(21)
P10904880-4 A2
Frederasáv2 :SEG BussEl
E 20
NtiCVS-i9.•:
1 .1 1111 ELI ADJI
*
(22) Data de Depósito: 04/09/2009
(51) !M.a.:
(43) Data da Publicação:
A61K 39/12
C12N 15/62
C12N 15/34
C12N 15/85
A61K 38/19
A61P 35/00
17/05/2011
(RPI 2106)
'veia ~.
(54) Título: COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
(57) Resumo:
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO UM
PLASMIDEO QUE EXPRESSA A ONCOPROTEINA E7 DE HPV-16
FUSIONADA A GD DO HSV- 1 CO-ADMINISTRADO COM UM
PLASMIDEO QUE EXPRESSA A IL-2 E O SEU USO NO CONTROLE
DE TUMORES INDUZIDOS POR HPV-16 A presente invenção trata
da utilização de duas construções de DNA plasmideal, uma contendo o
gene que expressa a oncoproteina E7 do vírus do papiloma humano
tipo-16 (HPV-16) fusionadas à glicoproteina D (gD) do herpes simplex
tipo-1 (HSV-1) e outra contendo o gene que expressa a interleucina-2
Titular(es): Farmacore Biotecnologia Limitada
(IL-2) para o preparo de uma composição farmacêutica e o seu uso no
controle de tumores induzidos pelo HPV-16. Tal composição
Inventor(es): Célio Lopes Silva farmacêutica apresenta interesse para a indústria farmacêutica para a
manufatura de medicamentos para uso humano destinados ao controle
de tumores.
CONTENDO UM PLASMÍDEO QUE EXPRESSA A
ONCOPROTEÍNA E7 DE HPV-16 FUSIONADA A GD
DO HSV-1 CO-ADMINISTRADO COM UM PLASMÍDEO
QUE EXPRESSA A IL-2 E O SEU USO NO
CONTROLE DE TUMORES INDUZIDOS POR HPV-16
(73)
(72)
A
RSV
L-2
C
CMV
1/13
Wifia-4l
P10904880
"COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO UM PLASMÍDEO QUE
EXPRESSA A ONCOPROTEÍNA E7 DE HPV-16 FUSIONADA A GD DO HSV1 CO-ADMINISTRADO COM UM PLASMÍDEO QUE EXPRESSA A IL-2 E O
SEU USO NO CONTROLE DE TUMORES INDUZIDOS PELO HPV-16
5
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção trata da utilização de duas construções de
DNA plasmideal, urna contendo o gene que expressa a oncoproteína E7 do
vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) fusionadas à glicoproteína D (gD)
do herpes simplex tipo-1 (HSV-1) e outra contendo o gene que expressa a
10 interleucina-2 (1L-2) para o preparo de urna composição farmacêutica e o seu
uso no controle de tumores induzidos pelo HPV-16. Tal composição
farmacêutica apresenta interesse para a indústria farmacêutica para a
manufatura de medicamentos para uso humano destinados ao controle de
tumores.
15
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O câncer de colo de útero é a terceira principal causa de morte
por câncer em mulheres de todo o mundo causando 200.000 mortes por ano
(PISANI P. PARKIN D.M., BRAY F. AND FERLAY J. (1999). Estimates of the
worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int. J. Cancer 83:18-29).. Dados
20 epidemiológicos mostram uma clara relação entre a infecção pelo vírus do
papiloma humano (HPV) e o desenvolvimento de câncer do colo do útero,
sendo que o genoma de HPV pode ser detectado em mais de 99% dos casos
deste tipo de câncer. Mais de 100 tipos de HPV foram descritos, e cerca de 20
têm mostrado propensão a infectar os tecidos do trato anogenital. Alguns tipos
25 de HPV causam verrugas e lesões benignas e raramente são encontrados em
carcinomas invasivos, sendo chamados de genótipos de baixo risco, como o
HPV-6 e o HPV-11. Os genótipos do HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 e
HPV-45 são freqüentemente encontrados em tecidos tumorais do colo do útero,
sendo chamados de genótipos de alto risco (WALBOOMERS, J.M., JACOBS
30 M.V., MANOS M.M. et aí (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of
invasive cervical cancer worldwide.
Pathol. 198:12-19). As proteínas E6 e E7
2/13
dos genótipos de alto risco são capazes de degradar p53 e inativar pRb,
interferindo com proteínas reguladoras do ciclo celular (HOWLEY P.M. (1991).
