UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJÁI
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE FARMÁCIA
FLÁVIA CRISTINA FIORI SANT’ANA
AVALIAÇÃO DA HEMOCOMPATIBILIDADE IN VITRO DE
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE DERIVADOS DA QUITOSANA.
Itajaí, 2013.
FLÁVIA CRISTINA FIORI SANT’ANA
AVALIAÇÃO DA HEMOCOMPATIBILIDADE IN VITRO DE
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE DERIVADOS DA QUITOSANA.
Monografia apresentada como requisito para
a obtenção do título de farmacêutico pela
Universidade do Vale do Itajaí, Centro de
Ciências da Saúde.
Orientadora: Profª. Dra. Anna Paula de
Borba Batschauer
Co-Orientador: Prof. Dr. Clóvis Antonio
Rodrigues
Itajaí (SC),
Junho de 2013.
Dedico aos meus pais, Flávio e Roseny,
por terem me ajudado a concretizar o tão
esperado sonho, que no decorrer de minha
vida me proporcionaram carinho e amor,
além de conhecimento e perseverança para
me tornar a pessoa que sou hoje.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, aos quais tenho muito orgulho, respeito e admiração, por
todo o esforço, nunca me faltaram com seu amor e paciência para enfrentar comigo
os meus momentos difíceis.
Aos meus avos, Dona Eny, por me incentivar desde criança a ser alguém e
querer algo mais, em especial ao Seu Domingos, que foi o meu maior exemplo de
conhecimento e inteligência.
Ao meu irmão Leonardo, que me ajudou dando força para continuar com um
carinho especial e amizade.
A Aline, que me ajudou muito na parte técnica e escrita do meu trabalho,
precisando vir aos sábados para me ajudar.
A minha orientadora, Profª Dra. Anna Paula de Borba Batschauer, pela
paciência, orientação e incentivo, como também aos puxões de orelha.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues que com muito
carinho me ajudou com as partículas e na orientação.
Aos membros da banca, pelas ideias compartilhadas, conselhos e
comentários valiosos que contribuíram para a consecução deste trabalho.
Aos meus amigos que tiveram muita compressão e companheirismo nos
meus momentos de desespero.
Ao meu namorado, pelo amor e paciência. Graças a sua presença foi mais
fácil transpor os dias de desânimo e cansaço.
A todos aquele que de alguma forma estiveram e estão próximos de mim,
fazendo esta vida valer cada vez mais. Obrigada por tudo!
“Nunca tenha medo de algo novo.
Lembre-se de que um amador
solitário construiu a Arca. Um
grande grupo de profissionais
construiu o Titanic.”
Luís Fernando Veríssimo
AVALIAÇÃO DA HEMOCOMPATIBILIDADE IN VITRO DE
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE DERIVADOS DA QUITOSANA.
Flávia Cristina FIORI SANT’ANA
Orientador: Profª. Dra. Anna Paula de Borba Batschauer
Defesa em: junho de 2013
Resumo:
A quitosana é obtida a partir da desacetilação parcial ou total da quitina, o
qual um polímero com importantes propriedades biológicas. Assim como a
quitosana, as partículas obtidas a partir dela possuem as mesmas propriedades e
vem sendo amplamente utilizadas em processos biotecnológicos, há relatos de
serem empregadas como anticoagulante, sendo assim, ele deve ser
hemocompatível. Para isso o material não poderá reagir com o plasma sanguíneo,
pois em alguns materiais pode ocorrer a adsorção de proteínas, e sucessivamente
a adesão plaquetária e a ativação de mecanismos de coagulação, além de reagir
com células sanguíneas alterando suas contagens e morfologia, sendo assim, a
proposta de materiais não aderentes a essas proteínas e células, poderá garantir a
hemocompatibilidade do produto. O objetivo deste estudo foi avaliar a
hemocompatibilidade in vitro de partículas magnéticas derivadas da quitosana, Ocarboximetilquitosana (OC) e a O-carboximetilquitosanabenzilada (OCBZ) em
diferentes concentrações, através de amostras de doadores saudáveis, utilizando
testes coagulométricos, tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina
parcial ativada (TTPa), além da contagem de plaquetas através da metodologia de
impedância e Fônio, leucócitos através da metodologia óptico e Shigilling e análise
da morfologia através de extensões sanguíneas. De acordo com os testes
realizados, as partículas não interferiram nos testes coagulométricos e processos
de coagulação (p> 0,248), entretanto durante as contagens celulares foi observada
uma diminuição da celularidade, em especial das hemácias, onde foi confirmada
com a existência de hemólise nas concentrações de OC (p= 0,022). Sugere-se,
que a partícula OCBZ pode ter sua utilização como veículo e na produção de
medicamentos, nas concentrações 5mg/mL, 10mg/mL, 15mg/mL, mas para isso
deve-se realizar testes confirmatórios. O mesmo não foi observado com a partícula
OC, uma vez que esta provocou hemólise comprometendo o seu uso como
partícula hemocompatível, podendo ser realizado diferentes testes, para diferentes
aplicações em diversas áreas.
