ESTUDO DO EFEITO DE LIGANTES DE TLRS EM
DIFERENTES ESTÁGIOS DA ONTOGENIA E DO
DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B.
Bárbara José Antunes Baptista
Rio de Janeiro
2009
BÁRBARA JOSÉ ANTUNES BAPTISTA
Aluna do curso de Biotecnologia
Matrícula 0613800170
ESTUDO DO EFEITO DE LIGANTES DE TLRS EM
DIFERENTES ESTÁGIOS DA ONTOGENIA E DO
DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B.
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso,
apresentado ao curso de graduação em
Biotecnologia, da UEZO como parte dos
requisitos para a obtenção do grau de
Tecnólogo
em
Biotecnologia
sobre
a
orientação da Dr. ElizeAyumi Hayashi.
Rio de Janeiro
Julho de 2009
ii
Baptista, Bárbara José Antunes
Estudo do efeito de ligantes de TLRs em diferentes estágios da ontogenia e do
desenvolvimento dos linfócitos B.
Bárbara José Antunes Baptista, Rio de Janeiro, 2009.
Trabalho de Conclusão de Curso – UFRJ/ Instituto de Microbiologia: Prof. Paulo
de Góes, 2009.
Orientadora: Elize Ayumi Hayashi
Co-Orientador: Alberto Félix Antônio da Nóbrega
1. Visão das diferenças fenotípicas entre as subpopulações de linfócitos B de
precursores purificados de medula óssea de camundongos jovens, adultos e idosos. 2.
diferenças dos linfócitos gerados in vitro na resposta ao LPS ao longo da ontogenia.
Trabalho de Conclusão de Curso. I. Elize Ayumi Hayashi. II. Universidade Federal do
Rio de Janeioro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes. Estudo do efeito de
ligantes de TLRs em diferentes estágios da ontogenia e do desenvolvimento dos
linfócitos B.
iii
Estudo do efeito de ligantes de TLRs em diferentes estágios da
ontogenia e do desenvolvimento dos linfócitos B.
Elaborado por Bárbara José Antunes Baptista
Aluna do curso de Biotecnologia da UEZO
Este trabalho de Graduação foi assinado e aprovado com
Grau: 10,0
Rio de Janeiro, 30 de julho de 2009.
________________________________________
Maria de Fátima Sarro da Silva, pós – doutorado.
________________________________________
Sérgio Henrique Seabra, pós – doutorado.
________________________________________
Elize Ayumi Hayashi, pós – doutorado.
RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL.
JULHO DE 2009
iv
AGRADECIMENTOS
•
A Deus, pela sua amizade que me sustentou em toda a minha vida, por ter me dado
forças para não desanimar e desistir nos momentos de dificuldades.
•
A minha mãe, Odiléa José Antunes, por ter me dado todo o incentivo e apoio
durante toda a sua vida.
•
A minha orientadora, Elize Ayumi Hayashi, por ter me ajudado a concluir este
trabalho, pelo acolhimento no laboratório, por toda a paciência em me ensinar, por
acreditar em mim, por não me deixar desistir nos momentos de desespero.
• Ao meu co-orientador Alberto Félix Antônio da Nóbrega, por ter me acolhido no
laboratório, por ter contribuído diretamente com idéias para o meu trabalho de
conclusão de curso, por todo o apoio e ajuda me dedicada.
•
A Profa Maria Bellio, pelos ensinamentos nos seminários, por toda a contribuição
nos experimentos.
•
Aos amigos de laboratório: Alessandra, Roberta, Marcio, Obrigada por toda a ajuda
no laboratório.
•
A banca examinadora desta monografia: Maria de Fátima Sarro, Sérgio Henrique
Seabra Filho, Elize Ayumi Hayashi, por toda a disponibilidade e compreensão.
v
RESUMO
Os linfócitos B, células da imunidade adaptativa, reconhecem de forma específica
uma gama de antígenos, conferindo ao sistema imune característica de especificidade. Os
receptores das células B (BCR), assim como receptores tipo Toll, desempenham um
importante papel no desenvolvimento dessas células. Trabalhos prévios evidenciaram que
o LPS é capaz de estimular a maturação de linfócitos B. Neste trabalho, foi analisado se
essa resposta dos linfócitos B ao LPS se altera ao longo da ontogenia, utilizando um
sistema de diferenciação in vitro a partir de precursores purificados de camundongos de
diferentes idades. Nossas análises foram realizadas com a utilização de um citômetro de
fluxo, para a identifição de marcadores de linhagem e de maturação.
Observamos que as células de animais jovens são em geral mais responsivas ao
LPS como estímulo de maturação se comparados a animais idosos. Mostramos evidências
de que esse fenômeno não é devido a defeitos intrínsecos da linhagem B, mas sim, à
presença de porcentagens pequenas de células que não pertencem à linhagem B, que tem
efeito inibitório na maturação. Esses resultados sugerem que estudos da ontogenia dos
linfócitos B são importantes para melhor compreensão da fisiologia dessas células e
possíveis causas de falhas em suas funções.
vi
ABSTRACT
B lymphocytes, cells of adaptive immunity, recognize a range of specific antigens,
giving the immune system characteristic of specificity. The B cell receptor (BCR) and Toll
type receptors, play an important role in the development of these cells. Previous studies
showed that LPS is able to stimulate the maturation of lymphocytes B. In this work, it was
examined whether the response of B lymphocytes to LPS changes throughout ontogeny,
using a system of differentiation in vitro of precursors purified from mice of different ages.
Our tests were performed using flow cytometry to identify markers of lineage and
maturation.
We observed that cells from young animals are generally more responsive to LPS
as a maturation stimulus when compared to older animals. We show evidence that this
phenomenon is not due to intrinsic defects of B lineage, but the presence of small
percentages of cells that do not belong to the B lineage, which has an inhibitory effect on
maturation. These results suggest that studies of the ontogeny of B lymphocytes are
important for better understanding of the physiology of these cells and possible causes of
failure in their function.
vii
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................... PÁG. VI
ABSTRACT .................................................................................................... ......... PÁG. VII
1 - INTRODUÇÃO ....................................................................................................... PÁG. 1
1.1 - Desenvolvimento dos Linfócitos B .................................................................. PÁG. 1
1.2 - Subtipos de Células B a partir da diferenciação dos progenitores. ................... PÁG. 3
1.3 - Diferenciação In Vitro do Linfócito B .............................................................. PÁG. 4
1.4 - Papel da Enzima Rag no Desenvolvimento dos Linfócitos B........................... PÁG. 5
1.5 - Receptores semelhantes a Toll (TLRs) ............................................................. PÁG. 6
1.6 - O sistema imunológico ao longo da ontogenia. ................................................ PÁG. 8
2 - OBJETIVO ........................................................................................................... PÁG. 11
2.1 - Objetivos Específicos: .................................................................................... PÁG. 11
3 - METODOLOGIA ................................................................................................ PÁG. 12
3.1 - Obtenção de células totais da medula óssea ................................................... PÁG. 12
3.2 - Contagem Celular........................................................................................... PÁG. 12
3.3 - Análise da purificação e comparação das células dos camundongos............. PÁG. 12
3.4 - Seleção das células precursoras de linhagem B (B220 + IgM-) .................... PÁG. 12
3.5 - Cultura de diferenciação de precursores de células B ...................................
