UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROTEÍNAS SAG1, SAG2, SAG3 DE Toxoplasma gondii COMO PERSPECTIVAS
PARA O DESENVOLVIMENTO DE PROTÓTIPO VACINAL CONTRA A
TOXOPLASMOSE.
ANDREW DOUGLAS MOURA
Natal
2013
ANDREW DOUGLAS MOURA
PROTEÍNAS SAG1, SAG2, SAG3 DE Toxoplasma gondii COMO PERSPECTIVAS
PARA O DESENVOLVIMENTO DE PROTÓTIPO VACINAL CONTRA A
TOXOPLASMOSE.
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa
de
Pós-Graduação
em
Ciências Biológicas, da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
requisito parcial para obtenção do título
de mestre em Ciências Biológicas.
Orientador: Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
Co-orientador: Dr. Oscar Bruna-Romero
Centro de Biociências - UFRN
Natal- RN
Abril/2013
APOIO FINANCEIRO
Este trabalho foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) e pelo Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico
(CNPq). Andrew Douglas Moura recebeu uma bolsa de mestrado do Conselho Nacional de
Pesquisa e Desenvolvimento Científico (CNPq).
AGRADECIMENTOS
Acredito que a sabedoria do reconhecimento está na arte de agradecer.
Eu não
poderia chegar a esse ponto sem olhar pra trás e não recordar de quem participou dessa
trajetória e contribuiu de alguma forma para essa conquista...
Primeiramente agradeço a Deus, Nsa. Sra Aparecida e Santo Expedito por me
manterem forte no meu ideal do princípio ao fim;
Agradeço ao meu orientador, professor Valter, por ter aberto as portas do laboratório,
pela amizade, orientação, confiança. Por acreditar no meu potencial e por todos os esforços
expendidos;
Ao meu co-orientador, professor Oscar, por toda a base de conhecimento que a mim
foi aplicada. Pela amizade, dedicação e confiança;
Aos colegas do LabMat por todos momentos compartilhados, em especial, aos meus
alunos Valber e Camila pelo empenho, pelas lutas, inúmeras ajudas e principalmente pelo
aprendizado que me proporcionaram ao se tornarem meus alunos;
Aos amigos do LAR (UFMG), Mariana, Gustavo, Rodrigo, Leoneide, por toda torcida
mesmo a distância, em especial à Ana pelo inestimável auxílio, contínua disposição,
contribuições, presença amiga e constante em todos os passos desta jornada;
Aos amigos do LabMic, Nielly, Renato, Duda e também de outros laboratórios,
Thiago, Érika, Lisianne e Marília pela amizade, carinho e companheirismo. Por tornarem os
meus dias mais prazerosos na Universidade;
Ao Miguel por todo companheirismo, paciência, força, amizade e contribuições nesses
últimos meses;
Aos laboratórios do Departamento de Microbiologia juntamente com seus alunos e
professores, pela disponibilização das instalações e empréstimos, os quais viabilizaram a
realização do trabalho experimental;
Ao Nil, Lise e aos demais amigos de Natal, pelos momentos compartilhados, pelo
apoio, torcida e compreensão quando eu não pude sair para estudar;
À todos meus amigos de SP e BH, que mesmo distante sempre fizeram presente pelo
facebook, SMS, e-mails, me apoiando e acreditando que seria possível sonhar e ao mesmo
tempo realizar esse sonho;
À toda a minha família, pelo amor, compreensão, preocupação sempre constante;
À Simone, João e Andréia por terem se tornado a minha família de Natal. Por terem
sempre estado do meu lado, nos melhores e piores momentos. Por todo carinho e por tudo que
fizeram e fazem por mim;
Aos meus irmãos, primos e tios pela amizade, amor, carinho, confiança e torcida;
Ao Paulo pelas grandes contribuições, ajuda, apoio e conselhos;
Em especial, à minha mãe e aos meus amados avós. A esses agradeço pelas mãos, que
sempre me ampararam e me impulsionaram aos meus objetivos. Por toda base que me
proporcionaram, e por me ensinarem que por mais difícil que alguma coisa seja... Nunca vale
a pena desistir! Pelo amor imensurável e pelo excelente trabalho que fizeram para comigo. A
vocês, dedico a minha dissertação de mestrado.
À Universidade Federal de Minas Gerais e Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, pela formação acadêmica e científica.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo provimento da bolsa de mestrado.
"Uma viagem de mil milhas começa com o primeiro passo".
(Lao-Tsé)
RESUMO
A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial causada pelo protozoário
Toxoplasma
gondi
podendo
desencadear
graves
complicações
em
pacientes
imunossuprimidos e gestantes; bem como acarretando grande impacto econômico para a
pecuária. Até o momento o controle da toxoplasmose é feito basicamente pela
quimioterapia.
Contudo, a maioria das drogas utilizadas na rotina apresentam alguma
limitação. No intuito do controle dessa parasitose, diversos grupos de pesquisas, inclusive o
nosso, vêm trabalhando para o desenvolvimento de uma vacina médico-veterinária com base
em antígenos do parasito, vetores e protocolos para imunização. Nesse estudo foram
implantadas e padronizadas metodologias para amplificação e clonagem de imunógenos em
sistema recombinante visando o desenvolvimento de um protótipo vacinal, tendo como base
os antígenos de superfície de T. gondii e adenovírus recombinante codificando esses
antígenos. Os genes que codificam as proteínas BAG1, GRA2 e SAG1 foram amplificados.
Foi estabelecida uma estratégia de clonagem dos genes SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1
em sistema recombinante. Os genes que codificam SAG1 e SAG2 foram clonados e suas
sequências apresentaram grande similaridade com sequências depositadas no GenBank. A
tradução virtual dessas proteínas apresentou polimorfismos no nível de aminoácidos, que
poderão ser correlacionadas com níveis de antigenicidade. Paralelamente, foi realizada a
expansão, purificação e caracterização dos adenovírus que codificam as SAGs (HAdSAGs).
A imunização de camundongos C57BL/6, utilizando o sobrenadante viral, não foi suficiente
para desencadear respostas imunológicas em altos níveis, sendo necessária a titulação dos
HAdSAGs para futuras imunizações. Portanto, esse estudo permitiu a clonagem de dois
genes importantes para o desenvolvimento de um protótipo vacinal, além de
implementações de metodologias que permitirão avanços para o desenvolvimento de uma
vacina contra a toxoplasmose usando adenovírus que expressem proteínas do parasito.
Palavras-chave: Toxoplasmose, vacinas, SAGs, adenovírus.
ABSTRACT
Toxoplasmosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by the protozoan Toxoplasma
gondii, triggering dangerous complications in immunocompromised patients and pregnant
women, as well as having great economic impact for the livestock. So far the control of
toxoplasmosis is made primarily by chemotherapy. However, most drugs used routinely have
some limitations. In order to control this disease, several research groups, including ours, has
been working to develop a medical-veterinary vaccine based on parasite antigens, vectors and
protocols of immunization. In this study were implemented and standardized methodologies
for amplification and cloning of recombinant immunogens in the system for the development
of a prototype vaccine, based on the surface antigens of T. gondii and recombinant adenovirus
encoding these antigens. Genes encoding BAG1, GRA2 and SAG1 proteins were amplified.
We established a strategy for cloning SAG1, SAG2, SAG3 and TgAMA1- genes in
recombinant system. The genes encoding SAG1 and SAG2 were cloned and their sequences
showed high similarity with sequences from GenBank. The virtual translation of these
proteins showed polymorphisms in the amino acid sequence, which can be correlated with
levels of antigenicity. Simultaneously, the adenovirus encoding the SAGs (HAdSAGs) were
expanded, purificated and characterizated. Immunization of C57bl/6 mice, using viral
supernatant was not enought to elicit immune responses at high levels, being required
HAdSAGs titration for future immunizations. Therefore, this study allowed the cloning of the
two genes important for the development of a prototype vaccine. Besides, implementations
methodologies that permit advancements in the development of a vaccine against
toxoplasmosis using adenovirus to express proteins of the parasite.
Key-words: Toxoplasmosis, vaccine, SAGs, adenovirus.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................14
1.1 Toxoplasmose e aspectos epidemiológicos .................................................................................14
1.2 Imunobiologia .............................................................................................................................18
1.3 Vacinas: Antígenos alvos, vetores e protocolos ............................................................................19
2. JUSTIFICATIVA .........................................................................................................................25
3. OBJETIVOS .................................................................................................................................26
3.1 Objetivo Geral: ...........................................................................................................................26
3.2 Objetivos específicos: .................................................................................................................26
4. ESTRATÉGIA DE TRABALHO ..................................................................................................27
5. MATERIAIS E MÉTODOS ..........................................................................................................28
5.1 Animais ......................................................................................................................................28
5.2 Manutenção da cepa do T. gondii e obtenção e taquizoítos ..........................................................28
5.3 Preparação do extrato antigênico (TLA); .....................................................................................28
5.4 Extração do DNA genômico do Toxoplasma gondii;....................................................................29
5.5 Extração de RNA e síntese de cDNA; ..........................................................................................29
5.6 Reação em cadeia de polimerase (PCR); ......................................................................................29
5.8 Plasmídeo pCR2.1.TOPO ............................................................................................................31
5.9 Transformação bacteriana (Sambrook e Russel, 1989) .................................................................32
5.10 Obtenção de plasmideos em pequena escala ..............................................................................33
5.11 Digestão dos plasmídeos para confirmação de clonagem............................................................34
5.12 Sequenciamento genético ..........................................................................................................34
5.13 Células permissivas para o adenovírus humano sorotipo 5 não replicativo e condições de
cultivo....... ........................................................................................................................................35
5.14 Expansão e purificação dos adenovírus ......................................................................................35
5.15 Imunização................................................................................................................................36
5.16 Teste de Hemaglutinação Indireta – HAI ...................................................................................36
6. RESULTADOS ...........................................................................................................................37
6.1 Amplificação dos genes que codificam as proteínas SAG1, BAG1 e GRA2 ................................37
6.2 Amplificação dos genes SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 como estratégia de clonagem ...........38
6.3 Inserção dos genes SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 no plasmídeo de clonagem PCR 2.1 TOPO,
transformação bacteriana e clivagem; ................................................................................................41
6.4 Sequenciamento genético de pTOPO/SAG1 e pTOPO/SAG2; .....................................................43
6.5 Expansão e purificação viral; .......................................................................................................51
6.6 Imunização, teste HAI e análise do extrato antigênico de T.gondii; ..............................................53
7. DISCUSSÃO ...............................................................................................................................55
8. CONCLUSÃO ..............................................................................................................................60
9. PERSPECTIVAS................................................................................................................................61
10.REFERÊNCIAS................................................................................................................................62
14
INTRODUÇÃO
1.1 Toxoplasmose e aspectos epidemiológicos
A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição geográfica mundial, causada pelo
Toxoplasma gondi (Figura 1), um protozoário intracelular obrigatório, descrito em 1908, por
Nicolle e Manceaux, em tecidos do roedor Ctenodactylus gundi. Ao mesmo tempo, no
Brasil, Splendore (1908) relatou a presença de T. gondii em tecidos de coelhos. O gênero foi
classificado por Nicolle e Manceaux como Toxoplasma devido a sua forma curvada (do
Grego Toxo= curva, arco; Plasma=criatura) (WEISS et al.,2009).
Figura 1: Taquizoítos de Toxoplasma gondii.
Fonte: <http://aprendendosobreprotozoarios.blogspot.com.br/2011/05/toxoplasmose.html>
Do ponto de vista epidemiológico, a toxoplasmose tem a sua distribuição influenciada
por vários fatores, entre os quais se pode incluir: os climáticos, os socioeconômicos, contato
com animais domésticos, em especial o gato, e o consumo de carne crua ou mal cozida
(COUPER, LOZANO & LOPES, 1981). Nesse contexto, essa parasitose apresenta
considerável importância em saúde pública e grande impacto médico-veterinário por causar
abortos, má-formação fetal e morte, sendo considerada uma das parasitoses mais difundidas
entre as enfermidades infecciosas (APPLEFORD & SMITH, 1997).