Palavras- chaves: Cascata de coagulação. Hemocompatibilidade. Partículas
magnéticas.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estrutura química da quitosana............................................................... 21
Figura 2- Fase de iniciação .................................................................................... 25
Figura 3- Fase de amplificação .............................................................................. 26
Figura 4- Fase de propagação ............................................................................... 27
Figura 5- Fórmula para a obtenção da porcentagem de hemólise ......................... 33
Figura 6- Número de plaquetas .............................................................................. 36
Figura 7- Porcentagem de hemólise....................................................................... 37
Figura 8- Comparação das medianas das amostras de cada concentração para as
diferentes partículas ................................................................................................ 38
Figura 9- Tempo de ativação da protrombina ......................................................... 39
Figura 10- Tempo de tromboplastina parcial ativada.............................................. 40
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 19
2.1 Objetivo geral .................................................................................................. 19
2.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 19
3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 21
3.1 Quitosana e seus derivados ........................................................................... 21
3.2 Hemocompatibilidade com partículas magnéticas ...................................... 22
3.3 Plaquetas ......................................................................................................... 23
3.4 Leucócitos ....................................................................................................... 23
3.5 Hemólise .......................................................................................................... 23
3.6 Cascata de coagulação ................................................................................... 24
3.6.1 Fase de iniciação ........................................................................................................ 24
3.6.2 Fase de amplificação .................................................................................................. 25
3.6.3 Fase de propagação ................................................................................................... 26
3.7 Avaliação da coagulação ................................................................................ 27
4 METODOLOGIA .................................................................................................. 29
4.1 População e amostra ...................................................................................... 29
4.2 Coleta de amostras ......................................................................................... 29
4.3 Preparo das partículas .................................................................................... 29
4.4 Preparo das amostras ..................................................................................... 30
4.5 Métodos ........................................................................................................... 30
4.5.1 Contagens celulares ................................................................................................... 30
4.5.1.1 Contagem de plaquetas............................................................................................. 31
4.5.1.2 Contagem de leucócitos ............................................................................................ 31
4.5.1.3 Análise da morfologia celular .................................................................................... 32
4.5.2 Tempo de protrombina (TP)....................................................................................... 32
4.5.3 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) ................................................... 32
4.5.4 Hemólise ...................................................................................................................... 33
4.5.5 Análise estatística ....................................................................................................... 33
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 35
5.1 Leucócitos e morfologia ................................................................................. 35
5.2 Plaquetas e hemólise ...................................................................................... 35
5.3 Tempo de protrombina (TP) ........................................................................... 38
5.4 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa)......................................... 39
6 CONCLUSÕES .................................................................................................... 43
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 45
APÊNDICE A- TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ........... 49
APÊNDICE B- TERMO DE UTILIZAÇÃO DE DADOS PARA COLETA DE DADOS
DE PESQUISAS ENVOLVENDO SERES HUMANOS ........................................... 53
ANEXO A- PARECER ÉTICA Nº 332/11a .............................................................. 55
17
1 INTRODUÇÃO
A quitosana é um polissacarídeo macromolecular obtido a partir da
desacetilação total ou parcial da quitina, o qual é polímero natural, mais abundante
e uma fonte de matéria-prima altamente renovável e economicamente viável.
Apresentam importantes propriedades biológicas, tais como, baixa toxicidade,
antibacteriana, não causa alergia, além de poder ser empregado como
anticoagulante já que trata de um produto biocompatível, como também pode ser
usada na absorção de íons metais, corantes e proteínas, e nas áreas da
agricultura, bioquímica e biotecnologia. Assim como a quitosana, partículas
magnéticas obtidas a partir dela também possuem as mesmas propriedades e vem
sendo amplamente utilizadas em diferentes processos biotecnológicos (JANEGITZ
et al., 2007; YANG et al., 2008; DUSZA et al., 2010; TSAI et al., 2010).
Estudo realizado mostra que as partículas catiônicas podem ser tóxicas,
devido à interação de cargas dos componentes celulares e proteínas, já as
aniônicas podem causar agregação plaquetária. Ademais, a habilidade de inibir a
agregação plaquetária também pode estar relacionada com o tamanho da
partícula, da sua superfície hidrofóbica e carga (BENDER et al., 2012).
Um material para ser considerado hemocompatível precisa ter afinidade com
o plasma sanguíneo. A resposta inicial do sangue quando em contato com um
material estranho é a adsorção de proteínas sobre a sua superfície (CHEN et al.,
2011). Sucessivamente a isso, tem-se então a adesão de plaquetas e a ativação de
mecanismos de coagulação levando à formação de trombos, que obstruem vasos e
interrompe o fluxo sanguíneo levando aos eventos isquêmicos (ZAGO; FALCÃO;
PASQUINI, 2004).Durante a coleta, deve-se tomar certos cuidados para que não
ocorra a ativação dos mecanismos de coagulação, tais como o dispositivo de
punção venosa, tipo de tubo de coleta, transporte da amostra e condições de
armazenamento antes da análise (LAGA; CHEVES; SWEENEY, 2006).
Em Mayer e colaboradores (2009) há relatos de pacientes que inalaram
nanopartículas, material particulado proveniente do ar como também preparações
medicamentosas, onde os possíveis efeitos após a exposição foram infarto agudo
do miocárdio, acidente vascular cerebral isquêmico, alterações na função
18
plaquetária e hemostasia, resultando em trombose, inflamação ou anormalidades
em campos de propriedades do plasma.
A cascata de coagulação pode ser relacionada a duas diferentes vias, com
diferentes estímulos endógenos e exógenos. O sistema extrínseco é ativado por
fatores endógenos, já o intrínseco é ativado por fatores exógenos, formam uma
importante cadeia de reações enzimáticas in vivo que é ativada até a formação da
rede de fibrina e a formação do coágulo. As reações podem ser monitoradas a
partir de testes in vitro onde os componentes da via extrínseca estão refletidos no
tempo de atividade de protrombina (TP) e os componentes da intrínseca estão
refletidos no tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). Estes testes são
utilizados para o diagnóstico e monitoramento de doenças relacionadas com a
coagulação (HOFFMAN, 2003; ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004).