Role of the human oaoillomaviruses in human cancer_ Cancer Res. 51:5019s-
5022s). Entre os genótipos de alto risco, destaca-se o HPV-16 encontrado em
5 50% a 60% dos casos de câncer do colo de útero, podendo ser considerado o
principal agente etiológico da doença (BOSCH F.X., MANOS M.M., MUglOZ N.,
SHERMAN M., JANSEN A.M., PETO J., SCHIFFMAN M.H., MORENO V.,
KURMAN R., SHAH K.V. (1995). Prevalence of human papillomavirus in
cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on
10 cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer Inst. 87(11):796-802).
Como o câncer cervical é causado por um tipo de infecção virai,
seria esperado que uma vacina capaz de gerar anticorpos neutralizantes que
bloqueiem a entrada do vírus reduzisse a incidência deste tipo de câncer em
longo prazo. Duas vacinas profiláticas baseadas em VLPs (Virus like particles)
15 formados por proteínas L1 de HPV-6, -11, -16 e 18 (Gardasil) ou HPV-16 e -18
(Cervarix) estão disponíveis no mercado. Entretanto, depois que a infecção já
foi estabelecida outro tipo de vacina faz-se necessária, pois os anticorpos
neutralizantes não são capazes de eliminar o vírus ou inibir o crescimento de
tumores.
20
Novas abordagens terapêuticas para tratamento de câncer são
continuamente investigadas no mundo todo e dentre elas, a imunoterapia ou
vacinas terapêuticas, representa uma forma de crescente relevância. O
conhecimento dos mecanismos imunológicos tem permitido que estas
abordagens sejam continuamente aprimoradas e se traduzam em progressos
25 clínicos contínuos. Diante disso, a relevância da pesquisa de vacinas
terapêuticas contra o câncer cervical, deve ser enfatizada, devido a milhões de
mulheres que já estão infectadas pelo vírus e que podem vir a desenvolver
tumores, já que o HPV é geralmente contraído por mulheres jovens, mas o
câncer se manifesta apenas depois dos 50 anos de idade (LEPIQUE A.P.,
30
In A t) A r, g__•
sge 1 A g 1
ni-Nomkininic 1., váLLm
i•-inrIrtx Lin%
kzuvw). nrv
Vi2UL11 Idt1011. 11
—r
ueyit 'ming 01 ule et lu
of cervical cancer? — A Review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 104(1): 1-10).
3/13
As vacinas terapêuticas contra o câncer surgem como uma
alternativa a processos cirúrgicos e radioterápicos. Diversos grupos têm
descrito o desenvolvimento de vacinas que trazem como alvo as células
cancerosas induzidas por HPV-16. Estudos de imunoterapia antígeno5 específica mostram que tumores induzidos pelo HPV podem ser controlados e
por vezes eliminados por ativação de resposta mediada por células específica
contra as proteínas E7 e E6 (LING M., KANAYAMA M., RODEN R., et al.
(2000). Preventive and therapeutic vaccines for human papillomavirusassociated cervical cancers. J Biomed Sci. 7(5):341-356). Vacinas de DNA
10 contra o HPV-16 que utilizam o gene da oncoproteína E7 na sua forma nativa
induzem baixos níveis de ativação de linfócitos T CD8 + e conseqüentemente
não protegem animais contra o desafio utilizando células transformadas pelo
HPV (HUNG C. F., MONIE A., ALVAREZ R. D., et al. (2007). DNA vaccines for
cervical cancer: from bench to bedside. Exp. Mol. Med. 39:679-689; KANODIA
15 S., DA SILVA D.M., KAST W.M. (2008). Recent advances in strategies for
immunotherapy of human papillomavirus-induced lesions.
Int J Câncer.
15; 122(2):247-59).
Estratégias alternativas para melhorar a apresentação antigênica,
como o direcionamento da expressão a compartimentos celulares específicos,
20sãocapzedumntrspoaiemd rlnfócitosTCD8e
proteger animais contra o HPV (JI H., WANG T.L., CHEN C.H., et al. (1999).
Targeting human papillomavirus type 16 E7 to the endosomal/lysosomal
compartrnent enhances the antitumor immunity of DNA vaccines against murine
human papillomavirus type 16 E7-expressing tumors.
Hum Gene Ther.
25 10:2727-2740; RODRIGUEZ F., AN L.L., HARKINS S., et al. (1998). DNA
immunization with minigenes: low frequency of memory cytotoxic T lymphocytes
and inefficient antiviral protection are rectified by ubiquitination.
