CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU
Universidade Federal de Uberlândia
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
DIRETORIA DE PESQUISA
COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
2008 – UFU 30 anos
EFEITO ADJUVANTE DOS DINUCLEOTÍDEOS DE CpG NA
IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS EXPERIMENTALMENTE
INFECTADOS POR Toxoplasma gondii
Marina Marçola Pereira de Freitas1
Laboratório de Imunoparasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia. Avenida
Pará, 1720 Bairro Umuarama, Uberlândia – MG, 38405-320
[email protected]
Dâmaso Pacheco Oliveira2
Laboratório de Imunoparasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia. Avenida
Pará, 1720 Bairro Umuarama, Uberlândia – MG, 38405-320
Deise Aparecida Oliveira Silva3
Laboratório de Imunoparasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia. Avenida
Pará, 1720 Bairro Umuarama, Uberlândia – MG, 38405-320
Taísa Carrijo Oliveira4
Laboratório de Imunoparasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia. Avenida
Pará, 1720 Bairro Umuarama, Uberlândia – MG, 38405-320
Ana Cláudia A. M. Pajuaba3
Laboratório de Imunoparasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia. Avenida
Pará, 1720 Bairro Umuarama, Uberlândia – MG, 38405-320
José Roberto Mineo5
Laboratório de Imunoparasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia. Avenida
Pará, 1720 Bairro Umuarama, Uberlândia – MG, 38405-320
[email protected]
Resumo: Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório que possui um complexo
apical que auxilia na invasão da célula alvo, portanto pertence ao grupo Apicomplexa. É
responsável por casos clínicos graves, principalmente entre pacientes imunocomprometidos e em
casos de transmissão materno-fetal. Em esquemas de imunização, a utilização de adjuvantes tem
sido muito estudada, visto que são estimuladores do sistema imune. Buscou-se avaliar o efeito
adjuvante do oligodioxinucleotídeos de CpG de camundongos experimentalmente infectados por
Toxoplasma gondii. Animais foram imunizados com antígeno solúvel de Toxoplasma gondii (STAg)
na presença ou não desse adjuvante e posteriormente desafiados para a verificação dos escores de
morbidade e mortalidade, contagem de cistos cerebrais dos animais sobreviventes e verificação dos
índices de IgG total anti-Toxoplasma gondii. O adjuvante foi capaz de reduzir o número de cistos
cerebrais e elevar a resposta imune específica, porém o efeito adjuvante do CpG não se apresentou
diferente do grupo imunizado com STAg, no que se refere à morbidade e mortalidade.
Palavras-chaves: Toxoplasma gondii, OND-CpG, adjuvante, imunização, vacina
1.INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório pertencente ao grupo
Apicomplexa. É caracterizado, então, por possuir um complexo apical o qual auxilia na invasão
¹ Acadêmica do curso de Ciências Biológicas
² Aluno do Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
3
Pesquisadora de nível superior - Médica Veterinária
4
Técnica administrativa de nível superior - Bioterista
5
Professor titular e orientador
1
ativa da célula-alvo (Vedadi et al., 2007). Capaz de invadir e se replicar em todas as células
nucleadas (Xue et al., 2008), este parasito é altamente disseminado entre os vertebrados,
principalmente aves e mamíferos, entre estes, o homem (Graille et al., 2005). Estima-se que um
terço da população adulta mundial esteja infectada por esse patógeno (Roque-Reséndiz e Rosales e
Herion, 2004).
A infecção por Toxoplasma gondii (toxoplasmose) pode ocorrer por duas formas: adquirida
ou congênita. A primeira ocorre pela ingestão de alimentos contaminados com occistos que foram
expelidos nas fezes de felinos infectados, seu hospedeiro definitivo, ou de carnes mal-cozidas que
contenham cistos teciduais. A transmissão congênita ocorre durante a gestação, quando os parasitos
atravessam a parede placentária e invadem os tecidos do feto em desenvolvimento (Liu et al., 2006;
Roque-Reséndiz e Rosales e Herion, 2004).