Para a análise da compatibilidade hematológica, além dos testes
coagulométricos, também se pode avaliar através dacontagem de plaquetas e
leucócitos os quais podem estar comprometidas após o contato com moléculas
desenvolvidas em técnicas de síntese laboratorial, bem como alterações
morfológicas que podem ser avaliadas por metodologias de automação e
microscópia óptica (JANEGITZ et al., 2007).
A indústria farmacêutica vem solicitando uma grande quantidade de
medicamentos, com características associadas à boa acessibilidade e bons
resultados a cerca de efeitos colaterais. A proposta de utilizar um derivado
magnético a partir da quitosana e analisar suas características hemocompatíveis,
poderá contribuir nos processos biotecnológicos relacionados à produção e
veiculação de novos fármacos.
O presente estudo baseia-se na crescente busca por novos fármacos
derivados de fontes naturais como a quitosana, como também a utilização de
partículas magnéticas como veículos de medicamentos, sem que ocorram
alterações nos sistemas biológicos, através da avaliação da coagulação sanguínea
e contagens celulares de leucócitos, plaquetas, como também a análise da
morfologia celular e a hemocompatibilidade das partículas magnéticas sintetizadas
a partir da quitosana, através de diversas análises laboratoriais.
19
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Analisar a hemocompatibilidade in vitro de partículas magnéticas de
derivados da quitosana, mantidas em contato com o plasma sanguíneo em
diferentes concentrações.
2.2 Objetivos específicos
Realizar os testes de TP e TTPa em amostras que permaneceram em
contato com diferentes concentrações da quitosana, partículas OC e OCBZ.
Determinar as alterações nos testes coagulométricos, TP e TTPa,
provocadas pelo contato com as partículas magnéticas derivadas da quitosana,
partículas OC e OCBZ.
Realizar a contagem de leucócitos e plaquetas em amostras mantidas em
contato com as partículas magnéticas derivadas da quitosana, partículas OC e
OCBZ.
Verificar o aspecto da morfologia celular em amostras mantidas em contato
com as partículas magnéticas derivadas da quitosana, partículas OC e OCBZ.
Discutir as alterações hematológicas em relação à concentração das
partículas magnéticas, OC e OCBZ, mantidas em contato com as amostras
biológicas.
20
21
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Quitosana e seus derivados
As nanopartículas magnéticas têm sido objetivo de diversos estudos para
diferentes aplicações tecnológicas, inclusive na área biomédica, tais como
aumentar a incorporação de drogas e seu controle de liberação para os sistemas,
como exemplo temos o seu uso na terapia do câncer, podendo apresentar
características próprias para os objetivos desejados de acordo com a metodologia
de preparo. Estas características, como uniformidade de tamanho, área superficial,
biocompatibilidade e propriedades magnéticas podem ser direcionadas de forma
que sejam adequadas para as aplicações a que se destinam. Por ter boa
biocompatibilidade, biodegrabilidade e propriedades magnéticas permitem o
controle da sua posição em um determinado meio através do posicionamento de
um campo magnético externo, possibilitando diferentes aplicações, como na terapia
antitumoral, através das técnicas de hipertermia induzida magneticamente e a
liberação vetorizada de agentes terapêuticos, em que há um acúmulo do material
magnético numa determinada região, podendo ser usado para acelerar o processo
de cicatrização de uma ferida e para sustentação de células (YANG et al., 2008;
MAYER et al., 2009; DUSZA et al., 2010;DEBRASSI, 2010).
Figura 1- Estrutura química da quitosana
Fonte: LARANJEIRA; FÁVERE, 2009.
Os derivados da quitosana são desenvolvidos através de diversas
metodologias, tais como, incorporação de nanopartículas magnéticas, ligação
covalente das quitosanas sobre a superfície das partículas ou método in situ de coprecipitação (DUSZA et al., 2010). Estudos mostram que em diferentes
22
metodologias usadas na obtenção de partículas magnéticas derivadas da
quitosana podem ser usadas para diferentes coisas, como em Yang e
colaboradores (2008), onde relatam que a quitosana em ácido acético e
heparinizada podem causar a coagulação sanguínea e deformação dos eritrócitos,
variando a intensidade de acordo com o peso molecular e o grau de desacetilação,
como também há relatos de a quitosana ou sua mistura com outros reagentes
como cloridrato de cálcio, alginato de sódio e fibrinogênio serem usados na
hemostasia. A partir de estudos como esses, passou a ser muito usada em testes
de hemostasia (YANG et al.,2008).
Alguns estudos modificam suas características como, minimização da
energia de superfície, equilíbrio ideal entre as características hidrofílicas e
hidrofóbicas, otimização da tensão superficial crítica, superfícies negativamente
carregadas e camadas de hidrogéis, buscando a otimização (YANG et al., 2008;
MAYER et al., 2009; XU et al.,2010).
3.2 Hemocompatibilidade com partículas magnéticas
A principal exigência para que um polímero seja um bom biomaterial é que
ele seja hemocompatível, ou seja, tenha boa afinidade com o plasma sanguíneo. A
resposta inicial do sangue quando colocado em contato com um material estranho
é a absorção de proteínas sobre as superfícies do objeto. Tem-se então a adesão
de plaquetas e a ativação de mecanismos de coagulação que levam à formação de
trombos (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004; CHEN et al., 2011).
Uma grande característica das nanopartículas é a sua forma e comprimento
como as proteínas circulantes do plasma como o fibrinogênio e as imunoglobulinas.
Essas proteínas possuem uma influência decisiva no plasma e viscosidade do
sangue, porém há uma preocupação do efeito das nanopartículas sobre esses dois
parâmetros (PACHECO et al., 2007). Portanto, através do desenvolvimento de
superfícies poliméricas não aderentes ou repelentes a proteínas podem minimizar a
ativação de contato dos mecanismos coagulantes (BERG, 1993).
