Julia Bolanho da Rosa Andrade
Efeito dos agentes de maturação, ABA, PEG e
maltose, na produção de óxido nítrico e de espécies
reativas de oxigênio em culturas embriogênicas de
Araucaria angustifolia.
São Paulo
2010
Julia Bolanho da Rosa Andrade
Efeito dos agentes de maturação, ABA, PEG e
maltose, na produção de óxido nítrico e de espécies
reativas de oxigênio em culturas embriogênicas de
Araucaria angustifolia.
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências da Universidade de São
Paulo, para a obtenção de Título de Mestre
em Ciências Biológicas, na Área de
Botânica.
Orientadora: Eny Iochevet Segal Floh
São Paulo
2010
Andrade, Julia Bolanho da Rosa
Efeito dos agentes de maturação,
ABA, PEG e maltose, na produção de óxido nítrico
e de espécies reativas de oxigênio em culturas
embriogênicas de Araucaria angustifolia.
74p
Dissertação (Mestrado) - Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo.
Departamento de Botânica.
1. Araucaria angustifolia 2. embriogênese
3. óxido nítrico
Universidade de São Paulo. Instituto
Biociências. Departamento de Botânica.
de
Julia Bolanho da Rosa Andrade
Efeito dos agentes de maturação, ABA, PEG e
maltose, na produção de óxido nítrico e de espécies
reativas de oxigênio em culturas embriogênicas de
Araucaria angustifolia.
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade
de São Paulo em _______________de 2010, para a obtenção de Título de
Mestre em Ciências Biológicas, na Área de Botânica.
________________________
_______________________
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
______________________
Profa. Dra. Eny Iochevet Segal Floh
Orientadora
Aos meus pais, Osvanir e Helena,
que sempre incentivaram e
patrocinaram meus estudos,
dedico.
L'homme se découvre quand il se mesure avec l'obstacle.
Antoine de Saint-Exupéry, Terre des hommes
Agradecimentos
Agradeço a todos que conviveram comigo durante o período de realização
do mestrado, porque de alguma maneira me ajudaram a continuar.
Aos meus pais, Helena e Osvanir por tudo, e meus irmãos, Felipe e
Carolina, pela compreensão;
Ao Guilherme pelo apoio e por ser minha família em São Paulo;
À Claudete Santa-Catarina pela ajuda na elaboração do projeto, na
correção da dissertação;
Aos companheiros de almoço, Augusto e Thalita;
Aos colegas do laboratório BIOCEL e laboratórios associados, Leonardo Jo,
Yve, Ana Lúcia, Ludmila, Rosângela, Nídia, pela convivência e por tornarem o
laboratório um ambiente agradável,
À Fernanda Pieruzzi, por me escutar sempre que eu quis falar,
Ao André dos Santos por ceder as culturas, por escutar e responder minhas
perguntas,
À Amanda, por sempre estar presente, ela e todos os reagentes,
À Carminha, por manter tudo em ordem,
Ao Tiago Balbuena, Leonardo Dias e Vanildo pela ajuda e todo
ensinamento de bancada;
À Suzi, pelo bom humor diário das manhãs;
Ao Departamento de Botânica e à Secretaria de Pós-graduação do IB, pela
prestatividade;
Aos amigos da graduação, pelas risadas;
À Bia Burin, que aguentou morar comigo;
As amigas de Ana, Patrícia e Juliana pela compreensão da amiga ausente;
À Universidade de São Paulo pela oportunidade de realização do mestrado;
À FAPESP e Capes pelo apoio financeiro concedido; e
À Profª. Eny Iochevet Segal Floh, por quem eu poderia escrever a segunda
página de agradecimentos.
Sumário
1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 9
1.1. Embriogênese em Coníferas................................................................ 9
1.2. A etapa de maturação dos embriões somáticos ................................ 11
1.3. O óxido nítrico e as espécies reativas de oxigênio ............................ 13
1.4. A Araucaria angustifolia como modelo de estudo para a embriogênese
.................................................................................................................. 16
1.4.1. Aspectos bioquímicos e moleculares da embriogênese zigótica e
somática ................................................................................................ 17
2. OBJETIVOS ............................................................................................. 21
2.1. Objetivo geral ..................................................................................... 21
2.2. Objetivos específicos ......................................................................... 21
3. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 22
3.1. Material vegetal.................................................................................. 22
3.2. Indução, manutenção e multiplicação das culturas ........................... 22
3.2.1. Estabelecimento das suspensões celulares................................ 23
3.3. Avaliações bioquímicas, morfológicas e de crescimento ................... 24
3.3.1. Quantificação e visualização de NO e ROS................................. 24
3.3.2. Análises morfológicas.................................................................. 25
3.3.3. Determinação da morte celular.................................................... 25
3.3.4. Determinação da matéria seca.................................................... 26
3.3.5. Determinação da matéria fresca.................................................. 26
3.3.6. Curva de crescimento.................................................................. 26
3.3.7. Análises estatísticas .................................................................... 26
3.4. Estudo do efeito dos promotores de maturação na produção de NO
em culturas embriogênicas da linhagem BM de A angustifolia................. 26
3.4.1. Efeito da concentração dos agentes de maturação no crescimento
celular e na produção endógena de NO................................................ 26
3.4.2. Efeito do tempo de incubação no crescimento celular e na
produção endógena de NO e ROS durante o período de cultura in vitro.
............................................................................................................... 27
3.4.3. Efeito do doador, sequestrador e inibidores da síntese de NO
sobre o conteúdo endógeno de NO e ROS........................................... 28
3.4.4. Efeito do condicionamento do meio de cultura no conteúdo de NO
e ROS.................................................................................................... 28
3.5. Estudo comparativo, entre duas linhagens (BM e MSG) com diferentes
competências para maturação .................................................................. 29
4. RESULTADOS ......................................................................................... 31
4.1. Estudo do efeito dos promotores de maturação no crescimento e na
produção de NO e ROS em culturas embriogênicas da linhagem BM de A
angustifolia................................................................................................ 31
4.1.1. Efeito concentração dependente dos promotores de maturação no
crescimento e no conteúdo de NO e ROS ............................................ 31
4.1.2. Efeito da adição dos agentes promotores de maturação, em
diferentes períodos de cultura, na produção endógena de NO e ROS . 33
4.1.3. Efeito do doador, sequestrador e inibidores da síntese de NO
sobre o conteúdo endógeno de NO e ROS em suspensões celulares
cultivadas nos tratamentos com promotores de maturação.................. 35
4.1.4. Efeito do condicionamento do meio de cultura no conteúdo de NO
e ROS em suspensões celulares .......................................................... 37
4.2. Estudo comparativo, entre duas linhagens (BM e MSG) com diferentes
competências para maturação .................................................................. 41
4.2.1. Aspectos morfológicos das suspensões celulares ...................... 41
4.2.2. Análises morfológicas das culturas embriogênicas ..................... 42
4.2.3. Determinação da morte celular.................................................... 45
4.2.4. Determinação da matéria seca.................................................... 46
4.2.5. Quantificação de NO e ROS........................................................ 47
4.2.6. Visualização intracelular de NO e ROS ....................................... 50
5. DISCUSSÃO............................................................................................. 52
5.1. Maturação das culturas embriogênicas ............................................. 52
5.2. Pomotores de maturação e produção de NO e ROS ......................... 54
5.2.1. PEG ............................................................................................. 54
5.2.2. Maltose ........................................................................................ 56
5.2.3. ABA.............................................................................................. 57
5.2.4. ABA + PEG + Maltose ................................................................. 58
5.3. Doadores, sequestradores e inibidores de NO .................................. 59
5.4. Morte celular ...................................................................................... 60
5.5. Diferença entre linhagens .................................................................. 61
6. CONCLUSÃO........................................................................................... 62
7. RESUMO .................................................................................................. 64
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 65
9
1. INTRODUÇÃO
1.1. Embriogênese em Coníferas
Em gimnospermas, a embriogênese é iniciada e caracterizada, após a
fecundação, por uma etapa de núcleos livres (Singh, 1978; Kong et al., 1999;
Hakman & Oliviusson, 2002) onde são reconhecidas três fases distintas, descritas
como: a) fase pró-embrionária, que vai desde a fertilização até o rompimento do
arquegônio pelo pró-embrião (estádios anteriores ao alongamento do suspensor
primário); b) fase embrionária inicial, que compreende os estádios após o
alongamento do suspensor secundário e antes do estabelecimento dos meristemas;
e c) fase embrionária tardia, na qual a protoderme e o procâmbio são diferenciados, e
os meristemas apical e radicular são estabelecidos (Singh, 1978; Haines & Prakash,
1980). Assim como para as angiospermas, o desenvolvimento do embrião é
finalizado após a formação completa dos cotilédones, acúmulo de substâncias de
reserva (proteínas, lipídios e carboidratos), diminuição da atividade metabólica, e
aquisição da tolerância à dessecação (Bewley & Black, 1994; Cairney & Pullman,
2007).
A embriogênese somática é um processo em que, através da técnica de
cultivo in vitro, células isoladas ou um pequeno grupo de células somáticas dão
origem aos embriões, onde esse processo morfogenético, se aproxima da seqüência
de eventos representativos da embriogênese zigótica (Tautorus et al., 1991; Stasolla
et al., 2003; Palovaara & Hakman, 2008). As similaridades entre os dois processos
envolvem aspectos morfológicos, bioquímicos e moleculares, incluindo a expressão
protéica (Hakman, 1993; Hvoslef-Eide & Corke, 1997; Sghaier et al., 2008), gênica
(Thibaud-Nissen et al., 2003; Ikeda & Kamada, 2005; Cairney et al., 2006; Schmidt et
al., 2006) e diferentes metabólitos (Kormuták et al., 2006; Jiménez, 2005; Tereso et
al., 2007; Floh et al., 2007).
O emprego da embriogênese somática pode ter uma série de objetivos que
vão desde a obtenção de um modelo referência para estudos básicos em fisiologia e
bioquímica, até o uso visando a propagação em larga escala e a transformação
genética (von Arnold et al., 2002).
Como modelo para estudo de um processo morfogenético, a embriogênese
somática é ideal para investigar o processo de diferenciação em plantas, bem como a
expressão dos mecanismos da totipotencialidade da célula vegetal. Incluem-se aqui,
10
abordagens diferenciais da competência celular, que pode ser definida como o
potencial de reprogramação de uma célula, em resposta a sinais específicos, por
meio dos processos de desdiferenciação e rediferenciação (Floh et al., 2007).
Destaca-se que, estudos com esta abordagem em espécies arbóreas nativas e
recalcitrantes são escassos na literatura.
De acordo com von Arnold et al. (2002), a embriogênese somática em
coníferas, e que tem como seu principal modelo Picea abies, é composta de cinco
etapas, descritas a seguir:
Etapa 1- indução – nesta etapa normalmente são utilizados meios de cultura
contendo reguladores de crescimento vegetal, como auxinas e citocininas. A
frequência de indução de culturas embriogênicas em coníferas é afetada por vários
fatores e, dentre eles, destaca-se: a influência do genótipo, o efeito do estádio de
desenvolvimento do explante e o potencial indutivo do meio de cultura, a fonte de
carboidrato (sacarose, maltose, lactose), a composição e teores de nitrogênio, os
agentes geleificantes, o pH e a concentração e tipos de reguladores de crescimento
no meio de cultura (Li et al., 1998, Guerra et al., 2000);
Etapa 2 - multiplicação - pode ser realizada em meio de cultura líquido ou
semi-sólido. Esta etapa é caracterizada pela passagem do material por três estádios
de desenvolvimento consecutivos. Esses estádios são caracterizados por agregados
celulares definidos como massas pró-embriogênicas (MPE) de três tipos (MPE I, II e
III). As MPE I são formadas por um aglomerado de pequenas células, associadas a
uma célula altamente vacuolada. Um conjunto semelhante, mas com mais de uma
célula vacuolada, determina a MPE II. Na fase de MPE III, o conjunto de células com
citoplasma aumenta e fica rodeado pelas células vacuoladas (Filonova et al., 2000).
O embrião propriamente dito, é formado a partir das MPE III, através de uma
bipolarização (Filonova et al., 2000; Stassola & Yeung, 2003). O conjunto de células
pequenas e aglomeradas é denominado de pró-embrião, e as células altamente
vacuoladas são os suspensores. Durante a multiplicação, culturas embriogênicas de
coníferas são normalmente mantidas em meios de cultura similares àqueles utilizados
na fase de indução porém, com redução na concentração de fitorreguladores (von
Arnold et al., 2002);
Etapa 3- pré-maturação- nesta etapa, em meio de cultura sem a presença de
fitorreguladores, os embriões iniciam o desenvolvimento tornando-se individualizados.
A necessidade de um pré-tratamento, com a desidratação lenta, anterior à
germinação, foi verificada como fundamental para diferentes sistemas de coníferas
incluindo embriões somáticos de Castanea sativa (Corredoira et al., 2008) e para
11
Ocotea catharinensis (Viana & Mantel, 1999). Segundo Malabadi & Nataraja (2006), o
estresse hídrico poderia induzir proteínas que possuem participação fundamental na
tolerância ao estresse de água, e na promoção da maturação dos embriões
somáticos;
Etapa 4 – maturação – nesta etapa ocorre a maturação dos embriões
somáticos, frequentemente em meios de cultura suplementados com promotores de
maturação, como o ácido abscísico (ABA) e/ou agentes osmóticos. Nesta etapa, os
embriões somáticos apresentam mudanças morfológicas e bioquímicas, resultando
no acúmulo de substâncias de reserva, redução da atividade metabólica e aquisição
da tolerância à desidratação (Thomas, 1993; von Arnold et al., 2002; Stasolla et al.,
2003). Esta condição mimetiza o efeito do estresse hídrico, que ocorre naturalmente
nas sementes, durante os estádios finais da maturação, e que permite com que os
embriões sobrevivam ao processo de desidratação (Bewley & Black, 1994). Esta
etapa de cultura consiste em um dos principais gargalos para a ampla utilização dos
sistemas de embriogênese somática em arbóreas devido a baixa frequência de
maturação e conversão de embriões somáticos em plântulas nestes sistemas
vegetais (Stasolla & Yeung, 2003; Stasolla et al., 2003). Em embriões de diferentes
espécies de coníferas a maturação é estimulada pela dessecação lenta em uma alta
umidade relativa (maior ou igual a 95%), antes da transferência para o meio de
germinação (Malabadi & van Staden, 2005; Salaj et al., 2005; Tremblay et al., 2005;
Vágner et al., 2005).
