérico de
transmissão, considerando semente com e sem fungicida. De igual
modo, é recomendável que nos trabalhos relativos ao controle do
fungo, deveriam ser incluídos testes in vivo rotineiramente em provas
de eficiência de fungicidas, com a finalidade de se estabelecer o
verdadeiro potencial de controle dos mesmos, sob condições
favoráveis, e, dessa maneira economizar esforços na procura de
métodos químicos eficientes na erradicação in vitro do fungo. Por
outro lado, a necessidade de controlar doenças que se desenvolvem no
início da cultura da cevada, através do tratamento de sementes, torna
necessária a continuação e a ampliação de pesquisas com misturas de
fungicidas.