A análise da hemocompatibilidade inclui hemólises, plaquetas e ativação da
coagulação do sangue, como já foram constatados em estudos, na sua maioria em
estudos in vivo (MAYER et al., 2009).
23
3.3 Plaquetas
As plaquetas são pequenas células anucleadas, descrita em 1906 por
Wright, formadas na medula óssea por fragmentação do citoplasma de uma célula
polipóide, os megacariócitos (PÉREZ RUÍZ et al., 1997). São ativadas rapidamente
após a lesão dos vasos sanguíneos ou exposição do sangue às superfícies
artificiais de dispositivos implantados, como também a adesão na superfície de
materiais estranhos, são um componente crucial da resposta primária da
hemostasia (YANG et al., 2007; FARIAS; BÓ, 2008).
A principal função das plaquetas é prevenir e deter a perda de sangue. Em
um indivíduo normal, estas células tem uma sobrevida de 8 dias, sendo o baço o
órgão responsável pela destruição de um terço das plaquetas circulantes (PÉREZ
RUÍZ et al., 1997).
3.4 Leucócitos
Os glóbulos brancos possuem a função primordial que consiste na resposta
imunológica frente a agressão do organismo por agentes infecciosos, tóxicos e
tumorais (NAOUM; NAOUM, 2010).
São agrupados em duas categorias diferentes: os leucócitos mononucleares
e os polimorfonucleares. Os primeiros incluem os linfócitos, plasmócitos e os
monócitos, que possuem núcleo único e uniforme. Os outros possuem granulação
citoplasmática e núcleo multiforme e segmentado, incluem os neutrófilos,
eosinófilos e basófilos (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004).
3.5 Hemólise
A hemólise é causada pela ruptura das células vermelhas, a qual libera
hemoglobina no plasma. O efeito da hemólise deve ser medido, pois pode causar
impacto na quantificação por alterar a amostra quando comparada com a matriz,
representada por uma amostra sem hemólise (CARTER et al., 2011).
Há dois tipos de hemólise, a hemólise extravascular onde as hemácias são
destruídas no tecido retículo-endotelial, especialmente no baço, onde alterações
afetam o citoesqueleto, a membrana ou a forma dos eritrócitos dificultando sua
24
passagem pelas fendas sinusoidais, aumentando o contato das hemácias com os
macrófagos. O outro tipo é a hemólise intravascular, são destruídas na própria
circulação, liberando o seu conteúdo no plasma, resultado de traumas mecânicos e
destruição imunológica pelo sistema complemento. Devido a essa hemólise pode
ocorrer o desenvolvimento de anemia, onde há um aumento de produção
eritropoietina pelo parênquima renal, estimulando os eritroblastos que passam a
lançar reticulócitos no sangue. Já o aumento de bilirrubina indireta pela destruição
das hemácias pelo baço, pode ocorrer a formação de cálculos biliares (ZAGO;
FALCÃO; PASQUINI, 2004).
3.6 Cascata de coagulação
Marfarlane e Davie & Ratnoff em 1964, propuseram o modelo da cascata de
coagulação para explicar a fisiologia de coagulação do sangue, segundo o qual a
coagulação ocorre por meio de ativação proteolítica sequencial de pró-enzimas por
proteases do plasma, resultando na formação de trombina que, então, quebra a
molécula de fibrinogênio em monômeros de fibrina (FERREIRA et al., 2010).
Atualmente utiliza-se um novo modelo para a cascata de coagulação,
baseado em células. Esse modelo inclui as proteínas pró-coagulantes, protrombina,
fatores e inibidores, ocorrendo em etapas distintas: iniciação, amplificação e
propagação (HOFFMAN, 2003).
3.6.1 Fase de iniciação
A coagulação é iniciada pelo fator tissular (TF), normalmente encontrado na
vasculatura. O fator VIIa/TF ativa pequenas quantidades de fator IX e X. O fator Xa
associado ao seu co- fator, o fator Va, forma complexos na superfície da célula TF
(HOFFMAN, 2003).
O fator V pode ser ativado pelo fator Xa ou por proteases, para ativar o fator
Va, necessário para a construção da protrombina. A presença de inibidores localiza
a efetividade do fator Xa para superfície em que foi formando. O fator IX pode
mover-se a partir do TF em que foi formada a próxima plaqueta ou a outra
superfície celular, uma vez que não seja inibida pelo TFPI ou inibida lentamente
pelo fator Xa pelo ATUI (HOFFMAN, 2003).
25
O fato VII é ligado ao TF extravascular X e IX, mesmo na ausência de lesão.
O processo de coagulação prossegue para a fase de amplificação apenas quando
há dano à vasculatura permitindo que as plaquetas e o F VIII/FvW sejam
derramados nos tecidos extravasculares e aderem ao TF no local da ação.
Podemos chamar essa via de extrínseca já que se dá fora da vasculatura (figura 2)
(HOFFMAN, 2003).
Figura 2- Fase de iniciação
Fonte: HOFFMAN, 2003
3.6.2 Fase de amplificação
Prepara o terreno para uma produção em larga escala de trombina para a
fase de propagação. A pequena quantidade de trombina gerada na célula TF tem
várias funções importantes, umas delas é a ativação de plaquetas, expondo os
sítios de ligação para os fatores de coagulação ativados. Durante a ativação, as
plaquetas liberam formas parcialmente ativadas do fator V sobre as suas
superfícies. Outra função na fase de iniciação é a ativação dos cofatores V e VII na
superfície das plaquetas. Nesse processo o complexo VII/vWF é dissociado, o que
permite que o vWF medeie a agregação adicional de plaquetas no local da lesão.
Também são ativados os fatores XI e XIa na superfície das plaquetas (figura 3)
(HOFFMAN, 2003).