PÁG. 13
3.6 - Análise de células por Citometria de Fluxo (FACS) ...................................... PÁG. 13
viii
4 - RESULTADOS ...................................................................................................... PÁG. 15
4.1 - Caracterização da linhagem B e análise da purificação dos precursores de medula
óssea em animais de diferentes idades. ........................................................................ PÁG. 15
4.2 - Estudo da maturação das células de linhagem B in vitro ................................ PÁG. 16
4.3 - Diferenciação das células B in vitro em resposta ao LPS em camundongos de
diferentes idades. .......................................................................................................... PÁG. 18
4.4 - Menor resposta de células B in Vitro ao LPS não corresponde totalmente com
avanço na idade do animal............................................................................................ PÁG. 21
4.5 - Presença de células que não pertencem à linhagem B inibe a diferenciação dos
precursores B In Vitro. ................................................................................................. PÁG. 22
5 - DISCUSSÃO .......................................................................................................... PÁG. 25
6 - CONCLUSÃO ....................................................................................................... PÁG. 28
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... PÁG. 29
ix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
BCR
Receptor de Células B
CDR
Regiões Determinantes de Complementaridade
CLP
Progenitores Linfóides Comum
EDTA
Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
HSA
Antígeno Estável ao Calor
HSCs
Células-tronco Hematopoéticas
IFN
Interferon
Ig
Imunoglobulina
IL-4
Interleucina 4
IL-7
Interleucina 7
LPS
Lipopolissacarídeo
PAMPs
Padrão Molecular Associado a Patógeno
PBS
Tampão Fosfato de Sódio
Pré-BCR
Receptor de Células Pre-B
PI
Iodeto de Propídeo
RAG
Genes Ativantes de Recombinação
SCF
Fator de Célula-tronco
SL
Cadeia Leve Substituta
TdT
Terminal Deoxinucleotidil Transferase
TLRS
Receptor tipo Toll
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral Alfa
x
LISTA DE FIGURA
Figura 1............................................................................................................. PÁG. 16
Figura 2............................................................................................................. PÁG. 18
Figura 3............................................................................................................. PÁG. 20
Figura 4............................................................................................................. PÁG. 21
Figura 5............................................................................................................. PÁG. 22
Figura 6............................................................................................................. PÁG. 24
Figura 7............................................................................................................. PÁG. 25
xi
1 - INTRODUÇÃO
O estudo da ontogenia em relação a produção das células de linhagem B é
importante para a compreensão de mecanismos pelos quais ocorrem diferenças
significativas da resposta do sistema imune adquirido ao longo do desenvolvimento e
envelhecimento do organismo. O repertório de linfócitos B, com sua capacidade de
resposta a infinita quantidade de antígenos externos e de auto-antígenos são também são
alvo de estudo de doenças auto-imunes, o que torna essas células foco de muitos estudos
atualmente.
Serão introduzidos alguns temas, a fim de maior compreensão sobre o a formação
da linhagem de células B e da complexidade dos mecanismos envolvidos nesse processo.
1.1 - DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B
As células-tronco hematopoéticas (HSCs) dão origem às células sangüíneas. Tais
células se originam, após o nascimento, na medula óssea. Dentre os vários progenitores de
linhagens da medula óssea, estão os progenitores linfóides comum (CLPs), que originam
as células B e T (ABBAS et al., 2008).
As células B ou linfócitos B, juntamente com os linfócitos T, são responsáveis pela
Imunidade Adquirida ou Adaptativa, resposta desenvolvida após infecção a fim de eliminála, a qual é capaz de ser altamente específica em distinguir diferentes moléculas (diferentes
antígenos), mesmo aquelas que apresentem grandes semelhanças, além de possuir
Memória Imunológia, ou seja, ser capaz de se “lembrar” e dessa forma aumentar a resposta
a infecções posteriores por um mesmo microrganismo (ABBAS et al., 2008).
Os linfócitos B são as únicas células que produzem anticorpos – moléculas cuja
função é neutralização do microrganismo, promover fagocitose e a ativação do Sistema
Complemento. Até chegar ao estágio de secretar anticorpos, os linfócitos B passam por
várias etapas de diferenciação ou estágios de amadurecimento (ABBAS et al., 2008).
As etapas de diferenciação dos linfócitos B podem ser definidas pelo: (I) rearranjo
dos genes de cadeia pesada e leve da Imunoglobulina; (II) As enzimas que atuam na
recombinação e os marcadores de superfícies; (III) A fase do ciclo celular em que a célula
se encontra; (IV) A capacidade de responder a estímulos como determinadas citocinas,
mitógenos e antígenos (HAYASHI et al., 2005).
1
O rearranjo e a expressão dos genes das Imunoglobulinas (Ig), proteínas
formadoras dos receptores dos linfócitos B e/ou dos anticorpos, são os dois eventos
principais que ocorrem no processo de amadurecimento dos linfócitos B. A sobrevivência
dessas células no organismo dependerá da funcionalidade do seu receptor.
Na medula óssea as primeiras células do estágio do desenvolvimento da linhagem
B são pré-progenitoras de células B (pré-pro-B). Essa subpopulação não apresenta HSA
(Heat Stable Antigen) e BP-1, na presença do estímulo IL-7, adquirem o fenótipo B220+,
CD19+, CD43+,CD10+, c-kit+ e passam a ser denominadas células progenitoras de B (proB), já expressam Igα e Igβ – proteínas transmembranas - que fazem parte do receptor de
célula B (BCR) e proteínas Vpre e λ5, que formam a cadeia leve substituta, SL (Surrogate
light chain) (HAYASHI et al., 2005). Na presença de células estromais, de IL-7 e
expressão dos genes ativadores de recombinação 1 e 2 (RAG-1 e RAG-2), ocorre o
prosseguimento para o estágio de célula B-I (pré B-I), que possui fenótipo idêntico as das
células pro-B, sendo distinguidas apenas por apresentarem rearranjo de alguns genes do
BCR, havido rearranjo produtivo (in frame), segue-se para o estágio pré-BII, realiza
rearranjo gênico a formar cadeia µ completa do BCR (MELCHERS & ROLINK, 1999).
As células pré-BII caracterizam-se por serem fenotipicamente c-kit-, CD43-, CD25+
(MELCHERS & ROLINK, 1999; ROLINK et al., 1994), expressam também o receptor pré
– antigênico (pré – BCR) formado pela cadeia µ e cadeia leve substituta. O pré – BCR
fornece sinais para a sobrevivência e proliferação das células para continuação do
desenvolvimento. Na ausência do receptor de célula pré-B (pré – BCR) as células sofrem
morte programada (ABBAS et al., 2008).
A cadeia leve devidamente rearranjada, junto com a cadeia µ e os componentes Igα
e Igβ do receptor dão origem ao receptor de células B (BCR), nesse estágio as células B
são denominadas Células B imaturas, que ainda expressam o marcador AA4 (ROLINK,
ANDERSSON & MELCHERS, 1998). A formação e a funcionalidade de tais receptores
no conhecimento de auto-antígenos são cruciais para que a célula continue seu
desenvolvimento, uma vez que ocorre reconhecimento ávido de auto-antígeno as células
podem ser eliminadas ou levadas a alterar seu receptor.
Na medula óssea as células B imaturas podem ser divididas em dois grupos: (I)
células B imaturas, caracterizadas fenotipicamente com B220low, IgMlow, IgD-; (II) células
B de transição, caracterizadas fenotipicamente com B220intern, igMhigh, IgDlow (CARSETTI
et al., 1995).