J Virol.
72(6):5174-5181; CHENG W.F., HUNG C.F., CHAI C.Y., et al. (2001). Tumorspecific immunity and antiangiogenesis generated by a DNA vaccine encoding
30 calreticulin linked to a tumor antigen. J. Clin. Invest. 108:669-678; CHU N.R.,
WU H.B., WU T., et al. (2000). Immunotherapy of a human papillomavirus
4/13
(HPV) type 16 E7-expressing tumour by administration of fusion protein
comprising Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 and
HPV16 E7. Clin Exp Immunol. 121:216-225; HUNG C.F., TSAI Y.C., HE L, et
al. (2007). DNA vaccines encoding li-PADRE generates potent PADRE-specific
5 CD4(+) T-cell immune responses and enhances vaccine potency. Moi. Ther.
15:1211-1219).
No Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo foram construídas vacinas
de DNA capazes de expressar as oncoproteínas E6 e E7 do HPV-16 na
10 superfície celular das células transfectadas (LASARO, M. O., DINIZ, M. O.,
ARTURO, R., ERTL, H. C., FERREIRA, L. C. S., (2005). Anti-tumor DNA
vaccines based on the expression of human papillomavirus-16 E6/E7
oncoproteins genetically fused with the glycoprotein D from herpes simplex
virus-1. Microbes and Infection. 7:1541-1550). As oncoproteínas E6 e E7 foram
15 fusionadas geneticamente à glicoproteína D (gD) do vírus do herpes simplex
tipo 1 (HSV-1). O vetor que expressa a proteína E7 fusionada a gD (pgDE7) em
regime vacinai de quatro doses, promoveu a ativação de células T CD8 +
espcífiaontrE7egudosanimefdosprlaticmne
com células tumorais. Além disso, a administração da vacina em animais que já
20 continham as células tumorais foi capaz de regredir os tumores em 40% dos
animais e retardar a evolução dos tumores nos animais não protegidos.
Como estratégia utilizada em nosso laboratório, a proteína E7 foi
inserida em sítios permissíveis próximos a extremidade C-terminal da proteína
gD do vírus herpes simplex tipo-1 (HSV-1). A proteína gD do HSV-1 é uma
25 proteína que apresenta superfície exposta, ficando ancorada à membrana das
células infectadas através de uma seqüência pequena localizada próxima à
região C-terminal. Desta forma, as oncoproteínas do HPV-16 estariam sendo
expressas no meio extracelular, reduzindo drasticamente os riscos
oncogênicos das células transfectadas. A proteína gD tem a capacidade de
30 aumentar a imunogenecidade de E7 ou outras proteínas a ela fusionadas por
exercer uma competição com BTLA (B and T lymphocyte attenuator) pelo sítio
5/13
de interação do receptor HVEM (Herpes vírus entry mediator), reduzindo os
efeitos co-inibitórios de BTLA em linfócitos T e B (LASARO M.O., TATSIS N.,
HENSLEY S.E, WHITBECK J.C., LIN S.W., RUX J.J., WHERRY E.J., COHEN
G.H., EISENBERG R.J., ERTL H.C. (2008). Targeting of antigen to the
5 herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses. Nat
Med. 14(2):205-12).
Um vetor que expressa as proteínas E5, E6 e E7 do HPV-16
fusionadas à gD do HSV-1 (pgDE7E6E5) está descrito na patente
W0/2008/027394 depositada por Lasaro e Ertl em 2008. Os dados já
10 publicados envolvendo esta construção demonstram que uma dose da vacina
gera proteção profilática á formação de tumores (LASARO TATSIS f‘L,
HENSLEY S.E., WHITBECK J.C., LIN S.W., RUX J.J., WHERRY E.J., COHEN
G.H., EISENBERG R.J., ERTL H.C. (2008). Targeting of antigen to the
herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses. Nat
15
Med.
14(2):205-12). Entretanto, o vetor descrito, assim como o vetor
inicialmente descrito por nós e que permitiu a elucidação dos efeitos adjuvantes
da proteína gD do HSV-1, não confere proteção total a camundongos que
previamente inoculados com as células tumorais, que consiste no principal
objetivo de uma vacina terapêutica contra câncer. Neste caso, em desafio de
20 proteção terapêutica a formação de tumores, a vacina é capaz de manter 70%
dos camundongos livres de tumores seguindo um regime vacinai de 3 doses.