26
3.6.3 Fase de propagação
Um grande número de plaquetas são recrutadas para o sitio da lesão, esta
fase ocorre na superfície das plaquetas ativadas (HOFFMAN, 2003).
O fator IXa ativado pode se ligar ao fator VIIIa, na fase de iniciação. O fator
adicional IXa pode ser fornecido pela plaqueta coberta de fator XI. Por não
conseguir se mover o fator Xa deve ser fornecido diretamente na superfície das
plaquetas pelo complexo dos fatores IX/ VIII. O fator Xa associa-se com o fator Va
ligado a plaqueta durante a fase de amplificação, levando a uma explosão de
geração de trombina de magnitude suficiente para coagular o fibrinogênio
(HOFFMAN, 2003).
A plaqueta provavelmente é o único tipo de célula em que ocorre de forma
mais eficaz a fase de propagação da coagulação. Sua superfície é especializada
para coordenar as montagens do tenase (FVIIIa/IXa) e protrombinase (figura 4)
(HOFFMAN, 2003).
Figura 3- Fase de amplificação
Fonte: HOFFMAN, 2003.
27
Figura 4- Fase de propagação
Fonte: HOFFMAN, 2003.
3.7 Avaliação da coagulação
O TP é um teste de screening que consiste na determinação do tempo de
formação do coágulo de fibrina após a adição de tromboplastina tecidual e de
cálcio, o que promove a ativação do fator VII, seguida da ativação do fator X,
iniciando a via comum de ativação. Mede os fatores envolvidos na via extrínseca e
na via comum, sendo independente da via intrínseca. Este teste também pode ser
usado para monitorar pacientes em uso de anticoagulantes orais, como a
warfarina, antagonista da vitamina K, causando variação na concentração dos
fatores da vitamina K dependentes. Útil na avaliação de deficiências adquiridas
e/ou congênitas dos fatores II, V, VII e X (FRANCO, 2001; FRITZEN et al., 2000).
O TTPa consiste na determinação do tempo de coagulação do plasma após
adição de um ativador da fase de contato da coagulação e de cefalina, que
substitui o fosfolípide da membrana plaquetária. É sensível ao nível dos fatores da
via intrínseca e da via comum (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004).
28
29
4 METODOLOGIA
4.1 População e amostra
Participaram desta pesquisa 13 voluntários com idade entre 18 a 40 anos,
saudáveis, que não faziam o uso de anticoagulante, contraceptivos orais ou
qualquer outro medicamento que possam influenciar nos processos de hemostasia.
Não participam deste estudo: gestantes, etilistas, fumantes bem como qualquer
portador de patologia pré-existente relacionada com a coagulação sanguínea.
Os voluntários fazem parte do corpo discente do Centro de Ciências da
Saúde da UNIVALI.
4.2 Coleta de amostras
As amostras foram coletadas pelo sistema à vácuo, em tubos apropriados,
no laboratório de hematologia, urinálise e citologia clínica, localizado no bloco E1,
2º andar, nº 208, na UNIVALI. Todos os experimentos também foram realizados no
laboratório de hematologia, urinálise e citologia clínica, sendo a responsável pelos
procedimentos de coleta e técnicos a Prof.ª Dr.ª Anna Paula de Borba Batschauer.
Foram coletados cerca de 24 ml de sangue através de punção venosa;
sendo 8 mL de sangue coletado com anticoagulante EDTA, para realização de
contagens de plaquetas e leucócitos e análise de morfologia celular, e 16mL
coletados com citrato de sódio como anticoagulante, para os testes de avaliação da
cascata de coagulação. O estudo e coleta de sangue somente foi realizada após a
assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), em anexo no
apêndice A, e todos os esclarecimentos sobre a pesquisa foram informados aos
participantes, como também foi aprovado pelo comitê de ética no parecer 332/11a.
4.3 Preparo das partículas
Partículas magnéticas foram sintetizadas no laboratório de Biopolímero
(Curso de Farmácia- UNIVALI), por Debrassi e colaboradores (2011) e
caracterizadas no Instituto de Física da Academia Polonesa de Ciências e
30
Laboratório de Física do Estado Condensado da Universidade do Maine, na
França, 2011.
Foram realizados testes com as seguintes partículas magnéticas, utilizando
a metodologia em in situ, onde o polímero (5,0g) foi disperso em água (500 mL) e
o pH foi ajustado para 10,0. Separadamente foi preparada uma solução (500 mL)
contendo FeCl3 . 6 H2O (22,65g) e FeSO4 . (NH4)2SO4 . 6 H2O (16,65g) (proporção
de 2:1 de Fe3+ : Fe2+). Esta solução foi adicionada sob agitação à dispersão
polimérica preparada anteriormente, mantendo o pH em aproximadamente 9,0 com
a adição de NaOH concentrado. As partículas foram filtradas, lavadas com água e
acetona
e
secas
em
dessecador
(DEBRASSI,
2010).
Obtendo
a
O-
carboximetilquitosana (OC); O-carboximetilquitosanabenzilada (OCBZ).
4.4 Preparo das amostras
O sangue foi alíquotado em partes de 1ml para as amostras com EDTA, e 2
ml para as amostras com citrato de sódio. Uma alíquota foi separada para uso
como controle para os dois anticoagulantes, e nas demais alíquotas foram
adicionadas partículas magnéticas derivadas da quitosana nas concentrações 5, 10
e 15mg/ml. A metodologia usada foi uma adaptação descrita em Xu e
colaboradores (2010).
As amostras foram homogeneizadas, após 30 minutos de contato do sangue
com a partícula, as amostras que continham citrato de sódio foram centrifugadas a
2500 rpm durante 20 minutos e separado o plasma para a execução do TP e TTPa.