A cada ano, estima-se que o T. gondii infecta mais de um bilhão de pessoas em todo o
mundo (EL-ON & PEISER, 2003), sendo sua infecção normalmente assintomática em
adultos saudáveis, podendo causar graves complicações em recém-nascidos infectados
congenitamente e em indivíduos imunocomprometidos, provocando doenças oculares e
15
neurológicas (DUBEY, 1996; PASSOS et al., 2000; SORRENTINO, 2005). A toxoplasmose
tem sido citada como a terceira causa de mortes relacionadas à alimentação nos Estados
Unidos (MEAD et al., 1999)
A transmissão desse protozoário ocorre principalmente por via oral através da ingestão
de cistos contendo bradizoítos, presentes em carne crua ou mal cozida, ou pela ingestão de
oocistos contendo esporozoítos, liberados nas fezes de felídeos; hospedeiros definitivos do
parasito. Os esporozoítos são a forma infectante oriunda do processo de reprodução sexuada
de T.gondii. O ciclo de vida (Figura 2) sexuado do parasito ocorre apenas no intestino de
membros da família Felidae. Nos herbívoros, os oocistos são a principal via de transmissão
(WEISS et al., 2009).
. Figura 2: Ciclo de vida. Adaptado de BRUÑA-ROMERO et. al.; 2011
16
Após a ingestão de cistos teciduais e/ou oocistos, os bradizoítos e/ou esporozoítos
invadem a célula hospedeira e se diferenciam em taquizoítos (WEISS et al., 2009), forma
assexuada que se divide rapidamente dentro das células. Esta interconversão pode estar
relacionada ao tipo celular em que o parasito se encontra para desenvolver seu ciclo, fatores
intrínsecos inerentes ao tipo celular e aos níveis de interferon-γ (IFN-γ) e reativos de
oxigênio (SKARIAH et al, 2010). Nessa fase do ciclo ocorre a ampla disseminação do
parasito no organismo do hospedeiro, com a multiplicação ativa dos taquizoítos em
diferentes tipos de células nucleadas, caracterizando a fase aguda da doença.
Outra via de infecção muito importante é a congênita. Ela decorre da transmissão para
o feto, por via transplacentária de taquizoítos (CAETANO et al, 2005), por mulheres com
primoinfecção durante a gestação ou por gestantes com comprometimento imune, devido à
reativação de uma infecção latente.
A incidência mundial da toxoplasmose congênita é estimada em 0,3 a 1,0 para cada
mil nascidos vivos (TROJOVSKY, 1998) e segundo Kawazoe (2005), cerca de 40% dos
fetos humanos podem adquirir o T. gondii quando a mulher adquire a infecção e desenvolve
a fase aguda da doença durante a gestação. A infecção congênita pela reativação do T.
gondii pode ocorrer em mulheres portadoras de infecção crônica, contudo esse evento ocorre
com uma frequência menor (KAWAZOE, 2005).
As consequências da infecção intrauterina pelo T. gondii nas duas últimas décadas
vem despertando atenção dos gestores em saúde pública, devido ao seu impacto para a saúde
humana. A toxoplasmose vem sendo diagnosticada em um número crescente de pacientes
com imunossupressão decorrente de várias causas, transplantes de órgãos e Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida –AIDS- (KOSKINIEMI et al., 1989). Clinicamente, a encefalite
toxoplásmica aparente tem sido reportada em 20 a 47 % dos pacientes com AIDS (GARLY
et AL., 1997).
Paralelamente, na pecuária, a importância econômica da infecção por T. gondii se deve
aos fatores reprodutivos e produtivos, uma vez que a transmissão congênita pode causar
abortos, ocorrência de natimortalidade, malformações fetais e nascimento de animais fracos
(DUBEY, 1994).
Entre os animais de produção, os ovinos e caprinos são os mais
susceptíveis ao T. gondii (DUBEY & ADAMS, 1990), o que justifica a necessidade de
estudos com esses ruminantes pela potencialidade de transmissão para humanos. Nosso
17
grupo de pesquisa já vem desenvolvendo trabalhos epidemiológicos em rebanhos de
caprinos no Sertão do Cabugi, que é a maior região produtora desses animais no Rio Grande
do Norte. Foi observada alta ocorrência da toxoplasmose nesses rebanhos e, no tocante a
saúde humana, em indivíduos que mantém contato estreito no manejo desses animais
(CLEMENTINO et al., 2007; CLEMENTINO et al., 2009). Esse fato aponta para os riscos
da toxoplasmose na população humana o que pode resultar em um impacto importante a ser
considerado para a saúde pública do Estado.
No Brasil não existem dados sistematizados quanto ao impacto dessa parasitose.
Traçando um paralelo com países desenvolvidos, percebe-se que o impacto econômico anual
da toxoplasmose nos Estados Unidos, por exemplo, é estimado em 7,7 bilhões de dólares,
sendo a toxoplasmose a terceira maior causa de morte causada por alimentos nesse país
(JONES et al., 2001). Em 1993, os Estados Unidos tiveram um custo anual de 5,3 bilhões de
dólares devido às perdas com cuidados médicos para os portadores de toxoplasmose
congênita, baixa na produtividade e custos com educação especial (ROBERTS et al., 1994),
constituindo-se um sério problema de saúde pública, sendo o seu diagnóstico crucial para
programas de assistência a gestantes (SPALDING et al., 2005).
A toxoplasmose raramente apresenta sinais clínicos no hospedeiro, entretanto, a
gravidade da doença, quando esta ocorre, está relacionada à espécie, idade do hospedeiro,
prenhez, condições imunológicas ou nutricionais, virulência e estágio do parasito e infecções
concomitantes por outros patógenos (LUFT & REMINGTON, 1992; DUBEY, 1994 a;
DUBEY et al., 1994b; LIESENFELD et al., 2001; DUBEY & JONES, 2008).
Atualmente, o controle desta parasitose depende basicamente do tratamento curativo
dos casos agudos e de medidas profiláticas que impeçam a disseminação de oocistos
esporulados. Entretanto, existe uma crescente preocupação com o desenvolvimento da
resistência do parasito às drogas utilizadas no tratamento por animais destinados a
alimentação humana. Além disso, não existe nenhuma droga disponível que possa agir
contra o estágio de cisto tecidual do T. gondii e assim debelar o parasito nesta fase da
infecção.
A vacinação tem como objetivo reduzir as lesões fetais, o número de cistos teciduais,
além de prevenir a formação de oocistos em felinos (DUBEY, 1996) sendo uma abordagem
promissora e fundamental para o controle dessa parasitose.
18
Sendo assim, novas estratégias para o combate da toxoplasmose se fazem necessárias
e o desenvolvimento de vacinas eficazes para uso veterinário e humano se mostra uma
estratégia altamente relevante para a saúde pública (BHOPALE, 2003).
1.2
Imunobiologia
Por se tratar de um parasito intracelular obrigatório, os mecanismos imunes mediados
pelas células são componentes importantes para a proteção do hospedeiro. A infecção oral
pelo T. gondii é sucedida por uma resposta imune, inicialmente inespecífica, seguida de uma
forte resposta celular Th1, além da produção de imunoglobulinas anti-Toxoplasma.
A resposta imunológica contra a toxoplasmose nos estágios iniciais da infecção, é
caracterizada pela ativação dos macrófagos e células dendríticas (DC), que internalizam os
taquizoítos ou seus constituintes antigênicos e produzem citocinas tais como, interleucina-12
(IL-12) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α ). A IL-12, por sua vez, ativa células matadoras
naturais (do inglês natural killer) e linfócitos T para a produção de interferon-γ (IFN-γ). O
IFN-γ e TNF-α agem sinergicamente na destruição dos taquizoítos por ação potencializada
dos macrófagos. A combinação dessas duas citocinas resulta numa maior produção de radicais
livres e óxido nítrico (ON), que agem na eliminação do parasito. A imunidade adquirida
contra T. gondii é caracterizada por forte atividade das células T CD4 + e CD8 +. O IFN-γ é a
principal citocina que controla a resistência do parasito nas fases aguda e crônica da infecção,
levando a diferenciação de
linfócitos T CD4+ específicos a antígenos do parasito, que
estimularam células T auxiliares (Th1) em conjunto com a IL-12. Além disso, células T CD8+
são fundamentais para controlar a replicação do parasito na fase crônica na reativação da
doença, desenvolvendo atividade citotóxica contra células infectadas e prevenção de infecção
(DENKERS; GAZZINELLI, 1998; BHOPALE, 2003; CAETANO, BRUNA-ROMERO et al.
2006, PIFER AND YAROVINSKY 2011).
Como tentativa de evasão da resposta imune do hospedeiro, os taquizoítos
diferenciam-se em bradizoítos formando cistos teciduais, passando para um estágio de
latência ou cronicidade. Quando ocorre essa diferenciação, os constituintes antigênicos do
T.gondii são voltados para dentro do vacúolo parasitóforo, não sendo reconhecido pelo
sistema imunológico. Essa fase da doença é caracterizada como fase crônica benigna, na qual
os sintomas são praticamente ausentes (FRENKEL, 1990; WASTUNG et al., 1995).
19
Diversas situações imunossupressoras, como infecção com o HIV e desenvolvimento
da AIDS, podem levar à reativação desses cistos e à recidiva da doença, com sintomas mais
graves tais como encefalite, podendo evoluir ao óbito (FLORES, 2005).
1.3 Vacinas: Antígenos alvos, vetores e protocolos
Não existem vacinas comerciais para a toxoplasmose humana que previnam a infecção
congênita ou a formação e reativação de cistos (GOTTSTEIN, 1995). Atualmente o controle
da toxoplasmose é feito apenas por fármacos, que além dos efeitos adversos presentes,
oferecem poucas alternativas de drogas.
Estudos têm demonstrado que a imunidade para T. gondii envolve as respostas imune
celular e humoral e que vacinas efetivas devem estimular os mecanismos de imunidade
celular e uma boa quantidade de anticorpos específicos circulantes, para juntos, prevenirem
a invasão da célula do hospedeiro e, por consequente impedir a parasitemia (SETHI,
PIEKARSKI, 1987; BUXTON et al., 1989). O desenvolvimento de uma vacina contra o T.
gondii é uma possibilidade viável já que indivíduos naturalmente infectados desenvolvem
imunidade intensa e duradoura contra o agente, sendo capaz de protegê-los contra
subsequentes reinfecções, já tendo sido demonstrado que o mesmo grau de resposta pode ser
obtido com a administração de formas atenuadas do parasito. O uso de vacinas atenuadas em
humanos é improvável, uma vez que é composta por taquizoítos vivos, podendo estabelecer
infecções crônicas ou reverter a um estado patogênico e causar doença aguda. Desta forma,
para desenvolver uma vacina contra a toxoplasmose torna-se essencial a identificação de
imunógenos e delineamento de protocolos de imunização que utilizem somente
componentes deste protozoário (MENDES, 2006).
As tentativas iniciais para induzir proteção contra a toxoplasmose em camundongos
envolveu o uso de taquizoítos vivos atenuados de cepas mutantes de T. gondii, tais como a
cepa ts-4 sensível a temperatura (GAZZINELLI et al. 1991; HIRAMOTO et al., 2002).
Apesar da elevada eficiência em termos de ativação de células T CD4+ e CD8+ e a eficácia
de proteção, vacinas baseadas em taquizoítos vivos não são aplicáveis a humanos, por causa
do risco de efeitos adversos importantes. Portanto, a maioria dos protocolos mais recentes
tem focado no desenvolvimento de vacinas recombinantes (CAETANO et al., 2006).
20
De acordo com Montoya & Liesenfeld (2004) uma vacina humana contra a
toxoplasmose é muito desejável, porém, ainda está longe da realidade. Neste sentido,
diversos estudos estão sendo conduzidos na tentativa de desenvolver uma vacina veterinária
que ofereça proteção eficaz contra esta parasitose. O objetivo é de induzir a proteção por
linfócito T (Th1) e por respostas humorais, repercutindo numa memória imune duradoura.
Acredita-se que os melhores antígenos para uso em vacinas são aqueles que são
secretados/excretados pelo parasito, uma vez que foram relatados como os alvos mais
relevantes da resposta imune durante a infecção natural, que, ao contrário do que é visto em
outras doenças, controla a capacidade do parasito de disseminar-se e replicar-se. A reposta
imune contra a infecção por T. gondii foi inicialmente focada em poucos antígenos, como
os antígenos de superfície (SAGs - do inglês “Surface Antigens”), os antígenos de grânulos
densos (GRAs), roptrias (ROPs) e antígenos micronemas (MICs). (BOOTHROYD 2009;
LIU et al.,2010).