Desta forma, considerando-se camundongos que previamente continham
células tumorais, os plasmídeos vacinais pgDE7 e pgDE7E6E5 demonstram
reduzir o número de camundongos apresentando tumores, mas não são
25 suficientes para gerar proteção total.
Como estratégia alternativa para aumentar a resposta induzida
por uma vacina de DNA, além da fusão a genes de proteínas heterólogas
podem ser utilizadas citocinas relacionadas à ativação ou proliferação de
células T, como a interleucina-2 (IL-2) e IL-12. Plasmídeos que codificam
30 citocinas são potentes adjuvantes capazes de aumentar a resposta imune
humoral e citotóxica em modelo animal (BAROUCH, D. H., A CRAIU, M. J.
6/13
KURODA, J. E. SCHMITZ, X. X. ZHENG, S., SANTRA, J. D. FROST, G. R.
KRIVULKA, M. A. LIFTON, C. L. CRABBS, G. HEIDECKER (2007). Induction of
specific immune responses by severe acute respiratory syndrome coronavirus
spike DNA vaccine with or without interleukin-2 immunization using different
5 vaccination routes in mice. Clinica] and vaccine immunol. 14:894-901; CHOW,
Y. H., B. L. CHIANG, Y. L. LEE, W. K CHI, W. C. LIN, Y. T. CHEN, AND M. H.
TA0_ (1998). Development of Th1 and Th2 populations and the nature of
immune responses to hepatitis B virus DNA vaccines can be modulated by
codelivery of various cytokine genes. J. Immunol. 160:1320-1329). Nesse
10 contexto, a IL-2 é uma citocina potente produzida por células T ativadas, capaz
de ativar múltiplos compartimentos do sistema imune e atua na proliferação
clonal de células T (WALDMANN T.A. (2006). The biology of interleukin-2 and
interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. Nat Rev
lmmunol. 6:595-601).
15
IL-2 é um dos adjuvantes sistêmicos mais amplamente utilizados
para vacinas baseadas em peptídeos. Seu uso clínico foi aprovado pelo FDA
para o tratamento de câncer renal metastático e melanoma maligno, sendo
capaz de induzir respostas clínicas em 15% dos pacientes com estes tipos de
cânceres (ROSENBERG S.A., YANG J.C., TOPALIAN S.L.,
20 SCHWARTZENTRUBER D.J., WEBER J.S., PARKINSON D.R., et al (1994).
Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell
cancer using high-dose bolus interleukin 2. JAMA. 271(12):907-13). Alguns
estudos que empregam plasmídeos que contém o gene da IL-2 têm obtido
aumentos significantes na resposta imunológica contra herpes bovino tipo I
25 (KUHNLE, G., R. A. COLLINS, J. E. SCOTT, AND G. M. KEIL. (1996). Bovine
interleukins 2 and 4 expressed in recombinant bovine herpesvirus 1 are
biologically active secreted glycoproteins_ J. Gene Virol. 77:2231-2240), Vírus
de hepatite C (GEISSLER, M., A. GESIEN, K. TOKUSHIGE, AND J. R.
WANDS. (1997). Enhancement of cellular and humoral immune• responses to
30 hepatitis C virus core protein using DNA - based vaccines augmented with
cytokine-expressing plasmids.
J. lmmunol.
158:1231-1237), vírus da
7/13
imunodeficiência adquirida humana (MOORE, A. C., W. P. KONG, B. K.