Após a ingestão do parasito, Toxoplasma gondii é capaz de atravessar o epitélio intestinal,
atingir tecidos e atravessar barreiras biológicas como a placentária e hemoencefálica (El-Malky et
al., 2005). Porém, em pacientes imunocompetentes a infecção é caracterizada como assintomática,
embora alguns casos demonstrem um quadro de linfoadenopatia, juntamente com febre, dores de
cabeça e musculares. Já em pacientes imunocomprometidos, como casos de pacientes com AIDS,
doenças neoplásicas e receptores de órgãos transplantados, sintomas indicam casos de pneumonia e
encefalites. Nos casos de transmissão vertical, o feto pode apresentar hidrocefalia,
comprometimentos na visão, no fígado e retardo mental (Kong et al., 2003; Liu et al., 2006; RoqueReséndiz e Rosales e Herion, 2004; Xue et al., 2008). Há casos em que ocorre infecção por
transplantes de órgãos, uma vez que haja cistos no órgão do doador e, também, por meio de
transfusão de sangue (Passos e Araújo Filho e Andrade Júnior, 2000; Rey, 2001).
Em pesquisas que analisam a resposta imune diante de infecção ao Toxoplasma gondii, é
importante conhecer os antígenos de superfície, que viabilizam o ataque e invasão do parasito,
desencadeando a resposta imune, a qual caracteriza a virulência da infecção. A proteína SAG1
pertence à superfamília das proteínas SRS. Estas possuem um peptídeo N-terminal ancorado em
glicosilfosfatidilinositol e se encontram na superfície de taquizóitas, estágio infectante (Graille et
al., 2005; Jung e Lee e Grigg, 2004; Liu et al., 2006). As funções biológicas das SAG1 são
controladas por diversos mecanismos e responsáveis por desencadear uma forte resposta imune
contra a invasão de taquizoítas, como demonstrado em modelos de camundongos acarretados por
um processo inflamatório letal causado após uma infecção por Toxoplasma gondii. Esse mecanismo
de gerar uma resposta imune permite que outras formas do parasito, desprovidas de SAG1, possam
se multiplicar(Graille et al., 2005; Jung e Lee e Grigg, 2004; Liu et al., 2006). O processo de
invasão ocorre pela ação das proteínas de superfície, SAG1 (P30), SAG2 (P22) e SAG3 (P43), que
são descritas como possíveis mediadoras da ligação do protozoário à célula hospedeira. Proteínas de
micronemas, MIC1, MIC2 e MIC3, têm afinidade pela superfície celular e, após serem liberadas,
tornam-se intimamente ligadas a essa superfície (Mineo et al., 1993; Mineo e Kasper, 1994).
A resposta contra a infecção por Toxoplasma gondii pode ser desencadeada tanto via
humoral quanto celular, sendo os anticorpos a primeira via de resposta (Graille et al., 2005). As
interações de moléculas de carboidratos com receptores de superfície de membrana desencadeiam
atividades celulares que estimulam a produção de citocinas durante uma resposta protetora inata
(Panunto-Castelo et al., 2001). Durante a infecção aguda a resposta imune é mediada
principalmente pela produção de interferon-γ (IFN- γ) pelas células Natural Killer (NK). Estas,
juntamente com neutrófilos e macrófagos, caracterizam a defesa imunitária do hospedeiro. São
responsáveis pela fagocitose, citotoxicidade celular e liberação de interleucina-12 (IL-12),
induzindo uma resposta imune do tipo Th1. Além disso, fator de necrose tumoral – α (TNF-α) e
óxido nítrico (NO) são produzidos pelos macrófagos na tentativa de combater a invasão do parasito.
A IL-12 é uma citocina chave na montagem da resposta imune celular, porém não parece ser
importante na fase crônica da infecção (Correa et al., 2007).