Vercammem et al. (2000) vacinaram camundongos com plasmídeos expressando
antígenos de GRA1, GRA7 e ROP2 e verificaram um estímulo específico de células T e
secreção de IFN-γ, em cultura de baços de animais vacinados. A taxa de sobrevivência dos
animais foi maior no grupo vacinado (variando de 10 a 90 %) quando comparado ao grupo
controle, no qual o número de cistos cerebrais foi significativamente menor no grupo
vacinado. Freire et al. (2003) imunizaram suínos com uma vacina constituída de um lisado
de taquizoítos do T. gondii incorporados ao ISCOM (antígenos incorporados em complexos
de imunoestimulação) e, após o desafio verificaram que a vacina foi capaz de estimular uma
forte resposta imune humoral.
Ainda incorporados ao ISCOM, Garcia et al. (2005)
estudaram o uso de proteínas de roptrias para proteger suínos desafiados com oocistos, e
verificaram a proteção parcial do grupo vacinado, quando comparado ao grupo controle
positivo, contra a formação de cistos teciduais.
Recentemente, progressos significativos têm sido feitos na identificação de antígenos
do T. gondii que possam induzir resposta imune protetora. Uma grande parte dos trabalhos
tem se concentrado em torno de antígenos de superfície de taquizoítos (SAGs) (BHOPALE,
2003). A partir de pesquisas de imunógenos para o desenvolvimento de vacinas de
subunidades foi possível a identificação de antígenos do T. gondii que induzem resposta
imune protetora, dentre os quais SAG1, SAG2 e SAG3 se destacam como os mais
abundantemente expressos na superfície de taquizoítos (CAETANO, 2005).
21
Os genes que codificam os antígenos de superfície do T. gondii, SAG1 e SAG2, têm
sido clonados e expressos em sistemas recombinantes de organismos procariotos e
eucariotos, e tanto proteínas recombinantes como moléculas de DNA plasmidial tem sido
usadas para imunizar camundongos e outras espécies de roedores. O potencial imunogênico
das SAGs, expressas como proteínas recombinantes já foi testado em Escherichia coli
(HARNING et al., 1996); Pichia pastoris (BIEMANS et al,1998), observando-se a redução
significativa na carga parasitária, expressa como cistos cerebrais, dos animais imunizados e
desafiados com o parasito. Letscher-Bru et al,(2003) em modelo de toxoplasmose congênita
imunizaram camundongos da linhagem BALB/c com o antígeno recombinante SAG1 e
observaram altos títulos de IgG nesses animais, além da redução de 50% da taxa de
transmissão para os fetos.
Além dos antígenos SAGs, outros antígenos candidatos à vacina nos despertam
interesse na busca de desenvolver um protocolo vacinal eficaz contra toxoplasmose. O
antígeno de membrana apical (AMA-1) é um imunógeno importante contido no Filo
Apicomplexa. A AMA-1 de Toxoplasma gondii (TgAMA-1) é uma proteína de micronema
diretamente relacionada ao processo de invasão celular pelo parasito (SANTOS, et al.,
2011). Não há relatos na literatura da expressão desse antígeno em sistema recombinante.
No entanto, Dautu et al (2007) imunizaram camundongos com o gene de TgAMA-1 e
observaram altos níveis de anticorpos assim como uma resposta celular associada com a
síntese de IFN- sugerindo a modulação de uma resposta do tipo Th1, além disso a
imunização com o gene TgAMA-1 resultou em uma proteção parcial mas significante na
fase aguda da toxoplasmose comparada aos genes MIC2, M2AP e BAG1.
As proteínas recombinantes, por si próprias, geralmente induzem altos títulos de
anticorpos, embora ainda respondam fracamente ao desafio com cepas virulentas de T.
gondii. No entanto, a combinação com adjuvantes adequados pode melhorar a resposta
gerada. Além da utilização de proteínas recombinantes emusilficadas com adjuvantes
vacinais potentes, a expressão dessas proteínas pela própria célula do hospedeiro
transfectada por vetores virais tais como os adenovírus transportando seqüências específicas
do protozoário, podem melhorar a resposta imune em comparação com as vacinas de
subunidades. Algumas vantagens são bem percebidas: (i) são mais eficientes em induzir a
expressão da proteína; (ii) apresentam baixa patogenicidade, o que permite o
desenvolvimento de vetores de imunização praticamente inócuos aos hospedeiros; (iii) suas
22
estratégias de replicação e genoma já são bem caracterizadas, sendo o material genético viral
incapaz de integrar-se ao da célula hospedeira; (iv) infectam uma grande variedade de
células, incluindo células chave do sistema imunológico, como as células dendríticas, que
pode ser a razão de sua elevada imunogenicidade quando comparado com outros vírus; (v)
são de fácil propagação, podendo ser obtidos em altos títulos (>10 9 unidades formadoras de
placas/mL - PFU), o que permite sua produção em larga escala (BABIUK & TIKOO, 2000;
MERCIER et al., 2002; WORGALL et al., 2004; SOUZA et al., 2005). Devido a essas
características, adenovírus são ativadores eficientes de células T CD4+ e CD8+ e são
capazes de conduzir a resposta imune para o perfil Th1 desejado (CAETANO et al., 2006).
Nesse contexto, em que se procura aliar a alta imunogenicidade com utilização segura,
os adenovírus recombinantes aparecem como uma alternativa viável para desenvolvimento
de uma vacina contra toxoplasmose, uma vez que são capazes de ativar uma forte resposta
mediada por células T CD8+ com atividade citotóxica e são modificados para se tornarem
deficientes em replicação e incapazes de se propagarem em células de mamíferos. Além
disso, seu genoma não se integra ao genoma celular e as infecções provocadas por esses
vírus modificados podem ser eliminadas em até 30 dias, são capazes de induzir alta
expressão do transgene, superando os seus níveis de expressão se comparados com outros
métodos de vacinação, como as plasmídiais (MENDES, 2006).
Diversos grupos de pesquisas em vacinas utilizam os adenovírus codificando
antígenos de superfície dos taquizoítos, pricipalmente SAG1, SAG2, SAG3 que são os mais
abundantes expressos na superfície dos taquizoítos. Acredita-se que essas proteínas atuam
interagindo com a célula hospedeira, mediando os processos de adesão, invasão/penetração.
A associação dessas proteínas com outros antígenos como TgAMA-1, por exemplo,
demonstram ser promissores em gerar uma resposta imune eficaz e protetora contra a
toxoplasmose em modelos animais (PARMLEY et al., 1994; DEBARD et al., 1996;
LETSCHER-BRU et al., 1998; PETERSEN et al., 1998; NIELSEN et al., 1998;
DZIERSZINSKI et al., 2000; BONENFANT et al., 2001; COUPER et al., 2003).
É importante ressaltar que a presença de anticorpos pode auxiliar no controle da
toxoplasmose em sua fase crônica, atuando na opsonização das formas do parasito que são
liberados a partir dos cistos teciduais (KANG et al., 2000). Os resultados de nosso grupo,
corroborados com os dados existentes na literatura mundial, indicam que adenovírus
recombinantes contendo as seqüências codificadoras das proteínas de superfície SAG1,
23
SAG2, SAG3, bem como sua associação a estas três proteínas combinadas, apresentam um
grande potencial para futura utilização como uma vacina contra o Toxoplasma gondii.
Não obstante, estudos mais aprofundados ainda precisam ser feitos para que seja
elucidada questões como: o estabelecimento do melhor protocolo vacinal, qual adjuvante a
ser administrado, qual adenovírus utilizar, para que os indivíduos que o recebam não
apresentem altos índices de anticorpos neutralizantes contra o mesmo, entender melhor a
imunidade anti-vetor que é induzida após a primeira imunização, bem como a avaliação das
citocinas de perfil Th1.
Caetano e colaboradores, (2006) geraram adenovirus recombinantes codificando
SAG1, SAG2 e SAG3(HAdSAG1, HAdSAG2, HAdSAG3) e imunizaram camundongos
com cada um desses e com a mistura dos três (HAdMIX) em que observaram anticorpos
potentes para cada proteína assim como um viés significativo em direção a um perfil Th1 em
animais imunizados com HAd/SAG1. Foi observado redução significativa na formação de
cistos cerebrais após desafiar os animais imunizados com a cepa P-Br , sendo que a
vacinação com HAd/Mix promoveu o maior nível de inibição de formação de cistos, em
torno de 80%. No entanto, não foi observado proteção contra a cepa RH de Toxoplasma
gondii. (CAETANO, BRUNA-ROMERO et al., 2006). Desta forma, tais adenovirus se
mostram promissores para futuras imunizações em ovinos.
Atualmente, a administração simultânea de múltiplos antígenos de T. gondii, seja
codificado por plasmídeos separados ou expressa como proteínas de fusão de um plasmídeo
único, têm demonstrado aumentar a potência das respostas imunológicas. (BEGHETTO, et
al. 2005; MEVELEC, et al. 2005; JONGERT, et al. 2007; XUE, et al. 2008; QU,et al. 2009;
WANG, et al. 2009; HOSEINIAN, et al. 2011). Além da escolha dos antígenos, dos vetores
vacinais e da associação e combinação dos mesmos para identificação de um possível
sinergismo para uma resposta imune eficaz e protetora, faz-se necessário uma adequação do
protocolo de imunização.
O objetivo fundamental das vacinas é promover a imunização prévia do indivíduo, de
modo que ele passe a responder de forma rápida e eficiente quando em contato com os
agentes infecciosos, evitando-se, a ocorrência da infecção e/ou o desenvolvimento de
doença. Para isto, uma vacina deve ser capaz de gerar células imunes de memória para
24
eliminar rapidamente o agente etiológico. Muitos estudos de vacinação utilizando vetores
virais associados a protocolos do tipo dose-reforço (do inglês prime-boost) demonstraram
grande eficiência na geração de resposta de memória de longa duração (LI et al. 1993;
BRUNA-ROMERO et al. 2001; KLINK, SCHINDELHAUER et al. 2004).
Estes protocolos baseiam-se em imunizações sequênciais com vetores recombinantes
capazes de expressar o mesmo antígeno, podendo ser homólogos ou heterólogos. Quando se
utiliza um mesmo vetor em todas as imunizações, denomina-se dose-reforço homólogo.
Quando se utiliza vetores diferentes para um mesmo imunógeno denomina-se dose-reforço
heterólogo (ROCHA et al., 2004). Os protocolos heterólogos são em muitos casos capazes
de induzir um maior aumento e níveis mais persistentes de células T CD8 + e células T CD4+
tipo Th1 do que os homólogos, segundo observado em alguns casos de triagem clínica de
candidatos à vacina contra malária (DUNACHIE et al., 2003).
Um fator importante no uso de protocolos dose-reforço é a ordem da administração
dos vetores. Muitos agentes vetoriais são capazes de induzir resposta imune na primeira
imunização e não são efetivos no reforço. Em geral, plasmídeos de DNA, formulações com
adjuvantes de proteínas, partículas “virus-like” e lipopeptídeos são bons agentes iniciantes,
mas relativamente ineficientes como agentes de reforço. Em contrapartida, o vírus vaccinia
replicativo é mais eficiente na geração de resposta imune quando usado como reforço.
Porém, amostras não-replicativas derivadas do mesmo como MVA (Modified Vaccinia
Ankara), ou adenovírus não replicativos, são eficientes tanto como iniciantes ou como
reforços quando usados em regimes heterólogos (DUNACHIE E HILL 2003).
Bouillet et al (2011) demonstraram que a imunização em modelos murinos adotando
protocolo de dose-reforço heterólogo utilizando proteínas recombinantes emulsificadas em
adjuvante seguida de uma dose adenoviral codificando as mesmas proteínas aumentou a
resposta imune humoral assim como produção de citocinas específicas em modelos murinos
vacinados contra a malária causada por Plasmodium vivax. Esse estudo, juntamente com
outros adotando o mesmo protocolo, apresentaram resultados promissores, sendo a base para
ensaios pré-clinicos em primatas não humanos com vacinas contra malária e um das
principais estudos para testes futuros, utilizando esse mesmo protocolo num possível
protótipo vacinal contra a toxoplasmose.