CHAKRABARTI, AND J. N. GARY. (2002). Effects of antigen and genetic
adjuvants on immune responses to human immunodeficiency virus DNA
vaccines in mice. J. Virol. 76:243-250), e contra tumores que expressam o
5 HER2/Neu (LIN CC, CHOU CW, SHIAU AL, TU CF, KO TM, CHEN YL, et ai.
(2004). Therapeutic HER2/Neu DNA vaccine inhibits mouse tumor naturally
overexpressing endogenous neu. Molec Therapy .10:290-301). A co-expressão
de IL-2 também tem sido utilizada para aumentar a resposta imune à gD do
HSV-1 utilizada como antígenos em vacinas de DNA (LI WR, NIU B,WANG JW,
10 FENG ZJ,WANG DX.(2006). Coexpression of interleukin-2 enhances the
immunization effect of a DNA vaccine expressing herpes simplex 1 glycoprotein
D. Acta Viro!. 50:251-6).
Diante do exposto, os Depositantes desenvolveram uma
composição farmacêutica para ser administrada por via intramuscular
15 combinando um plasmídeo que expressa a E7 de HPV-16 fusionada à gD de
HSV-1 com um plasmídeo que expressa a IL-2. A administração dessa
composição farmacêutica, em animais previamente desafiados com linhagem
tumoral TC-1, conferiu proteção completa (100%) para o desenvolvimento de
tumores, tanto de forma profilática como terapêutica, e representa uma
20 estratégia inédita de grande interesse prático, e que necessita de proteção do
invento visando futuras aplicações clínicas em seres humanos e animais.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 mostra esquematicamente os vetores plasmidiais
utilizados na pesquisa. Em (A) está representado o vetor pgDE7 que codifica a
25 proteína E7 do HPV-16 geneticamente fusionada à proteína gD do HSV-1 e
contém gene de resistência a ampicilina. Em (B) está representado o vetor pIL2 que codifica para a citocina 1L-2 murina. Em (C) está representado o vetor
pVaxgDE7 que codifica a proteína E7 do HPV-16 geneticamente fusionada à
proteína gD do HSV-1 e contém gene de resistência a canamicina.
30
A figura 2 mostra um ensaio de proteção terapêutica de
camundongos C57BU6 desafiados com células tumorais TC-1. Os animais
8/13
foram imunizados com três doses do vetor pgD, pIL-2 ou pgDE7 e uma, duas
ou três doses da composição farmacêutica contendo os vetores pgDE7 e pIL-2
pela via intramuscular. Os plasmídeos foram administrados na quantidade de
100pg de DNA/dose. Os protocolos vacinais tiveram início no mesmo dia do
5 desafio. O desafio foi feito através da inoculação por via subcutânea de 5x10 4
céluastmoriTC-1pnal.OsvetorpgDIL-2isladmentão
foram capazes de manter os camundongos livres de tumores, e o vetor pgDE7
sozinho gerou 70% de proteção. Entretanto a composição farmacêutica
contendo os vetores pgDE7 e pIL-2 foi capaz de proteger 100% dos
10 camundongos do desenvolvimento de tumor com a inoculação de uma, duas
ou três doses da composição.
A figura 3 mostra um ensaio de proteção terapêutica de
camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1. Os animais
foram imunizados com uma dose de 100pg do vetor pIL-2, ou uma dose da
15 composição farmacêutica contendo os vetores pgDE7 e pIL-2 administradas na
quantidade de 100pg, 50pg, 25pg ou 10pg DNA/dose. Os protocolos vacinais
tiveram início no mesmo dia do desafio. O desafio foi feito através da
inoculação por via subcutânea de 5x10 4 células tumorais TC-1 por animal. A
composição farmacêutica contendo os vetores pgDE7 e pIL-2 foi capaz de
20 proteger 100% dos camundongos do desenvolvimento de tumor em dose única
com a inoculação de 100pg, 50pg ou 25pg de DNA/dose. A inoculação de 11 0pg
de DNA/dose da formulação vacinai protegeu 50% dos camundongos do
desenvolvimento de tumores e o vetor pIL-2 isoladamente não foi capaz de
manter os camundongos livres de tumores.
25
A figura 4 mostra um ensaio de proteção terapêutica de
camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1. Os animais
foram imunizados com uma dose do vetor pIL-2, ou uma dose da composição
farmacêutica contendo os vetores pgDE7 e plL-2 administradas na quantidade
de 50pg de DNA/dose. A composição farmacêutica foi administrada no mesmo
30 dia (dia 0), 3, 7, 10 ou 14 dias após o desafio. O desafio foi feito através da
inoculação por via subcutânea de 5x10 4 células tumorais TC-1 por animal. A
9/13
composição farmacêutica contendo os vetores pgDE7 e pIL-2 foi capaz de
proteger 100% dos camundongos do desenvolvimento de tumor em dose única
com a inoculação de 50pg de DNA/dose quando a vacina foi administrada no
mesmo dia ou 3 dias após o desafio. Quando a composição farmacêutica foi
5 inoculada nos dias 7, 10 e 14, os valores de proteção obtidos foram de 60%,
40% e 0% de camundongos livres de tumor, respectivamente. O vetor pIL-2
isoladamente não foi capaz de manter os camundongos livres de tumores.