2
As células B imaturas deixam à medula óssea via artéria central e vão para o
baço, único órgão periférico que abriga células B imaturas (JANEWAY, TRAVERS et al.,
2002). Dessas células imaturas somente 30 a 50% conseguem sobreviver durante algumas
semanas (ALLMAN et al., 1993; ROLINK, ANDERSSON & MELCHERS, 1998). Essas
células no baço são denominadas células B de transição e são subdivididas em 3 grupos: (I)
T1, com fenótipo B220interm, CD21low, CD23low, IgMhigh,IgDlow; (II) T2, com fenótipo
B220high, Cd21interm/high, CD23+, IgMhigh, IgDhigh ( Lorder et al., 1999); (III) T3, com
fenótipo CD23+, IgMlow e que ainda expressam AA4.1 (ALLMAN et al., 2001).
No baço as células B completam seu amadurecimento e são capazes de responder a
antígenos estranhos, se tornando linfócitos efetores, células secretoras de anticorpos,
denominadas plasmócitos.
1.2 - SUBTIPOS DE CÉLULAS B A PARTIR DA DIFERENCIAÇÃO DOS
PROGENITORES.
Na medula óssea as células tronco hematopoéticas dão origem a maior parte das
células B, denominadas células B-2. Essas passam por uma série de seqüências, como
síntese de proteínas, receptores os quais exigidos para muitas transformações e se
comprometem com o desenvolvimento da linhagem de células B da Zona marginal e
células B Foliculares (ABBAS et al., 2008).
As células B foliculares formam a maior parte das células B chamadas de maduras,
já que apresentam co-expressão de receptores IgM e IgD de membrana e habilidade de
circular.
As células B foliculares são também denominadas células B circulantes, uma vez
que migram de um órgão linfóide para o outro e residem em compartimentos
especializados conhecidos como folículos de células B. O BAFF um ligante trófico da
família de citocinas de necrose tumoral (TNF) mantêm, em parte, as células B nesses
compartimentos (ABBAS et al., 2008).
As células B da zona marginal localizadas próximo ao seio marginal do baço,
expressam IgM e marcador de superfície CD21. Essas células parecem mediar resposta
imunológica dependentes de células T, apesar de mediarem geralmente resposta
imunológicas a antígenos circulantes independente de T, além de se diferenciarem em
plasmócitos secretores de IgM de vida curta (ABBAS et al., 2008).
3
Outro subtipo de células B são as células B-1 desenvolvidas a partir de célulastronco hematopoéticas no fígado fetal. No adulto são encontradas como população autorenovavéis de células B-1 em peritônio e mucosas.
As células B-1 apresentam um repertório de diversidade menor em relação as
células B convencionais. Essas células são fontes de rápida produção de anticorpos contra
microrganismos no peritônio e análogas às células T γδ, pois possuem um repertório
limitado de receptores de antígenos e acredita-se que a resposta imunológica inicial ocorra
de forma parecida em ambas (ABBAS et al., 2008).
1.3 - DIFERENCIAÇÃO IN VITRO DO LINFÓCITO B
A diferenciação de células B In Vitro, geralmente, utiliza-se células estromais da
linhagem S17 e ST2 obtidas através da clonagem dessas células em culturas de células de
medula e de fígado fetal respectivamente, alem da citocina IL-7 (NAMEN et al., 1988;
CUMANO et al., 1990; HARDY et al., 1991; ROLINK et al., 1991), que pode ser
fornecida pelas células estromais ou purificada de sobrenadante de células transfectadas
com o DNA recombinante contendo o gene para a IL-7 (NAMEN et al., 1988).
A citocina IL-7 é uma glicoproteina de 25 kDa , que tem o papel de potencializar o
crescimento dos precursores linfóides através da ligação com o receptor de IL-7 presente
nas células na fase pro-B, pre-B-I e no início da fase pre-B-II, estimula a proliferação
celular nesses estágios in vivo.
Condições em que IL-7 se encontra saturante na cultura as células nos estágios
pro/pre-B-I crescem em detrimento das outras células presentes na cultura (inclusive as
pre-B-II), e inibem a sua diferenciação para os próximos estágios (HAYASHI et al., 2005).
A cultura em fígado fetal (fetal liver organ culture-FLOC) é outro sistema de
diferenciação In Vitro, que utiliza partes de fígado fetal como suporte para o crescimento
de precursores B, e é capaz de manter um padrão de diferenciação semelhante ao obtido in
vivo (CEREDIG et al., 1998).
Reconhece-se que na medula óssea e outros órgãos linfóides primários, existe um
microambiente formado de diferentes tipos celulares do estroma que fornecem os inúmeros
fatores que atuam na diferenciação das células hematopoiéticas, “mas não se sabe, se um
único tipo celular é capaz de fornecer todos os suportes necessários na diferenciação das
4
células B, nem as fases em que essas interações com as células estromais se fazem
necessária” (HAYASHI et al., 2005).
1.4 - PAPEL DA ENZIMA RAG NO DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B
Nos eventos de origem do receptor de célula B (BCR) ocorre recombinação
somática efetuada, principalmente, pela enzima Rag e alguns fatores de transcrição. Os
receptores são gerados por rearranjo em cada linfócito de genes de região variável (V),
com genes da região de diversidade (D) e/ou com genes de região de junção (J) (ABBAS et
al., 2008).
O receptor de células B (Ig) é formado por uma cadeia pesada e uma cadeia leve,
cada uma das cadeias possui uma região constante (C) e uma região variável (V). Os genes
que formam a região variável da cadeia pesada são os V, D, J e os que formam a região
variável da cadeia leve são os: V, J, e ambos contêm, logo após esses segmentos gênicos,
os segmentos que codificam suas respectivas regiões constantes.
As enzimas Rag1 e Rag 2 (recombination activating gene ou Recombinationactivating protein) possuem seus genes localizados no cromossomo 11. Essas enzimas
reconhecem a região de clivagem do DNA nas regiões entre os genes V, D e J (cadeia
pesada) e V e J (cadeia leve) por meio de seqüências de nucleotídeos. Tem por atividade
clivar os segmentos codificadores que são unidos por ligases específicas, gerando uma
seqüência codificadora capaz de ser transcrita em RNAm ( RNA mensageiro), que será
traduzido em polipeptídio nascente, o qual é processado e glicosilado, dando origem a um
polipeptídio maduro (OETTINGER et al.,1990). A junção de dois polipeptídeo, um de
cadeia pesada e outro de cadeia leve por pontes dissulfeto forma um heterodímero e a
junção de dois desses heterodímeros por pontes dissulfeto entre as duas cadeias pesadas
forma uma molécula de Imunoglobulina completa. O processamento do receptor de célula
B (BCR) pelas enzimas Rag 1 e 2 ocorre por etapas. Inicia-se na etapa de diferenciação da
linhagem de linfócitos B: Pré B-I, em que há expressão da enzima TdT (Transferase
desoxinocleotidil terminal), a qual realiza a adição de até 20 nucleotídeos, auxiliando o
mecanismo de diversidade juncional, expressão dos genes ativadores de recombinação 1 e
2 ( RAG1 e RAG 2) e rearranjo dos segmentos DJH. No estágio de precursora de célula BII, ocorre rearranjo entre o segmento VH e o rearranjo DJH pela atuação das Rags,
formando uma cadeia µ completa do BCR (ABBAS et al., 2008).