Com o sangue coletado com EDTA foi realizado a contagem de plaquetas e
leucócitos e a confecção de extensões sanguíneas coradas com MAY GRUNWALD
GIEMSA para a observação de possíveis alterações na morfologia celular.
4.5 Métodos
4.5.1 Contagens celulares
A contagem automatizada foi realizada através do equipamento CELLDYN® 3000 (Abbott R), os leucócitos são analisados em dois canais diferentes o
31
óptico e o de impedância elétrica. O primeiro acontece quando um laser é focado
na célula de fluxo, à medida que o fluxo da amostra intercepta o laser, a luz é
difundida pelas células, medido em quatro intervalos angulares diferentes. Já a
impedância é baseada na medição das mudanças da corrente elétrica que são
produzidas por uma partícula. O número de impulsos gerados é indicado pelo
número de plaquetas que atravessam a abertura. A amplitude de cada impulso é
proporcional ao volume de partículas que atravessa a abertura, esta última também
é utilizada para a contagem de hemácias e plaquetas.
As contagens são realizadas em contador hematológico automatizado,
fornecendo resultados sensíveis, reprodutíveis e precisos, a mesma pode induzir a
um elevado número de falsos positivos que devem ser confirmados pela
microscópia para garantia de um resultado reprodutível (SANTOS; BANDEIRA;
SIQUEIRA, 2009).
4.5.1.1 Contagem de plaquetas
A contagem de plaquetas do controle (sem partículas) foi realizada em
equipamento automatizado através da metodologia de impedância, as amostras
que continham as partículas não puderam ser passadas no equipamento, pois são
magnéticas, assim foi realizadas lâminas de extensões sanguíneas coradas com
MAY GRUNWALD GIEMSA, das amostras e do controle para a contagem de
plaquetas através da metodologia de Fônio. Todas as lâminas identificadas
corretamente.
O método de Fônio consiste em uma contagem das hemácias e plaquetas
de 10 campos. Com os valores totais das hemácias e plaquetas dos 10 campos
contados é realizado uma regra de três utilizando o valor das hemácias obtidos
pela impedância, assim pode-se obter o valor de plaquetas / mm3.
4.5.1.2 Contagem de leucócitos
A contagem de leucócitos do controle foi realizada através de equipamento
automatizado através da metodologia óptica e foram confeccionadas lâminas de
32
extensões sanguíneas coradas com MAY GRUNWALD GIEMSA para a leitura das
amostras e dos controles, através da metodologia de Shilling onde são contadas
um total de 100 glóbulos brancos, onde não há aglomerado de hemácias, e pela
mesma metodologia foi realizada a leitura em câmara de Newbauer com a amostra
à fresco.
4.5.1.3 Análise da morfologia celular
Para analisar a morfologia, foram utilizadas extensões sanguíneas das
amostras e dos controles, onde foi analisada a morfologia ao microscópico na
objetiva de 100x na procura de aglomerações celulares, partículas magnéticas, que
são semelhantes as plaquetas sem forma definida e aglomeradas, e alterações no
aspecto e tamanho das células.
4.5.2 Tempo de protrombina (TP)
O TP foi determinado conforme recomendações do fabricante Labtest®. As
amostras do plasma controle, o plasma a ser testado e do reagente de
protrombina, reconstituído previamente, foram aquecidas em banho-maria 370C,
por cerca de 2 minutos. Em seguida, foram adicionados 0,2 ml de reagente de
protrombina em um tubo de hemólise juntamente com 0,1 ml de plasma
amostra/controle disparando simultaneamente o cronômetro. A determinação do
TP foi realizada pelo equipamento semi- automatizado Quick Timer- DRAKE®, que
realiza a leitura através de um feixe de luz, quando adicionado o reagente de
protrombina ocorre à formação do coágulo de fibrina ficando o meio límpido e
nesse momento o feixe de luz passa e o tempo é marcado. Todos os testes foram
realizados em duplicata, segundo as orientações do fabricante Labtest®.
4.5.3 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa)
O TTPA foi determinado conforme recomendações do fabricante Labtest®. A
solução reagente de cloreto de cálcio, o reagente contendo cefalina e as amostras
do plasma controle, e a amostra foram previamente aquecidas em banho-maria a
37°C. Separadamente, em tubo de hemólise, adiciona-se 0,1 ml do plasma
33
amostra/controle e 0,1ml do reagente contendo cefalina, essa mistura foi incubada
a 37°C por 3 minutos, em seguida foi adicionado 0,1 ml de cloreto de cálcio,
incubar a 37°C por 20 segundos. A determinação do TTPA foi realizada pelo
equipamento semi- automatizado Quick Timer- DRAKE®, a leitura se dá como
descrito no item 4.5.2, mas difere que este precisa da cefalina e do cloreto de
cálcio para a formação do coágulo de fibrina. Todos os testes foram realizados em
duplicata, seguindo as orientações do fabricante Labtest®.
4.5.4 Hemólise
O teste de hemólise foi adaptado de Bender e colaboradores (2012), onde o
plasma centrifugado a 2500 rpm durante 20 minutos, em temperatura ambiente,
teve a sua absorbância medida em espectrofotômetro, num comprimento de onda
de 540 nm, onde foi necessário ter uma amostra com 100% de hemólise, que foi
representada por 1mL de sangue com 1mL de salina. A amostra controle é
representada pelo plasma do sangue sem a partícula e a amostra é representada
pelo plasma do sangue em contato com as partículas. A absorbância foram
medidas e os respectivos valores foram aplicados à fórmula, representada na figura
5.
Figura 5- Fórmula para a obtenção da porcentagem de hemólise
Fonte: Adaptado de BENDER et al., 2012.