Etapa 5 - conversão em plântulas – nesta etapa ocorre a germinação dos
embriões que passaram pela dessecação, geralmente em meio de cultura isento de
fitorreguladores, obtendo-se as plântulas. Quando o sistema radicular encontra-se
bem desenvolvido, com a presença de raízes laterais, as plantas provenientes de
embriões somáticos podem ser aclimatizadas ex vitro (Högberg et al., 2003).
1.2. A etapa de maturação dos embriões somáticos
Muitos avanços têm sido realizados para a compreensão e otimização da
embriogênese somática em coníferas (Jain & Ishii, 1998; von Arnold et al., 2002;
Breton et al., 2005; Maruma et al., 2009). Entretanto, a maturação dos embriões
somáticos, e a subsequente regeneração de plantas, ainda são etapas limitantes.
Assim, existem vários aspectos a serem elucidados para as diferentes espécies,
incluindo a Araucaria angustifolia (Steiner et al., 2008). A baixa taxa de germinação
12
dos embriões somáticos tem sido atribuída como sendo decorrente de problemas
existentes no processo de maturação, como acúmulo de substâncias de reserva,
danos durante a desidratação/reidratação, ou ainda uma insuficiente tolerância a
desidratação (Moon & Hildebrand, 2003; Durzan, 2008).
A tolerância à desidratação está relacionada com a lenta perda de água pelas
células, e inclui a capacidade destas, em reidratar-se novamente (Hoekstra et al.,
2001). Os mecanismos relacionados a esta tolerância baseiam-se na troca da água
por moléculas que possibilitam a saída lenta de água, protegendo a membrana
celular contra os danos ocasionados pela desidratação (Hoekstra et al., 2001), com a
presença de consideráveis quantidades de oligossacarídeos, e proteínas específicas.
Essas proteínas, incluindo-se as LEA (“late embryogenesis abundant”) são
armazenadas na fase final da embriogênese, durante o processo de maturação e na
desidratação de tecidos vegetativos de plantas (Bewley & Black, 1994; Hoekstra et
al., 2001; Boudet et al., 2006).
Culturas de embriões somáticos submetidas às condições de maturação
sofrem a influência de diferentes fatores. Dentre estes fatores destaca-se: genótipo
do explante, estádio de desenvolvimento das massas pró-embriogênicas, tipos e
concentrações de reguladores de crescimento, osmolaridade e composição do meio
de cultura, frequência de subcultivos, e idade das culturas (Bozhkov & von Arnold,
1998; Salaj et al., 2004).
Dentre as principais estratégias para maturação de culturas embriogênicas,
estão a suplementação do meio de cultura com determinados reguladores de
crescimento
e
agentes
osmóticos,
os
quais
permitem
a
progressão
do
desenvolvimento normal dos embriões somáticos (Stasolla & Yeung, 2003; Stasolla et
al., 2003). Diversos estudos têm apresentado protocolos otimizados da maturação de
embriões somáticos em coníferas, com a utilização do ABA, agentes osmóticos e
carvão ativado (Langhansova et al., 2004;Jiménez et al., 2005, García-Martin et al.,
2005).
O ABA é um regulador de crescimento freqüentemente utilizado nessa fase de
maturação dos embriões somáticos em muitas espécies arbóreas (Mauri &
Manzanera, 2004; García-Martin et al., 2005; Prakash & Gurumurthi, 2010). O
metabolismo deste composto regula vários processos fundamentais, como a síntese
e deposição de proteínas de reserva (Dodeman et al., 1997), e a eliminação do
suspensor das massas pró-embriogênicas (Filonova et al., 2000; Steiner et al., 2008).
Tipicamente, nas sementes de várias gimnospermas e angiospermas, o nível
13
endógeno de ABA é baixo, durante as fases iniciais da embriogênese, aumentando
durante
o
crescimento
de
embrião,
e
decrescendo
nas fases
finais
de
desenvolvimento (Stasolla & Yeung, 2003).
Diferentes agentes osmóticos, incluindo compostos com baixo peso molecular
(sais inorgânicos, aminoácidos e mono e dissacarídeos) e com alto peso molecular
(polietilenoglicol – PEG), são comumente utilizados para diminuir o potencial osmótico
do meio de cultura. Dentre estes compostos, o PEG, devido ao seu caráter nãoplasmolisante, é o agente osmótico preferido em relação aos agentes plasmolisantes
(Tautorus et al., 1991; Attree & Fowke, 1993; Stasolla & Yeung, 2003; Stasolla et al.,
2003).
A maltose, assim como outros carboidratos, atua como fonte de carbono e
como agente osmótico (Shoji et al., 2006). A sua quebra disponibiliza glicose, que é
prontamente
assimilável
pelas
células
vegetais
(Salajova
et
al.,
1999).
Frequentemente, a utilização de maltose é preferida em relação à sacarose, por
promover um aumento no número de embriões somáticos, conforme observado para
Pinus elliottii e em Pinus taeda (Salajova et al., 1999). Adicionalmente esta
substância mantém o potencial osmótico do meio negativo, e constante, por um longo
período, devido a sua quebra mais lenta em relação à sacarose (Yildirin, 2006; Shoji
et al., 2006).
A combinação do ABA com um ou vários agentes osmóticos, tem se mostrado
eficiente para o processo de maturação, em várias espécies florestais, incluindo-se
as coníferas (Tautorus et al., 1991; Attree & Fowke, 1993; Stasolla & Yeung, 2003;
Steiner et al., 2007; Steiner et al., 2008).
1.3. O óxido nítrico e as espécies reativas de oxigênio
O óxido nítrico (NO) e as espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas
que atuam nas respostas das plantas aos vários estresses ambientais, tais como:
hídrico, temperatura, ultravioleta, ozônio (Mittler et al., 2004; Delledonne, 2005, Zago
et al., 2006), e estresses bióticos (Delledonne et al., 2001). Ambas as moléculas
estão envolvidas em processos de desenvolvimento como a germinação de
sementes, o gravitropismo, a lignificação da parede celular, a morte celular
programada e o desenvolvimento de raízes (Neill et al., 2008). Assim, essas
substâncias possuem papel fundamental nas respostas das plantas aos sinais e
estímulos endógenos (Desikan et al., 2004; Zago et al., 2006; Liu et al., 2009).
14
O NO é um radical livre, gasoso e altamente difusível que tem sido descrito
como um mensageiro intra e intercelular para diferentes sistemas vegetais (Neill et
al., 2008). Essa substância é formada, principalmente em tecidos com crescimento
ativo, como o eixo embrionário e cotilédones, com níveis menores nos tecidos
maduros e órgãos senescentes (Leshem et al., 1998; Caro & Puntarulo, 1999).
Isoladamente, o NO é uma molécula não tóxica que mesmo em altas concentrações
não ocasiona morte celular (Pryor & Squadrito, 1995). Entretanto, na presença do
-
superóxido (O2 ), o NO torna-se um potente radical livre, com a formação de um forte
oxidante, o peroxinitrito (ONOO-) (Ducrocq et al., 1999).
Diferentes estudos demonstraram que o NO pode promover a divisão celular e
a formação de células embriogênicas, na presença da auxina ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D), em culturas derivadas de protoplastos de folha de alfafa
(Ötvös et al., 2005). Nesse material foi verificado que os vários doadores de NO, que
promoveram a divisão celular dependente de presença de auxina, aumentaram a
freqüência de células viáveis, e a expressão do gene McSERK, o qual somente é
expresso em células com potencial embriogênico. Adicionalmente, esses doadores
inibiram o alongamento celular, favorecendo a formação de células esféricas com
citoplasma denso (Ötvös et al., 2005). Adicionalmente, relatos de atuação do NO na
transdução de sinal de citocininas favorecendo a divisão celular foram realizados
para culturas celulares de Arabidopsis thaliana, salsa (Petroselinum crispum) e
tabaco (Nicotiana tabacum) (Tun et al., 2001).
Estudos têm demonstrado que, quando o ABA é adicionado ao meio de
cultura, ocorre um aumento nos níveis endógenos de NO (Neill et al., 2002; Guo et
al., 2003) e de ROS (Pei et al., 2000; Zhang et al., 2001), indicando que estas
substâncias possam atuar como sinalizadoras intermediárias deste fitormônio (Pei &
Kuchitsu, 2005).
O papel protetor do NO no dano oxidativo causado pelo estresse osmótico do
PEG, quando adicionado ao meio de cultura em suspensões celulares de Phragmites
communis, foi recentemente demonstrado. Verificou-se que a aplicação de
nitroprussiato de sódio (SNP), um doador de NO, previne os efeitos causados pelo
PEG,
enquanto
a
aplicação
do
sequestrador
de
NO,
2-phenyl-4,4,5,5-
tetramethylimidazoline-1,1-oxyl-3-oxide (PTIO), cancela o efeito protetor do doador
(Zhao et al., 2008).
A morte celular programada (MCP) em plantas tem sido estudada e
relacionada com o metabolismo do NO. A MCP está presente em todos os estádios
15
do ciclo de vida da planta, desde a fertilização até a senescência da planta, inclusive
durante o processo de embriogênese (Schwartz et al., 1994). Outras situações, como
a xilogênese (Minami & Fukuda, 1995) e a resposta de hipersensibilidade (Ryerson &
Heath 1996), são caracterizadas por eventos relacionados a esse processo de MCP.
Neste sentido, estudos citológicos e moleculares, durante a embriogênese
zigótica em milho (Zea mays) indicam que a MCP ocorre durante o desenvolvimento
embrionário, e é essencial para a formação do eixo central do embrião (Giuliani et al.,
2002). A degradação das células do suspensor de embriões zigóticos em coníferas,
que tem como função primordial a promoção do crescimento do embrião nos estádios
iniciais da embriogênese,
tem sido frequentemente, referida como exemplo
característico de MCP em plantas (Filonova et al., 2000). De maneira similar, durante
a embriogênese somática em P. abies verifica-se a ocorrência da MCP com a
eliminação da célula do suspensor (Filonova et al., 2000). Neste sentido, a inibição da
MCP resulta na supressão da diferenciação de embriões somáticos e eliminação de
células do suspensor, causando a inibição na maturação (Helmersson et al., 2008).
Alguns trabalhos têm demonstrado a relação entre reguladores de
crescimento vegetal, NO e ROS com o processo de MCP. Carimi et al. (2005)
demonstraram que, em suspensões celulares de A. thaliana, a citocinina BA (6benzylaminopurine) induz ambos, a formação de NO e a MCP, e reduz o crescimento
celular das culturas. Zago et al. (2006) propuseram que o peróxido de hidrogênio
(H2O2) age juntamente com NO, quando em concentrações elevadas, na indução da
MCP. Posteriormente, De Michele et al. (2009), trabalhando com o sistema de
suspensões celulares de A. thaliana, confirmaram o envolvimento do NO na
promoção da MCP, o que foi relacionado com a hipótese de uma aceleração da
senescência.
As ROS, assim como o H2O2, são altamente reativas e causam distúrbios no
sistema redox da célula, influenciando as principais vias metabólicas, através de
alterações diretas nas atividades enzimáticas e nas propriedades de membrana, bem
como na estrutura do DNA (Inzé & van Montagu, 1995; Cassels & Curry, 2001;
Konieczny et al., 2008). Essas substâncias, na ausência de mecanismos efetivos de
proteção, podem causar sérios danos às plantas, como por exemplo, a degradação
de proteínas, oxidação lipídica, quebra de DNA, e a MCP (Beligni & Lamattina, 1999).
As ROS podem estar relacionadas com as propriedades osmóticas do meio
de cultura e a regeneração de plantas, via embriogênese somática. O aumento nos
níveis endógenos de H2O2 parece ser essencial para a formação de embriões
16
somáticos em culturas de girassol (Konieczny et al., 2008). Estudos tem mostrado
que a sua adição ao meio de cultura promove um aumento na frequência dos
embriões somáticos neoformados em Lycium barbarum (Kairong et al., 1999) e
Gladiolus hybridus (Gupta & Datta, 2004).
Adicionalmente, estudos recentes têm demonstrado, pela primeira vez, a
ocorrência da relação entre poliaminas (PAs) e NO em plantas, onde a adição
exógena de PAs, principalmente a espermidina (Spd) e a espermina (Spm), induzem
a biossíntese e a rápida liberação de NO em plântulas de A. thaliana (Tun et al.,
2006). Estudos nesta linha tem confirmado esta relação em diferentes sistemas
vegetais (Santa-Catarina et al., 2007; Silveira et al., 2006).
1.4. A Araucaria angustifolia como modelo de estudo para a embriogênese
A. angustifolia é uma conífera nativa do Brasil, pertencente à floresta
ombrófila mista. Originalmente as florestas com essa espécie ocupavam 20 milhões
de hectares, distribuídos nos Estados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Santa
Catarina e Rio Grande do Sul (Guerra et al., 2002). O intenso desmatamento, iniciado
a partir da década de 30, sem a preocupação com reflorestamento das áreas
exploradas, levou ao esgotamento das reservas naturais. Atualmente, as reservas
com exemplares desta espécie, estão limitadas a aproximadamente 3% da área
original (Farjon, 2006).
A. angustifolia é uma espécie heliófita e pioneira, considerada como sendo a
única conífera nativa do Brasil com importância econômica. Sua importância
econômica está relacionada com a alta qualidade da madeira, utilizada para
tabulados, vigamentos, caixas, móveis, instrumentos musicais, artigos de esporte,
ferramentas e fabricação de compensados (Guerra et al., 2002). Além disso, a
madeira da espécie contém 58% de celulose, 29% de lignina e fibras longas de alto
rendimento em celulose, tornando-a muito atraente para as indústrias de papel e
celulose (Guerra et al., 2008). Um outro produto deste material, muito utilizado por
populações locais é a sua semente, também conhecida como pinhão (Conforti &
Lupano, 2007) e que é uma fonte rica de amido, possuindo também, proteínas,
lipídios, açúcares, fibras, magnésio e cobre, e compostos polifenólicos (Cordenunsi et
al., 2004).
No Brasil, muitos estudos têm sido realizados visando conservação e a
manutenção da variabilidade genética dos pinheirais remanescentes. Para A.
17
angustifolia, a modalidade de conservação in situ, é aquela que apresenta maiores
dificuldades para ser executada, não apenas pela fragmentação das populações
naturais e pelo longo ciclo reprodutivo (a produção de sementes normalmente ocorre
após 15 a 20 anos de idade), mas, principalmente, pela pressão de ocupação do
meio rural.