5
O estágio celular pré B-II pode ser dividido em 3: (I) As células estão na fase
mitótica e expressam o pré-BCR, constituído pela cadeia µ e proteínas substitutas de cadeia
leve, SL. Se o BCR for funcional ocorre sinalização para o desligamento da maquinaria
enzimática que age na recombinação somática; (II) As células deixam de expressar as SL e
voltam a expressar o RNAm das enzimas Rags; (III) nesse estágio as enzimas Rags
efetuam o rearranjo da cadeia leve. Existem dois Loci de cadeia leve қ e λ, que parece ser
rearranjados independentes um do outro, entretanto o rearranjo қ é superior ao de λ,
aumentando de 5 a 10 vezes mais as chances de se ter rearranjo қ;
A cadeia leve é definitivamente arranjada e unida a cadeia µ e aos componentes Igα
e Igβ, formando completamente o BCR e causando desativação das Rags, no estágio de
células imaturas (MELCKERS & ROLINK et al., 2000). Depois de formado o receptor as
enzimas podem ser ativadas novamente caso esse receptor faça reconhecimento de autoantígeno, ocasionando o “editing” do receptor (MELAMED et al., 1998).
1.5 - RECEPTORES SEMELHANTES A TOLL (TLRS)
Os receptores semelhantes a Toll fazem parte de uma família de receptores
reconhecedores de padrão. Esses receptores são encontrados em uma gama de tipos
celulares e possuem vias de tradução de sinal intracelulares que ativam várias respostas
pró-inflamatórias na célula. O receptor tipo Toll é de uma família conservada de proteínas
que desempenham funções de resposta na imunidade natural a patógenos (ABBAS et al.,
2008), mas recentemente estudos mostram que os receptores tipo Toll também estão
envolvidos no amadurecimento de linfócitos B (HAYASHI et al., 2005), esses receptores
formam uma família de 11 receptores identificados até os presentes estudos (AKIRA,
TAKEDA & KAISHO, 2001). São encontrados em superfície da membrana celular, como
os TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 e em membranas intracelulares, como os TLR3,
TLR7, TLR8, TLR9. Possuem em sua estrutura intracelular domínio de homologia ao
receptor Toll/IL-1 (TIR), importante para a interação com proteínas citoplasmáticas
responsáveis pela cascata de sinalização para os diferentes produtos da estimulação via
TLRs (JENKINS et al., 2009). Estudos indicam que essas proteínas são também
responsáveis pela variação no padrão de resposta a diferentes ligantes desses receptores
(ABBAS et al., 2008). Cada um dos TLRs tem padrão de reconhecimento molecular
característico, por exemplo os receptores intracelulares fazem o reconhecimento de
6
seqüências gênicas não próprias, enquanto os receptores da superfície celular fazem o
reconhecimento de polipeptídeos não próprios (ABBAS et al., 2008).
O TLR4 reconhece LPS bacteriano gram-negativo; mananos fúngicos, fosfolipídeos
parasitários entre outros. Esse receptor é um dos principais focos de estudos entre os
receptores tipo Toll no amadurecimento das células B, tendo em vista que seu agonista, o
LPS é capaz de ativar linfócitos B, estimulando a proliferação e secreção de anticorpo de
forma independente do receptor BCR (ANDERSSON, COUTINHO & MELCHERS,
1977; HOSHINO et al., 1999), além da maturação do mesmo, no entanto, os mecanismos
pelo qual acontece não estão bem estabelecidos.
Estudos demonstram que o LPS seria um co-estimulo para o aparecimento de
células B1, através de doses aplicadas em camundongos deficientes nesse tipo celular
(MURAKAMI et al., 1997) e também agiria de forma peculiar com proteínas ligadas ao
aparecimento do BCR que é sinal de proliferação e amadurecimento para as células B.
O melhor compreendimento da ativação e o amadurecimento de células B permitem
melhor entender o funcionamento de uma das células de defesa do sistema imune com
grande capacidade de identificar antígenos e o/os passos em que essa mesma célula pode
causar dano irreversível ao organismo quando faz reconhecimento de auto-antígenos.
Os sítios de ligação dos ligantes microbianos nos receptores tipo Toll ainda estão
sendo estudados por cristalografia de raio- X e analises de mutações.
Os receptores tipo Toll reconhecem padrões moleculares associados a patógenos
(PAMPs) e a base estrutural para a diversidade de reconhecimento à diferentes moléculas
ainda é desconhecida (ABBAS et al., 2008).
Algumas vias de sinal através de Toll induzem a dimerização do receptor.
Interações homotipicas TIR-TIR são realizadas e fazem o recrutamento de outras proteínas,
através de cascata de sinalização, que iniciam um downstream para ativar de alguns fatores
de transcrição, como: NF-қB e AP-1 estes estimulam a expressão de genes de muitas
moléculas do sistema imune, principalmente citocinas pró-inflamatórias (JENKINS et al.,
2009; JANEWAY et al., 2002).
A proteína Myd88 é uma proteína adaptadora que inicia a cascata de sinalização de
alguns receptores tipo Toll e pode ser a chave para se entender as vias de sinalização
desses receptores, entretanto outras três proteínas adaptadoras são conhecidas: Mal
(Myd88 semelhante à adaptadora) /TIRAP (proteína adaptadora contendo domínio TIR)
7
Trif (adaptadora contendo domínio TIR induzindo interferon-β) e TRAM (molécula
adaptadora relacionada com a Trif).
Estudos demonstram que os ligantes de Toll têm importante participação na
diferenciação de células B, por exemplo: O LPS (agonista de TLR4) e seqüências CpG
(agonista de TLR9) além de possuírem papel na ativação de citocinas pró-inflamatórias
também estão envolvidos na maturação e ativação das células B respectivamente
(AZULAY-DEBBY, 2007; HAYASHI et al., 2005). Contudo, pouco se sabe sobre a
expressão desses receptores e funcionamento dos mesmos no desenvolvimento dessas
células e acredita-se que a sinalização TLR e o BCR podem agir de forma sinérgica na
ativação da maturação das células B (HAYASHI et al., 2005).
1.6 - O SISTEMA IMUNOLÓGICO AO LONGO DA ONTOGENIA.
A ontogenia, formação e desenvolvimento desde a fecundação do óvulo até a morte
do indivíduo vêm sendo estudada, entre outros aspectos, para o entendimento da fisiologia
dos linfócitos B.
É reconhecido que no homem, o sistema imune neonatal tem sido considerado
pouco competente na geração de resposta imune. Seu sistema adquirido não se apresenta
bem desenvolvido e suas defesas são de origem materna, que possui vida curta. No outro
extremo da idade, o sistema imune passa a ter dificuldade de responder a patógenos aos
quais já foi exposto anteriormente, bem como a novos patógenos, levando as várias
doenças infecciosas e neoplásicas.
Em estudos com camundongos idosos saudáveis, anticorpos e respostas
imunológicas são de curta duração, e a hematopoiése da medula é restrita aos ossos
vertebral, esterno, costelas, ossos planos do crânio e pélvis e ao final dos ossos longos. Já
nos jovens existem mais ossos com medula ativa produzindo células B.
O declínio da função imunológica com o envelhecimento tem sido atribuído a
vários fatores inclusive alterações ambientais e uma falha de células senescentes
(THOMAN & WEIGLE, 1989; HODES, 1995; PROUST et al., 1996; BURNS &
GOODWIN, 1997; HODES, 1997), associado também a deficiências de células T-help
(SONG et al., 1997).
A resposta proliferativa de células B humanas purificadas do sangue periférico para
estimulação com anti-IgM, ou anti-M, com o ativador policlonal SAC, ou com MAb contra
8
CD20 ou CD40, tem sido relatada a ser reduzidas nos idosos (WHISLER et al., 1995) e a
auto-imunidade parece aumentar (GOIDL et al.; 1981; ZHAO et al., 1995), entretanto
outros estudos indicam que a resposta proliferativa se mantem com o envelhecimento e a
susceptibilidade e a capacidade de ativação de apoptose modificada (VONGTHIP &
SOUVANNAVONG et al., 1998).