A figura 5 mostra um ensaio de proteção terapêutica de
camundongos C57BU6 desafiados com células tumorais TC-1. Os animais
10 foram imunizados com uma dose do vetor pIL-2 ou pVaxgDE7, ou com uma
dose da composição farmacêutica contendo os vetores pVaxgDE7 e pIL-2
administradas na quantidade de 50pg de DNA/dose. As vacinas e a
composição farmacêutica foram administradas 3 dias após o desafio. O desafio
foi feito através da inoculação por via subcutânea de 5x10 4 células tumorais
15 TC-1 por animal. A composição farmacêutica contendo os vetores pVaxgDE7 e
pIL-2 foi capaz de proteger 100% dos camundongos do desenvolvimento de
tumor em dose única com a inoculação de 50pg de DNA/dose. Os vetores pIL2 e pVaxgDE7 isoladamente não foram capazes de manter os camundongos
livres de tumores.
20
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve o preparo de formulações
farmacêuticas vacinais contendo um plasmídeo que expressa a oncoproteína
E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) fusionadas a glicoproteína D
(gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1) co-administrado a um plasmídeo que
25 expressa a interleucina-2 (IL-2) e o seu uso no controle de tumores induzidos
por HPV-16.
O presente pedido de patente consiste na combinação das
propriedades adjuvantes de um plasmídeo que expressa IL-2 com o potencial
vacinai e terapêutico de um plasmídeo que expressa a oncoproteína E7 de
30 HPV-16 fusionada a gD de HSV-1.
10/13
Em uma primeira realização, a presente invenção envolve a
formulação baseada na co-administração de um plasmídeo que expressa 1L-2 e
um plasmídeo que expressa a oncoproteína E7 de HPV-16 fusionada a gD de
HSV-1 em concentrações de 100pg de DNA de cada, que podem variar de 25
5 pg a 100 pg.
As formulações da presente invenção podem ser administradas
por via parenteral, preferencialmente, sendo administrada pela via
intramuscular.
EXEMPLOS
A compo s ição farmacêutica
armacêu
dd presente
10
iydu fui t'utetdd em
modelo murino de tumor TC-1, sendo a composição farmacêutica composta de
um plasmídeo que contém o gene da oncoproteína E7 de HPV-16 fusionado no
sítio de Apal do gene da gD de HSV-1 co-administrado com um plasmídeo que
contém o gene da IL-2 para o controle terapêutico de tumores induzidos pelo
15 HPV-16.
CONSTRUÇÃO E PURIFICAÇÃO DOS VETORES PLASMIDIAIS
Para a construção do vetor pIL-2 o gene da IL-2 foi amplificado
por PCR e clonado no vetor pcDNA3.1 (Invitrogen). O vetor pgDE7 foi
construído através da amplificação do gene da proteína E7 a partir do genoma
20 total do HPV-16, gentilmente cedido pelo Dr. VVilly Beçak do Instituto Butantan,
utilizando iniciadores específicos desenhados com base na seqüência
depositada no GeneBank (GI:9627100) e incluindo sítios para a enzima Apal
nos iniciadores de E7. O plasmídeo pRE4 que contém o gene da glicoproteína
D do HSV-1, gentilmente cedido pelo Dr. G. Cohen da Universidade da
25 Pensilvânia, foi utilizado para a clonagem do gene de E7 fusionado ao gene
gD. Para a construção do vetor pVaxgDE7 o gene gDE7 foi retirado do vetor
pgDE7 através de digestão com a enzima de restrição Hindi' e clonado no
vetor pVax1 (Invitrogen). As células eletrocompetentes utilizadas para a
transformação com o vetor pRE4 foram bactérias Escherichia coli JM 110. Os
30 tratamentos com enzimas de restrição, ligação, eletroforese em gel de agarose,
purificação dos fragmentos de DNA e eletroporação seguiram os
11/13
procedimentos descritos anteriormente por Sambrook e colaboradores (1989).
Todos os plasmídeos foram propagados em Escherichia coli DH5a em meio LB
suplementado com ampicilina (100i.kg/mL) e purificado por duplo gradiente de
densidade de cloreto de césio seguido de precipitação com etanol e
5 ressuspensão em água estéril. O conteúdo de DNA das amostras foi
determinado em espectofotômetro a 260nm e confirmado por inspeção visual
em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo usando fragmentos de
DNA com concentrações conhecidas (Invitrogen). Os plasmídeos foram
mantidos a —20° C até o momento de uso, quando a concentração foi ajustada
10 para 1p.g/gL em PBS.