4.5.5 Análise estatística
Os resultados dos testes realizados foram submetidos ao teste estatístico
não paramétrico Mann-Whitney, onde foram analisados. Os valores de p foram
considerados significativos quando inferiores a 0,05.
34
35
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Leucócitos e morfologia
Foram utilizadas as mesmas lâminas para a contagem de leucócitos e
análise da morfologia celular. Conforme apresentado na tabela 1 não foi observado
diferença estatística na contagem do diferencial de leucócitos, como também na
morfologia celular, que incluem todas as células sanguíneas, nas amostras com as
duas partículas OC e OCBZ, quando comparadas com o controle.
Não foram encontrados relatados na literatura da análise da morfologia de
outras células do sangue, além dos eritrócitos. De acordo com Yang e
colaboradores (2008) que realizaram um estudo com diversos tipos de quitosana e
sua
interferência
na
hemostasia,
onde
a
quitosana
soliquoid
e
carboximetilquitosana não causaram mudança na morfologia dos eritrócitos nem
sedimentação destes.
Tabela 1: Mediana da contagem diferencial dos leucócito nas diferentes concentrações
das partículas e no controle.
Monócitos Linfócitos
Basófilos Eosinófilos Neutrófilos
Controle
7,5
26,5
0,5
2,5
65
OC 5 mg/mL
8
27,5
0
2,5
60
OC 10 mg/ml
9
20
0
2,5
64,5
OC 15 mg/mL
9
25
0
2,5
63
OCBZ 5 mg/mL
7
30
0
2,5
63
OCBZ 10 mg/mL
8
30,5
0,5
2
62
OCBZ 15 mg/mL
6,5
27
0
2
60,5
5.2 Plaquetas e hemólise
Foram utilizadas as mesmas lâminas de extensão sanguínea para a análise
das plaquetas, conforme se observa na tabela 2. A contagem de plaquetas das
amostras apresentaram um discreto aumento no seu número quando comparadas
com o controle, mas isso deve-se a uma redução do número de hemácias
36
consequentemente aumentando o número de plaquetas, no entanto quando
comparadas entre si, não apresentaram diferença (p> 0,846).
Estes resultados estão melhores representados na figura 6, onde podemos
observar que as plaquetas permaneceram dentro com valor controle, que está
representado pela linha pontilhada.
Tabela 2: Contagem das plaquetas nas diferentes concentrações das partículas e no
controle.
Concentração
s/ partícula
5 mg/mL
10 mg/mL
15 mg/mL
Mediana (/mm3)
257000
Mediana OC (/mm³)
251.400
281.045
269.845
Mediana OCBZ (/mm³)
267.700
262.610
272.000
Desvio padrão OC
(/mm³)
115.277
144.735
94.183
Desvio padrão OCBZ
(/mm³)
120.711
101.926
82.128
Podemos observar na figura 6 que os dados ficaram dentro do limite que
abrange os valores de 240.000 a 400.000 /mm3, como também verificamos através
dos valores de p que não houve diferença (p> 0,846).
Figura 6- Número de plaquetas
Nota: Número de plaquetas após 30 minutos de contato do sangue com as partículas OC
(p=0,933) e OCBZ (p=0,846) nas concentrações de 5, 10, 15mg/mL.
37
Como comentado anteriormente, que na contagem de plaquetas o número
de hemácias havia diminuído, observamos não somente neste teste, mas pudemos
comprovar após da centrifugação das amostras para os testes coagulométricos,
quando o plasma apresentou coloração avermelhada, devido a presença de
hemoglobina, consequente da lise das hemácias, sendo necessário realizar uma
diferente análise. Na partícula OC foi observado um aumento gradual significativo
(p= 0,022) ao aumento da concentração da partícula, já a partícula OCBZ não
apresentou o mesmo comportamento, não apresentando diferença (p= 0,757)
conforme o demostrado na figura 7.
Figura 7- Porcentagem de hemólise
Nota:Porcentagem da hemólise causada depois de 30 minutos de contato do sangue com
as partículas OC (p=0,022) e OCBZ (p=0,757) nas concentrações de 5, 10, 15 mg/mL.
Podemos confirmar a diferença entre as partículas pela figura 8, onde
mostra o percentual de hemólise da partícula OC (azul) subindo significativamente
com o aumento das concentrações, enquanto a partícula OCBZ (vermelho)
mantém o percentual constante. Como relatado em Naffe e colaboradores, (2009),
esta hemólise pode estar associada a alguns polímeros catiônicos que podem
causar injúria aos eritrócitos devido a interações eletrostáticas, como também em
Letchford e colaboradores, (2009), onde moléculas surfactantes podem penetrar na
membrana eritrocitária causando solubilização de lipídios e proteínas.
Já em um estudo realizado por Bender e colaboradores (2012), para a
obtenção de uma nanocápsula lipídios core, estabilizada com polissorbato 80 e
lecitina carregada positivamente com uma cobertura de quitosana em diferentes
38
concentrações. Foi realizada soluções desta e colocadas em contado com o
sangue, onde se observou em maiores concentrações causam uma maior
hemólise.
Figura 8- Comparação das medianas das amostras de cada concentração para as
diferentes partículas
5.3 Tempo de protrombina (TP)
O TP é o tempo necessário para a formação de fibrina a partir do estímulo
de fator tissular pela protrombina.
A Figura 9, apresenta os valores obtidos na análise TP das amostras que
permaneceram
em
contato
com
diferentes
partículas
e
em
diferentes
concentrações, e pode observar que os valores ficaram dentro do controle, que
está representado pela linha pontilhada, como também não apresentaram diferença
(p> 0,902) em ambas as partículas.