A morte fisiológica celular, Apoptose desempenha importante papel na homeostase
do sistema imunológico e é fundamental seleção negativa e, por conseguinte na supressão
de células auto-reativas (GOLSTEIN et al., 1991; COHEN et al., 1992). Muitos estudos
têm sido realizados sobre a linhagem de células-T, associada ao papel do envelhecimento
de linfócitos B na susceptibilidade à apoptose, mas existem pouca informações a respeito.
A idade se reflete também na diminuição do repertório de diversidade dos linfócitos
B, no entanto, os mecanismos moleculares permanecem obscuros. Em estudos com ratos
de idade avançada observou-se declínio no RNA mensageiro das enzimas Rag1 e Rag 2
(JOSEPH et al., 2009).
Os fotores transcricionais de regulação da linfopoeise de células B, por exemplo:
E2A, EBF, e Pax-5 (ZHUANG et al., 1994; KEE et al., 2000; KEE & MURRE, 1998;
O'RIORDAN & GROSSCHEDL, 1999), estão envolvidos na regulação da mesma e podem
ser significativos em estudos de declínio do repertório de células B no envelhecimento. As
primeiras especificações de linhagem B envolvem a expressão de E2A e sua redução
resulta na inibição da linfopoeiese de células B (ZHUANG et al., 1996; KEE et al., 2000;
KEE & MURRE 1998; O'RIORDAN & GROSSCHEDL, 1999).
Uma importante função do E2A é promover a expressão das cadeias leves
substitutas e facilitar a formação do pré-célula B receptor (preBCR). Outros fatores tais
como: EBF e interferon são críticos na regulação da expressão da cadeia leve substituta.
No entanto, não se sabe que elementos influenciam a expressão de tais moléculas
reguladoras na medula e que elementos são necessários para a manutenção normal da
linfopoeise B ou para provocar linfoipoiese anormal na velhice.
Tem-se reconhecido que o microambiente da medula óssea tem importante papel na
deficiência de B linfopoiese na velhice fato sugerido pelo os estudos de Stephan
(STEPHAN et al., 1997), que têm mostrado que células estromais dentro do
microambiente da medula óssea de camundongos com idade são menos capazes de apoiar
o desenvolvimento B lineage in vitro. Em especial, Labrie (LABRIE et al., 2004)
demonstrou que a senescencia de células da medula desempenha papel importante em
9
limitar a expressão da RAG enzima e recombinação gênica nas células B precursoras.
Postula-se que deficiências nos fatores intrínsecos de células B podem contribuir para o
estado anormal da linfopoiese em organismos envelhecidos.
Experimentos indicam que células B de organismos jovens comparados com
organismos adultos são mais responsivas a estímulos, entretanto os mecanismos e as razões
pelas quais essas respostas são distintas ainda estão em estudo. Na ontogenia dessas
células, a relação dos diferentes acontecimentos de desenvolvimento com os diferentes
receptores celulares ainda não está bem esclarecida, e acredita-se que a sua compreensão
seja a chave para elucidamento das distintas respostas de células B a antígenos.
10
2 - OBJETIVO
Nosso objetivo neste projeto é avaliar os efeitos diretos e indiretos dos ligantes
dos receptores tipo Toll no desenvolvimento de linfócitos B ao longo da ontogenia,
analisando a resposta a estes ligantes na diferenciação de linfócitos B in vitro a partir de
precursores purificados de camundongos em diferentes idades.
2.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1) Detectar por citometria de fluxo as diferenças fenotípicas entre as subpopulações de
linfócitos B gerados na presença ou ausência de LPS (agonista de TLR4) em
culturas de precursores purificados de medula óssea de camundongos jovens,
adultos e idosos.
2) Identificar se as diferenças dos linfócitos gerados in vitro na resposta ao LPS ao
longo da ontogenia podem ser conseqüência da influência de outras linhagens
celulares ou de propriedades intrínsecas dos linfócitos B, analisando o papel de
outras linhagens celulares em culturas mistas de precursores B purificados com
outras linhagens celulares.
11
3 - METODOLOGIA
3.1 - OBTENÇÃO DE CÉLULAS TOTAIS DA MEDULA ÓSSEA: Foram obtidos
camundongos fêmeas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, do instituto de
microbiologia, setor imunologia, da linhagem CS7BL/6J de 6 meses, 3 meses e 20 dias de
idade. A suspensão de células totais da medula óssea foi obtida, cortando-se as
extremidades do fêmur e com o auxilio de seringa tamanho 22G para os animais de 3 e 6
meses e de seringa tamanho 27,5G para animais de 20 dias contento PBS (tampão fosfato
de sódio), EDTA 2 mM com 5% de soro fetal bovino, para lavagem das células do canal
medular. As células foram separadas por idade dos camundongos em tubos tipo Falcon de
50 mL. Foram centrifugadas em 1300 rpm a 4°C por 7 minutos. Posteriormente, o
sobrenadante foi removido e as células foram ressuspendidas em 5 mL de ACK, para
causar lise de hemácias, novamente centrifugação nas mesmas condições iniciais e em
seguida, o sobrenadante foi retirado e as células foram ressuspendidas em 5 mL de PBS,
EDTA 2 mM com 5% de soro fetal bovino para posterior contagem celular.
3.2 - CONTAGEM CELULAR: A contagem das células viáveis foi realizada com Azul de
Tripan utilizando microscópio óptico, em Câmara de Neubauer.
3.3 - ANÁLISE DA PURIFICAÇÃO E COMPARAÇÃO DAS CÉLULAS DOS
CAMUNDONGOS: Para a verificação das subpopulações de medula e da pureza dos
precursores após a separação magnética, foram separadas alíquotas de 0,2 x 106 células de
medula dos camundongos das diferentes idades, e das amostras pós-separação magnética a
fim de observar o padrão do fenótipo celular com marcação por anticorpos acoplados a
fluorocromos por citometria de fluxo.
3.4 - SELEÇÃO DAS CÉLULAS PRECURSORAS DE LINHAGEM B (B220
+
IGM-):
Foram utilizados tubo tipo Falcon para centrifugação das células de medula óssea em 1300
rpm a 4°C por 7 minutos, o sobrenadante foi retirado e as células foram ressuspendidas
num volume determinado de tampão de acordo com o número de células totais recuperadas
para camundongos de diferentes idades. Foi adicionado a cada volume, anticorpo α IgM
acoplado a microbeads magnéticas (Miltenyi Biotec) para uma concentração final do
mesmo de 1:20. As células foram incubadas por 20 minutos em gelo. Após incubação as
células foram centrifugadas e ressuspendidas em 500 µL de PBS, EDTA 2 mM com 5% de
12
soro fetal bovino para serem passadas na coluna magnética seguindo o protocolo do
fabricante.
A separação das células B220+ IgM- da medula óssea por seleção negativa, foi feita
por depleção das células não marcadas com o anticorpo específico, após lavagem indicada
em protocolo.
As células obtidas posterior passagem na coluna foram centrifugadas em 1300 rpm
a 4°C por 7 minutos e ressuspendidas em meio de cultura. Em seguida realizou-se
contagem celular e posteriormente as células foram resuspendidas em volume de acordo
com o número de células totais recuperadas em cada tubo tipo Falcon (6 meses, 3meses, 20
dias) e marcadas com anticorpo α CD19 acoplado a microbeads magnéticas para
concentração final do mesmo de 1:10. As células foram incubadas por 20 minutos em
banho de gelo, centrifugadas e ressuspendidas em 10 mL, novamente centrifugadas e
passadas em coluna magnética para seleção positiva seguindo protocolo de seleção do
fabricante. As células obtidas foram centrifugadas e ressuspendidas em meio OptiMEM,
10% de soro fetal bovino, 5 ×10-5 M de 2-β- mercaptoetanol, 100 U/mL de estreptomicina
e 100 µg/mL de penicilina, centrifugadas e ressuspensas em 1mL para contagem celular e
plaqueadas.