25
2.
JUSTIFICATIVA
Embora haja progressos significativos em estudos de vacinas contra a toxoplasmose,
até então não foi criada a tão esperada vacina que proteja por completo e amenize os danos
causados por essa parasitose, que ainda é considerada um problema de saúde pública. Nosso
grupo de pesquisa vem agregando conhecimento através de trocas de tecnologias e
metodologias propiciadas por uma rede crescente de colaborações e parcerias que tem por
meta a construção de uma vacina e a avaliação do seu nível de eficácia. Nesse sentido, os
adenovírus recombinantes que codificam as proteínas SAG1, SAG2 e SAG3 foram
desenhados e produzidos pelo grupo do prof° Oscar Brunã-Romero; necessitando apenas a
expansão, purificação e titulação dos mesmos para o início dos trabalhos de imunização.
Caetano et al. (2006) verificaram que embora a resposta imunológica gerada em
murinos tenha sido satisfatória, esses animais não estavam protegidos por completo após
desafio com cepas virulentas de T. gondii. Paralelamente, o protocolo utilizado por Boulliet
et al. (2011) se mostra bem promissor, e abre perspectivas para a contrução de vacinas de
subunidades proteicas contra a toxoplasmose, permitindo a análise sinergica dos perfis de
resposta imune geradas para o conjunto proteína e adenovírus.
Portanto, a utilização de modelos murinos para uma adequada análise da proteção
congênita, assim como avaliações de imunogenicidade em ruminantes e em primatas não
humanos, oriundos do núcleo de primatologia da UFRN, são estratégias imprescindíveis
para o desenvolvimento de um protótipo vacinal conta T. gondii.
Deste modo, fez-se necessário implementar metodologias nas áreas de biologia
molecular, celular, microbiologia e imunologia no laboratório da Malária e Toxoplasmose,
Departamento de Microbiologia e Parasitologia/UFRN, para a identificação de genes que
codificam imunógenos importantes, assim como a clonagem de outros genes em sistema
recombinante, possibilitando a criação de novos projetos de pesquisas.
26
3.
OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral:
Implementar metodologias que permeiem o desenvolvimento de um protótipo vacinal contra a
toxoplasmose.
3.2 Objetivos específicos:
- Implementar técnicas de biologia molecular para a identificação de genes que codificam
imunógenos de T. gondii;
- Amplificar os genes SAG1, BAG1 e GRA2 pela técnica de PCR;
- Amplificar e clonar os genes SAG1, SAG2 e SAG3 em sistema recombinante;
- Analisar as sequências dos genes clonados e subsequente tradução virtual;
- Expandir, purificar e caracterizar os adenovírus que codificam as proteínas SAG1, SAG2 e
SAG3.
- Teste de imunização piloto em murinos utilizando os HAdSAGs.
27
4.
ESTRATÉGIA DE TRABALHO
28
5.
MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Animais
Para a manutenção da cepa RH de Toxoplasma gondii foram utilizados camundongos
de linhagem Swiss mantidos no Biotério do Laboratório de Biologia da Malária e
Toxoplasmose (LABMAT), Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte. Para ensaios de imunização e análises imunológicas, foram utilizadas fêmeas de
camundongos C57bl/6 com idade aproximadamente de 13 semanas, mantidos nesse mesmo
biotério, sob condições de alimentação, temperatura e aeração, estipulados pela Comissão de
Ética no Uso de Animais (CEUA-UFRN), tais como: acesso livre à água e ração,
temperatura ambiente de 23± 2ºC, ciclos claros/escuros de 12/12hrs, exaustores, etc. O uso
dessas cobaias foi aprovado pelo CEUA-UFRN nº 43/2010.
5.2 Manutenção da cepa do T. gondii e obtenção e taquizoítos
A cepa RH 88, gentilmente cedida pelo Prof. Ricardo Vítor do Depto. de
Parasitologia, ICB/ UFMG, foi mantida por passagem sucessivas semanalmente no
LABMAT. Os camundongos Swiss (20 ± 5g) receberam, via intraperitoneal, inóculo de 0,5
a 1 mL de uma suspensão de taquizoítos vivos, em solução fisiológica estéril, obtidos
através de uma lavagem peritoneal de camundongos previamente infectados. Os taquizoítos
obtidos foram utilizados para a produção do extrato antigênico (TLA) e extração do DNA
genômico.
5.3 Preparação do extrato antigênico (TLA);
A partir de taquizoítos da cepa RH 88 obtidos por lavagem da cavidade
intraperitoneal, utilizando tampão PBS1X, ( 8g de NaCl, 1,44g de Na2HPO4.2H2O, 0,2g de
KH2PO4, 0,2gKCl diluídos em 1L de água destilada, sendo o pH ajustado para 7.2) foi
preparado o extrato antigênico. O material foi centrifugado por 30 segundos a 160g para
separação das células murinas. O sedimento foi desprezado e o sobrenadante foi lavado por
centrifugação a 2.000g por 10 minutos. O sedimento foi ressuspendido e a suspensão dos
parasitos foi submetida à sonicação a 40hertz por 15 minutos para o rompimento dos
taquizoítos seguida de centrifugação a 11500 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante foi
29
dosado pelo método de Bradford (1976) e utilizado como extrato antigênico. Para a análise
do perfil proteico do TLA, foi utilizada a metodologia de eletroforese em gel SDS-PAGE
descrita por Laemmli (1970).
5.4 Extração do DNA genômico do Toxoplasma gondii;
Para a extração do DNA foram utilizadas massas de taquizoítos obtidas previamente e
processadas utilizando o kit da Qiagen, QIAamp DNA Mini Kit 250 (Qiagen, Valencia, CA)
seguindo instruções do fabricante. O DNA purificado foi ressupendido e mantido a -20°C
até o momento de uso.
5.5 Extração de RNA e síntese de cDNA;
A extração do RNA do T. gondii foi realizada a partir de taquizoítos como descrito
anteriormente, utilizando-se e seguindo orientações do kit RNeasy Mini Kit (Qiagen
Valencia, CA). Posteriormente, o RNA foi convertido em cDNA seguindo instruções do kit
M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, EUA).
5.6 Reação em cadeia de polimerase (PCR);
As seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas SAG1, BAG1 e GRA2
foram amplificadas por meio da técnica de PCR tendo como molde o DNA genômico de
taquizoítos da cepa RH 88. Foram utilizados os seguintes iniciadores:
Tabela 1: Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação de SAG1, BAG1 e GRA2
Oligonucleotídeo
Sequências
SAG1 (senso)
5´ TCGGATCCCCCTCTTGTTG 3´
SAG1 (anti-senso)
5´ CTCCAGTTTCACGGTACAG 3´
BAG1 (senso)
5´ AGATGGCGCCGTCAGCAT 3´
BAG1 (anti-senso)
5´ CTACTTCACGCTGATTTG 3‟
GRA2 (senso)
5´ CATTGTTTGCTGGTTGTTG 3´
GRA2 (anti-senso)
5´ TCTCACTGTGATGTCCGAG 3´
Tamanho do
Fragmento
759pb
1898pb
975pb
30
Para os genes SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 (tabela 2) foram adicionados aos
produtos de PCR, sítios de enzimas de restrição adaptados para serem inseridos no vetor de
clonagem. Nas reações de PCR os iniciadores foram utilizados numa reação padrão de 25
L sendo 1L de cada iniciador, 12,5L de PCR Master Mix (Promega Madison, WI,
EUA), 1,5 L de DNA molde e água livre de nuclease qsp 25L. Quando realizada
manualmente as concentrações de cada reagente foram: 2 L de tampão 10X para Taq
polimerase (Promega Corporation, WI, E.U.A), 1,6 L de MgCl2 25 mM (Promega
Corporation, WI, E.U.A), 0,4 L dNTPs 10 mM (Promega Corporation, WI, E.U.A), 0,4 L
de iniciador senso 10 mM (IDT technologies, E.U.A), 0,4 L iniciador anti-senso e 10 mM
(IDT technologies, E.U.A), 0,3 L de Taq polimerase (Promega Corporation, WI, E.U.A),
1,0 L contendo de DNA molde e o restante do volume completado com H 2O ultrapura
nível II, totalizando um volume final de 25 L. As reações de PCR foram processadas no
termociclador Techne TC-512 (Scie Plas) ou no Mastercyler Nexus Gradiente (Eppendorf)
sob 1 ciclo de 95°C a 5 minutos, 35 ciclos de 94°C por 1 minuto, gradiente de temperatura
de anelamento variando de 53°C a 70°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos e um ciclo de
extensão final a 72°C por 8 minutos.
Tabela 2: Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação de SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 e seus
respectivos sítios das enzimas de restrição.
Oligos
SAG1 (senso)
SAG1 (anti-senso)
SAG2 (senso)
SAG2 (anti-senso)
SAG3 (senso)
Sequências
Tamanho do
Fragmento
5´ GAATTaCACCTGATGTCGTTCTTGC 3´
5´ AAGCTTbCATTTTGCTGACCCTGC 3´
836pb
5´ GAATTaCTCCACCACCGAGACG 3´
5´ AAGCTTbTCAGAGAGACACAGGGTCAA 3´
435pb
5´ GAATTaCGGAGAGCACGGACTGTT 3´
SAG3 (anti-senso)
5´ AAGCTTbTCATTCTGTTCCAGCTTGA 3´
TgAMA-1(senso)
5´ GCGAATTaCATGGGGCTCGTGGGCGTA 3´
TgAMA-1(anti-senso)
5´ TTAAGCTTbCTAGTAATCCCCCTCGAC 3´
a: Sitio de enzima de restrição para EcoRI;
b: Sitio de enzima de restrição para HindIII.
975pb
1600pb
31
Os produtos de PCR (5 μL) foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%
em TAE 1X (tris-acetato 0,04M; EDTA 0,001M), acrescido com Gel-Red (Uniscience do
Brasil, SP, Brasil) na proporção 1:10000 v/v , brometo de etídio (1% p/v) ou Sybr-Green
(SIGMA-Aldrich, Sant Louise, MO, USA) na proporção de 1:10000 sendo utilizado na
marcação das amostras. As corridas foram realizadas sob voltagem de 100 V, visualizado
em luz U.V. de 320 nm e fotografado.
5.7 Preparo das bactérias competentes (POPE & KENTE 1996)
As bactérias E.coli DH5foram cultivadas em 500 mL de meio Luria Bertani (LB) 1x
(Bactotriptona 1% p/v; extrato de levedura 0,5% p/v, NaCl 171 mM) e incubadas sob
agitação (180 r.p.m., Shaker Superohom G25, Brasil) a 37ºC por 16 horas. O crescimento foi
acompanhado até a cultura atingir uma A600nm igual a 0,6. As bactérias foram
centrifugadas a 2800 x g durante 10 minutos a 4°C e o sedimento homogeneizado em 150
mL de 75mM de CaCl2, 10mM de Tris-HCl pH8,0. As bactérias foram centrifugadas
novamente e o sedimento celular foi ressuspendido em 30 mL da mesma solução, acrescida
de 15% de Glicerol, sendo então distribuído em alíquotas e congelado rapidamente a -70°C
até o momento do uso.
5.8 Plasmídeo pCR2.1.TOPO
Com a finalidade de clonar o produto da amplificação da sequência de DNA
correspondente às proteínas SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 e de adequar os sítios de
clonagem flanqueadores do fragmento de DNA àqueles necessários para a subclonagem
posterior, foi utilizado o plasmídeo pCR2.1.TOPO (Figura 3) (Invitrogen GmbH,
Alemanha). A clonagem dos produtos resultantes da amplificação pela reação em cadeia da
polimerase de Thermus aquaticus (Taq) no pCR2.1.TOPO é facilitada de duas maneiras: (I)
pelo aproveitamento da complementaridade de bases A/T (o “A” sendo base adicional
preferêncialmente incorporada nos produtos de PCR gerados pela polimerase Taq e o “T” do
plasmídeo pCR2.1.TOPO); (II) pela rápida ação ligante da enzima topoisomerase. A reação
de ligação do produto de PCR com o plasmídeo foi realizada seguindo as instruções do
manual do TOPO TA cloning kit (Invitrogen GmbH, Alemanha). Para esta clonagem, foram
utilizados 4L (~ 100 ng) do produto de PCR, 1 L (10 ng) do plasmídeo pCR2.1-TOPO e 1
32
L de solução salina (1,2 M NaCl e 0,06 M MgCl2), totalizando portanto, um volume final
de 6 L. A reação foi incubada por 30 minutos a temperatura ambiente e bactérias foram
utilizadas para transformação com os produtos resultantes dessa reação.