1.4.1. Aspectos bioquímicos e moleculares da embriogênese zigótica e somática
A atuação e participação de diferentes reguladores de crescimento e
sinalizadores no processo de embriogênese zigótica e somática em A. angustifolia
têm sido objeto de estudo para várias pesquisas (Silveira et al., 2006; Santos et al.,
2008a, Steiner et al., 2008; Silveira et al., 2008; Balbuena et al., 2009).
Nas fases iniciais da embriogênese, O AIA (ácido indol-3-acético) é uma das
principais auxinas relacionadas com o estabelecimento do eixo ápice-base, e com a
simetria bilateral do embrião (Kong et al., 1997; Friml et al., 2003). Durante a
embriogênese zigótica em A. angustifolia foi demonstrado que conteúdos mais
elevados de AIA ocorrem nos estádios iniciais do processo, com um decréscimo
contínuo até o final do desenvolvimento embrionário, quando ocorre a diferenciação
dos cotilédones e o desenvolvimento da semente (Astarita et al., 2003a). Situação
inversa ocorre em relação ao ABA, ou seja, durante as fases iniciais da
embriogênese zigótica, foi identificado um conteúdo mais reduzido, aumentando
durante o desenvolvimento do embrião, e decrescendo nas fases finais de
desenvolvimento embrionário (Silveira et al., 2006).
Durante a embriogênese zigótica, o papel das PAs tem sido avaliado para o
sistema A. angustifolia (Astarita et al, 2003b; Silveira et al., 2006). Astarita et al.
(2003b) verificaram que a putrescina (Put) possui importância fundamental no início
da embriogênese, quando a taxa de divisão celular é alta. Elevados conteúdos de
espermidina (Spd) e espermina (Spm) são essenciais ao final do desenvolvimento do
embrião, quando o crescimento está associado, principalmente, com o alongamento
celular.
Estudos de proteômica comparativa também foram realizados para os
diferentes estádios da embriogênese zigótica de A. angustifolia (Silveira et al., 2008;
Balbuena et al., 2009). Foram identificadas proteínas estádio-específicas, as quais
podem ser utilizadas como marcadores bioquímicos. Destaca-se que, a síntese de
proteínas de reserva foi sugerida com sendo fundamental para o monitoramento do
desenvolvimento de embriões zigóticos e somáticos (Silveira et al., 2008). Balbuena
18
(2009), trabalhando com esse sistema, verificaram que, durante a fase inicial de
desenvolvimento
do
embrião
zigótico, as
proteínas
mais
expressas
estão
relacionadas com o metabolismo do estresse oxidativo, enquanto nas fases tardias
ocorre uma ativação do metabolismo como um todo, resultando numa intensa
assimilação de carbono e acúmulo de compostos de armazenamento.
Dos Santos et al. (2006) realizaram análises qualitativas e quantitativas dos
mapas proteômicos obtidos por 2-DE de diferentes estádios do desenvolvimento de
sementes de A. angustifolia. Embora não tenham sido utilizadas técnicas de
espectrometria de massas para a identificação de proteínas, a presença de
arabinogalactanos e proteínas do tipo quitinases foram detectadas por coloração
imunológica e utilização de substratos específicos, em análises por eletroforese
unidimensional. Nesse trabalho, os pesquisadores utilizaram a estratégia de
identificação de proteínas por PMF (peptide mass fingerprinting) para a identificação
das proteínas e observadaram a ocorrência, exclusivamente no estádio maduro, da
enzima fosfoinositídeo fosfatase, de uma proteína LEA e de uma proteína de reserva
do tipo vicilina.
O primeiro relato da embriogênese somática em A. angustifolia foi realizado
por Guerra & Kemper (1992). Desde então, diversos grupos de pesquisa vêm
trabalhando no desenvolvimento de protocolos para indução, manutenção e
maturação de embriões somáticos nesta espécie (Astarita & Guerra, 1998, 2000;
Guerra et al., 2000; dos Santos et al., 2002; Silveira et al., 2002; Steiner et al., 2005;
Silveira et al., 2006; Steiner et al., 2007, 2008; Santos et al., 2008b). As condições
básicas para a indução de culturas e proliferação das culturas embriogênica, a partir
de embriões zigoticos imaturos foram estabelecidas (Astarita e Guerra, 1998; 2000;
Guerra et al., 2000; Silveira et al., 2002, dos Santos et al., 2002). Essas etapas da
embriogênese ocorrem em meios de cultura suplementados ou não com
fitorreguladores (Steiner et al., 2005; Steiner et al., 2007) e são influenciadas pela
fonte de carbono, utilizada no meio de cultura (Steiner et al., 2005).
As relações entre as PAs e o NO e as suas interações com as vias de
diferenciação e multiplicação das culturas embriogênicas, foram demonstradas no
processo de embriogênese somática, em A. angustifolia (Silveira et al., 2006; Steiner
et al., 2008; Osti et al., 2010). Durante a proliferação de culturas embriogênicas,
Steiner et al. (2005) verificou que a PA que ocorre em maior quantidade é a Put,
seguida pela Spd e Spm, o que favorece a manutenção da divisão celular. Quando
essas culturas foram suplementadas com Spm e Spd, ocorreu um maior acúmulo de
19
matéria seca e uma maior deposição de substâncias de reserva, como proteínas e
amido. Ao adicionar a Spd ao meio de cultura, ocorre um aumento no conteúdo
endógeno de ABA (Steiner et al., 2005).
Silveira et al. (2006) verificaram que as PAs, Spd e Spm, reduzem o
crescimento celular e o conteúdo endógeno de NO, além de promoverem a
progressão da morfologia dos pró-embriões. Adicionalmente, propuseram que as PAs
devem estar envolvidas no processo da maturação de culturas embriogênicas.
Sugeriram uma possível correlação entre a produção de NO, induzida ou não pelas
PAs, e a aquisição para a competência para a embriogênese. O efeito da aplicação
exógena de um doador de NO em culturas embriogênicas de A. angustifolia foi
avaliado por Osti et al. (2010), onde verificaram que a adição de NO interfere no
crescimento celular, dentro de um limite de concentração, quando suplementado ao
meio de cultura.
Como para a maioria das arbóreas, a maturação de embriões somáticos
constitui uma etapa crítica para o sucesso de protocolos de embriogênese somática
em A. angustifolia (Steiner et al., 2008). Vários estudos têm sido realizados,
objetivando a identificação do efeito do ABA, PEG e maltose durante a maturação
destas culturas embriogênicas (Steiner et al., 2005; Steiner et al., 2008). Nesse
sistema, a suplementação com ABA ao meio de cultura de maturação, após oitenta
dias, propiciou o desenvolvimento dos embriões nos estádios tardios, similarmente ao
observado para os embriões zigóticos. Contudo, esses embriões somáticos ocorrem
em baixa freqüência, e de maneira não sincronizada (Steiner et al., 2007). A adição
de
PEG,
ABA
e
maltose,
revelaram
variações
no
padrão
de
proteínas
diferencialmente expressas. Assim, culturas tratadas com PEG apresentaram maior
número de polipeptídios, enquanto aquelas tratadas com ABA, o menor número de
polipeptídios. Com relação à presença de maltose, verificaram uma maior
porcentagem de polipeptídios de alto peso molecular (Andrade et al., 2007) e um
incremento no conteúdo protéico, quando comparado com o controle suplementado
com sacarose (Steiner et al., 2005).
Embora os vários estudos acima relatados tenham sido realizados utilizando o
efeito dos agentes promotores da maturação, como ABA, PEG e maltose, sobre o
metabolismo bioquímico de PAs, proteínas e hormônios vegetais.
Até o presente momento, não foram conduzidos estudos no sentido de
verificar o efeito de agentes promotores de maturação (ABA, PEG e maltose), no
metabolismo endógeno de NO e ROS e no crescimento de culturas embriogênicas de
20
A. angustifolia. Estudos neste sentido são fundamentais para o entendimento dos
eventos bioquímicos associados à maturação na embriogênese somática dessa
espécie.
21
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Estudar o efeito dos agentes promotores da maturação no metabolismo de
NO e ROS, crescimento e evolução morfológica das culturas embriogênicas de A.
angustifolia.
2.2. Objetivos específicos
● Verificar o efeito dos promotores de maturação na produção de NO e ROS
em culturas embriogênicas da linhagem BM de A angustifolia;
● Realizar estudos comparativos entre duas linhagens (BM e MSG) com
diferentes competências para maturação, verificando o efeito dos promotores de
maturação na produção de NO e ROS e evolução morfológica em culturas
embriogênicas de A angustifolia.
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material vegetal
Como material vegetal foi utilizada a A. angustifolia, uma conífera nativa do
Brasil, pertencente à floresta ombrófila mista (Guerra et al., 2002). Para o início das
culturas, como fonte de explantes foram utilizados embriões zigóticos retirados de
sementes imaturas, obtidas a partir de cones femininos imaturos, coletados em
diferentes localidades. Assim, para a primeira linhagem, denominada BM, foram
utilizadas sementes imaturas coletadas entre dezembro de 2004 e janeiro de 2005,
provenientes do município de Epagri de Lages (SC). Para a segunda linhagem,
denominada MSG, foram coletadas sementes imaturas, no município de Canoinhas
(SC), em dezembro de 2008.
3.2. Indução, manutenção e multiplicação das culturas
Foram utilizadas duas linhagens distintas baseadas na competência para a
maturação dos pró-embriões somáticos. As condições de maturação foram
estabelecidas em experimentos prévios, e são consideradas a seguir:
a) Linhagem BM (fig. 1A): essa linhagem, considerada não competente para a
maturação, foi induzida e estabelecida de acordo com Steiner et al. (2005), no
Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal – LFDGV/UFSC em
2005, e mantidas no Laboratório de Biologia Celular de Planta, BIOCEL - Depto de
Botânica - IB/USP. A manutenção e multiplicação das culturas foram realizadas em
meio de cultura BM (Gupta & Pullmann, 1991) suplementado com sacarose (3%),
-1
-1
-1
caseína hidrolisada (0,5 g.L ), L-glutamina (1,0 g.L ) e mio-inositol (0,1 g.L ), 2 µM
de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacetico), 0,5 µM de BA (6-benzilaminopurina) e 0,5
µM de Kin (cinetina) com a adição de phytagel® (2%). O pH do meio de cultura foi
ajustado para 5,7, após a adição dos reguladores de crescimento, e antes da
autoclavagem à 121ºC, e 1,5 atm, por 15 min. A solução de glutamina foi
filtroesterilizada, e adicionada ao meio de cultura após a autoclavagem. A
manutenção e multiplicação das culturas foram realizadas através de repicagens
sucessivas, a cada 21 dias, mantidas no escuro, em temperatura controlada de
25±1ºC.
b) Linhagem MSG (fig. 1B): essa linhagem, considerada competente para a
maturação, foi induzida e estabelecida no BIOCEL, de acordo com a metodologia
23
descrita por Becwar et al. (1989). As culturas foram mantidas, em meio de cultura
MSG (Becwar et al., 1989), suplementado com Gelryte® (0,3%). O pH do meio de
cultura foi ajustado para 5,7, antes da autoclavagem a 121ºC, 1,5 atm, por 15 min. A
solução de glutamina foi filtroesterilizada, e adicionada ao meio de cultura após a
autoclavagem. A manutenção e multiplicação das culturas foram realizadas através
de repicagens sucessivas a cada 21 dias, mantidas no escuro, em temperatura
controlada de 25±1ºC.
A
B
E
5mm
0,5mm
E
Figura 1: Aspecto das culturas embriogênicas de A.angustifolia durante a maturação
em meio de cultura semi-solido. Linhagem BM (A) sem competência para maturação
dos embriões somáticos, e linhagem MSG (B) com competência para maturação dos
embriões somáticos. (E): embrião somático.
3.2.1. Estabelecimento das suspensões celulares
As suspensões celulares foram obtidas a partir das duas linhagens de culturas
embriogênicas (item 3.2). Os meios de cultura foram os mesmos utilizados para a
multiplicação das respectivas culturas, sem a adição do agente solidificante, e dos
reguladores de crescimento 2,4-D, BA e Kin.
Para iniciar as suspensões celulares, 500 mg de células mantidas no meio
semi-sólido (item 3.2), foram dissociadas e inoculadas em meio de cultura líquido, em
frascos de Erlenmeyer (250mL) contendo 50 mL de meio de cultura. Esses frascos
foram mantidos em agitador horizontal orbital (60 rpm) à temperatura de 25±1ºC, no
escuro, com subcultivos a cada 15 dias.
As suspensões celulares obtidas foram filtradas e as células retidas, em
peneira de dissociação celular (Sigma S-1145, malha 150 m), foram utilizadas para
os estudos de maturação dos embriões somáticos.
24
3.3. Avaliações bioquímicas, morfológicas e de crescimento
3.3.1. Quantificação e visualização de NO e ROS
A quantificação e visualização do NO e ROS nas suspensões celulares foram
realizadas de acordo com as metodologias descritas por Silveira et al. (2006) e Laxalt
et al. (2007), respectivamente. A Figura 2 apresenta um esquema da metodologia
utilizada.
Liberação e visualização de NO e ROS
Fluorômetro
Agitação (100rpm)
50mg
Escuro
2 ml de
meio de
cultura
Tratamentos
Culturas
embriogênicas
Incubação com:
DAR 4M (2,5 M)
DAR 4MAM (5 M)
H 2DCFDA (25 M)
Microscópio de fluorescência
Figura 2: Metodologia utilizada para a quantificação e visualização de NO e ROS, nas culturas
embriogênicas de A. angustifolia.
Para as análises de NO e ROS, foram utilizadas 50 mg das células em
suspensão (item 3.2.1.), as quais foram inoculadas em 2 mL do respectivo meio de
cultura. Após 1h, adicionou-se o marcador de fluorescência, o reagente DAR-4M
(diaminorhodamine 4M), impermeável à membrana plasmática, para a quantificação
do
NO extracelular liberado, e o reagente DAR-4M AM (diaminorhodamine-4M
acetoxymethyl ester), permeável à membrana plasmática, para quantificação
intracelular de NO. A quantificação das ROS foi realizada utilizando-se o reagente
H2DCFDA (2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate). As células foram mantidas em
cultivo, durante duas horas no escuro, sob agitação de 60 rpm, a 25°C ± 2.
A quantificação da fluorescência, após duas horas de incubação, foi
determinada, utilizando-se um fluorômetro (Victor 3TM - PerkinElmer), com excitação
em comprimentos de onda de 560 nm e emissão em 575 nm para o DAR 4M e DAR
4M AM. Para o H2DCFDA utilizou-se comprimento de onda de excitação em 502 nm e
de emissão em 523 nm.