Esquemas de imunizações têm sido intensamente avaliados na tentativa de prevenir a
disseminação da infecção por Toxoplasma gondii. A utilização de adjuvantes no processo de
vacinação é muito estudada. Têm importante papel no mecanismo de proteção contra as infecções,
2
pois são capazes de aumentar a cinética da resposta imune e determinar seu perfil imunológico (ElMalky et al., 2005).
Os oligonucleotídios de CpG são importantes na estimulação do sistema imune, visto que
induzem a produção de IL-6, IL-12 e IFN- γ por NKs, linfócitos B e T CD4+ e secreção de
imunoglobulinas em murinos (Klinman et al., 1996; Krieg et. al., 1995). Pesquisas mostram que a
utilização de CPG ODN foi capaz de induzir uma reposta do tipo Th1, conferindo proteção à
camundongos infectados com cepa moderadamente virulenta de Toxoplasma gondii (El-Malky et
al., 2005).
Justifica-se este projeto pela busca de uma formulação segura e eficiente de profilaxia contra
Toxoplasma gondii, estimulando o sistema imunológico de forma mais adequada com antígenos do
parasito e substâncias co-estimulatórias. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo geral
determinar a ação do CpG como adjuvante na imunização de camundongos experimentalmente
infectados por Toxoplasma gondii e, avaliar seu potencial na formulação de vacinas eficazes contra
este parasito. Como objetivos específicos, a presente pesquisa se propôs a avaliar o padrão de
resposta imune humoral dos camundongos imunizados com antígeno solúvel total (STAg) de T.
gondii associados à CpG mediante a detecção de anticorpos séricos da classe IgG contra
Toxoplasma gondii; e determinar o efeito protetor da imunização de camundongos com o antígeno
STAg associados ao adjuvante CpG após a infecção.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Animais
Foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 com 6 a 8 semanas de idade,
os quais foram mantidos no Centro de Bioterismo e Experimentação Animal do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia, seguindo as normas recomendadas
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA (1991).
2.2 Manutenção da Cepa de Toxoplasma gondii
Cistos teciduais da cepa ME-49 de T. gondii foram obtidos de encéfalos de Callomys
callosus previamente infectados por no mínimo 30 dias. Os cérebros foram removidos e
homogeneizados em PBS. O material foi lavado em PBS duas vezes e o sedimento foi
ressuspendido para a contagem de cistos cerebrais em lâmina e lamínula de microscopia.
2.3 Preparo do Antígeno Solúvel de Toxoplasma gondii (STAg)
Suspensões parasitárias da cepa RH de T. gondii foram descongeladas e ressuspensas em
PBS suplementado com inibidores de proteases (aprotinina 10 µg/mL, leupeptina 50 µg/mL e
PMSF (fenil-metillsulfonil fluoreto) 1,6 mM) e submetidas a 6 ciclos de congelamento em
nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria a 37°C. O material obtido por criólise foi
sonicado (6 ciclos de ultra-som a 60 Hz em banho de gelo) e centrifugado a 10.000 x g por 30
minutos a 4oC. O sobrenadante foi coletado e alíquotas foram armazenadas a –70°C, após a
determinação da concentração protéica realizada pelo método de Lowry et al. (1951).
2.4 Obtenção do Oligodeoxinucleotídeo Sintético CpG
O oligodeoxinucleotídeo (ODN) CpG 1826 a ser utilizado neste estudo foi sintetizado e
constituído pela seqüência 5´-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3´, contendo dois motifs CpG. Este
foi obtido pela compra do produto na Coley Pharmaceutical Group, MA, Estados Unidos da
América.
3
2.5 Análise Eletroforética em SDS-PAGE
O antígeno solúvel de Toxoplasma gondii (STAg) foi avaliado quanto ao perfil protéico em
gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) a 15% de concentração,
segundo Laemmli (1970), utilizando o sistema de eletroforese vertical (Gibco BRL, Life
Technologies, Inc., Gaithersburg, USA). O perfil protéico foi analisado pelo método de coloração
de Coomassie-blue e comparado aos padrões de peso molecular (Sigma Chemical Co.).