COMPOSIÇÃO MEDICAMENTOSA
A composição farmacêutica medicamentosa consiste na coadministração de plasmídeo que expressa a E7 de HPV-16 fusionada à
proteína gD de HSV-1 em combinação com o plasmídeo que expressa a IL-2
15 humana ou de outras espécies de mamíferos. Esta composição farmacêutica
preparada em solução salina pela mistura dos dois plasmídeos pode ser
administrada por via parenteral utilizando-se doses que podem variar entre 10
Dg a 100mg de DNA, de acordo com a espécie a ser vacinada, sendo seu
efeito ótimo, obtido em camundongos, com 501.1g de DNA com células TC-1 por
20 animal. A composição farmacêutica pode ser administrada em dose única ou
múltiplas doses de acordo com o grau de desenvolvimento do tumor. A
formulação vacinai pode ser administrada também em combinação com
vetores que codifiquem para as citocinas IL-12 e/ou GM-CSF assim como com
citocinas purificadas e administradas na forma de proteínas.
25
CÉLULAS TUMORAIS
A linhagem celular tumoral TC-1 é derivada de células primárias
do epitélio pulmonar de C57B1/6 transformadas com v-Has-ras e os genes de
E6 e E7 do HPV-16 (gentilmente cedida pelo Dr. T.C. Wu, Universidade Johns
Hopkins, EUA). As células TC-1 foram cultivadas em meio DMEM
30 suplementado com 2mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 2 mM
aminoácidos não essenciais, 10mM tampão HEPES, 50 U/mL
12/13
penicilina/streptomicina, 10% de soro fetal bovino (SFB) e mantidas a 37°C e
5% de CO2. No dia do desafio tumoral as células são tratadas com tripsina,
lavadas duas vezes, e ressuspendidas em meio sem soro a concentrações
apropriadas para a inoculação.
5
IMUNIZAÇÃO DOS CAMUNDONGOS E DESAFIO COM AS CÉLULAS TUMORAIS
Os experimentos
de
imunização foram realizados com
camundongas fêmeas C57BU6 com idade entre 6-8 semanas adquiridos do
Biotério de Camundongos Isogênicos do Depto de Imunologia da USP e
manuseados segundo as normas estabelecidas pela comissão de ética do ICB10 USP. Grupos de 5-10 animais foram vacinados com as composições
farmacêuticas por via intramuscular. As doses tiveram de 10jig a 100 IA de
DNA diluído em 100p1 de PBS e foram inoculadas no músculo tibial anterior de
cada pata (50p1 por pata).
A inoculação das células tumorais TC-1 foi feita por via
15 subcutânea em camundongos na concentração de 5x 10 4células/animal. As
células foram ressuspensas em 100 pL de meio de cultura sem soro e
inoculadas em uma região dorso-lateral do animal.
Para determinar o efeito de regressão de tumores já
estabelecidos, os camundongos foram desafiados com as células TC-1 e oito
20 horas depois teve início o protocolo vacinai. O acompanhamento da evolução
dos tumores nos ensaios de regressão tumoral foi feito três vezes a cada
semana por um período mínimo de 60 dias. Os tumores quando presentes
foram medidos com o auxílio de um paquímetro e os animais que
apresentarem tumores maiores que 1,5 crn de diâmetro foram eutanasiados.
25
RESULTADOS
Os resultados descritos no presente invento demonstram que a
composição farmacêutica contendo uma combinação do plasmídeo pgDE7 e
pcDNA3.IL-2 resultou em total proteção terapêutica a desafios feitos com as
células TC-1 em regime de 1,2 ou 3 doses da composição farmacêutica
30 administradas pela via intramuscular e que a quantidade de DNA/dose pode
13/13
ser de 25pg a 100pg de DNA de cada plasmideo na composição farmacêutica.
A formulação farmacêutica proposta, assim, como outras derivadas do conceito
baseado na co-administração de plasmídeo pgDE7 e plasmicleos que
codifiquem citocinas, assim como citocinas purificadas, representa uma
5 estratégica terapêutica anti-tumoral única que deve ser protegida quanto ao
potencial de utilização clínica e/ou veterinária.
1/2
REIVINDICAÇÕES
1. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pela
combinação de um vetor plasmideal que codifica a proteína E7 do HPV-16
(pgDE7) associada a um vetor plasmideal que codifica a IL-2 (pcDNA3.IL-2).