25
As análises de microscopia de fluorescência foram realizadas após 1 hora de
incubação com os reagentes DAR-4M AM e H2DCFDA. Após esta incubação, as
células foram lavadas, montadas em lâminas e o material analisado utilizando-se
microscópio de fluorescência Axio Imager M2 (Zeiss) com o programa Axio Vision
Rel. 4.8 (Zeiss), e fotografado com câmera Axio Cam MR3 (Zeiss), obtendo-se
imagens em campo claro e fluorescência para efeito de comparação e identificação
do local de produção de NO e ROS. Foram utilizados os seguintes filtros: para o DAR
filtro de excitação 546/12 e emissão 575-640, e para H2DCFDA filtro de excitação
500/20 e emissão 535/30.
3.3.2. Análises morfológicas
O aspecto morfológico das culturas embriogênicas nos diferentes tratamentos
foi monitorado através da dupla-coloração com azul de Evans e carmin acético,
segundo a metodologia descrita por Gupta & Durzan (1987). Esta dupla coloração
realizada permite uma visualização diferenciada dos tipos celulares uma vez que as
várias células que compõe o embrião somático possuem diferentes afinidades com
estes corantes. Assim, o carmim acético possui alta afinidade com o núcleo das
células da região embriogênica, que coram intensamente de vermelho, enquanto o
Azul de Evans cora as células vacuoladas dos suspensores, evidenciando o núcleo,
em azul escuro, e o citoplasma, em azul claro (von Arnold et al, 1995).
Os materiais corados foram montados em lâminas e lamínulas, e analisadas
utilizando-se um microscópio Axio Imager M2 (Zeiss), com o programa Axio Vision
Rel. 4.8 (Zeiss), e fotografado com o auxílio de uma câmera Axio Cam MR3 (Zeiss)
acoplada ao equipamento.
3.3.3. Determinação da morte celular
A morte celular foi avaliada utilizando-se a metodologia descrita por Delledone
et al. (2001). Para tanto, as células foram incubadas em uma solução de corante de
azul de Evans (0,05%). Após lavagem, com água, e extração, a 50ºC com a solução
SDS (dodecilsulfato de sódio): metanol: água (1:50:50), a absorbância foi medida, em
comprimento de onda de 600 nm (espectrofotômetro Shimadzu UV-1601). A
diferença entre os valores obtidos, para o controle e para a maturação, foi
transformada em porcentagem, considerando o valor do controle como 100%, em
cada uma das linhagens.
26
3.3.4. Determinação da matéria seca
Amostras dos vários tratamentos foram congeladas em nitrogênio líquido, e
armazenadas a -80ºC em todos os dias de coleta. Os materiais foram liofilizados por
aproximadamente 18h, em liofilizador (LABCONCO Freezone 4.5.), e a matéria seca
final foi avaliada obtendo-se a pesagem das amostras em utilizando-se balança
analítica (Mettler Toledo AB204).
3.3.5. Determinação da matéria fresca
O crescimento das culturas após 21 dias de cultivo foi avaliado após a
transferência do material, cultivado em placas de 12 poços, para tubos do tipo
eppendorf, seguido de centrifugação por 1 min, a 3000 rpm, para separação do meio
de cultura. As células isoladas foram pesadas utilizando-se balança analítica (Mettler
Toledo AB204) e a matéria fresca determinada.
3.3.6. Curva de crescimento
A curva de crescimento foi realizada utilizando-se a metodologia do volume
celular sedimentado, descrita por Osti et al. (2010), cada 2 dias de cultivo, durante 30
dias de incubação. Para tanto, foram utilizados frascos Erlemeyer (50 mL) adaptados
(Osti et al., 2010) contendo 6 mL de meio de cultura de maturação, e onde foram
inoculados 120 mg de células.
3.3.7. Análises estatísticas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados obtidos foram
submetidos a análise da variância (ANOVA), e quando necessário foi aplicado o teste
de T Student, usando o programa BioEstat 5.0 desenvolvido pelo Instituto Mamirauá.
3.4. Estudo do efeito dos promotores de maturação na produção de NO em
culturas embriogênicas da linhagem BM de A angustifolia
3.4.1. Efeito da concentração dos agentes de maturação no crescimento celular e na
produção endógena de NO
Visando estudar o efeito dependente da concentração dos agentes de
maturação sobre a síntese de endógena e liberação de NO, bem como no
27
crescimento celular, foram utilizadas suspensões celulares mantidas no meio de
cultura BM líquido (item 3.2.). Ao meio de cultura foram adicionados diferentes
concentrações de ABA (0, 50, 100 e 200 µM), PEG (0, 4,5, 9 e 13,5%) e Maltose (0,
4,5, 9 e 13,5%), isoladamente ou em combinação, obtendo-se os seguintes
tratamentos:
1) Controle;
2) ABA 50 µM; 3) ABA 100 µM; 4) ABA 200 µM;
5) PEG 4,5%; 6) PEG 9%; 7) PEG 13,5%;
8) Maltose 4,5%; 9) Maltose 9%; 10) Maltose 13,5%;
11) APM1: ABA 50 µM + 4,5% PEG +4,5% Maltose;
12) APM 2: ABA 100 µM + 9% PEG + 9% Maltose;
13) APM 3: ABA 200 µM + 13,5% PEG + 13,5% Maltose;
14) APM 4: ABA 200 µM + 9% PEG + 9% Maltose.
O pH dos meios de cultura foram ajustados para 5,7, antes da autoclavagem
a 121ºC e 1,5 atm, por 15 min. O ABA foi adicionado ao meio de cultura após a
autoclavagem, por filtroesterelização, em câmara de fluxo laminar.
Para o inicio das culturas, 40 mg de células embriogênicas (item 3.1.2.) foram
transferidas para as placas de cultura contendo 12 poços. Cada um dos poços
recebeu 2 mL dos meios de cultura (tratamentos 1-14), descritos acima. Após 21 dias
de cultivo, foram analisados o conteúdo de NO intra e extracelular, em respectivos
novos meios de cultura, conforme descrito no item 3.3.1.
O crescimento das culturas foi realizado conforme descrito no item 3.3.5.
3.4.2. Efeito do tempo de incubação no crescimento celular e na produção endógena
de NO e ROS durante o período de cultura in vitro.
Foi utilizado o meio de cultura BM líquido, ao qual foram adicionados os
agentes de maturação, constituindo os seguintes tratamentos:
1) Controle – sem adição de promotores de maturação;
2) ABA 200µM;
3) PEG 9%;
4) Maltose 9%;
5) APM = ABA 200µM + PEG 9% + Maltose 9%.
A seleção dessas concentrações dos agentes de maturação basearam-se nas
análises realizadas e descritas no item anterior (Item 3.4.1). O pH dos meios de
cultura foram ajustados para 5,7 antes da autoclavagem a 121ºC, e 1,5 atm por 15
min. O ABA foi adicionado ao meio de cultura após a autoclavagem, por
filtroesterilização, em câmara de fluxo laminar.
28
O crescimento foi avaliado através da realização de uma curva de crescimento
descrita no item 3.3.6.
Para as análises de NO e ROS, as células (700mg) foram cultivadas, em
frascos Erlemeyer, contendo 35ml dos meios de cultura de maturação. Após 21 dias
em cultura, o material foi filtrado e as células (50mg) retidas, em peneira de
dissociação celular (Sigma S-1145, malha 150 m), foram utilizadas para realização
da quantificação conforme descrito no item 3.3.1. As análises de NO e ROS foram
realizadas durante as 2h iniciais de incubação e após 21 dias de cultivo. A
quantificação foi realizada, em respectivos novos meios de cultura, durante um
período de 2 h, com intervalos de 5 min entre cada leitura no fluorômetro.
3.4.3. Efeito do doador, sequestrador e inibidores da síntese de NO sobre o conteúdo
endógeno de NO e ROS
Os tratamentos utilizados foram os mesmos descritos no item 3.4.2. Para as
analises foram incorporados, ao meio de cultura 100µM das seguintes substancias:
um doador de NO, o nitroprussiato de sódio (SNP); um seqüestrador de NO, o 2phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1,1-oxyl-3-oxide (PTIO); e dois inibidores da
G
síntese de NO, o N -nitro-L-arginine methyl ester (L- NAME), inibidor da enzima óxido
nítrico sintase (NOS); e o Tungstato, inibidor da enzima nitrato redutase (NR).
O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,7, antes da autoclavagem, a
121ºC, e 1,5 atm durante 15 min. Todos os compostos foram adicionados ao meio de
cultura após a autoclavagem, por filtroesterilização (membrana de 0,22 m), em
câmara de fluxo laminar.
Os materiais foram cultivados em placas de cultura de 12 poços e após 21
dias de cultivo, foram analisados os conteúdos de NO intra e extracelular e ROS
intracelular conforme metodologia descrita no item 3.3.1.
3.4.4. Efeito do condicionamento do meio de cultura no conteúdo de NO e ROS
Celulas embriogênicas (700mg de células do item 3.2.1.), foram inoculadas
em frascos contendo 35ml de meio de cultura BM (item 3.2.1.), e nos seguintes
tratamentos: 1) Controle: sem a adição de promotores de maturação; 2) APM:
suplementado com ABA (200 µM), PEG (9%) e maltose (9%) (APM).
Após 21 dias de cultivo, as culturas foram filtradas conforme item 3.4.2. Em
placas de cultura foram adicionadas 50mg dessas células e 2 ml de meio de cultura
denominados acondicionado e fresco. Foi estabelecido como sendo o meio
acondicionado, aquele em que as células foram cultivadas, durante o período de 21
29
dias, e como meio fresco, um meio novo de mesma formulação. Foram realizadas
análises de NO intra e extracelular como descrito no item 3.3.1.
3.5. Estudo comparativo, entre duas linhagens (BM e MSG) com diferentes
competências para maturação
O efeito dos agentes de maturação, na evolução morfogenética foi avaliado
pela utilização dos seguintes tratamentos :
Para a linhagem BM:
Tratamento 1- meio BM sem promotores de maturação (controle);
Tratamento 2- meio BM suplementado com PEG, maltose , durante todo o
período em cultura (60 dias) e ABA, após 30 dias de cultura;
Para a linhagem MSG:
Tratamento 3- meio MSG sem promotores de maturação (controle);
Tratamento 4- meio MSG suplementado com PEG, maltose , durante todo o
período em cultura (60 dias) e ABA, após 30 dias de cultura.
Nos tratamentos controle, sem os agentes de maturação (Tratamento 1 e 3),
as repicagens foram realizadas a cada 15 dias, até um período total de 60 dias, e
sempre para o meio de cultura de mesma formulação que o inicial (descrito no item
3.2.1). Para os tratamentos contendo os agentes promotores de maturação
(Tratamento 2 e 4), durante os primeiros 30 dias, as células foram incubadas em
meio de maturação (meio cultura descrito no item 3.2.1.) suplementado com PEG
4000 (7%) e maltose (9%). Nos últimos 30 dias de maturação além de PEG e
maltose, foi adicionado ao meio de cultura o ABA (120µM).
As soluções de ABA e glutamina foram filtroesterilizadas e adicionadas aos
meios de cultura após a autoclavagem.
A cada 15 dias de cultivo, nos diferentes tratamentos, as suspensões
celulares foram filtradas em uma peneira de dissociação celular (Sigma S-1145,
malha 150 m). Parte das células retidas na filtragem foi utilizada para as análises
bioquímicas e morfológicas. A outra parte das células retidas (1g) foi utilizada para
dar continuidade ao ciclo seguinte, em frascos contendo 100ml de meio de cultura
dos respectivos tratamentos. Após a inoculação, as suspensões celulares foram
mantidas em agitador horizontal orbital (60 rpm), à temperatura de 25±1ºC, no
escuro.
30
As analises realizadas a cada 15 dias foram: quantificação e visualização de
NO e ROS (item 3.3.1), avaliação morfológica (item 3.3.2), morte celular (item 3.3.3) e
matéria seca (item 3.3.4). A Figura 3 apresenta um resumo das avaliações realizadas
com as duas linhagens, nos diferentes tratamentos.
Células
Avaliações a cada 15 dias
Quantificação
NO
Quantificação
ROS
Visualização
NO
Visualização
ROS
Aspectos
Morfológicos
Morte
Celular
Peso
Seco
Figura 3: Avaliações realizadas, nas células das suspensões celulares das linhagens BM e MSG,
nos diferentes tratamentos e analisadas a cada 15 dias de cultivo.
31
4. RESULTADOS
4.1. Estudo do efeito dos promotores de maturação no crescimento e na
produção de NO e ROS em culturas embriogênicas da linhagem BM de A
angustifolia
4.1.1. Efeito concentração dependente dos promotores de maturação no crescimento
e no conteúdo de NO e ROS
A análise do crescimento após 21 dias de cultivo em diferentes concentrações
de ABA, PEG e maltose, demonstrou que ocorre um menor crescimento das culturas
embriogênicas mantidas nos tratamentos com agentes de maturação, quando
comparado ao controle, independentemente do tratamento utilizado (Fig. 4).
Verificou-se que o decréscimo no crescimento das culturas foi dose-dependente,
ocorrendo uma redução do crescimento com o aumento da concentração do agente
de maturação incorporado ao meio de cultura. Os menores valores para crescimento
foram observados nas culturas embriogênicas mantidas no meio contendo a
combinação de todos os agentes promotores de maturação (APM), e no tratamento
Crescimento
(% relativa)
Crescimento
(% relativa
ao controle)
com 13,5% de maltose (Fig. 4).
60
a
50
a
ab
40
ab
ab
bc
bc
bcd
30
cd
20
d
d
d
d
10
0
50 100µM
100 200µM
200
4,5
9 13,5%
13,5
50µM
4,5% 9%
ABAABA
(µM)
PEG
(%)
PEG
4,5 9%
9
4,5%
13,5
13,5%
Maltose
Maltose(%)
11
22
3
4
APM
APM
Figura 4: Crescimento (% em relação ao controle) das suspensões celulares
embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle e suplementados
com diferentes concentrações de ABA, PEG e maltose. (APM 1: 50µM ABA + 4,5%
PEG + 4,5% Maltose; APM 2: 100µM ABA + 9%PEG + 9%Maltose; APM3: 150µM
ABA + 13,5%PEG + 13,5%Maltose; APM 4: 200µM ABA + 9%PEG + 9%Maltose).
Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de
acordo com o Teste T (n=3).
Após 21 dias de incubação, verificou-se que o conteúdo intracelular de NO do
tratamento controle não diferiu dos tratamentos contendo ABA, independentemente
da concentração utilizada, similar ao verificado também para o tratamento PEG 4,5%.