2.6 Esquema de Imunização dos Animais
Os animais foram divididos em quatro grupos, com 13 camundongos, conforme os grupos
de imunização distribuídos na Tabela 1. Estes foram imunizados por via subcutânea. Cada animal
recebeu duas doses num intervalo de 15 dias. Cada inóculo continha um volume total de 200 µL.
Tabela 1: Grupos de animais separados de acordo com as substâncias inoculadas no processo de
imunização e suas respectivas concentrações.
Grupos
Substância inoculada
I
II
III
IV
STAg + CpG
STAg
CpG
PBS (controle)
Concentração ministrada
(µg/ animal)
25 + 50
25
50
200
Amostras de sangue foram coletadas aos 15, 30, 45 e 60 dias após a primeira imunização e
os soros obtidos foram armazenados a -20oC para análise de anticorpos.
Os animais foram submetidos à sangria prévia à imunização (soro pré- imune) para serem
analisados sorologicamente a fim de verificarem a ausência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii.
2.7 Desafio
Para a análise do efeito protetor, os animais imunizados foram desafiados
intraperitonealmente após 30 dias a última imunização com inóculo contendo 75 cistos parasitários
da cepa ME-49 diluídos em PBS num volume total de 200 µL. Os animais foram avaliados
diariamente quanto à mortalidade, morbidade e variação do peso corpóreo.
2.8 Detecção de Cistos Teciduais
Os sobreviventes ao desafio foram sacrificados por deslocamento cervical. O cérebro foi
coletado para contagem de cistos teciduais a fresco, seguindo o mesmo protocolo para a obtenção
de cistos cerebrais em Callomys callosus já descrito acima.
2.9 Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para Detecção de Anticorpos IgG1 e IgG2a AntiToxoplasma gondii
O método ELISA indireto foi realizado para a detecção de anticorpos IgG anti-T. gondii em
amostras de soros individuais de camundongos imunizados, segundo o protocolo anteriormente
descrito (Mineo et al., 1980). Placas de microtitulação de poliestireno foram sensibilizadas com
antígeno STAg e incubadas seqüencialmente com amostras de soros e com conjugados anti-IgG de
camundongo marcados com peroxidase (Sigma Chemical Co.). A reação foi revelada com o
substrato enzimático (ortofenilenodiamina [OPD] a 1 mg/ml e H2O2 a 0,03%) e a densidade óptica
4
determinada a 492 nm em leitor de microplacas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, EUA).
Amostras de soros controles positivos e negativos foram incluídas em cada placa.
2.10 Análise Estatística dos Resultados
Comparações entre os grupos, em relação aos índices que apresentarem distribuição normal
pelos testes de Kolmorov-Smirnov, foram realizadas pelos testes ANOVA one way e teste t de
Student. Quanto aos índices que não apresentarem uma distribuição gaussiana, foram analisados
pelos testes de Wilcoxon, Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. As curvas de sobrevida foram
analisadas pelo método de Kaplan-Meier. Todos os testes estatísticos foram realizados utilizando-se
o aplicativo GraphPad Prism versão 4.01 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).
2.11 Normas de Biossegurança
A realização do projeto seguirá as normas de biossegurança pertinentes aos tipos de
procedimentos que foram aplicados para a sua realização como descrito mais recentemente por
Mineo (2005).
3. RESULTADOS
3.1 Análise da Mortalidade, Morbidade e Variação de Peso
As curvas de sobrevida de camundongos infectados com a cepa avirulenta ME49 de
Toxoplasma gondii estão ilustradas na Figura 1. Todos os grupos de imunização apresentaram
animais sobreviventes até o 34º dia pós-desafio (dpd).
O grupo STAg+CpG não mostrou diferença significativa quanfo comparado com a
mortalidade dos demais grupos. A média de sobrevida para o grupo STAg foi de 8,5 dias e para o
STAg+CpG foi de 10 dias. Não houve diferença entre os grupos STAg e PBS (p=0,1197).