.
Figura 3: Mapa e sequências nucleotídicas para clonagem existentes no plasmídeo pCR2.1.TOPO,
mostrando a localização do produto de PCR após ligação com o plasmídeo, assim como alguns dos sítios de
restrição mais próximos deste produto. Pode-se observar que o plasmídeo permite a inserção de produtos de
PCR entre dois sítios EcoRI.
5.9 Transformação bacteriana (Sambrook e Russel, 1989)
Para a transformação bacteriana, utilizamos as bactérias quimiocompetentes da
linhagem E.coli DH5 descritas anteriormente. O procedimento foi realizado pelo método
do choque térmico. Para as transformações foram incubados, por 30 minutos em gelo, 3 L
do produto da ligação correspondente, ou um volume equivalente contendo ~50 ng do
33
plasmídeo previamente purificado, com 100 L da cultura de bactéria competente recém
descongelada em gelo. Logo após, foi efetuado o choque térmico de 42 ºC por 2 minutos em
banho-maria. Em seguida, foi adicionado à cultura bacteriana 1 mL de meio de cultura
líquido estéril LB sem antibiótico e incubado a 37 ºC por 1 hora. Durante o período de
incubação, os tubos foram esporadicamente homogeneizados. Ao fim desta incubação, a
cultura bacteriana foi centrifugada por 30 segundos a 11.500 r.p.m.(13.330 g) para obter o
pellet. O sobrenadante foi descartado e o pellet resultante foi ressupendido em 30 L do
próprio meio LB. As bactérias foram semeadas em placas de Petri descartáveis contendo
meio LB semissólido suplementado com o antibiótico ao qual o plasmídeo em questão
confere resistência, no caso kanamicina (100 g de kanamicina para cada mL de meio LB).
As placas foram incubadas overnight a 37 °C.
5.10
Obtenção de plasmídeos em pequena escala
Para a obtenção de plasmídeos em pequena escala, as colônias transformantes foram
inoculadas em 5 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100 g/mL) e incubadas
overnight a 37 ºC sob agitação de 150 r.p.m. Após o período de incubação, foi aliquotado 1
mL de cada cultura bacteriana isolada, adicionado de 10% de glicerol e estocado a –70 ºC.
As mini-preps foram feitas com o kit QIAprep Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemanha)
seguindo as instruções do fabricante quando o objetivo era a obtenção de fragmentos de
DNA e ainda realizadas de forma manual quando o objetivo era a triagem de múltiplos
clones. Para realização da mini-prep manual (adaptado de Sambrook et al., 1989), a cultura
bacteriana foi centrifugada a 5.000 r.p.m. por 15 minutos a 4 ºC e o sobrenadante foi
descartado. O pellet foi ressuspendido em 200 L de solução de lise (para um volume final
de 50 mL, foram preparados 37,75 mL de H2O miliQ, 10 mL glicose 50%, 1 mL EDTA 0,5
M e 1,25 mL de Tris-HCl pH 8,0) e transferido para um microtubo. Acrescentou-se 400 L
de SDS alcalina (para um volume final de 50 mL, foram preparados 38 mL de H2O milli-Q,
10 mL de SDS 5% previamente aquecido e 2 mL de NaOH 5N) e agitando vigorosamente.
Incubou-se por 5 minutos no gelo, acrescentou-se 300 L de High Salt Solution (misturando
solução de ácido acético 3 M na solução de acetato de sódio 3 M até obter pH 5,2 ) agitando
vigorosamente. Seguiu-se de incubação por 10 minutos no gelo e posteriormente
centrifugação por 10 minutos a 4 ºC a 13.000 r.p.m. Removeu-se 700 L do sobrenadante o
qual foi transferido para um novo microtubo. Foram adicionados 700 L de isopropanol,
34
homogeinizados e incubados no gelo por 10 minutos. Centrifugou-se por 10 minutos à 4 ºC.
O sobrenadante foi descartado e o pellet lavado com 400 L de etanol 70%.
Novamente
esse material foi centrifugado por 5 minutos à temperatura ambiente, sendo desprezado o
sobrenadante, e foi aguardado pellet secar a temperatura ambiente por aproximadamente 30
minutos. Por fim, o pellet foi ressuspendido com 50 L de H2O com RNAse.
5.11
Digestão dos plasmídeos para confirmação de clonagem
Para a confirmação da clonagem, os plasmídeos puros foram clivados utilizando as
enzimas de restrição EcoRI e HindIII (Promega) com a finalidade de liberar os produtos de
PCR inseridos no vetor de clonagem. Para tal, a reação de digestão foi ajustada para um
volume final de 50L , sendo 5L do DNA plasmidial, 0.5L da enzima EcoRI, 0.5L da
enzima HindIII, 5L do tampão Multicore (Promega) e H2O livre de nuclease q.s.p 50L.
As reações foram incubadas a 37°C durante 3 horas no termociclador, posteriormente
submetidas a eletroforese em gel de agarose.
5.12
Sequenciamento genético
O sequenciamento foi realizado pelo método de dideoxinucleotídeos, baseado naquele
descrito por Sanger e colaboradores (1977), em sequênciador automático capilar Mega
Bace™ 1000 (GE Healthcare, PA, E.U.A), utilizando o Kit DyEnamic™ ET Dye
Terminator (GE Healthcare, PA, E.U.A) de acordo com as condições do fabricante. Foram
sequênciados os clones pTOPO/SAG1 e pTOPO/SAG2.
Os eletroferogramas gerados para cada uma das sequências de nucleotídeos, senso
positivo e senso negativo, foram submetidos à análise através do site da Embrapa
(http//asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/) para confirmar se era realmente a região
esperada, analisar a qualidade das bases de nucleotídeos dos eletroferogramas e estabelecer a
sequências obtidas após sequenciamento pelo programa CAP3 desse mesmo site. A
sequência consenso de cada clone foi gerada pelo alinhamento das sequências obtidas pelo
programa CAP3 com as sequências referências para amplificação dos genes, utilizando o
Clustal-W. Posteriormente, cada sequência consenso foi comparada com sequências
disponíveis no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI -
35
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
O algoritmo BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) do pacote BLAST 2.0
(Basic Alignment Search Tool) desenvolvido pelo NCBI foi utilizado para a busca de
similaridade entre as sequências de nucleotídeos. Em uma análise mais minuciosa, um novo
alinhamento foi realizado entre sequências com maior similaridade e consenso, tradução e
análise de possíveis polimorfismo, utilizando os softwares MEGA 5.10 e BioEdit.
5.13
Células permissivas para o adenovírus humano sorotipo 5 não replicativo
e condições de cultivo
As células HEK293 (Human Embrionary Kidney cells - depositadas no American Type
Culture Collection -ATCC- sob o número de acesso CRL-1573) foram empregadas para a
expansão e purificação dos adenovírus recombinantes não replicativos usados neste trabalho.
Esta linhagem celular derivou-se de células de rim embrionário humano transfectadas, por
Graham e colaboradores na década de 70, com fragmentos de DNA do adenovírus humano
sorotipo 5 que contém a região E1 do genoma adenoviral. Por este motivo tais células são
permissivas ao crescimento de adenovírus não replicativos que tenham sido gerados por
deleção da região E1 do seu genoma (revisado por LOUIS et al., 1997). As células foram
cultivadas em garrafas de 75 e 150 cm² a 37 ºC e 5% de dióxido de carbono em meio
DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium - GIBCO/Life Technologies, E.U.A.)
suplementado com 10% de soro fetal bovino (GIBCO/Life technologies, E.U.A.), 5 mM de
bicarbonato de sódio, 25 mM de HEPES (Invitrogen, CA, E.U.A.) e 5% de antibiótico.
5.14
Expansão e purificação dos adenovírus
Para a expansão viral, quatro garrafas de 75 cm² contendo células HEK-293 com
confluência entre 80-90% foram infectadas com 2L de cada adenovirus. Após a adsorção
viral, essas garrafas foram mantidas na estufa nas mesmas condições descritas anteriormente
e monitoradas durante 24-48 horas para análise do efeito citopático. Posteriormente, foram
coletadas as células para lise e clarificação, seguindo orientações do kit ViraBind™
Adenovirus Purification empregado para o procedimento de purificação. Parte do
sobrenadante foi estocada a -70°C e utilizado para reinfecções futuras e teste piloto de
36
imunização. Os adenovirus purificados foram estocados a -70°C. Para confirmação do
procedimento de purificação, foi realizada a técnica de PCR utilizando os adenovirus como
molde para a reação.
5.15
Imunização
Fêmeas de camundongos C57bl/6 com aproximadamente 12 semanas foram
imunizadas com o sobrenadante viral de cada adenovírus diluído 1:2 em PBS 1X. Cada
animal recebeu 200L dessa diluição pela via subcutânea. Esses animais foram então
divididos em 5 grupos com 3 animais cada, como ilustra a tabela 3. Este ensaio se constituiu
em um teste piloto para essa avaliação. As amostras de soro foram obtidas 14 dias após a
imunização.
Tabela 3: Esquema de grupos vacinais.
5.16
Grupos
Antígeno
G1
Controle Negativo (PBS)
G2
HAdSAG1
G3
HAdSAG2
G4
HAdSAG3
G5
Mix: HAdSAG1+HAdSAG2+HAdSAG3
Teste de Hemaglutinação Indireta – HAI
Para o teste foi utilizado o kit comercial Imuno-HAI TOXO (Wama Diagnostica,
Brasil), seguindo todas as especificações do fabricante. Para cada poço da placa de
microtitulação de fundo “V” foram adicionados 25 µL dos soros testes, nas diluições
variando de 1:32 a 1:512, na proporção de 1:2 em solução diluente fornecida no Kit. Todas
as amostras, assim como os soros controles positivo e negativo, foram testadas em triplicata.
A seguir, adicionou-se 25 µL da suspensão antigênica, constituída por hemácias de aves
sensibilizadas com antígenos solúveis de T. gondii. Após leve agitação, a placa foi incubada
durante uma hora à temperatura ambiente, quando a leitura foi realizada a olho
”desarmado”. A reação foi considerada reagente quando um tapete uniforme (malha) de
hemácias recobriu toda a cavidade do poço, e não reagente quando as hemácias ficaram
acumuladas em sedimentos na forma de um botão compacto no fundo do poço.
37
6 . RESULTADOS
6.1 Amplificação dos genes que codificam as proteínas SAG1, BAG1 e GRA2
Os fragmentos de SAG1, BAG1, GRA2 foram amplificados a partir do DNA
genômico extraído da cepa RH 88 de T.gondii, por meio da técnica de PCR. Foi realizado
um gradiente de temperatura de anelamento dos iniciadores. Para confirmação da
amplificação foi realizada eletroforese em gel de agarose 1% com os produtos da PCR,
sendo essa também a primeira metodologia de biologia molecular implantada no LabMat
(Figuras 4 e 5).
Figura 4: Eletroforese em gel de agarose 1% acrescido de Gel Red como marcador de DNA, dos produtos de
PCR dos genes BAG1 e SAG1. MM: Marcador de Peso molecular 100pb Promega.(-): Controles negativo.
38
Figura 5: Eletroforese em gel de agarose 1% do produto de PCR do gene GRA2. MM: Marcador de Peso
molecular 1pb Promega. (-): Controle negativo.
Foi verificado que os genes amplificam em temperaturas entre 53.8°C a 58.2°C
conforme as bandas visíveis no gel que correspondem ao tamanho dos fragmentos
esperados.
6.2 Amplificação dos genes SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 como estratégia de
clonagem
Como estratégia de clonagem, as sequências codificante das proteínas SAG1, SAG2,
SAG3 e TgAMA-1 foram amplificadas mediante PCR utilizando os iniciadores contendo
sítios de restrição para as enzimas EcoRI e HindIII. O termociclador foi programado para
realização de um gradiente de temperatura de anelamento.