Nos demais tratamentos de maturação foram quantificadas concentrações menores
32
de NO intracelular comparado-se ao controle (Fig. 5A). Os tratamentos contendo a
combinação dos três agentes de maturação (tratamento APM), apresentaram as
menores concentrações de NO intracelular em relação aos demais tratamentos
realizados. De uma forma geral, observou-se um decréscimo no conteúdo intracelular
de NO, com o aumento na concentração dos agentes de maturação utilizados (Fig.
5A).
Em relação ao conteúdo de NO extracelular liberado, verificou-se que a
adição do PEG resultou nos menores valores, enquanto os tratamentos APM 2 (100
µM ABA + 9% PEG + 9% Maltose), Maltose 13,5% e ABA 50 M apresentaram as
maiores concentrações de NO extracelular (Fig. 5B).
1
NO intracelular
a
ab
Conteúdo de NO (105 UA)
A
ab
bc
bc
cd
cd
cde
de
de
de
e
e
e
3
4
0.5
0
50 100 200
Controle
4,5
ABA (µM)
13,5
4,5
9
13,5
1
2
Maltose (%)
APM
NO extracelular
2.5
Conteúdo de NO (105 UA)
9
PEG (%)
B
2
bc
abc
a
abc
bcd
bc
bcde
cde
cde
def
1.5
g
g
efg
fg
1
0.5
0
50 100 200
Controle
ABA (µM)
4,5
9
13,5
PEG (%)
4,5
9
13,5
Maltose (%)
1
2
3
4
APM
Figura 5: Conteúdo de NO intracelular (A) e extracelular (B) nas suspensões
celulares embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle e
suplementados com diferentes concentrações de ABA, PEG e maltose. (APM 1:
50µM ABA + 4,5% PEG + 4,5% Maltose; APM 2: 100µM ABA + 9%PEG +
9%Maltose; APM3: 150µM ABA + 13,5%PEG + 13,5%Maltose; APM 4: 200µM ABA
+ 9%PEG + 9%Maltose). Médias seguidas por letras iguais não diferem
estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3). : tratamento
controle; : tratamentos de maturação. (UA= unidades de absorbância).
33
4.1.2. Efeito da adição dos agentes promotores de maturação, em diferentes
períodos de cultura, na produção endógena de NO e ROS
A aplicação dos promotores de maturação, no início da incubação, promove
um aumento na quantidade de NO em todos os tratamentos, durante 2h de análise. A
maior produção endógena de NO, ocorreu para o tratamento contendo maltose (Fig.
6A). A menor quantidade foi identificada no tratamento APM, onde foram adicionados
todos os promotores de maturação (Fig. 6A).
Por outro lado, após 21 dias de incubação verificou-se uma alteração no
padrão de síntese de NO pelos promotores de maturação comparado à análise com 2
h. Foi verificada uma redução dos níves intracelulares de NO (Fig. 6B), em todos os
tratamentos, e com os menores valores no tratamento APM.
Para o tratamento APM observou-se uma redução nos níveis endógenos de
NO, em relação ao controle, já nas duas primeiras horas de incubação (Fig. 6A),
enquanto para a maltose, o processo se inicia com a promoção síntese de NO
durante as duas primeiras horas (Fig. 6A), seguido de uma redução após 21 dias de
incubação (Fig. 6B).
NO 0 dias
Conteúdo
de NO (10 5 UA)
Conteúdo relativo de NO
1.1
A
A
1
a
0.9
b
bc
cd
d
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0h
30min
1h30min
2h
BB
NO 21 dias
1.6
Conteúdo
de NO (10 5 UA)
Conteúdo relativo de NO
1h
a
1.4
1.2
1
0.8
0.6
b
b
c
0.4
0.2
d
0
0h
30min
1h
1h30min
2h
Figura 6: Conteúdo de NO intracelular após 2 horas (A) e 21 dias (B) de incubação
das suspensões celulares embriogênicas nos tratamentos controle, ABA (200 uM),
PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose). Médias
seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo
34
com o Teste T (n=3). (
Controle/
APM) (UA= unidades de absorbância).
ABA/
PEG/
maltose/
A produção de ROS foi crescente nas suspensões celulares, durante as duas
horas após a aplicação dos promotores de maturação, em todos os tratamentos (Fig.
7A). As menores concentrações de ROS foram observadas nos tratamentos
suplementados com PEG, e com a combinação de todos os promotores (APM). Os
maiores conteúdos de ROS foram obtidos para as culturas controle, incubadas sem a
adição dos agentes de maturação (Fig. 7A).
Após 21 dias de incubação, ocorreu uma diferença acentuada no conteúdo de
ROS entre o controle e os demais tratamentos (Fig. 7B). As culturas mantidas no
controle, ou seja, sem a adição de promotores de maturação, apresentaram um
conteúdo crescente e alto de ROS, seguido pelo tratamento com ABA. Os demais
tratamentos apresentaram concentrações de ROS baixas e constantes.
5 UA)
Conteúdo
de NOde
(10ROS
Conteúdo relativo
30
A
A
ROS 0 dias
a
b
b
25
20
c
15
d
10
5
0
0h
30m in
1h30min
2h
B
B
ROS 21 dias
16
5
Conteúdo
de NOde(10
Conteúdo relativo
ROSUA)
1h
a
14
12
10
b
8
6
4
c
c
c
2
0
0h
30m in
1h
1h30min
2h
Figura 7: Conteúdo intracelular de ROS após 2 horas (A) e 21 dias (B) de incubação
das suspensões celulares embriogênicas nos tratamentos controle, ABA (200 uM),
PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose). Médias
seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo
com o Teste T (n=3). (
Controle/
ABA/
PEG/
maltose/
APM) (UA= unidades de absorbância).
35
O crescimento celular, avaliado ao longo de 30 dias em cultura, demonstrou
um maior incremento para o tratamento controle e um menor crescimento no
tratamento APM, contendo a combinação dos três agentes de maturação (Fig. 8).
Verificou-se que a adição dos agentes de maturação, especialmente o ABA e a
Maltose, não estimulam o crescimento das suspensões celulares. Embora o PEG
tenha promovido um pequeno crescimento, a partir do 8
O
dia, este foi inferior ao
observado para o tratamento controle.
1,4
Matéria
fresca(g)
Peso fresco
(g)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Dias
cultivo
Tempo
de de
cultivo
(dias)
Figura 8: Crescimento das suspensões celulares embriogênicas nos tratamentos controle, ABA
(200 uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose). Médias
seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T
(n=3). (
Controle/
ABA/
PEG/
maltose/
APM).
4.1.3. Efeito do doador, sequestrador e inibidores da síntese de NO sobre o conteúdo
endógeno de NO e ROS em suspensões celulares cultivadas nos tratamentos com
promotores de maturação.
A adição de SNP, ao meio de cultura, estimulou o aumento de NO intracelular,
nos tratamentos suplementados com ABA e maltose (Fig. 9A). O mesmo ocorrendo
com adição do PTIO no tratamento com ABA.
Não foram verificadas alterações no conteúdo de NO intracelular ao utilizar-se
o inibidor L-NAME (Fig. 9C). A adição de tungstato ao meio de cultura, nos
tratamentos contendo ABA e PEG, promeveu um aumento no conteúdo de NO
intracelular nessas culturas (Fig. 9D).
36
a
Conteúdo de NO (10 5 UA)
100000
1
A
SNP
a
a
ab
75000
0,5
50000
bc
c
c
25000
c
c
c
0
Controle
Controle
ABA
ABA
Maltose
Maltose
APM
APM
B
PTIO
100000
1
Conteúdo de NO (10 5 UA)
PEG
PEG
a
ab
75000
abc
50000
0,5
bcd
abcd
abc
bcd
cd
25000
cd
d
0
Controle
Controle
ABA
ABA
PEG
PEG
Maltose
Maltose
APM
APM
C
Conteúdo de NO (10 5 UA)
1000001
L-name
a
75000
ab
0,5
50000
bc
bc
c
c
0
Controle
Controle
ABA
ABA
PEG
PEG
Maltose
Maltose
APM
APM
D
Tungstato
1000001
Conteúdo de NO (10 5 UA)
bc
c
c
25000
ab
a
a
75000
ab
bc
0,5
50000
c
c
cd
c
c
25000
d
0
Controle
Controle
ABA
ABA
PEG
PEG
Maltose
Maltose
APM
APM
Figura 9: Conteúdo de NO intracelular das suspensões celulares
embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle, ABA (200
uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9%
Maltose) suplementados com doador, sequestrador e inibidor da síntese de
NO. : sem adição dos reagentes de NO. : com adição de SNP (A); PTIO
(B); L-name (C) e Tungstato (D). Médias seguidas por letras iguais não
diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3).
(UA= unidades de absorbância).
37
Similarmente ao observado para o conteúdo de NO intracelular, observou-se
um aumento do conteúdo de NO extracelular nos tratamentos ABA e maltose quando
adicionado ao meio de cultura o SNP (Fig. 10A). O seqüestrador de NO, PTIO,
também promoveu um aumento no conteudo NO extracelular no tratamento ABA,
porém causou redução no tratamento APM (ABA, PEG e maltose) (Fig. 10B). Por
outro lado, a adição do inibidor L-NAME, não provocou mudança na liberação de NO
em nenhum dos tratamentos (Fig. 10C). A adição tungstato aumentou o NO liberado
nos tratamentos ABA e PEG, enquanto no tratamento APM foi observado uma
redução (Fig. 10D).
Culturas suplementadas com SNP, PTIO e inibidores, L-NAME e tungstato,
apresentam uma redução no conteúdo de ROS. Ao adicionar-se SNP e PTIO,
verifica-se uma diminuição nos níveis de ROS, nos tratamentos suplementados com
ABA e maltose (Fig. 11A e 11B). Verificou-se redução no conteúdo de ROS nos
tratamentos PEG e maltose quando suplementados com L-NAME (Fig. 11C). Nos
tratamentos com tungstato, apenas o tratamento APM não apresentou redução no
conteúdo de ROS (Fig. 11D).
4.1.4. Efeito do condicionamento do meio de cultura no conteúdo de NO e ROS em
suspensões celulares
Na análise dos meios de cultura condicionados, não houve diferença na
produção de NO entre o controle e o tratamento APM. A produção de ROS, no
tratamento APM foi menor que o controle, tanto no meio condicionado (21 dias),
quanto no meio novo (Fig. 12C).
A transferência das células para o novo meio de cultura, no tratamento
controle (Figura 12), aumentou o conteúdo intra (Fig. 12A) e extracelular (Fig. 12B) de
NO, e reduziu o conteúdo de ROS (Fig. 12C). No tratamento APM, não houve
diferença em relação aos conteúdos de NO e ROS, quando da transferência para um
novo meio de cultura.
Conteúdo de NO (10 5 UA)
38
a
6000006
A
SNP
a
a
4000004
b
2000002
0
c
c
Conteúdo de NO (10 5 UA)
Controle
c
c
ABA
c
PEG
c
Maltose
B
PTIO
6
600000
APM
a
400000
4
b
b
200000
2
0
c
c
Controle
c
c
ABA
c
PEG
c
c
Maltose
APM
Conteúdo de NO (10 5 UA)
C
6
600000
a
L-name
a
4
400000
200000
2
b
0
b
b
Controle
b
b
ABA
b
b
PEG
b
Maltose
APM
Conteúdo de NO (10 5 UA)
D
Tungstato
600000
6
a
a
400000
4
b
b
200000
2
bc
c
0
c
Controle
c
ABA
c
PEG
c
Maltose
APM
Figura 10: Conteúdo de NO extracelular das suspensões celulares
embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle, ABA
(200 uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG +
9% Maltose) suplementados com doador, sequestrador e inibidor da
síntese de NO. : sem adição dos reagentes de NO. : com adição de
SNP (A); PTIO (B); L-name (C) e Tungstato (D). Médias seguidas por
letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo
com o Teste T (n=3). (UA= unidades de absorbância).
Conteúdo de ROS (10 5 UA)
39
2500000
A
SNP
3000000
30
a
a
a
a
a
2000000
20
a
1500000
1000000
10
500000
PEG
Maltose
APM
B
PTIO
30
3000000
2500000
ABA
b
b
0
Controle
Conteúdo de ROS (10 5 UA)
b
b
a
a
ab
ab ab
20
2000000
ab
1500000
bc
10
1000000
bc
500000
c
0
Conteúdo de ROS (10 5 UA)
Controle
3000000
30
2500000
ABA
PEG
a
C
ab
ab
2000000
20
abc
1500000
1000000
10
bc
c
500000
c c
0
Conteúdo de ROS (10 5 UA)
Controle
ABA
PEG
Maltose
APM
D
Tungstato
3000000
30
2500000
APM
L-name
a
a
Maltose
c
a
a
a
a
2000000
20
1500000
1000000
10
500000
b
b
b
b
b
0
Controle
ABA
PEG
Maltose
b
APM
Figura 11: Conteúdo de ROS das suspensões celulares embriogênicas,
após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle, ABA (200 uM), PEG
(9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose)
suplementados com doador, sequestrador e inibidor da síntese de NO.
: sem adição dos reagentes de NO. : com adição de SNP (A); PTIO
(B); L-name (C) e Tungstato (D). Médias seguidas por letras iguais não
diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T
(n=3). (UA= unidades de absorbância).
40
6000006
A
Conteúdo de NO (10 5 UA)
a
500000
4000004
300000
2000002
100000
b
b
bb
0
Controle
APM
6000006
Conteúdo de NO (10 5 UA)
B
500000
4000004
a
300000
2000002
100000
b
bb
b
0
Controle
a
C
Conteúdo de ROS (10 5 UA)
30000006
APM
2500000
20000004
b
1500000
10000002
500000
c
c
0
Controle
APM
Figura 12: Conteúdo de NO interno (A), externo (B) e ROS (C) das suspensões
celulares embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle e APM
(200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose) transferidos ou não para um novo meio de
cultura. : meio de cultura novo. : meio cultivado por 21 dias. Médias seguidas por
letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T
(n=3). (UA= unidades de absorbância).
41
4.2. Estudo comparativo, entre duas linhagens (BM e MSG) com diferentes
competências para maturação
4.2.1. Aspectos morfológicos das suspensões celulares
As culturas das duas linhagens, MSG e BM, a partir do 15º dia de maturação,
apresentaram diferenças quanto à coloração. A linhagem BM (Fig. 13A), inicialmente
marrom escura, intensificou essa coloração, nos demais dias de cultivo, enquanto, a
linhagem MSG permaneceu com a coloração amarelada (Fig. 13B), durante todo o
período de cultura.