Sobrevida (%)
125
STAg + CpG
STAg
CpG
PBS
100
75
50
25
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
Dias pós-desafio
Figura 1: Curva de sobrevida de camundongos C57BL/6 imunizados com STAg na presença
ou não de CpG ou solução salina tamponada (PBS) após o desafio.
Como observado na Figura 2, a curva de escores de morbidade foi semelhante entre os
grupos. A presença de adjuvante não diminuiu o aparecimento dos sintomas clínicos decorrentes da
infecção, uma vez que o grupo imunizados com CpG não é estatisticamente diferente dos grupos
STAg e PBS.
5
Morbidade (escore m édio)
5.5
STAg + CpG
STAg
CpG
PBS
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
Dias pós-desafio (cepa ME49)
Figura 2: Escores médio de morbidade de camundongos C57BL/6 imunizados com STAg na
presença ou não de CpG (C) ou solução salina tamponada (PBS) após o desafio.
Todos os grupos de animais desafiados apresentaram queda de peso (Fig. 3). O grupo PBS
apresentou maior queda de peso em relação ao peso inicial, 29,3%. Porém os demais grupos
também apresentaram uma baixa performance visto que apresentaram mais de 20% de perda de
peso, e portanto o grupo imunizado com STAg+CpG não foi estatisticamente diferente dos grupos
STAg e CpG, apresentando uma perda de peso de 21,6 % da média do peso inicial. O grupo
imunizado apenas com adjuvante apresentou perda de peso e variação no decorrer do tempo
semelhante aos grupos STAg e PBS, não sendo estatisticamente diferentes.
STAg + CpG
STAg
CpG
PBS
Diferença de peso (g)
2.5
1.5
0.5
-0.5
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
-1.5
-2.5
-3.5
-4.5
-5.5
-6.5
-7.5
Dias pós-infecção
Figura 3: Variação média do peso de camundongos C57BL/6 imunizados com STAg na
presença ou não de CpG ou solução salina tamponada (PBS) após o desafio.
3.2 Cistos Cerebrais
Os animais sobreviventes dos grupos desafiados com a cepa avirulenta ME-49 apresentaram
cistos teciduais após 34º dia pós-desafio (Fig. 4). O grupo que apresentou o maior número de cistos
parasitários no tecido cerebral foi o imunizado somente com STAg, porém não foi
significativamente diferente do grupo controle PBS (p>0,05).
Os grupos imunizados com antígeno solúvel e adjuvante tiveram uma redução da carga
parasitária, sendo diferente quando comparados ao grupo STAg (p=0,0136). Porém esta diferença
não foi observada quando comparados aos grupos PBS e CpG.
Os animais imunizados somente com adjuvante também apresentaram uma redução da carga
parasitária no tecido cerebral. Porém quando comparados com o grupo PBS não houve nenhuma
diferença. Diferenças estatísticas foram observadas entre os grupos STAg e CpG (p=0,0065).
6
2500
2000
1500
1000
500
PB
S
C
ST
A
g
+
C
ST
A
g
pG
0
pG
Número de cistos cerebrais
3000
Grupos de imunização
Figura 4: Número de cistos cerebrais encontrados em camundongos C57BL/6 imunizados com
STAg na presença ou não de CpG ou solução salina tamponada (PBS) 34 dias pós-desafio.
3.3 Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
Os grupos que foram imunizados com antígeno solúvel soroconverteram após a 2ª dose de
imunização (14 dias) (Fig. 5), o que não foi observado para os grupos que receberam dose somente
com adjuvante ou PBS. A partir do 14º dia pós-imunização foi possível notar diferenças estatísticas
entre os grupos STAg+CpG e STAg (p<0,001). Nesse caso, a presença do adjuvante aumenta a
eficiência da resposta humoral, ou seja, o nível de anticorpos é maior nesse grupo.