Para visualização da
amplificação foi realizada uma eletroforese em gel de agarose 1% utilizando 5 L de cada
produto da PCR. A figura 6 mostra os fragmentos que foram amplificados e suas respectivas
temperaturas.
39
Figura 6: Eletroforese em gel de agarose 1% onde as amostras foram pré-marcadas com Sybr-Green, dos
produtos de PCR dos genes SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 amplificados como estratégia de clonagem.
MM: Padrão de peso molecular 1kb Plus Fermentas. (-) Controles negativo.
Com esses resultados foi possível estabelecer as condições para amplificação dos
genes que codificam as proteínas SAG1, SAG2 e SAG3, sendo verificado que para
estratégia de clonagem, as melhores temperaturas de anelamento para amplificação desses
genes são 55,1ºC, 55,1ºC e 57,5ºC respectivamente. Dados ilustrados na figura 7 como
resultado confirmativo. Não foram identificadas amplificações em temperaturas superiores
a 60ºC (dados não apresentados).
40
Figura 7: Resultado confirmativo de amplificação dos genes SAG1, SAG2 e SAG3 por eletroforese em gel de
agarose 1%. O gel foi marcado com brometo de etídio. MM: Padrão de peso molecular 1kb Plus Fermentas.
O gene que codifica a proteína TgAMA-1 pouco foi amplificado nessas condições.
Dessa forma o mix foi feito manualmente, sendo alterada a quantidade de MgCl2, (de 1mM a
4mM por reação) dNTP e Taq Polimerase, resultando em amplificações inespecíficas. No
entanto, foi evidenciada a presença da banda de aproximadamente 1600pb correspondente
ao gene (Figura 8A). Essa banda foi, então, eluída do gel e purificada seguindo orientações
do kit Hi Yeld Gel/PCR/DNA mini kit (Real Genomic) em duplicata. Além disso, a banda
correspondente a TgAMA-1 foi eluida e purificada do gel.
Ainda na tentativa de amplificação desse gene, foi utilizado o cDNA de T.gondii
como molde para a reação de PCR mantendo as mesmas condições em que se teve uma
amplificação pouco específica quando foi utilizado o DNA do parasito, no entanto, nada foi
amplificado Foram realizadas mais de 12 PCR (dados não apresentados) para padronização.
Curvas de temperaturas, tempo de anelamento, quantidade de DNA molde, concentração de
MgCl2 para auxilio no anile dos iniciadores, aumento na concentração de Taq Polimerase,
até que por fim a banda de aproximadamente 1600pb que corresponde ao gene fez-se
presente (em destaque). Embora não seja a banda principal é visível (figura 8B). O restante
dos produtos da PCR foram utilizados para subclonagem no plasmídeo pCR2.1TOPO,
aproveitando a complementaridade de bases T/A.
41
Figura 8: A) Eletroforese em gel de agarose 1% do produto de PCR mais próximo à amplificação de TgAMA-1.
MM: Marcador de Peso molecular 1kb plus Fermentas Canaleta 1: 4mM de MgCl2/ Canaleta 2: 2mM MgCl2/
-: Controle negativo. B) Marcador de Peso molecular 1kb plus Fermentas, 1 e 2: cDNA de T.gondii utilizado
como molde, 3: Produto eluído e purificado do gel apresentado na figura 8A.
A)
B)
6.3 Inserção dos genes SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 no plasmídeo de clonagem PCR
2.1 TOPO, transformação bacteriana e clivagem;
Os produtos de PCR foram inseridos no plasmídeo de clonagem PCR 2.1 TOPO
(Invitrogen). Posteriormente, os plasmídeos contendo os genes de SAG1, SAG2, SAG3 e
TgAMA1 foram inseridos por choque térmico em bactérias quimiocompetentes E.coli
DH5Após a transformação, essas bactérias foram cultivadas em meio LB Agar contendo
Kanamicina e incubadas por 16 horas a 37ºC. Foram selecionadas colônias, colocadas para
crescer em Meio LB liquido e posteriormente foi extraído o DNA plasmidial. Para
confirmação dos clones positivos, o DNA Plasmidial foi clivado com as enzimas EcoRI e
HindIII e posteriormente submetidos a eletroforese em gel de agarose, O fragmento
correspondente a SAG1 foi clivado do Topo confirmando a clonagem desse gene (Figura 9).
42
Figura 9: Eletroforese em gel de agarose 1% para confirmação da clonagem e transformação bacteriana. Três
clones foram selecionados para pTOPO/SAG1, 2 clones para pTOPO/SAG2 e um clone para pTOPO/SAG3.
MM: Marcador de Peso molecular. Cl: Clones. (-) DNA plasmidial não digerido. (+) DNA plasmidial digerido
com EcoRI e HindIII.
Alíquotas
dos
clones
clB(+)e
clC(+)pTOPO/SAG1
foram
enviadas
para
sequenciamento genômico. Em relação à SAG3, até então não foi verificada a inserção deste
gene no plasmídeo.
Outras tentativas de clonagem dos genes SAG2 e TgAMA-1 foram realizadas. A
figura 10 ilustra com sucesso a inserção e clonagem do gene SAG2. Um clone
pTOPO/TgAMA-1 foi analisado nessa figura, sendo negativo.
Figura 10: Eletroforese em gel de agarose 1% para a confirmação de clonagem de pTOPO/SAG2. MM:
Marcador de Peso molecular 1kb Plus Fermentas. cl: Clones.
43
Duas alíquotas de pTOPO/SAG2 foram enviadas para o sequenciamento genético.
Ainda restam clones de pTOPO/TgAMA-1 a ser clivados e analisados para confirmação de
clonagem, o que será abordado nas perspectivas futuras desse trabalho.
6.4.
Sequenciamento genético de pTOPO/SAG1 e pTOPO/SAG2;
Duas amostras de pTOPO/SAG1 e pTOPO/SAG2 analisadas mediante digestão
enzimática foram submetidas ao sequenciamento para conhecimento da sequência de bases
dos seus DNA. Todas as amostras foram sequenciadas em ambas as direções (senso e antisenso) utilizando seus respectivos iniciadores.
Uma sequência nucleotídica foi gerada para o clone pTOPO/SAG1 (figura 11), a qual
foi alinhada com a sequência referência codificante de SAG1 (figura 12), extraída e
modificada do trabalho de Caetano et al. (2006), no qual foi empregada para a construção
dos HadSAGs.
Figura 11: Sequência nucleotídica gerada para o clone pTOPO/SAG1 após a realização do sequenciamento pelo
método de Sangers et al.(1977) em sequênciador capilar MEGA BACE, e posteriormente submetida a análise
pelo programa CAP3 tendo como base os melhores eletroferogramas resultantes.
TGTCACCTGCCCAGATTAAAAATCGACAGCCGCGGTCATTCTCACAC-CGACGGAGAACC
ACTTCACTCTCAAGTGCCCTAAAACAGCGCTCACAGAGCCTCCCACTCTTGCGTACTCAC
CCAACAGGCAAATCTGCCCAGCGGG-TACTACAAGTAGCTGTACATCAACGGCTGTAACA
TTGAGCTCCTTGATTCCTGAAGCAGAACGATAGCTGGTGGACGGGGGATTCTGCTAGTCT
CGAGACGGCAGGCATCAAACTCACAGTTCCAATCCGAGAAGTTCCCCGTGACAAACGCAG
ACGTTTGTGGTCGGTTGCATCAAGGGAGACGACGCACAGAGTTGTATGGTCACAGTGACA
GTACAAGCCCAGAGCCTCATCGGTCGTTCAATAATGTCGCAAGGTGCTCCTAACGGTGCA
AGACCAGCACTCTTGGTCCATGTCAAAGTTTGTCTAGCGGAAGGACCCACTACAATGACC
CTCGTGTGCGGGAAAGATGGAGTCAAAGTTCCTCAAGACAACAATCAGTACTGTTCCGGG
ACGACGCTGACTGGTTGCAAACGAGAAGTCGTTCAAAGATATTTTGCCAAAATTAACTGA
GAACCCGTGGCAGGGTAACGCTTCGAGTGATAAGGGTGCCACGCTAACGATCAAGAAGGA
CAGCATTTCCTAGCCGTAGTCCAAAAAGCGTCATTATAGGACGCAGCAGGGGATCGCCTG
AG
O alinhamento de pTOPO/SAG1 com a sequência referência mostrou identidade, no
entanto, foi possível verificar falhas de sequenciamento, resultando em uma sequência
consenso com 722pb (figura 13), resultante do não sequenciamento de algumas bases pelo
sequenciamento. Tendo elaborado a sequência consenso, essa foi comparada com outras
sequências contidas no Gene Bank para análise de similaridade (figura 14), onde foi
44
verificado um grau de identidade de 97% entre as bases na maioria das sequências.
Posteriormente à análise de similaridade, outro alinhamento foi realizado entre a consenso
de pTOPO/SAG1 com a sequência mais similar, a qual possui número de acesso ao Gene
Bank JX045421.1 (figura 15), onde foram verificados 3 substituições de nucleotídeos, sendo
que, alguns não foram apresentados pela sequência JX045421.1.
Figura 12: Alinhamento da sequência obtida do clone pTOPO/SAG1 com a sequência referência do gene SAG1
utilizando o Clustal-W, sendo possível identificar falhas de sequenciamento, onde há incompatibilidade entre
nucleotídeos.
45
Figura 13: Sequência consenso gerada para o clone pTOPO/SAG1 com 722 pb após a realização alinhamento
com a sequência referência, para evitar que haja algum nucleotídeo pertencente ao vetor de clonagem. A parte
que foi sequenciada excluiu os iniciadores senso e anti-senso do gene SAG1. Assim como foi verificado que
nem todas as bases foram identificadas.
TGTCACCTGCCCAGATTAAAAATCGACAGCCGCGGTCATTCTCACAC-CGACGGAGAACC
ACTTCACTCTCAAGTGCCCTAAAACAGCGCTCACAGAGCCTCCCACTCTTGCGTACTCAC
CCAACAGGCAAATCTGCCCAGCGGG-TACTACAAGTAGCTGTACATCAACGGCTGTAACA
TTGAGCTCCTTGATTCCTGAAGCAGAACGATAGCTGGTGGACGGGGGATTCTGCTAGTCT
CGAGACGGCAGGCATCAAACTCACAGTTCCAATCCGAGAAGTTCCCCGTGACAAACGCAG
ACGTTTGTGGTCGGTTGCATCAAGGGAGACGACGCACAGAGTTGTATGGTCACAGTGACA
GTACAAGCCCAGAGCCTCATCGGTCGTTCAATAATGTCGCAAGGTGCTCCTAACGGTGCA
AGACCAGCACTCTTGGTCCATGTCAAAGTTTGTCTAGCGGAAGGACCCACTACAATGACC
CTCGTGTGCGGGAAAGATGGAGTCAAAGTTCCTCAAGACAACAATCAGTACTGTTCCGGG
ACGACGCTGACTGGTTGCAAACGAGAAGTCGTTCAAAGATATTTTGCCAAAATTAACTGA
GAACCCGTGGCAGGGTAACGCTTCGAGTGATAAGGGTGCCACGCTAACGATCAAGAAGGA
CAGCATTTCCTAGCCGTAGTCCAAAAAGCGTCATTATAGGACGCAGCAGGGGATCGCCTG
AG
Figura 14: Comparação do grau de similaridade entre a sequência consenso pTOPO/SAG1 e outras sequências
depositadas no Gene Bank. As sequências mais similares apresentaram 97% de identidade.
Foi realizada a tradução virtual e alinhamento dos aminoácidos. A sequência que
codifica a proteína SAG1 a partir do clone pTOPO/SAG1 apresentou-se mais completa que
a sequência JX045421.1 em nível de aminoácidos após a tradução conforme apresenta a
46
figura 16. Foram identificadas trocas de aminoácidos nas posições 140 ( „K‟ Lisina por „R‟
Arginina), 235 („S‟ Serina por „T” Treonina), 236 („R‟ Arginina por „G‟ Glicina).
Figura 15: Alinhamento da sequência resultante do clone pTOPO/SAG1 com a sequência do gene SAG1
contida extraída do Gene Bank.