A
B
Figura 13: Aspecto das linhagens de suspensões celulares BM (A) e MSG (B) de A.
angustifolia, após 15 dias de incubação, no tratamento de maturação. Linhagem BM =
sem competência para maturação; Linhagem MSG = com competência para
maturação.
Observa-se, morfológicamente diferenças entre as duas linhagens quanto à
organização e ao padrão de diferenciação das células (Fig. 14). Células da linhagem
BM apresentaram-se mais compactas, pequenas e não-agrupadas (Figs. 14A e 14B)
enquanto a linhagem MSG, por sua vez, apresentou células translúcidas,
mucilaginosas e agrupadas, formando pequenos aglomerados de células (Figs. 14C
e 14D).
Adicionalmente, diferenças na morfologia foram observadas também nos
diferentes tratamentos de uma mesma linhagem. As culturas embriogênicas da
42
linhagem BM mantidas controle apresentaram-se com coloração amarela (Fig. 14A)
enquanto, culturas submetidas aos tratamentos de maturação, apresentaram
coloração marrom (Fig. 14B). A linhagem MSG mantida no controle, por sua vez,
apresentou culturas embriogênicas com uma coloração branca (Fig. 14C), e quando a
cultura foi submetida à maturação, apresentou coloração amarelada, com células
agrupadas em aglomerados densos (Fig. 14D).
Figura 14: Aspecto morfológico das células das linhagens BM e
MSG, após 60 dias em cultura. (A) Linhagem BM, controle (B)
Linhagem BM em meio de maturação; (C) Linhagem MSG, controle;
(D) Linhagem MSG em meio de maturação (Barra= 3mm).
4.2.2. Análises morfológicas das culturas embriogênicas
As células da linhagem BM, no tratamento controle, apresentaram massas de
pró-embriões, corados em vermelho, em grande quantidade, sem aparente
polarização. As células do suspensor, coradas em azul, localizaram-se ao redor da
massa de pró-embriões (Fig. 15). Esse tipo de organização estrutural foi mantido
durante as várias repicagens. Nesse material, puderam ser evidenciadas, células
tipicamente na primeira divisão assimétrica, características da formação do próembrião (Fig. 15F – ponta de seta) e do suspensor (Fig. 15F – seta).
43
Figura 15: Aspecto das culturas embriogênicas da linhagem BM mantidas no controle, em
diferentes períodos de cultivo (A) 0 dias; (B) 15 dias; (C) 30 dias; (D) 45 dias; (E) 60 dias;
(F) detalhe da primeira divisão assimétrica na formação do pro-embrião (ponta de seta), e
do suspensor (seta).
Nas culturas mantidas no tratamento controle, da linhagem MSG, também
foram observadas massas de pró-embriões, e uma grande quantidade de células do
suspensor (Fig. 16). Entretanto, a organização dessas células difere daquele
observado na linhagem BM. Neste caso, as células apresentam pró-embriões
caracteristicamente bipolares, com as células do suspensor acoplados na base da
massa pró-embriogênica (Fig. 16). Esta estrutura também é mantida, durante todo o
período de cultivo.
A linhagem BM, quando cultivada na presença dos promotores de maturação,
apresentou células desagregadas, e de menor tamanho, em relação ao controle. Não
foram identificadas as estruturas pró-embrionárias bipolares características. O padrão
de coloração verificado foi diferente daquele normalmente observado ao utilizar os
corantes azul de Evans e carmin acético. Neste caso, observou-se uma coloração
marrom, em todo o material, inclusive nas porções que normalmente teriam sido
coradas em vermelho devido a afinidade com o carmim acético (Fig. 17).
44
Figura 16: Aspecto das culturas embriogênicas da linhagem MSG, controle, em diferentes
períodos de cultivo (A) 0 dias; (B) 15dias; (C) 30 dias; (D) 45 dias; (E) 60dias.
Figura 17: Aspecto das culturas embriogênicas da linhagem BM cultivadas em meio de
maturação, durante diferentes períodos de cultivo (A) 0 dias; (B) 15 dias; (C) 30 dias; (D) 45
dias; (E) 60 dias.
45
As culturas embriogênicas, mantidas no meio MSG, suplementadas com
promotores de maturação, apresentaram estruturas definidas e características de próembriões nos estádios iniciais de desenvolvimento (Fig. 18). Em vermelho foram
evidenciadas as células das massas pró-embrionárias, e em azul as células dos
suspensores. Esse tipo de organização pode ser observado nos materiais cultivados
durante 45 dias. Após esse período, não é mais possível a identificação desse
padrão. Culturas com 60 dias apresentam células isoladas, de menor tamanho, e de
coloração azul de menor intensidade. Após 30 dias em cultura, foram identificadas
estruturas bipolares (Fig. 18F), caracterizadas como embriões somáticos em estádios
iniciais de maturação.
Figura 18: Aspecto das células da linhagem MSG cultivadas em meio de maturação, em
diferentes períodos de cultivo (A) 0 dias; (B) 15 dias; (C) 30 dias; (D) 45dias; (E) 60 dias; (F)
pró-embrião bipolarizado após 30 dias de cultura(seta).
4.2.3. Determinação da morte celular
A incubação de culturas embriogênicas da linhagem BM em meio de cultura
suplementado com promotores de maturação (PEG, maltose e ABA), provocou um
incremento da morte celular, a partir de 15 dias de cultivo. Essa resposta foi
intensificada com o decorrer do tempo de cultivo (Fig. 19). Após 60 dias de cultivo, a
morte celular nessas culturas superou em 200%, quando comparada com o controle
46
(Fig.19 A). Para a linhagem MSG observou-se uma menor diferença, cerca de 20%
de morte celular, ao comparar o os tratamentos controle e maturação (Fig. 19B).
A
250
(% relativarelativa
ao controle)
Porcentagem
(%)
Morte celular
a
BM
200
150
b
100
b
b
50
0
15
30
45
60
Dias
de cultivo
Tempo
de cultivo
(dias)
(% relativa
controle)
Morte
celular ao
(%
relativa)
Porcentagem
relativa
(%)
Morte celular
20
a
B
MSG
10
ab
0
15
30
-10
45
60
ab
-20
b
TempoDias
de cultivo
(dias)
de cultivo
Figura 19: Morte celular (porcentagem em relação ao controle) das suspensões celulares
embriogênicas das linhagens BM (A) e MSG (B), durante 60 dias de cultivo, em meio de
maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01)
de acordo com o Teste T (n=3).
4.2.4. Determinação da matéria seca
A figura 20 apresenta o crescimento em materia seca das duas linhagens, BM
e
MSG,
nos
tratamentos
controle
e
de
maturação.
Verifica-se
que,
independentemente da linhagem utilizada, culturas submetidas à maturação
apresentam, ao longo de todo o período de cultura, valores de matéria seca sempre
inferior em relação ao controle. A avaliação entre as duas linhagens não revelou
diferenças significativas.
47
Matéria seca (mg/gMF)
BM peso seco
BM
300
ab
A
a
ab
250
b
200
150
100
cd
c
maturação
c
cd
d
50
controle
0
0
15
30
Tempo de cultivo (dias)
45
60
Matéria seca (mg/gMF)
MSG peso seco
MSG
300
a
250
ab
200
150
B
a
b
c
c
100
maturação
cd
cd
d
50
controle
0
0
15
30
Tempo de cultivo (dias)
45
60
Figura 20: Crescimento em materia seca (mg/g MF) das suspensões celulares embriogênicas das
linhagens BM (A) e MSG (B) durante 60 dias de cultivo em meio de cultura controle e de
maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de
acordo com o Teste T (n=3) (
: controle) (
: maturação).
4.2.5. Quantificação de NO e ROS
As linhagens BM e MSG mantidas nos tratamentos controle apresentaram um
padrão similar de liberação de NO durante todo período de cultivo. Ao serem
adicionados os três promotores de maturação (ABA, PEG e maltose), observou-se
um aumento na liberação de NO, quando comparadas com os tratamentos controle
nas duas linhagens. Verificou-se uma maior liberação de NO na linhagem MSG,
mantida em condições de maturação. Neste material, a maior quantidade de NO
ocorreu após 15 dias de incubação, em meio de maturação (Fig. 21B).
48
Conteúdo de NO (10 5 UA)
NO externo _ BM
BM
A
5
4
3
2
1
a
a
b
b
bc
0
0
b
b
15
30
Dias dede
cultivo
Tempo
cultivo (dias)
c
45
maturação
c controle
60
Conteúdo de NO (10 5 UA)
NO externo _ MSG
MSG
5
a
B
4
b
3
bc
c
maturação
2
1
d
d
0
15
d
d
d
30
45
60
controle
0
Tempo
cultivo (dias)
Dias
de de
cultivo
Figura 21: Conteúdo de NO extracelular em suspensões celulares embriogênicas das
linhagens BM (A) e MSG (B) durante 60 dias de cultivo em meio de cultura controle e de
maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01)
de acordo com o Teste T (n=3) (UA= unidades de absorbância) (
: controle) (
:
maturação).
Verificou-se que os tratamentos controle, sem adição de promotores de
maturação, apresentaram níveis maiores de NO intracelular, quando comparado com
os tratamentos submetidos à maturação. A maior produção de NO ocorre após 15
dias, no tratamento controle da linhagem MSG (Fig. 22). Os menores valores são
observados para as linhagens BM, mantidas no tratamento maturação.
A incorporação do ABA ao meio de cultura a partir de 30 dias de incubação,
não alterou significativamente o conteúdo de NO intracelular, ao analisar os
diferentes tratamentos de maturação, nas duas linhagens estudadas (Fig. 22).
49
Conteúdo de NO (10 5 UA)
NO interno _ BM
BM
1.5
A
a
1
ab
ab
b
ab
b controle
0.5
c
c
c
c
maturação
0
0
15
30
Dias de cultivo
Tempo de cultivo (dias)
45
60
Conteúdo de NO (10 5 UA)
NO interno _ MSG
MSG
1.5
B
a
1
ab
abc
ab
ab
controle
abc maturação
bc
bc
c
0.5
0
0
15
30
45
60
Tempo de cultivo (dias)
Figura 22: Conteúdo de NO intracelular em suspensões celulares embriogênicas das
linhagens BM (A) e MSG (B) durante 60 dias de cultivo em meio de cultura controle e de
maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01)
de acordo com o Teste T (n=3) (UA= unidades de absorbância) (
: controle;
:
maturação).
Em relação às espécies reativas de oxigênio (ROS), verificou-se que os
tratamentos controle das linhagens BM e MSG apresentaram maiores níveis de ROS
que os suplementados com os promotores de maturação (Fig. 23) durante todo o
período de cultura.
50
Conteúdo de ROS (10 5 UA)
ROS _ BM
BM
3.5
A
a
ab
3
ab
ab
b
2.5
controle
2
1.5
c
1
0.5
d
0
0
15
30
d
45
d maturação
60
Dias
de cultivo
Tempo
de cultivo (dias)
Conteúdo de ROS (10 5 UA)
ROS _ MSG
MSG
B
3.5
3
a
a
2.5
ab
ab
controle
ab
2
1.5
bc
bcd
maturação
1
cd
0.5
d
d
15
30
0
0
45
60
Dias
de cultivo
Tempo
de cultivo (dias)
Figura 23: Conteúdo de ROS nas suspensões celulares embriogênicas das linhagens BM (A) e
MSG (B) durante 60 dias de cultivo em meios de cultura controle e de maturação. Médias
seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o
Teste T (n=3) (UA= unidades de absorbância) (
: controle) (
: maturação).
4.2.6. Visualização intracelular de NO e ROS
Através de análises por microscopia de fluorescência, verificou-se que a
produção de NO e ROS ocorre em maior intensidade nas células embriogênicas
(Figura 24), independentemente da linhagem e do tratamento utilizado. A figura 24,
realizada com observações em campo claro e em fluorescência, demonstra que não
houve produção de NO e ROS nas células do suspensor.
Verificou-se também que nos tratamentos suplementados com promotores de
maturação ocorre uma redução na fluorescência, em relação aos tratamentos
controle, para ambas as linhagens (Fig. 24). Esse resultado corrobora as avaliações
dos resultados de quantificação referentes ao conteúdo relativo de NO e ROS (Fig.
22 e 23) (item 4.2.5.).
51
Fluorescência
Campo Claro
ROS
NO
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Controle
BM
Maturação
Controle
MSG
Maturação
Figura 24: Visualização intracelular de ROS e NO das suspensões celulares embriogênicas
das linhagens BM e MSG cultivadas em meios de cultura controle (BM: A,B,C) (MSG: G,H,I) e
de maturação (BM: D,E,F) (MSG: J,K,L) (barra = 200µM).
52
5. DISCUSSÃO
5.1. Maturação das culturas embriogênicas
Durante o processo de embriogênese somática são definidas as fases de
indução, proliferação, maturação e germinação dos embriões somáticos (Warren,
1993). A maturação é uma fase crítica e limitante, para várias espécies arbóreas, o
que resulta em uma baixa taxa de conversão de embriões em plantas (Capuana &
Debergh, 1997; Stasolla & Yeung, 2003).
A remoção de auxinas e citocininas, usadas em meios de manutenção e
multiplicação, e a adição de ABA e agentes osmóticos (PEG e maltose), promovem
um aumento da osmolaridade do meio de cultura, resultando na produção de
embriões em estádios avançados de desenvolvimento, para várias espécies de
coníferas (Gupta & Pullman, 1991; Shoji et al., 2006). Essa estratégia tem se
mostrado bastante eficiente, nos diferentes sistemas vegetais, para a maturação dos
pró-embriões somáticos presentes nas culturas celulares.
Dependendo
do
sistema
vegetal
estudado,
observam-se
diferentes
necessidades de combinações dos vários agentes de maturação. Em P. taeda, o
meio de maturação, contendo PEG (6%), maltose (4%) e ABA (150 µM), foi o mais
eficiente para induzir a formação de embriões somáticos cotiledonares (Li et al.,
1998). Por outro lado, para de P. brutia a melhor combinação para a maturação
observada foi de 80 µM de ABA, com 6% de maltose e 3,75% de PEG, em culturas
de embriões somáticos mantidos em meio semi-sólido (Yildirim et al., 2006). Para A.
angustifolia,em estudos preliminares, foi demonstrado que o tratamento de
maturação, promovido pela adição de PEG (7%) e de maltose (9%) ao meio de
cultura, com ou sem adição de ABA (60 µM), promoveu a maturação de embriões
somáticos (dos Santos et al., 2002).