3.5 - CULTURA DE DIFERENCIAÇÃO DE PRECURSORES DE CÉLULAS B: LPS
(Lipopolissacarídeo) foi utilizado, em diferentes concentrações e tempo de cultura, como
estímulo para maturação das células B220+ IgM-, após 3 dias de cultura das mesmas. As
concentrações de LPS utilizadas foram as seguintes: 12,5; 2,5; 0,5 µg/mL. Foram
cultivadas 0,2x106 células / 200 µL / poço (placa de 96 poços) em meio de cultura
OpitMEM suplementado como descrito acima, com os determinados estímulos em estufa
umidificada a 37°C, com CO2 a 7%.
3.6 - ANÁLISE DE CÉLULAS POR CITOMETRIA DE FLUXO (FACS): Para a análise
fenotípica das células por citometria de fluxo, foi realizada a marcação das diferentes
amostras com um “mix” de anticorpos acoplados a fluorocromos. Os anticorpos usados
foram os seguintes: CD23 PE, B220 FITC, IgM Alexa, CD23 APC, CD69 PE, IgM FITC.
Esses anticorpos foram diluídos em tampão PBS suplementado com 5% de soro fetal
bovino e azida a 0.05% para a preparação dos diferentes “mix”. As amostras foram
incubadas em volume de 30µl por 20 min. a 4 °C e lavadas com o mesmo tampão usado
13
para a incubação. Após a lavagem, as células foram ressuspendidas com o tampão para a
separação de alíquotas da amostra para a marcação das células em cultura, a fim de
observá-las em análises de citometria de fluxo.
14
4 - RESULTADOS
4.1 - CARACTERIZAÇÃO DA LINHAGEM B E ANÁLISE DA PURIFICAÇÃO DOS
PRECURSORES DE MEDULA ÓSSEA EM ANIMAIS DE DIFERENTES IDADES.
A fim de se estudar o efeito do LPS como estímulo de maturação para os linfócitos
B, via receptor tipo Toll 4, na linfopoeise de células B dos camundongos de diferentes
idades, foram realizados para obtenção e análise de maturação das células B experimentos
in vitro.
Como passo inicial do estudo, as células hematopoéticas do canal medular do fêmur
dos camundongos C57BL/6 de 20 dias, 3 meses e 6 meses foram retiradas e posteriormente
incubadas com anticorpos monoclonais anti-IgM acoplados a micro-partículas magnéticas
para depletar linfócitos B, e com anticorpos anti-CD19 acoplados a micro-partículas
magnéticas, para a obtenção dos precursores (B220 +IgM-) de células B. A analise
populacional das medulas ósseas dos animais das diferentes idades bem como a avaliação
da pureza dos precursores B purificados foi feita por citometria de fluxo (Figura 1). Na
citometria de fluxo, as células B foram visualizadas a partir da detecção da fluorescência
emitida por anticorpos acoplados a flurocromos, específicos para marcadores de superfície
característicos de diferentes estágios da linfopoiese B.
Antes da purificação, a porcentagem de precursores na medula total dos
camundongos eram de: 36%, 20% e 8,16% para camundongos de 20 dias, 3 meses e 6
meses respectivamente.Tal fato pode ser remetido ao declínio da linfopoiese B ao longo da
ontogenia já descrito em outros trabalhos (CLAIRE-ANNE SIEGRIST*, RICHARD
ASPINALL, 2009). De acordo com o experimento realizado, a porcentagem de precursores
recuperados também varia após a purificação nos camundongos de idades diferentes. Nos
camundongos de 20 dias há 97% de pureza comparada com 95% e 86% de pureza dos
camundongos de 3 e 6 meses respectivamente, ou seja, com o avanço da idade, menor
foram as porcentagens dos precursores. Dessa maneira, a diminuição de células B na
medula óssea dificulta a purificação das mesmas em meio a outras linhagens celulares
presentes na medula.
15
Figura 1: Análise da purificação das células da medula óssea.
Gráfico das Subpopulações de células B B220+ e IgM + da medula óssea total e de precursores B purificados.
Nessa análise foram utilizados camundongos de diferentes idades: 20 dias; 3 meses e 6 meses. As células da
medula óssea total foram incubadas com anti-IgM magnético, passadas na coluna para seleção negativa,
posteriormente as células depletadas foram incubadas com anticorpo anti-CD19 magnético para a seleção
positiva. Amostras de células da medula óssea total e dos precursores purificados foram incubadas com
anticorpo anti-B220 FITC e anti-IgM Alexa 647 para análise por citometria de fluxo.
4.2 - ESTUDO DA MATURAÇÃO DAS CÉLULAS DE LINHAGEM B IN VITRO
As células obtidas da medula óssea dos camundongos foram colocadas em placas
de cultura contendo meio de cultura e incubadas por 3 dias para diferenciação celular. Nas
primeiras 24 horas surgem os linfócitos IgM+ e em 72 horas passam ser aproximadamente
cerca de 50% da população B220+ presente em cultura, posteriormente a esse período
ocorre aumento da mortalidade celular. Após diferenciação as células foram estimuladas a
maturação in vitro pelo mitógeno LPS.
A transição do estágio das células imaturas para células B maduras inclui mudanças
na expressão de marcadores, como menor expressão do marcador AA4.1 e expressão do
marcador CD23. Utilizamos a expressão de CD23 como leitura para avaliar o nível de
maturação in vitro. A análise do nível de expressão CD23 a partir dos linfócitos
16
estimulados com LPS, por citometria de fluxo, envolve: seleção das células nucleadas,
exclusão das células mortas, identificação das populações B220+, IgM+ e CD23
+
de
células B ( Figura 2).
As células nucleadas foram selecionadas em um gráfico de tamanho (forward
scatter) e granulosidade (side scatter) por uma área de estudo previamente delimitada
(gate) que abrange as populações de macrófagos, polimorfonucleares e linfócitos (Figura
2a).
Para exclusão de células mortas foi utilizado iodeto de propideo (PI), um composto
fluorescente que se liga ao DNA e não atravessa membrana celular devido a sua baixa
lipofilicidade. Quando este atravessa a membrana plasmática é sinal que ela esta
danificada, indicando perda de viabilidade celular. O PI fluoresce em canais específicos do
citômetro de fluxo, FL-2 e FL-3, possibilitando a identificação das células marcadas com
esse composto. Normalmente as células com PI são visualizadas formando uma diagonal
na analise de citometria, e assim podem ser excluídas com a delimitação de uma gate
(Figura 2b).
Os marcadores de superfície B220, CD23 e o receptor de células B IgM
caracterizam estágios do desenvolvimento das células B. Em animal adulto três principais
subpopulações de células B são descritas na medula óssea de acordo com o padrão de
expressão de B220 e IgM (CARSETTI et al., 1995): (I) Células B imaturas B220lowIgMlow,
que correspondem ao estágio mais imaturo de linfócitos B, IgM+;(II) Células B
transicionais B220interm/highIgMhigh, mais avançadas na maturação; e (III) Células B maduras
foliculares recirculantes B220highIgMlow. Na Figura 2c podemos observar que o sistema de
diferenciação in vitro permite a geração de linfócitos B imaturos e transicionais, mas não
maduros.