47
Figura 16: Tradução da sequência de nucleotídeos de pTOPO/SAG1 e alinhamento dos aminoácidos. Foi
verificado maior identificação de aminoácidos para a proteína SAG1 a partir de pTOPO/SAG1. As trocas de
aminoácidos foram identificadas nas posições 140, 235 e 236.
Para a análise das sequências do clone pTOPO/SAG2, os mesmos procedimentos
descritos na análise de pTOPO/SAG1 foram realizados. A sequência de bases obtida após o
sequenciamento de pTOPO/SAG2 (figura 17) apresentou grande compatibilidade máxima
com a sequência referência desse gene, conforme ilustra o alinhamento dessas na figura 18.
Figura 17: Sequência nucleotídica gerada para o clone pTOPO/SAG2 utilizando o programa CAP3 a partir dos
melhores eletroferogramas obtidos. Nota-se presença de bases do vetor de clonagem nessa sequência, pelo
tamanho em pares de bases da mesma.
ACCGTTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAACCGGAAGAG
CGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCAC
GACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTC
ACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATT
GTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGT
ACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTTGAATTCTC
CACCACCGAGACGCCAGCGCCCATTGAGTGCACTGCCGGCGCAACGAAGACTGTTGATGC
ACCCTCCAGTGGTTCCGTTGTCTTCCGATGTGGGTATAAACTAACCATCAGTCCCAGTGG
CGAAGGTGATGTCTTTTATGGCAAGGAATGCACAGACTCGAGGAAGTTGACGACTGTCCT
TCCAGGTGCGGTCTTGGCAGCTAAGGTCGAGCAGCCCCCGGAAGGTCCTGCTACCTACAC
ACTGTCTTACGACGGTACTCCCGAGAAACCTCAGGTTCTCTGTTACAAGTGCGTTGCCGA
AGCAGGTGCTCCCGCTGGTCGAAATAATGATGGTGGTTCTAGCGCTCCGACGCCTAAAGA
CTGCAAACTCATTGTTCGCGTTCCGGGTGCCGATGGCCGTGTCACATCTGGGTTTGACCC
TGTGTCTCTCTGAAAGCTTTAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGACGCT
CGAGCATGCATCTAGAGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTTCACTGG
GCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTTAATCGCCT
TGCAGCACATCCCCTTTCGCAGCTGGCGTAATAGCGAAAAGGCCAGAACGAGAGGGATAC
GAAAGACATTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCG
CATTAAGCGCGGCGGGTGTGG
48
Com esse primeiro alinhamento foi possível excluir bases do vetor de clonagem que
apareceram após a análise dos eletroferogramas, sendo então possível determinar a
sequência consenso para pTOPO/SAG2 com 435pb e identificar os seus iniciadores,
conforme ilustra a figura 19.
Figura 18: Alinhamento da sequência pTOPO/SAG2 com a sequência referência. Nota-se presença de bases
pertencentes ao plasmídeo de clonagem. Foi utilizado o Clustal-W para essa análise.
49
Figura 19: Sequência consenso de pTOPO/SAG2 com 435pb obtida após alinhamento com a sequência
referência. Em verde, destacado os iniciadores senso e anti-senso para o gene SAG2, os quais também foram
utilizados no sequenciamento.
TCCACCACCGAGACGCCAGCGCCCATTGAGTGCACTGCCGGCGCAACGAAGACTGTTGATGCACCCT
CCAGTGGTTCCGTTGTCTTCCGATGTGGGTATAAACTAACCATCAGTCCCAGTGGCGAAGGTGATG
TCTTTTATGGCAAGGAATGCACAGACTCGAGGAAGTTGACGACTGTCCTTCCAGGTGCGGTCTTGG
CAGCTAAGGTCGAGCAGCCCCCGGAAGGTCCTGCTACCTACACACTGTCTTACGACGGTACTCCCG
AGAAACCTCAGGTTCTCTGTTACAAGTGCGTTGCCGAAGCAGGTGCTCCCGCTGGTCGAAATAATG
ATGGTGGTTCTAGCGCTCCGACGCCTAAAGACTGCAAACTCATTGTTCGCGTTCCGGGTGCCGATG
GCCGTGTCACATCTGGGTTTGACCCTGTGTCTCTCTGA
O grau de identidade de pTOPO/SAG2 foi analisado pelo BLASTn, sendo comparada
a sequência consenso com outras sequências para SAG2 contidas no Gene Bank. Foi
verificado grau de identidade de 99% entre essas sequências, conforme apresentado na
figura 20.
Figura 20: Comparação do grau de similaridade entre a sequência consenso pTOPO/SAG2 e outras sequências
depositadas no Gene Bank. Foi verificado alto grau de identidade na maioria das sequências comparadas, com
similaridade máxima de 99%.
A sequência com número de acesso JX045472.1 no Gene Bank foi alinhada com
pTOPO/SAG2. Embora a identidade entre ambas sequências é de 99%, foi identificada duas
trocas em nível de nucleotídeos, conforme ilustra a figura 21. Para esse gene foram
50
excluídas âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) das sequências do gene SAG2,
originando assim a sequência referência, pois o objetivo é a expressão dessa proteína em
sistema recombinante procarioto. Tais âncoras interferem no processo de indução bacteriana
para expressão da proteína. Por esse motivo, é verificado em destaque ainda na figura 21,
uma região com ausência de bases na sequência de pTOPO/SAG2, e por fim o códon de
terminação TGA.
Figura 21: Alinhamento da sequência resultante do clone pTOPO/SAG2 com a sequência do gene SAG2
contida e extraída do Gene Bank. Em destaque pelas setas trocas de nucleotídeos.
51
Para analisar a sequência de aminoácidos resultante da clonagem de SAG2, a
sequência obtida de pTOPO/SAG2, assim como a sequência desse gene que apresentou
maior identidade entre as bases, foram traduzidas virtualmente e alinhadas através dos
softwares MEGA e BioEdit (figura 22). No nível de aminoácido houve apenas uma troca de
aminoácidos na posição 33 („Y‟ Tirosina por „D‟ Ácido Aspártico).
Figura 22: Alinhamento da sequência resultante do clone pTOPO/SAG2 com a sequência do gene SAG2
contida e extraída do Gene Bank. Em destaque pelas setas trocas de nucleotídeos
6.5 Expansão e purificação viral
Células HEK-293 infectadas com HAdSAG1, HAdSAG2 e HAdSAG3 para expansão
dos adenovirus. Após 48 horas, quando foi observado o efeito citopático gerado pela
infecção viral, essas células foram lisadas para obtenção dos adenovírus. Todo conteúdo
viral foi clarificado e posteriormente purificado. Para confirmação da qualidade dos
respectivos adenovírus após a purificação, foi realizada a técnica de PCR utilizando os
iniciadores dos genes SAG1, SAG2 e SAG3 nas mesmas condições padronizadas e
quantidades diferentes de cada adenovírus como molde para a reação. A figura 21 mostra a
purificação amplificação desses genes pela eletroforese, confirmando a purificação.
52
Figura 23: Eletroforese em gel de agarose 1% análise de cada adenovírus obtido após a purificação. Os genes
SAG1, SAG2 e SAG3 foram amplificados a partir de seus respectivos adenovirus. MM: Marcador de Peso
molecular 1kb Plus Fermentas.MM‟: Marcador de Peso molecular Invitrogen 300pb.
Os genes SAG1 e SAG3 foram amplificados com maior intensidade utilizando-se 1L
de adenovírus como molde para a reação de PCR, evidenciado na figura 11 pela presença de
bandas correspondente a aproximadamente 850pb e 975pb respectivamente. A concentração
de DNA aplicada no gel foi menor para SAG3, o que justifica a banda de menor intensidade.
Além disso, também se verifica amplificação de SAG1 utilizando 1,5L de HAdSAG1
como molde na reação. No caso de SAG2 houve amplificação em todas as concentrações e
excesso de DNA aplicado no gel, o que é representado pelos arrastes, sendo a banda
principal desse gene a que se encontra em aproximadamente 500pb comparada aos padrões
utilizados.
53
6.6 Imunização, teste HAI e análise do extrato antigênico de T.gondii;
Camundongos fêmeas de linhagem C57bl/6 com aproximadamente 13 semanas, foram
imunizadas com sobrenadante adenoviral em um teste piloto. Catorze dias após a
imunização, foi coletado soro e submetido ao teste de hemaglutinação indireta em uma
análise semi-quantitativa, o qual se mostrou negativo para todos os grupos conforme ilustra
a figura 22.
Figura 24: Ilustração do resultado do teste de Hemaglutinação indireta. Foi verificado ausência de
hemaglutinação nas amostras dos grupos vacinais. Todas as amostras foram testadas em duplicata.
Como nesse teste é utilizado vários antígenos de T.gondii, sua especificidade diminui
na busca de anticorpos anti-SAGs. Além disso, a quantidade de adenovirus inoculada nos
animais foi baixa quanto à carga viral. Aproximadamente 7 testes de ELISA também foram
realizados, utilizando do extrato bruto do T.gondii (TLA) como antígeno para sensibilização
das placas em diferentes concentrações, os quais apresentaram elevada frequência de falsopositivos (dados não mostrados) em que todas as amostras testadas foram altamente reativas.
Para confirmar essa ocorrência de falso-positivos, foi realizada uma eletroforese em gel
SDS-PAGE para análise do perfil proteico do TLA em diferentes concentrações, conforme
está apresentado na figura 25.
54
Figura 25: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% utilizando diferentes concentrações de TLA. MM:
Marcador de peso molecular Page Ruller Plus Fermentas.
Em todas as concentrações apresentadas, foi verificado que a banda principal do TLA
corresponde a aproximadamente 55KDa. Os demais constituintes estão em menor
quantidade e intensidade. Foi verificado presença de proteínas na região entre 10 e 35 KDa
(região em que se encontram os antígenos de superfície do parasito) apenas com
concentrações mais elevadas, entre 8 e 16 g do TLA.
55
7 . DISCUSSÃO
Para que uma vacina possa ser considerada excelente, deve-se sempre levar em conta
alguns fatores como custo, período de proteção, riscos de infecção humana acidental, efeitos
colaterais, e principalmente o grau de imunidade conferida pela mesma. Atualmente, a
administração simultânea de múltiplos antígenos de T. gondii, seja codificado por
plasmídeos separados ou expressa como proteínas de fusão de um plasmídeo único, têm
potencializado as respostas imunológicas, como por exemplo,
induzir a produção de
citocinas como IL-12 e TNF-, para que sejam ativadas células matadoras naturais, que
sejam capazes de secretar
INF-.(BEGHETTO et al., 2005; MEVELEC et al., 2005;
JONGERT et al., 2007; XUE
et al., 2008; QU et al., 2009; WANG et al., 2009;
HOSEINIAN et al., 2011).
O INF-é considerada a citocina central no controle da replicação do T. gondii, pois
em sinergismo com TNF-ativa as céluas T CD4 e CD8, que atuam mediando a
eliminação de taquizoítos por macrófagos que produzem óxido nitricos. A resposta do tipo B
também é importante, pois altos títulos de anticorpos ajudam a evitar a formação de cistos.
(DENKERS e GAZZINELLI, 1998; GAZZINELLI et al., 1991). Além do desencadeamento
dessa resposta imunológica, busca-se em uma vacina a capacidade de proteger animais
imunizados diante desafio com cepas de T.gondii
de diferentes virulência. Em outra
perspectiva, busca-se também desenvolver um protótipo vacinal que seja capaz de diminuir
a incidência da toxoplasmose congênita.
De acordo com Bruna-Romero et al. (2012), grande parte dos pesquisadores optam
primeiramente por desenvolver vacinas de DNA codificando genes de antígenos de T.gondii,
pela facilidade de contrução e caracterização, bem como pelo fato de vacinas genéticas
induzirem respostas imunológicas fortes em animais. No entanto, ainda há vários riscos
envolvendo vacinas de DNA assim como desvangens em sua utilização. Uma das grandes
preocupações com esse tipo de vacina é o risco de integração do plasmídeo ao DNA da
célula hospedeira e também a dificuldade de absorção celular de plasmídeos, o que
56
consequentemente interfere na expressão do gene alvo e na resposta imune esperada(WANG
et al.,2004). Dessa forma, outras alternativas tem sido utilizadas para o desenvolvimento de
uma vacina contra a toxoplasmose, tais como a identificação, amplificação e clonagem de
genes que codifiquem antígenos em sistema recombinante para, posteriormente, induzir a
expressão desses antígenos, obtendo dessa forma a proteína recombinante.