No presente trabalho a combinação de ABA (120µM), PEG (7%) e maltose
(9%), mostrou ser o tratamento mais eficiente para a maturação dos embriões
somáticos da linhagem MSG, de A. angustifolia. Observou-se que os pró-embriões
atingiram estádios avançados do desenvolvimento embrionário, evidenciado pela
formação das estruturas bipolares (Fig. 18). Contudo, não se observou a presença de
embrião maduro, ou seja, embrião no estádio cotiledonar. Provavelmente esse fato
esteja relacionado com a utilização de um meio de cultura líquido para a maturação.
Diversos estudos ressaltam que, a grande maioria das espécies de coníferas,
apresentam a maturação de pró-embriões e a evolução dos embriões somáticos para
53
maduros, em meio semi-sólido. Alguns autores sugerem que em meio semi-sólido, as
altas concentrações de agentes geleificantes estimulam a formação de embriões
somáticos, como observado para P. strobus (Klimaszewska & Smith, 1997;
Klimaszewska et al., 2000). Essa situação foi considerada como semelhante ao efeito
osmótico não plasmolizante do PEG (Yildirim et al., 2006) pela redução da
disponibilidade de água. No presente trabalho, embora não tenha sido utilizado o
meio semi-sólido para a maturação, mas sim o meio de cultura líquido por propiciar
uma melhor metodologia para os estudos de visualização e quantificação de NO,
pode-se visualizar que as culturas quando incubadas com os promotores de
maturação apresentaram vários aspectos similares aos observados para as culturas
embriogênicas mantidas no meio de maturação semi-sólido.
Verificou-se no presente trabalho que a adição de agentes promotores da
maturação (ABA, PEG e maltose) promoveu uma redução no crescimento celular, em
matéria
seca,
nas
duas
linhagens utilizadas
de
A.
angustifolia
(Fig.
8).
Adicionalmente, verificou-se uma redução no crescimento com o aumento na
concentração dos promotores de maturação ABA, PEG e maltose incorporados ao
meio de cultura (Fig.4). Conforme verificado em diferentes materiais, a redução no
crescimento e no conteúdo de água das culturas embriogênicas é uma característica
desejável para a obtenção de maturação dos embriões somáticos (Attree & Fowke,
1993; von Arnold et al., 2002). Durante a etapa de maturação observa-se uma
redução na atividade de divisão celular, e uma consequente evolução na
diferenciação do embrião, onde diferentes tipos de agentes promotores de maturação
atuam de forma individualizada (Attree & Fowke, 1993).
Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que, os agentes osmóticos, PEG
e maltose, diminuem a produção intracelular de ROS e NO, nas culturas
embriogênicas da linhagem MSG, ao mesmo tempo em que promovem a sua
maturação (Fig. 5-7 e 21-24). Essas observações levam a hipótese de que uma
redução na produção dessas substâncias (NO e ROS), associado à redução do
crescimento celular, seja fundamental para ocorrer o processo de maturação das
culturas embriogênicas em A. angustifolia. Essa hipótese está de acordo com
resultados observados por Silveira et al. (2006), que verificaram a redução nos níveis
de NO na presença das PAs Spd e Spm, as quais promoveram uma evolução das
culturas embriogênicas de A. angustifolia. Adicionalmente, Osti et al. (2010) também
mostraram que a adição de NO resulta num aumento do conteúdo endógeno de NO,
o qual está associado ao crescimento celular sem evolução morfogenética das
culturas embriogênicas de A. angustifolia em suspensão celular.
54
Verificou-se ainda neste trabalho, que a adição dos agentes promotores de
maturação resultou na evolução morfogenética das culturas embriogênicas somente
na linhagem MSG, a qual apresentou o desenvolvimento de embriões em estágios
avançados de maturação (Fig. 18). Entretanto, esta resposta na evolução
morfogenética não foi observada para a linhagem BM (Fig. 17), embora tenha sido
verificada resposta similar com relação ao crescimento celular e conteúdo endógeno
de NO e ROS entre as duas linhagens utilizadas. Estes resultados sugerem que,
embora os agentes promotores de maturação sinalizem resposta similar em relação
ao conteúdo de NO e ROS para as duas linhagens quando submetidas a maturação,
somente a que possui competência para a evolução é que efetivamente resultará na
evolução morfológica adequada. Estudos com diferentes sistemas experimentais
demonstram um aumento na qualidade e quantidade de embriões somáticos quando
o meio de cultura utilizado na maturação contém promotores de maturação, como
ABA, PEG e maltose (Attree & Fowke, 1993; Capuana & Debergh, 1997;
Klimaszewska & Smith, 1997; Guerra et al., 2000, Filonova et al., 2000). É importante
salientar aqui também, um possível efeito dos componentes dos meios de cultura
utilizados neste trabalho, comparando-se os meios BM e MSG possibilitando assim,
esta diferença na evolução morfológica das culturas embriogênicas em A.
angustifolia.
Os resultados iniciais obtidos neste trabalho são inéditos e fundamentais para
o entendimento do processo de sinalização celular durante a maturação das culturas
embriogênicas nesta espécie.
5.2. Pomotores de maturação e produção de NO e ROS
5.2.1. PEG
A adição de PEG nos meios de cultura tem como objetivo a indução de um
estresse osmótico simulando o estresse hídrico observado em embriões zigóticos,
sujeitos a condições de desidratação (von Arnold et al., 2002). Salienta-se que a
parede celular não é permeável às moléculas maiores de PEG, e desta maneira, a
célula sofre plasmólise sem que ocorra entrada do composto. Essa situação leva a
uma redução na pressão de turgor e a redução do potencial osmótico intracelular
(von Arnold et al., 2002). Em P. pinaster a adição de PEG reduziu o crescimento da
cultura embriogênica, essencialmente devido à redução da proliferação celular, e ao
mesmo tempo propiciou a maturação de embriões somáticos com morfologia
55
semelhante àquela observada durante a embriogênese zigótica (Ramarosandratana
et al., 2001).
Verificou-se no presente trabalho que a adição de PEG resultou numa
redução do crescimento celular (Figs. 4 e 8), associado a uma redução nos níveis de
NO (Figs. 5, 6) e ROS (Figs. 7), após 21 dias de cultivo em relação ao controle.
Entretanto, os resultados obtidos neste trabalho para o sistema A. angustifolia
diferem daqueles observados para outros sistemas vegetais, e que reportam,
frequentemente, um aumento de ROS nos tratamentos suplementados com agentes
osmóticos (Beligni & Lamattina, 1999; Wei, 2009). Exemplo desse tipo de resposta foi
descrito para grãos de cevada, onde o estresse osmótico causado pela adição de
PEG, induziu o aumento de ABA endógeno, diminuiu a matéria fresca e seca, e
aumentou a concentração de H2O2 em relação ao controle (Wei, 2009).
Adicionalmente, sob estresse osmótico, diversas espécies vegetais apresentaram
rápida formação de NO, como foi demonstrado em trigo, raízes de A. thaliana e
ervilha, tratados com PEG. Nesses sistemas ocorreu aumento da produção de NO
em relação ao controle até 36 h após o contato com o agente osmótico, enquanto no
período seguinte houve uma estabilização no conteúdo de NO produzido (Kolbert et
al., 2008).
A suplementação com PEG (8000) no cultivo in vitro de Deschampsia
antarctica foi responsável pela diminuição de H2O2. Foi demonstrado, nesse sistema
vegetal, que a tolerância ao estresse hídrico está associada com um aumento na
atividade de enzimas antioxidantes e com a capacidade de retirar radicais livres
(Zamora, 2010).
Em nosso trabalho, os resultados obtidos sugerem que algum mecanismo de
proteção contra o estresse oxidativo pode ter sido ativado após a suplementação de
PEG ao meio de cultura, impedindo o aumento no conteúdo de ROS e NO após 21
dias em incubação com este promotor de maturação. Neste sentido, diminuição no
conteúdo de NO e ROS em culturas tratadas com agentes osmóticos pode estar
associada ao aumento da atividade de enzimas antioxidantes. Análises de expressão
e atividade de enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase (SOD), catalase e
ascorbato peroxidase, durante o período de cultivo das células de A. angustifolia,
poderiam confirmar essa hipótese.
56
5.2.2. Maltose
A maltose, assim como outros carboidratos, atua como uma fonte de carbono
e como agente osmótico (Shoji et al. 2006). Sua quebra disponibiliza a glicose, que é
prontamente
assimilável
pelas
células
vegetais
(Salajova
et
al.,
1999).
Frequentemente, a utilização de maltose é preferida, em relação à sacarose, por
promover um aumento no número de embriões somáticos. Essa situação foi
observada para diferentes sistemas de coníferas como em P. elliottii e em P. taeda
(Salajova et al., 1999). Atualmente, poucos trabalhos relatam o efeito da maltose na
produção de NO e ROS, entretanto é conhecido que as fontes de carbono são
freqüentemente relacionadas com a atividade de enzimas antioxidantes (Couée et al.,
2006).
Os nossos resultados demonstraram que a adição de maltose ao meio de
cultura causou um aumento inicial na produção de NO (Fig. 6A). Após 21 dias de
cultivo, a produção de NO foi menor quando comparada com o controle, nas
diferentes concentrações testadas (Fig. 5 e 6B). Similarmente ao observado para NO,
o conteúdo de ROS, nos tratamentos suplementados com maltose, também foi
inferior ao controle após 21 dias de cultivo. Estes resultados sugerem que, algum
mecanismo de proteção contra o estresse oxidativo foi ativado após a suplementação
de maltose ao meio de cultura, impedindo que o conteúdo de ROS e NO
permanecessem altos.
Alguns trabalhos tem mostrado que a maltose também atua como uma
molécula sinalizadora (Couée et al., 2006; Bolouri-Moghaddam et al., 2010). Uma das
funções atribuída aos açúcares solúveis é a indução da expressão de enzimas
antioxidantes em resposta ao estresse oxidativo (Couée et al., 2006). Açúcares
solúveis podem estar envolvidos na via de produção metabólica de ROS, como na
respiração, mas também podem estimular a via de produção de NADPH, contribuindo
para a eliminação de ROS, através da ativação das enzimas antioxiantes(Couée et
al., 2006).
A maltose foi usada como fonte de carbono, no cultivo in vitro de Trifolium
repens, e o seu efeito na atividade de SOD foi avaliado (Ślesak et al., 2006), uma
enzima antioxidante envolvida na regulação do nível de ROS em plantas. Foi
demonstrado que os açúcares sacarose, frutose e maltose, aumentaram a atividade
da SOD nas culturas de T. repens.
A adição de maltose ao meio de cultura, além de atuar como promotor de
maturação, também é importante para a indução de culturas embriogênicas. A
57
indução da embriogenese somática em Hevea brasiliensis (Blanc et al., 2002) foi
uniforme, e duas vezes mais rápida, quando o meio foi suplementado com maltose
em substituição à sacarose. Ao final do cultivo, os autores observaram um aumento
da atividade de enzimas antioxidantes e proteínas de membrana na presença de
maltose, os quais associaram estas respostas
com a organização do embrião
somático, e com a manutenção da integridade da membrana destes (Blanc et al.,
2002).Estudos com essa abordagem, visando quantificar a atividade das enzimas
antioxidantes no sistema de culturas embriogênicas de A. angustifolia, poderiam
elucidar diferentes aspectos relacionados à produção de NO e ROS durante a
maturação.
5.2.3. ABA
Vários estudos indicam a importância do ABA na maturação de embriões
somáticos, sendo que a sua adição no meio de maturação promove o
desenvolvimento normal dos embriões e a sua conversão em plântulas em várias
espécies (Bertossi et al., 2001; Stasolla & Yeung, 2003).
Vários estudos têm mostrado em sistemas vegetais que a adição de ABA
resulta no aumento do conteúdo de NO e ROS. Em células-guarda de A. thaliana, foi
demonstrado que a adição do ABA ao meio de cultura aumentou os níveis
endógenos de ROS e de NO (Pei et al., 2000; Zhang et al., 2001, Neill et al., 2002;
Guo et al., 2003). Adicionalmente, trabalhos tem mostrado que o NO atua como
molécula chave na mediação de respostas ao ABA em ervilha (Neill et al., 2002),
Vicia faba (Garcia-Mata & Lamattina, 2002) e A. thaliana (Desikan et al., 2004). Em A.
thaliana, Bright et al. (2006) constataram que o ABA induz a formação de NO
dependente do aumento de H2O2. Liu et al. (2009) confirmaram que o aumento de
NO é essencial e responsável pela diminuição do conteúdo de ABA em sementes de
A. thaliana, para que ocorra a quebra de dormência.
Comparando-se o período de cultivo, verificou-se que a produção de ROS e
NO no meio de cultura suplementado com ABA foi maior no início, durante as
primeiras horas de incubação, quando comparada com sua adição após 21 de
cultivo. Porém, salienta-se que dentre os promotores de maturação testados, o ABA
foi o único que apresentou conteúdo crescente de ROS aos 21 dias de cultivo,
enquanto os demais tratamentos permaneceram constantes neste período de
avaliação (Fig. 7B). Neste sentido, pode-se sugerir que o ABA apresentou um
possível efeito protetor considerando-se os resultados obtidos no presente trabalho.
58
5.2.4. ABA + PEG + Maltose
A combinação de ABA, PEG e maltose, utilizada nesse experimento
objetivando a maturação das culturas embriogênicas de A. angustifolia foram
estabelecidas em trabalhos anteriores para essa espécie (dos Santos et al., 2002) e
para outras coníferas, como P. taeda (Li et al., 1998). Para A. angustifolia os
tratamentos contendo, 9% de PEG e 9% de maltose no meio de cultura, com ou sem
adição de ABA, promoveram a maturação dos embriões somáticos (dos Santos et al.,
2002), enquanto para P. taeda o meio de maturação, contendo 6% de PEG, 4% de
maltose e 150 µM de ABA, induziu a formação de embriões somáticos cotiledonares
(Li et al., 1998).
Nossos resultados demonstraram que, a adição conjunta dos três promotores
de maturação, foi responsável pela diminuição do conteúdo de NO (Fig. 6, 21 e 22) e
ROS (7 e 23) em relação ao controle após 21 dias de cultivo. Durante as primeiras
duas horas de incubação das culturas embriogênicas com o meio APM, observou-se
um aumento no conteúdo de NO e ROS, que embora menor em relação aos outros
meios de cultura, foi maior quando comparado ao mesmo tratamento após 21 d
Observou-se para o tratamento APM, que a transferência das culturas
embriogênicas para um novo meio de cultivo de mesma composição, após 21 dias,
não causou aumento dos níveis de NO nem diminuição de ROS (Fig. 12). O aumento
nestes compostos foi observado somente para o tratamento controle, o que sugere
que algum mecanismo de proteção seja ativado durante a maturação, com os
promotores incorporados ao meio de cultura. Neste sentido, a análise da atividade de
enzimas antioxidantes pode ser um fator chave para elucidar o envolvimento do ABA
na produção de NO no processo de maturação de culturas embriogênicas de A.
angustifolia.