O marcador de superfície CD23 sugere que as células B estão avançando no estágio
de maturação. Esse marcador é expresso em uma significativa parte das células
transicionais e em todas as células maduras da linhagem B.
17
Figura 2: Abordagem Usada para Análise da Maturação das Células B.
Análise das subpopulações que expressam CD23. (a) seleção das células nucleadas por citometria em gráfico
de tamanho (forward scatter) e granulosidade (side scatter); (b) Padrão de identificação de células viáveis
por fluorescência com utilização de iodeto de propídeo (PI), onde a região R7 corresponde as células viáveis;
(c) identificação das células B precursoras (B220+ IgM-, em R5), imaturas e transicionais ( B220+IgM+, em
R1); (d) identificação das células CD23+, em R8.
4.3 - DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS B IN VITRO EM RESPOSTA AO LPS EM
CAMUNDONGOS DE DIFERENTES IDADES.
No estudo presente foi utilizado sistema experimental in vitro de diferenciação de
células B com meio de cultura e adição do mitógeno LPS. Sistemas experimentais In Vitro
de diferenciação têm sido extensamente utilizados para o estudo dos processos envolvidos
no desenvolvimento da linhagem B (HARDY et al., 1991; CUMANO et al., 1990; RAY et
al., 1998; ROLINK et al., 2000).
Após 2 dias, as culturas de precursores B purificados foram estimuladas com LPS e
incubadas por mais um dia, e posteriormente recolhidas e marcadas com anticorpos antiB220, anti-IgM e anti-CD23, a fim de se visualizar a maturação das células B pelo agonista
de TLR4. A presença de diferentes subpopulações foi analisada por citometria utilizando a
abordagem descrita no item 4.3.
A porcentagem das subpopulações de linfócitos B que expressaram CD23 foi
analisada nos camundongos de diferentes idades (Figura 3a).
18
Figura 3 a: Análise Comparativa da Expressão de B220 e CD23 em Resposta ao LPS ao Longo da Ontogenia
das Células B.
Os gráficos apresentam a porcentagem de células CD23+ dentro da população IgM+
das culturas de
precursores B de camundongos de diferentes idades: 20 dias, 3 meses e 6 meses, estimuladas por 20 horas
com LPS a 12,5 µg/mL (a direita) comparado com o controle de células não tratadas com LPS (a esquerda),
após 3 dias de cultura celular. As células forma purificadas em coluna magnética, incubadas com anticorpo
anti- B220 e anti- CD23. As amostras foram lidas no citometro de fluxo.
19
Nos camundongos jovens foi observado um aumento de 3 vezes na porcentagem de
CD23 comparado com controle. Em relação aos camundongos adultos também houve
aumento de aproximadamente de 3 vezes da porcentagem de CD23, após as células
receberem o estímulo LPS para maturação.
Os resultados demonstram que o organismo envelhecido tende a responder de
forma igual ao organismo jovem ao LPS. Em camundongos de 20 dias aumentou de 7,5%
para 21,8% a porcentagem de células B CD23+, nos camundongos de 3 meses aumentou de
5,3 para 16% e em camundongos de 6 meses aumentou de 4,2% para 11,5%, significando
que ao longo da ontogenia a resposta ao LPS se mantém. Por outro lado verificamos que a
expressão de CD23 é maior em camundongos de 20 dias em relação aos camundongos de 3
e 6 meses (Figura 3b).
Figura 3b: Análise da expressão de CD23 em camundongos de diferentes idades.
O gráfico mostra a porcentagem de CD23+ em células B de camundongos de 20 dias, 3 meses e 6 meses de
idade tratados com LPS em diferentes concentrações: 0,5µg/mL; 2,5µg/mL; 12,5µg/mL.
20
4.4 - MENOR RESPOSTA DE CÉLULAS B IN VITRO AO LPS NÃO CORRESPONDE
TOTALMENTE COM AVANÇO NA IDADE DO ANIMAL.
Ao relacionar a porcentagem de células CD23+ com o envelhecimento do animal
em um segundo experimento, foi observado que em camundongos de 3 meses a
porcentagem de CD23 em culturas estimuladas com LPS era menor em relação ao
camundongo de 6 meses (Figura 4). Observamos que esse resultado coincidiu com baixa
pureza de precursores (85%) dos animais de 3 meses, menor que na cultura de precursores
de animais de 7 meses (96%) neste caso. A influencia de outras linhagens diferentes de B
na maturação das células B poderia ser a causa pela qual houve pouca diferenciação dos
precursores das células B de camundongos de 3 meses, assim, experimentos com cultura
de células B com outras linhagens celulares foram realizados.
É presente na literatura que a linfopoiese de células B na medula parece diminuir
em virtude do envelhecimento do animal, tendo-se por outro lado um aumento de outras
linhagens celulares, entretanto, ainda não se tem confirmado como essas alterações podem
afetar a diferenciação de células B.
Figura 4: Análise do desenvolvimento das células B In Vitro.
Gráfico de coluna da diferenciação das células B em CD23+ por estimulo de LPS em camundongos de
diferentes idades. Os precursores purificados dos camundongos, após 3 dias de cultura, foram estimulados
com LPS a 12,5 µg/mL
por 24 horas, a fim de observar diferenciação celular da linhagem B nos
camundongos. As células da cultura foram incubadas com anticorpo anti-B220 e anti-CD23 acoplados a
fluorocromo e analisadas por citometria.
21
4.5 - PRESENÇA DE CÉLULAS QUE NÃO PERTENCEM À LINHAGEM B INIBE A
DIFERENCIAÇÃO DOS PRECURSORES B IN VITRO.
Os precursores purificados dos camundongos de 20 dias foram utilizados para
observação da diferenciação das células B na presença do agonista LPS e de células de que
não pertencem à linhagem B.
Em cultura celular de camundongos de 20 dias foram adicionadas células de outras
linhagens presentes na medula óssea tanto dos próprios camundongos de 20 dias quanto de
camundongos de 4 meses, em diferentes tempos de estímulo e diferentes concentrações de
LPS para maturação das células B (figura 5 a e 5 b).
Após analise da cultura de células B com outras linhagens celulares foi observado
que em diferentes concentrações de LPS: 12,5 µg/mL e 0,25µg/mL na presença de
linhagens celulares diferentes de B ocorreu um declínio na porcentagem de linfócitos B
CD23+. Em 20 horas de estimulo com LPS foi observado que a porcentagem de CD23
diminui em culturas de linfócitos B com 5% e 20% de linhagens celulares diferentes de B
de camundongos de 20 dias. Com linhagens celulares diferente de B de camundongos de 4
meses, o efeito inibitório de CD23 foi mais acentuado (Figura 5a).
Em 72 horas de estímulo com LPS em diferentes concentrações na presença de
linhagens celulares não-B tanto de camundongos de 20 dias quanto de 4 meses ocorreu
diminuição na porcentagem de células B CD23+ (Figura 5b). Entretanto esse efeito pode
ser mais bem visualizado nas primeiras 20 horas de estímulos em cultura com linhagens
celulares diferentes de B de camundongos de 4 meses.
Visto que a diferenciação das células B ocorre com o agonista LPS independente da
idade dos camundongos e que na presença de outras linhagens celulares ocorre diminuição
da diferenciação das células B em CD23+, acredita-se então não ser um defeito intrínseco
dos linfócitos, mas o microambiente em que esse se encontra que influencia na maturação
dessas células B.
22
Figura 5 a: Análise da diferenciação das células B na presença de linhagem celular diferente de B em 20
horas de estímulo com LPS.