Nesse trabalho, a primeira etapa de implementação metodológica foi à identificação de
alguns imunógenos importantes na prospecção de geração de um protocolo vacinal contra a
toxoplasmose, assim como, sua utilização para facilitar diagnósticos e perspectivas de novos
projetos, como por exemplo, a busca de marcadores de resistência através de genotipagem
de parasitas do filo Apicomplexa. Nesse contexto, foi possível padronizar e implantar
metodologias que permitirão avanços tecnológicos e de inovação nas áreas de pesquisas
moleculares para o nosso grupo utilizando o Toxoplasma gondii. A partir disso, os genes que
codificam as proteínas SAG1, BAG1 e GRA2 foram identificados pela amplificação
específica desses através da técnica de PCR; a qual encontra-se devidamente padronizada e
executada na rotina do LABMAT atualmente.
Outro fator muito importante e que não deve ser descartado para estudos com vacinas
diz respeito a grande variedade de isolados não clonais de T.gondii circulantes no hemisfério
sul (AJZENBERG et al., 2004 ), fato esse também estudado pelo nosso grupo no Rio
Grande do Norte (CLEMENTINO-ANDRADE et al., 2013). Essa variedade de isolados não
clonais pode repercutir em uma maior dificuldade para caracteriza-los no nível de virulencia.
Dada essa variabilidade antigênica, uma vacina constituída por varias classes de antígenos
pode ser mais eficaz no Brasil.
O foco principal desse trabalho centrava-se nas proteínas SAG1, SAG2 e SAG3,
devido ao grande potencial imunogênico dessas proteínas, bem como a facilidade de sua
obtenção em sistema recombinante (HARNING et al., 1996; BIEMANS et al,1998;
BHOPALE et al., 2006) e adicionalmente, ao potencial de SAG1 em inibir em 50% a
toxoplasmose congenita ( LETSCHER-BRU et al., 2003). Contudo, foi verificado que após a
amplificação dos genes BAG1 e GRA2, outras classes de proteínas expressas por esses genes
poderiam ser também melhor estudadas e aprofundadas de modo a utilizá-las conjuntamente
com as SAGs.
Contudo, verificou-se que a proteínas de micronema, em especial a TgAMA-1,
poderiam ser utilizadas como opções num protótipo vacinal. Os trabalhos relacionados com
57
TgAMA-1 ou envolvem imunizações com plasmídeos de DNA, ou mais recentemente, a
construção do adenovírus expressando essa proteína (DAUTU et. al., 2007; YU et. al.; 2012).
Mais uma vez esse antígeno se destaca em gerar respostas imunológicas satisfatórias e
proteção parcial diante de um desafio secundário com taquizoitos. Dessa forma, pretendemos
ainda, em uma outra etapa, obter essa proteína ou uma porção desse antígeno, para associá-la
em esquema de imunização com as proteínas SAGs.
Conforme mencionado anteriormente, as proteínas de grânulos densos, como a GRA7, pertencente a família da GRA-2, tem se destacado também como uma proteína promissora
para um protótipo vacinal. Recentemente foi observado em murinos imunizados com GRA-7,
um aumento no nível de IgG, IgG2a e IFN- γ nos grupos vacinados, associado com um
aumento significativo na taxa de sobrevida dos animais desafiados com diferentes cepas de
T.gondii (MIN et al. 2012). Com isso, pretende-se, futuramente, incluir a proteína GRA-7 na
continuidade desse trabalho para análise sinégica com as proteínas SAGs e TgAMA-1.
Uma etapa bastante importante nesse estudo, foi o estabelecimento de uma estratégia
de clonagem dos genes que codificam SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1. Para isso, foram
adicionados sitios de enzimas de restrição junto aos seus iniciadores para que após a
amplificação desses genes fosse possível à inserção no plasmídeo de clonagem e,
posteriormente, no plasmídeo de expressão. Os genes que codificam as SAGs foram
amplificados por PCR, resultando em bandas únicas sem inespecíficações, o que facilitou a
sua extração do gel de agarose e a correspodente inserção no plasmídeo de clonagem
pCR2.1.TOPO. Essa abordagem, do ponto de vista tecnológico, facilita os trabalhos para
triagem de bons antígenos candidatos a vacinas.
Após a transformação bacteriana, foram utilizadas enzimas de restrição para
confirmação de clones positivos, onde foi verificado que SAG1 e SAG2 foram clonados. O
sequenciamento dos plasmídeos pTOPO/SAG1 e pTOPO/SAG2 mostrou que as sequências
de bases dos respectivos DNA apresentaram grande similaridade com sequências já descritas
na literatura.
Quando as sequências foram comparadas usando o BLAST/n com sequências de
SAG1 e SAG2 poucas diferenças foram percebidas no nível de nucleotídeos.
Após o
alinhamento com essas sequências, foi realizada a tradução virtual onde foram observadas
alterações nas sequências de aminoácidos o que sugere polimorfismos dessas proteínas. Essa
possibilidade deverá ser mais bem estudada em trabalhos posteriores, no intuito de verificar se
58
há associação com o potencial antigênico dos isolados de T. gondii encontrados no Rio
Grande do Norte. Essa abordagem abre perspectivas para estudos epidemiológicos e avaliação
da virulência de cepas do parasita circulantes em nosso meio, bem como estudos de
sensibilidade a fármacos.
Quanto a SAG3, ela não foi inserida no plasmídeo de clonagem e os clones restantes
pTOPO/TgAMA-1 serão
analisados
novamente.
Algumas
dificuldades
técnicas
e
metodológicas foram os fatores limitantes nessa abordagem. Por conseguinte, nossos
resultados também sugerem uma maior dificuldade de obtenção dessas proteínas em sistema
recombinante o que não deve ser descartado.
A perspectiva desse estudo, a médio e longo prazo é utilizar as proteínas sugeridas
para ensaios de imunização em campo utilizando pequenos ruminantes. Para isso serão
utilizados os adenovírus construídos por Caetano et al. (2006), afim de associá-los com
proteínas emulsificadas em adjuvantes, obedecendo o protocolo dose-reforço heterólogo
abordado por Bouillet et. al (2011).
Caetano et al. (2006) construíram adenovírus recombinante, deficiente de replicação
que codificam as proteínas SAG1, SAG2 e SAG3 para utilização como vetor vacinal.
Camundongos de linhagem Balb/C foram imunizados adotando o protocolo dose-reforço
homólogo. Protocolos de imunização com mais de uma dose mostraram-se necessários para
chegar aos níveis de imunogenicidade requerido por algumas vacinas hoje utilizadas no
calendário do Ministério da Saúde. Um exemplo relevante neste aspecto é o da vacina contra
a hepatite B, em que são necessárias três doses para se obter títulos suficientes de anticorpos
protetores (SADECK e RAMOS, 2004).
Com a utilização do protocolo dose reforço homólogo, Caetano et. al. (2006)
conseguiram a indução de altos títulos de anticorpos e produção de citocinas e,
adicionalmente, diminuição de cistos cerebrais em animais imunizados, confirmando o
potencial imunogênico das SAGs em um vetor viral. Ainda assim, o modelo de imunização
utilizado não protegeu esses animais quando desafiados contra a cepa RH.
Paralelamente, nosso grupo realizou alguns ensaios pilotos utilizando esses mesmos
adenovirus em imunizações com caprinos, nos quias foram observados uma satisfatória
produção de IgG nos animais vacinados. Contudo, as vacinas propiciaram níveis
semelhantes na produção de anticorpos IgG, com a elevação destes níveis após a aplicação
59
da primeira imunização, seguida por diminuição gradual na produção de IgG até após a
aplicação da terceira imunização (MEDEIROS et al., 2010). Alguns fatores podem explicar
esse evento, como por exemplo, o fenômeno Immune Exhaustion, segundo o qual repetir as
imunizações pode acabar com os clones de linfócitos B específicos para o antígeno
(respondem demais e morrem por apoptose) ou ainda, três imunizações podem causar
anergia (falta de resposta por tolerização ao antígeno). Isso deve ser mais bem estudado
durante o doutorado onde pretendemos imunizar ovinos e caprinos.
Nessa perspectiva, no presente estudo, foram realizadas a expansão e a purificação
desses adenovírus para ter-se quantidade suficiente para imunizações em murinos de
diferentes linhagens (isogênica e não-isogênica). O fato do sobrenadante viral não estimular
a produção de anticorpos esperados em um modelo murino pode está relacionado à carga
viral, provavelmente pequena para desencadear uma resposta imunológica satisfatória ou,
uma possibilidade que não deve ser descartada, a via de imunização utilizada.
Caetano et al. (2006) e Bouillet et al. (2011) usaram 10 9 unidades formadoras de placa
como carga viral em modelos murinos para obter uma indução de resposta imunológica.
Para determinar tal carga viral, é necessário que seja realizada titulação desses adenovírus
por meio de diluição limitante. O qual não foi possível no decorrer desse estudo.
Em contrapartida, nossos resultados também sugerem que o TLA não seja um bom
antígeno na captura de anticorpos específicos. A ativação direta da resposta Th1 não foi
observada em outros modelos de imunização que envolveram o uso de extratos de
taquizoítos (YAP et al., 1998) ou SAG1 e SAG2 purificadas de taquizoítos (BONENFANT
et al., 2001). Acredita-se que com a expressão dessas proteínas, além de utilizá-las em
imunizações, poderão ser aplicadas na sensibilização de placas, com o obejtivo de capturar
anticorpos específicos e indutores de resposta celular, comparando com o TLA.
Com a titulação desses adenovirus, assim como a expressão dessas proteínas, será
possível aprimorar métodos mais específicos para análises imunológicas necessárias para o
protocolo vacinal proposto. A abordagem proposta é exequível e apresenta baixos riscos
para os pesquisadores e/ou estudantes envolvidos com o desenvolvimento de vacinas e
encontra-se em plena expansão no LABMAT. O que não for pertinente de ser realizado na
UFRN poderá ser realizado na Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de
Microbiologia, Imunologia e Parasitologia – MIP/CCB/UFSC em colaboração com o Prof.
Dr. Oscar Bruña Romero.
60
8 . CONCLUSÃO
As bases metodológicas necessárias e básicas para a construção de um protótipo vacinal
contra a toxoplasmose foram implantadas nesse primeiro momento. Outras abordagens
deverão ser implementadas em nosso laboratório para aliar outros antígenos em um esquema
vacinal conjuntamente com as SAGs e seus respectivos adenovírus, de modo a ampliar a
proteção da vacina.
61
9. PERSPECTIVAS
Como perspectiva, pretende-se continuar a avaliação do protótipo vacinal verificando
outros
protocolos
de
imunização,
bem
como
a
implantação
de
técnicas
moleculares/imunoparasitológicas necessárias e que permitam a:
- Amplificação do gene que codifica a proteína GRA-7;
- Clonagem dos genes SAG3, TgAMA-1, e GRA-7;
- Expressão em sistema recombinante dos genes SAG1, SAG2,SAG3, TgAMA-1, GRA-15;
- Imunização de murinos com proteínas SAGs em diferentes adjuvantes vacinais e análise
sinérgica da resposta imune humoral e celular;
- Construção de adenovírus recombinante para GRA-7;
- Expansão, purificação e titulação dos adenovírus recombinantes;
- Imunização de camundongos apenas com os HadSAGs seguida da análise de respostas
imune humoral e celular, desafio secundário, e análise de proteção contra toxoplasmose
congênita;
- Imunização de modelos murinos de linhagens isogênicas e não isogênicas seguindo
protocolo prime-boost heterólogo;
- Comparação da resposta imunológica gerada após imunização em ambas as linhagens;
- Desafio com diferentes cepas de T.gondii avaliando taxas de sobrevida dos animais;
- Avaliação de proteção congênita pós- imunização;
- Avaliação neurológica de animais imunizados;
- Imunização de ovinos e análise de resposta imune humoral e celular;
- Ensaios pré-clinicos em primatas não-humanos.
62
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