Adicionalmente, o tratamento combinando os três promotores de maturação
foi mais efeciente na maturação das culturas embriogênicas de A. angustifolia da
linhagem MSG, uma vez que resultou na evolução morfogenética destas culturas
(Fig. 18), apresentando embriões somáticos em estádios mais avançados de
desenvolvimento, concomitantemente a redução do crescimento (Fig. 20) e do
conteúdo endógeno de NO e ROS (Figs. 22 e 23).
59
5.3. Doadores, sequestradores e inibidores de NO
O NO tem sido descrito como um mensageiro intra e intercelular, podendo
participar de vários processos em plantas, incluindo a expressão de genes
relacionados com defesa e morte celular programada (Neill et al., 2003), respostas ao
estresse abiótico (Mackerness et al., 2001; Garcia-Mata & Lamattina, 2002; Gould et
al., 2003) e na regulação do crescimento e desenvolvimento vegetal, como
germinação (Beligni & Lamattina, 1999; Leshem & Pinchasov, 2000; Seregélyes et
al., 2003), expansão foliar (Zhang et al., 2003), senescência (Leshem & Haramaty,
1996), e organogênese (Correa-Aragunde et al., 2004).
Em células vegetais, entretanto, ainda não está bem elucidado o envolvimento
direto ou indireto do NO nos eventos de transdução de sinais relacionados ao ciclo de
divisão celular (Pagnussat et al., 2004). Recentemente, foi demonstrado por Ötvös et
al. (2005) que o NO pode estimular a sinalização e ativação da divisão celular e a
formação de células embriogênicas na presença de 2,4-D em culturas derivadas de
protoplastos de folha de alfafa (Medicago sativa).
Embora vários estudos tenham sido desenvolvidos em diferentes sistemas
vegetais, na embriogênese poucos estudo tem mostrado a relação do NO com este
processo morfogenético. Silveira et al. (2006) demonstraram que as PAs Spd e Spm
possibilitam a evolução morfogenética das culturas embriogênicas de A. angustifolia
mediante uma redução nos níveis endógenos de NO, sugerindo que a redução deste
composto é essencial para a maturação das culturas embriogênicas. Recentemente,
Osti et al. (2010) demonstraram que a adição de SNP permite um aumento no
crescimento celular sem uma redução na evolução morfogenética em culturas
embriogênicas de A. angustifolia.
Neste sentido, objetivou-se verificar se a adição do NO ao meio de cultura
reverteria o efeito dos promotores de maturação. Entretanto, no presente trabalho
não obteve-se uma resposta adequada neste experimento, possivelmente devido a
interação entre todos estes componentes com as demais rotas metabólicas neste
sistema.
Verificou-se que a adição de SNP estimulou o aumento de NO interno (Fig.
9A) e externo (Fig. 10A) somente nos tratamentos suplementados com ABA e
maltose, ao mesmo tempo em que reduziu os níveis de ROS, nesses mesmos
tratamentos (Fig. 11A). Por outro lado, a aplicação de PTIO, um sequestrador de
NO,ao meio de cultura das células embriogênicas de A. angustifolia, quando na
presença de todos os promotores de maturação (APM), ocasionou a redução na
60
liberação de NO (Fig 10B). Já nas culturas suplementadas com ABA, ocorreu um
aumento de NO interno e externo. Esse resultado pode ser utilizado no
aperfeiçoamento da maturação de embriões somáticos de A. angustifolia, uma vez
que sabemos que é necessária uma diminuição nos conteúdos de NO na promoção
da maturação. Entretanto, para melhor entendimento destes dados obtidos, uma
análise morfológica das culturas embriogênicas nestes diferentes tratamentos deveria
ser realizada, verificando analisar o padrão morfológico obtido nos diferentes
tratamentos e compará-los com os anteiores.
Em células guarda de ervilha foi observado que a síntese de NO induzida por
ABA pode ser parcialmente inibida pelo L-name, sugerindo o envolvimento da enzima
NOS na produção de NO. Por outro lado, em células da epiderme de A. thaliana
(Desikan et al.,2002), assim como nos nossos resultados, em culturas embriogênicas
de A. angustifolia, não ocorre alteração no conteúdo de NO quando adicionado o Lname. Estes resultados sugerem que a produção de NO, nesses casos, não poderia
esta ocorrendo pela via da enzima Oxido Nítrico Sintase (NOS), e sim por outro
mecanismos.
Tungstato, por inibir a atividade da NR, inibiu ABA, a síntese de NO induzida
por nitrito e o fechamento de estômato em células guarda de A. thaliana (Bright,
2006). Em nossos resultados o tungstato foi o que mais alterou a produção de NO,
aumentando a produção e liberação quando adicionado nos tratamentos
ABA e
PEG, a liberação no controle, maltose e APM, sugerindo que a produção de NO pela
via da enzima nitrato redutase estaria ativa nas culturas embriogênicas de A.
angustifolia.
5.4. Morte celular
O NO pode atuar como um antioxidante ou como promotor de morte celular
programada, na dependência da concentração, localização e associação com
espécies reativas de oxigênio (De Michele et al., 2009). Delledone et al. (2001),
investigaram as interações entre NO e ROS na resposta de resistência a doenças, e
propuseram que o balanço entre NO e ROS é o fator regulatorio da MCP. Em células
de soja, altos níveis de NO não afetam a viabilidade da célula a menos que seja
compensado por altos níveis de ROS (Delledone et al., 2001).
Para as células embriogênicas de A. angustifolia, verificou-se, no presente
trabalho, que a adição de agentes de maturação (ABA, PEG e maltose) resultaram
num aumento da MCP na linhagem BM, acompanhado de redução de ROS e do NO
61
intracelular. Esses resultados sugerem que a morte celular apresentada pela
linhagem BM quando da adição dos promotores de maturação, pode estar
relacionada com a MCP característica da embriogênese, onde a degradação das
células do suspensor tem como função a promoção do crescimento do embrião.
5.5. Diferença entre linhagens
Embriões somáticos apresentam variações morfológicas e genotípicas, e
algumas linhagens de células não são capazes de completar o processo de
maturação dos embriões somáticos, mesmo em condições consideradas favoráveis
para outras linhagens (Wang et al., 2009). Variações fisiológicas também foram
observadas em P.abies, ao comparar com diferentes capacidades para a maturação
(Wang et al. 2009). Nesse sistema, foi verificado que a linhagem sem a competencia
para a maturação apresenta conteúdo reduzido de ABA, quando comparada àquela
competente para a maturação (Wang et al., 2009).
A perda do potencial embriogênico da linhagem BM pode ter sido causada
pela variação somaclonal. Essa se manifesta em cultura de tecidos em vários níveis,
fenotipica, citológica, bioquímica, genética e epigeneticamente (Maruma et al., 2009).
Alguns fatores como de genótipo, fonte de explante, composição do meio de cultura,
e idade da cultura afetam a variação somaclonal (Brar & Jain, 1998). Os prováveis
mecanismos
da
variação
incluem
mudanças
genéticas
como
mutações,
reorganização dos cromossomos, troca das cromátides irmãs e deleção, e mudanças
epigenéticas como amplificação de DNA, elementos de transposição e metilação de
DNA (Ahuja, 1998).
Embora as linhagens utilizadas no presente trabalho apresentem diferenças
relacionadas ao genótipo, e às condições iniciais de cultivo, elas respondem mesma
maneira em relação ao conteúdo de NO e ROS e promovem a formação de embriões
somáticos com diferentes competências para evoluírem no processo de maturação.
Nesse contexto elas podem ser avaliadas e comparadas.
62
6. CONCLUSÃO
Os sinais embriogênicos já foram intensamente estudados e hoje sabemos
que, em culturas de coníferas, a adição de ABA e agentes osmóticos promove os
sinais necessários para a ativação da embriogênese. Conforme já salientado, um
sério limitante da aplicação prática do processo de embriogênese somática, refere-se
a baixa taxa de germinação do embrião somático e sua conversão em plântula.
Neste contexto, o estudo das etapas finais do desenvolvimento embrionário
em sementes (maturação), e da germinação, além de permitir um melhor
entendimento das bases moleculares e fisiológicas envolvidas no processo
embriogênico, e germinativo, podem gerar informações importantes para a
manipulação e otimização da técnica de multiplicação in vitro por embriogênese
somática. Ressalta-se, novamente, que estudos nesta linha de pesquisa, envolvendo
espécies com sementes recalcitrantes são escassos, e a literatura existente referente
a maturação e germinação de sementes, é praticamente toda baseada em estudos
com espécies ortodoxas.
Vários estudos têm sido desenvolvidos visando a obtenção de embriões
somáticos com maior viabilidade (Stasolla & Yeung, 2003; Stasolla et al., 2003). Em
virtude das similaridades, vários estudos têm buscado marcadores comuns e a
interface dos diferentes estádios do desenvolvimento da embriogênese somática e
zigótica,
inclusive
permitindo
que
sejam estabelecidos
parâmetros para
o
monitoramento e a otimização dos protocolos de embriogênese somática (Pullman et
al., 2003; Misra, 2008).
A interface e as similaridades morfológica, bioquímicas e moleculares, da
embriogênese somática e zigótica tem sido foco de pesquisas desenvolvidas pelo
Laboratório de Biologia Celular de Plantas (BIOCEL), em associação com diferentes
grupos de pesquisa do país e do exterior (Astarita et al., 2003a, Astarita et al., 2003b;
Silveira et al., 2006; Steiner et al, 2008; Santos et al., 2008; Balbuena et al., 2009).
As principais linhas de pesquisa incluem o estudo dos parâmetros fisiológicos
(metabolismo hormonal), bioquímicos (metabolismo de poliaminas, óxido nítrico e
aminoácidos) e moleculares (proteômica comparativa e expressão gênica) durante o
desenvolvimento da embriogênese zigótica e somática em espécies arbóreas nativas.
A realização deste trabalho complementa os estudos existentes ao longo de vários
anos relativos à embriogênese zigótica e somática no sistema A. angustifolia.
O sistema A. angustifolia foi selecionado pelos seguintes motivos a) é uma
espécie arbórea nativa de importância econômica, e que está incluídas na lista de
63
espécies ameaçadas de extinção, na categoria de perigo crítico (IUCN – International
Union for Conservation of Nature and Natural Resources – www.iucnredlist.org); b)
possui sementes recalcitrantes e problemas de propagação vegetativa por
metodologias tradicionais; c) constitui excelente sistema para estudos de biologia
celular, fisiologia e bioquímica dos processos de desenvolvimento (embriogênese e
germinação); d) possui as suas condições básicas de cultivo in vitro, relativas à
indução da embriogênese somática, relativamente bem estabelecidas, e vem sendo
estudadas pelo nosso grupo de pesquisa.
De acordo com os resultados obtidos, pode-se observar que os agentes
promotores da maturação reduzem a síntese endógena de NO e ROS, e também o
crescimento celular. Nas culturas embriogênicas com capacidade de maturação
(linhagem MSG), esses promotores induzem a maturação, enquanto nas culturas
que não maturam (linhagem BM), promovem a morte celular programada. Mesmo não
sendo uma linhagem embriogênica e não respondendo aos estímulos dos promotores
de maturação com a evolução a embriões somáticos, a linhagem BM respondeu de
forma similar que a linhagem embriogênica MSG na produção de NO e ROS,
sugerindo que o bloqueio da resposta para formação de embriões pode acontecer
após a sinalização de NO.
Estes resultados são inéditos e fundamentais para uma melhor compreensão
do envolvimento e sinalização do NO e ROS na etapa de maturação durante o
processo da embriogênese somática. Trabalhos sobre a ativação de mecanismos de
defesa, como enzimas antioxidantes, são interessantes para complementar este
trabalho, visando identificar como as culturas embriogênicas equilibram a sintese
destes compostos quando submetidas a maturação.
64
7. RESUMO
Andrade, JBR. Efeito dos agentes de maturação, ABA, PEG e maltose, na
produção de óxido nítrico e de espécies reativas de oxigênio em culturas
embriogênicas de Araucaria angustifolia. 2010. 74p. Dissertação (Mestrado) –
Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo.
Araucaria angustifolia é uma conífera nativa do Brasil de importância
econômica, que, após intenso desmatamento, possui sua distribuição limitada a
aproximadamente 3% da área original. Atualmente está incluída na lista de espécies
ameaçadas de extinção, na categoria de perigo crítico de acordo com a IUCN
(International Union for Conservation of Nature). A embriogênese somática é um
processo em que, através da técnica de cultivo in vitro, células isoladas ou um
pequeno grupo de células somáticas dão origem a embriões. Este é um sistema com
potencial de aplicação em conservação, reflorestamento, propagação em larga
escala, e melhoramento vegetal em espécies arbóreas recalcitrantes e em risco de
extinção. Um dos principais fatores limitantes, nos sistemas de embriogênese
somática em arbóreas, é a baixa freqüência de maturação e conversão de embriões
somáticos em plântulas. Durante a fase de maturação, os embriões somáticos
acumulam substâncias de reserva, reduzem a atividade metabólica e adquirem
tolerância à desidratação. A suplementação do meio de cultura com determinados
reguladores de crescimento e agentes osmóticos, os quais permitem a progressão do
desenvolvimento normal dos embriões somáticos, promove um estresse hídrico. Esta
situação mimetiza aquela que ocorre durante a embriogênese zigótica quando do
desenvolvimento da semente. O óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio
(ROS) são moléculas que atuam nas respostas das plantas aos vários estresses
ambientais e estão envolvidas em processos de desenvolvimento como
embriogênese e germinação de sementes, gravitropismo, formação de raízes. Este
trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de promotores de maturação, ABA e os
agentes osmóticos, PEG e maltose, no conteúdo de NO e ROS em culturas
embriogênicas de A. angustifolia. Foi observado que os agentes promotores da
maturação reduzem a síntese endógena de NO e ROS. Essa redução é dose
dependente. Foram pesquisadas duas linhagens de células com diferentes
capacidades de maturação. Para as culturas embriogênicas com competência de
maturação esses promotores induzem a maturação e nas culturas que não maturam,
promovem a morte celular programada.
Palavras-chave: Araucaria angustifolia, embriogênese, óxido nítrico.
65
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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