Análise da maturação das células B por porcentagem de CD23 em 20 horas de estímulo com LPS. Foram
utilizadas as porcentagens de 5 % e 20% das células não B obtidas de camundongos na cultura das células B.
Células de camundongos de 20 dias foram estimuladas com LPS em diferentes concentrações: 12,5 µg e
2,5µg, após 3 dias de cultura, na presença de linhagem celular diferente de B dos próprios camundongos de
20 dias e de camundongos de 4 meses.
23
Figura 5 b: Análise da diferenciação das células B na presença de linhagem celular diferente de B em 72
horas de estímulo com LPS.
Análise da maturação das células B por porcentagem de CD23 em72 horas de estímulo com LPS. Foram
utilizadas também nesse experimento as porcentagens de 5 % e 20% das células não B obtidas de
camundongos na cultura das células B. Células de camundongos de 20 dias foram estimuladas com LPS em
diferentes concentrações: 12,5 µg e 2,5µg, após 3 dias de cultura, na presença de linhagem celular diferente
de B de camundongos de 20 dias e 4 meses.
24
5 - DISCUSSÃO
As células tronco-hematopoéticas são geralmente menos de uma por 5 x 104 células
da medula óssea (KUBY et al., 2008) e a partir dela originam-se os precursores linfóides
comum (CLPs), desses uma pequena parte se diferenciam em células B. Entretanto a
porcentagem de células B tende a diminuir ainda mais ao longo da ontogenia de um
organismo (CLAIRE-ANNE SIEGRISY* & RICHARD ASPINALL, 2009).
As células B podem se diferenciar em sistemas in vitro até o estágio de células
transicionais (CEREDIG et al., 1998), na presença de células estromais, da citocina IL-7
ou de mitógenos.
Estudos demonstraram que o LPS, agonista de TLR4, promove maturação dos
linfócitos (HAYASHI et al., 2005). Assim, in vitro, o LPS em células imaturas
(AA4lowIgMhigh) estimula a expressão do marcador de superfície CD23, e as células que
expressam esse marcador passam para novo estágio de desenvolvimento e são chamadas
células B transicionais. No entanto, os fatores envolvidos na regulação da expressão de
CD23 em células B ainda são desconhecidos. Sabe-se que o BAFF é importante fator para
a sobrevivência e maturação dos linfócitos B no baço e é capaz de induzir as células B
transicionais a expressarem o marcador CD23 (GORELIK et al., 2004).
A capacidade de induzir a expressão de CD23 pelo LPS já foi descrita na literatura
também para linfócitos B maduros. Os linfócitos B maduros CD23+ têm os níveis de CD23
aumentados na presença de LPS e IL-4, num fenômeno chamado de superindução de CD23
(CONRAD et al., 1988). A ativação dos linfócitos B pelo LPS também já é descrita, e
ocorre de maneira semelhante à que ocorre em linfócitos B maduros.
Nossos resultados iniciais confirmaram que a linfopoiese de B tende a diminuir
com a idade do animal como descrito em literatura. As causas porque tal fato ocorre ainda
não foram esclarecidas. Assim, no presente trabalho, com camundongos de diferentes
idades, foi estudado se a maturação in vitro dos linfócitos B a partir de precursores
purificados da medula óssea, estimulada ou não por LPS, pode variar ao longo da
ontogenia, verificando o papel de outras linhagens celulares nesse processo.
Vimos que nos camundongos de 20 dias na presença de LPS ocorreu maior
diferenciação dos precursores em células CD23+ comparado com os outros camundongos
de idades adulta. Sugerindo que os linfócitos B de camundongos de 20 dias são capazes de
maior maturação em resposta ao LPS.
25
Em uma segunda avaliação do comportamento das células B da medula óssea em
resposta ao LPS, verificamos que as células B dos camundongos de 3 meses, apresentavam
menor porcentagem de CD23+ em relação as células B dos outros camundongos estudados.
Vale ressaltar que neste experimento em particular, nos animais de 3 meses a porcentagem
de precursores purificados encontrava-se menor em relação aos precursores dos animais de
7 meses, sugerindo que possíveis linhagens celulares diferentes de B poderiam estar
interferindo na maturação dos linfócitos B pelo agonista de TLR4, LPS. A influencia de
outras linhagens estaria inibindo não só a maturação dos camundongos de 3 meses, como
também dos camundongos de 7 meses, uma vez que nesses últimos também foi observado
declínio da porcentagem de CD23 comparado com camundongos jovens.
A fim se confirmar a hipótese que a inibição da maturação dos linfócitos não era
efeito intrínseco dos mesmos, mas o microambiente em que se encontravam, foi realizado
experimento com 20 e 72 horas de estímulo com LPS, na presença de linhagem diferente
de B de camundongos de 20 dias e 4 meses. A inibição da maturação pelo LPS foi
claramente visualizada na presença das linhagens não-B, confirmando a hipótese.
O efeito inibitório de linhagens não-B presentes poderia ser explicado pelos tipos de
linhagens presentes; ou as condições que se encontravam essas linhagens no
microambiente do camundongo antes de serem postas em cultura, ou ainda citocinas
liberadas por essas que estariam fazendo o efeito inibitório.
O LPS é pontencial ativador de macrófagos e outros tipos celulares da medula
óssea levando essas células a secretarem algumas citocinas, como IFN tipo I e TNF-α que
podem também inibir o desenvolvimentos de B (LIN, DONG, COOPER, 1998; UEDA et
al., 2004). Outros estudos mostram que células Natural Killer (NK), bem como presença
de certas citocinas em cultura de células B inibe o desenvolvimento dos linfócitos B
(CLAIRE-ANNE SIEGRISY* & RICHARD ASPINALL, 2009; ANNE, KING,
RICHARD* et al., 2009). Poderiam então essas mesmas células ter uma influencia na
maturação dos linfócitos? Caso tenha, em que proporções seriam capazes de inibir a
maturação? Nossos estudos demonstraram que em 5% de linhagem celular não-B presente
em cultura já é capaz de inibir a maturação dos linfócitos B.
De acordo com os resultados encontrados seria importante identificar que tipo de
linhagem celular estaria realizando o efeito inibitório da maturação dos linfócitos B e
determinar se a inibição ocorre por simples contato ou pela secreção de alguma citocina,
26
esses estudos seriam um acréscimo ao entendimento do comportamento do linfócito B em
meio a outro tipo celular na cultura, entre outros aspectos.
De fato, observamos neste trabalho que em estudos do desenvolvimento de células
B os níveis de pureza são de extrema importância, pois pequena quantidade de outras
linhagens ou citocinas podem influenciar nos resultados finais.
Os conhecimentos adquiridos por esses estudos presentes, além dos já existentes,
possibilita o estabelecimento de cultura de linfócitos B com maiores critérios, levando em
consideração a porcentagem de outras linhagens diferentes B, bem como a influencia do
LPS na maturação dos linfócitos B ao longo da ontogenia, além de refletir em
conhecimento para a imunologia básica.
27
6 - CONCLUSÃO
1) O LPS, agonista de TLR4, é capaz de induzir maturação dos linfócitos B. Resultado
observado através da leitura de CD23 como marcador de maturação.
2) Linfócitos B de camundongos jovens são em geral mais responsivas ao LPS
comparado com os linfócitos B dos camundongos adultos e idosos por
apresentarem maior nível de pureza dos precursores B.
3) Linhagens celulares diferentes de B são capazes de inibir a ação estimulatória do
LPS no desenvolvimento dos linfócitos B mesmo em porcentagens muito pequenas.
28
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