5 2. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a
reivindicação 1, caracterizada pelo uso do gene ET derivados do HPV-16,
assim como do HPV-18 e outros tipos virais associados à formação de tumores
e produzidos por síntese química.
3.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as
10 reinvindicações 1 e 2, caracterizada pelo uso do gene da interleucina 2 (IL-2),
preferencialmente, ou da IL-12 e GM-CSF, derivados de mamíferos e/ou
produzido por síntese química.
4.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as
reinvindicações 1 a 3, caracterizada pelo uso de plasmídeos recombinantes
15
que possam ser usados em humanos e animais de estimação ou criação para
o controle de tumores induzidos por diferente papilomavirus.
5.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as
reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo uso dos vetores descritos, em
concentrações que variam entre 0,1 pg a 100 pg por dose para camundongos
20 e de 0,1 pg a 5 mg por dose para humanos e outras espécies de mamíferos.
6.
PROCESSO DE OBTENÇÃO DA FORMULAÇÃO
FARMACÊUTICA, de acordo com as reinvindicações 1 a 5, caracterizada pela
purificação do DNA em condições de boas práticas de laboratório e de boas
pr6'ticns
25
fmbrirnra", livros
do
endot^xina e adequado para testes pré-clínico
e/ou clínicos.
7.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as
reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato da administração da dita
composição farmacêutica
vacinai ser feita pelas vias sub-cutânea,
intradérmica, transdérmica, mucosa e, preferencialmente, por via intramuscular.
30
8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as
reinvindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato dos plasmídeos pgDE7 e
2/2
pcDNA3.IL-2 serem aplicados em solução de salina ou combinada a sistemas
de liberação sustentada ou controlada, como os lipossomos, emulsões lipídicas
e micropartículas de PLGA.
9.
USO DOS CONSTRUTOS DE PLASMÍDEOS, de acordo
5 com as reivindicações 2 e 3, na preparação de uma COMPOSIÇÃO
FARMACÊUTICA para imunoterapia ou tratamento de tumores induzidos por
HPV em humanos e animais de estimação.
1/3
Fig
1L-2
c
CMV
\.Apai
.11111"41
pVaxgDET
Apai
gD
Figura 2.
188%
86%
68%
48%
—*—pgDE7 3 doses
--pgDE7 4 piL-2 1 dose
--e--pgDE7
26%
4 pfl_-2 2 doses
DE7 f piL-2 3 doses
6%
1%., Tr." LL, 7:2
O
7
14
21
30
Dias após desarmo
•■••
r.
42
49
,..10
2/3
Figura 3.
o
-E-- pIL-2
E
a 80%
o
-of
GO%
-á- pg DE 7 pIL.2 100ug
pg 0E7 p11.2 5Oug
pg CE 7 .p1L-Z 25dg
pg0E7 pli-Z Oug
•
o 40%
29%
É
° O%
O
7
14
21
30
35
42
49
to
Dias após desafia
Figura 4.
100%
-Á- 1:11.-'7 4,2 clã O
a- of1Dt7 p11.-2 de 3
pg3E 7 01-2 de 7
o
E 54% a
•
-
1ç,G;E7 1011-2 de 13
pnCE7. pa-2 d$14
•
CNP
4614-
o
ic
0%
1)
7
14
21
30
Dias apôs desafio
42
45
50
3/3
Figura 5.
100%
-t- p R. -2
-E-- pilo
rr. 7
-*- pVa xsi 0E7 •pil-2
1
4
7
10
13
16
Dias apto desafio
10
22
25
1/1
(01 ,0 t-PC7-Li
RESUMO
"COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO UM PLASMIDEO QUE
EXPRESSA A ONCOPROTEÍNA E7 DE HPV-16 FUSIONADA A GD DO HSV1 CO-ADMINISTRADO COM UM PLASMIDEO QUE EXPRESSA A IL-2 E O
5
SEU USO NO CONTROLE DE TUMORES INDUZIDOS POR HPV-16"
A presente invenção trata da utilização de duas construções de
DNA plasmideal, uma contendo o gene que expressa a oncoproteína E7 do
vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) fusionadas à glicoproteína D (gD)
do herpes simplex tipo-1 (HSV-1) e outra contendo o gene que expressa a
10 interleucina-2 (IL-2) para o preparo de uma composição farmacêutica e o seu
uso no controle de tumores induzidos pelo HPV-16. Tal composição
farmacêutica apresenta interesse para a indústria farmacêutica para a
manufatura de medicamentos para uso humano destinados ao controle de
tumores.