7.2
IgG anti-T. gondii (IE)
6.6
6.0
5.4
4.8
STAg + CpG
STAg
CpG
PBS
4.2
3.6
3.0
2.4
1.8
1.2
0.6
0.0
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
Dias pós-imunização
Figura 5: Índice ELISA (IE) de IgG anti-Toxoplasma gondii de soros de camundongos
C57BL/6 imunizados com três doses de antígeno solúvel de Toxoplasma gondii (STAg) na presença
ou não de CpG ou solução salina tamponada (PBS). As setas pontilhadas representam os dias em
que foram dadas as doses de imunização, e a seta contínua o dia em que os animais foram
desafiados, sendo que o dia 0 representa a pré-sangria.
4 CONCLUSÕES E DISCUSSÃO
A formulação de vacinas contra Toxoplasma gondii tem sido alvo de diversos estudos e sua
importância é decorrente dos problemas ocasionados em grupos de riscos, tais como mulheres
grávidas e pacientes imunocomprometidos (Cuppari et al., 2008; Jongert et al., 2008). Adjuvantes
têm sido utilizados em protocolos de imunizações devido aos seus potenciais imunoestimulatórios
7
(Baba et al. 2007; Coltri et al., 2008; Teixeira et al., 2006; Zimmermann and Dalpke and Heeg,
2008).
Em toxoplasmose, a proteção contra a infecção requer uma reposta imune celular com
elevada produção de IFN-γ induzido pela presença de IL-12, caracterizando, portanto, uma reposta
do tipo Th1 (Jongert et al., 2008; Yarovinsky, 2008). Porém, estudos recentes (Cuppari et al., 2008;
Jongert et al., 2008) demonstraram que esquemas de imunização que induziram uma reposta mista
Th1/Th2 também foram capazes de conferir proteção contra a infecção por Toxoplasma gondii.
Nosso trabalho demonstrou que o adjuvante foi capaz de promover a redução do número de
cistos no tecido cerebral, independente de sua associação com antígeno solúvel de Toxoplasma
gondii (STAg). O grupo imunizado com ODN-CpG promoveu o aumento da reposta imune
específica, apresentando um elevado índice de IgG total quando associados ao STAg.
Vale ressaltar que o pior desempenho foi observado no grupo imunizado somente com
antígeno solúvel de Toxoplasma gondii. Kasper e colaboradores (1985) mostraram que animais
imunizados com proteína P30 (principal antígeno de superfície de Toxoplasma gondii)
apresentaram menor taxa de sobrevida que aqueles não imunizados, porém o número de cistos
cerebrais foi menor no grupo imunizado com o antígeno. No nosso estudo, os animais imunizados
com STAg apresentaram menor taxa de sobrevida, associado com o pior quadro de sinais clínicos e
com o maior número de cistos cerebrais. Yarovinsky (2008) mostra que a produção de IL-12 por
neutrófilos foi reduzida quando essas células foram estimuladas com taquizoítos vivos ou STAg.
Esses dados mostraram uma resposta inesperada induzida pelo STAg, sendo importante novos
estudos que busquem antígenos que desencadeiam repostas mais eficientes.
Os animais que receberam ODN-CpG sucumbiram à infecção pois apresentou um baixo
desempenho quanto à mortalidade e morbidade. Por outro lado, quando associado ao STAg, foi
capaz de induzir elevada taxa de IgG total anti-Toxoplasma gondii. Apesar de ser capaz de induzir
IL-12 via TLR9, gerando um perfil de resposta Th1, ODN-CpG não é capaz de induzir uma
proteção efetiva contra toxoplasmose (Zimmermann and Dalpke and Heeg, 2008), mesmo
apresentando efeitos benéficos contra essa infecção.
Em síntese, a utilização de adjuvante mostrou-se importante no nosso esquema de
imunização, uma vez que eles induziram uma reposta diferente quando comparados com o grupo
imunizado somente com STAg. Porém, a presença de adjuvante não foi capaz de propiciar uma
melhora no quadro clínico. Nosso grupo está trabalhando com diferentes procedimentos para
melhor entender seu efeito adjuvante. Novos estudos devem ser feitos na tentativa de buscar um
antígeno e uma adjuvante mais eficiente contra a infecção.
5. AGRADECIMENTOS
Agradeço ao apoio financeiro do programa de bolsa PIBIC/CNPq da Universidade Federal
de Uberlândia.
6. REFERÊNCIAS
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Lymphocyte Activation and Th1/Th2 Cytokine Secretion”, Journal of Leukocyte Biology, Vol. 81,
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Animal”, Disponível em: < http://www.cobea.org.br/etica.htm#3 >. Acesso em: 12 Mai. 2007.
Coltri, K.C. et al, 2008, “Therapeutic Administration of KM+ Lectin Protects Mice Against
Paracoccidioides brasiliensis Infection via Interleukin-12 Production in a Toll-like Receptor 2Dependent Mechanism”, The American Journal of Pathology, Vol. 173, pp 423-432.
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Cuppari, A.F. et al., 2008, “Toxoplasma gondii Protease Inhibitor-1 (TgPI-1) is a Novel Vaccine
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El-Malk Y, M. et al., 2005, “Protective Effect of Vaccination with Toxoplasma Lysate Antigen and
CpG as an Adjuvant Against Toxoplasma gondii in Susceptible C57BL/6 Mice”, Microbiology and
Immunology, Vol. 49, pp 639-646.
Graille, M. et al., 2005, “Crystal Structure of the Complex Between the Monomeric Form of
Toxoplasma gondii Surface Antigen 1 (SAG1) and a Monoclonal Antibody that Mimics the Human
Immune Response”, Journal of Molecular Biology, Vol. 354, pp 447–458.
Jongert, E. et al., 2008, “Protective Th1 Immune Responses Against Chronic Toxoplasmosis
Induced by a Protein-Protein Vaccine Combination but not by its DNA-Protein Counterpart”,
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Kasper, L.H. and Currie, K.M.and Bradley, M.S., 1985, “An Unexpected Response to Vaccination
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ADJUVANT EFFECT OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES IN MICE
EXPERIMENTALY IMMUNIZED WITH Toxoplasma gondii
Marina Marçola Pereira de Freitas
Laboratory of Imunoparasitology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia. Avenue Pará,
1720 Umuarama, Uberlândia – MG, Brazil 38405-320.
[email protected]
Dâmaso Pacheco Oliveira
Laboratory of Imunoparasitology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia. Avenue Pará,
1720 Umuarama, Uberlândia – MG, Brazil 38405-320.
Deise Aparecida Oliveira Silva
Laboratory of Imunoparasitology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia. Avenue Pará,
1720 Umuarama, Uberlândia – MG, Brazil 38405-320.
Taísa Carrijo Oliveira
Laboratory of Imunoparasitology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia. Avenue Pará,
1720 Umuarama, Uberlândia – MG, Brazil 38405-320.
Ana Cláudia A. M. Pajuaba
Laboratory of Imunoparasitology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia. Avenue Pará,
1720 Umuarama, Uberlândia – MG, Brazil 38405-320.
José Roberto Mineo
Laboratory of Imunoparasitology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia. Avenue Pará,
1720 Umuarama, Uberlândia – MG, Brazil 38405-320.
[email protected]
Abstract: Toxoplasma gondii is an obligatory intracellular protozoan, belonging to the
Apicomplexan phylum. It is responsible for serious diseases, mainly in immuno-compromised
patients and in cases of transplacental infection. Adjuvants have been utilized intensively because
they are potent inducers of the immune response. This work aimed to evaluate the effect of
oligodeoxynucleotide of CpG in the immunization of mice experimentally infected by Toxoplasma
gondii. Mice were immunized with soluble antigen of Toxoplasma gondii (STAg) with or without
this adjuvant and subsequently they were challenged to verify the morbidity and mortality rates, to
determine the number of cysts in surviving animals’s brains and evaluate anti-Toxoplasma gondii
IgG rates. The adjuvant was able to reduce brain cysts number and to increase the specific
response, but CpG was not different to STAg group when compared their morbidity and mortality
rates.
Key-words: Toxoplasma gondii, OND-CpG, adjuvant, imunization, vaccine.
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