Semelhante ao aqui exibido, em Bender e colaboradores (2012), realizaram
soluções de uma nanocápsula revestida por quitosana que foi colocada em contato
com o sangue na concentração de 2% (v/v). A quitosana não alterou o valor de TP,
não influenciando a via extrínseca da coagulação sanguínea mantendo a atividade
in vitro de anticoagulante.
39
Figura 9- Tempo de ativação da protrombina
Nota: Tempo de ativação da protrombina nas concentrações 5, 10, 15 mg/mL das
partículas OC (p=0,902) e OCBZ (p=0,936).
5.4 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa)
O TTPa é o tempo de formação do coágulo de fibrina a partir do estímulo da
via intrínseca da coagulação através de fosfolípideos e cloreto de cálcio. Como
representado na figura 10, as partículas nas diferentes concentrações não
apresentaram (p>0,248), mas quando comparadas com o controle, representado
pela linha pontilhada, podemos observar um aumento gradual do tempo das
partículas com as diferentes concentrações, sendo mais evidente na partícula OC.
Pode-se
comparar este
estudo
com o
realizado
por
Pacheco
e
colaboradores (2007), no qual se obteve valores de TTPa levemente alterados,
mas não estatisticamente significantes, quando realizado teste ex- vivo em coelhos
após a injeção de vários concentrações de nanopartículas, apresentando
resultados semelhantes.
40
Figura 10- Tempo de tromboplastina parcial ativada
Nota: Tempo de ativação da tromboplastina parcial ativada nas concentrações 5, 10, 15
mg/mL das partículas OC (p=0,248) e OCBZ (p=0,649).
5.5 Testes coagulométricos
Como observamos anteriormente, o TP não apresentou diferença
(figura 9), o TTPa também não apresentou diferença (figura 10), mas observou-se
um aumento no tempo em cada partícula com o aumento da concentração desta.
Podemos observar o mesmo comportamento em estudo realizado por Xu e
colaboradores (2010), onde foram analisados in vitro, copolímeros em blocos de
poliuretano revestidos com quitosana em contato com sangue de coelho. Quando
realizados os testes coagulométricos, estes apresentaram um aumento no TTPa
das amostras, mas o TP permaneceu inalterado, como o aqui apresentado. Em
outro estudo realizado por Yang e colaboradores (2008), que avaliou o efeito da
quitosana na hemostasia, as quitosanas soliquoid e a carboximetilquitosana em
solução salina fisiológica, não causaram alterados dos valores de TP e TTPa,
quando comparadas com o controle, se assemelhando com o estudo da partícula
OC e OCBZ.
O Clinical and Laboratory Standards Institute, afirma que em amostras com
visível hemólise não devem ser utilizadas por causa da possível competição com a
tromboplastina para a ativação do fator VIIa da coagulação, que podem causar
interferência com a medição final, de acordo com as suas diretrizes para o Tempo
de protrombina (TP) e Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). Como
também a intensidade da hemólise varia, ficando a critério de cada laboratório a
41
classificação de hemolisado e não hemolisado, como no estudo eles usam como
não hemolisado 20 mg/dL e 30 mg/dL hemolisado (LAGA; CHEVES; SWEENEY,
2006).
42
43
6 CONCLUSÕES
De acordo com os dados obtidos a partir dos estudos realizados, podemos
concluir que a partícula OCBZ apresentou bons resultados com uma menor
alteração nos testes coagulométricos , TP e TTPa, quando comparada com a
partícula OC, sendo assim, é conveniente dar procedência a testes confirmatórios,
in vitro como TT ( Tempo de Trombina), Fibrinogênio e Dímero-D, e testes in vivo
utilizando ratos ou camundongos, a fim de definir o mecanismo de atuação.
Desta forma, podemos sugerir que a partícula magnética OCBZ, poderá ser
utilizada
futuramente
como
um
veículo
para
fármacos,
devido
a
sua
hemocompatibilidade, no entanto é necessário mais testes coagulométricos para
comprovar sua confiabilidade.
O fato de a partícula OC, não apresentar resultados satisfatórios para este
estudo, significa que ela deve ser descartada. Podem ser realizados diferentes
estudos e testes, que podem apresentar propriedades para uso em outras áreas da
medicina, como também na área de agricultura, biotecnologia, indústria de
cosméticos, produtos alimentícios, e como adsorvente na remoção de corantes e
espécies metálicas.
44
45
REFERÊNCIAS
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48
49
APÊNDICE
A-
TERMO
DE
CONSENTIMENTO
LIVRE
E
ESCLARECIDO
Titulo do projeto: Avaliação da hemocompatibilidade in vitro de partículas
magnéticas de derivados da quitosana.
Introdução
Você está sendo convidado(a) a participar voluntariamente de um estudo de
pesquisa.
Antes de obter seu consentimento, é importante que todas as informações a
seguir sejam lidas com atenção, e que todas as dúvidas sejam esclarecidas.
Objetivo do estudo
O principal objetivo deste estudo será avaliar a hemocompatibilidade in vitro
de partículas magnéticas derivadas da quitosana.
A realização deste estudo consiste apenas na busca por novos tratamentos
compatíveis com nossas funções vitais.
Participação no estudo
Este estudo destina-se indivíduos voluntários com idade entre 18 á 40 anos,
que não façam uso de nenhum tipo de medicação ou que tenha qualquer doença.
Não serão aceitos gestantes, alcoólatras e fumantes é necessário também que o
paciente não tem ingerido nenhum tipo de bebida alcoólica nas horas últimas 48
horas. Serão requeridos aproximadamente 30 indivíduos.
A sua participação é totalmente voluntária e você tem a liberdade de não
querer participar desta pesquisa. Você não terá prejuízo algum por está decisão.
Você não receberá nenhum pagamento pela sua participação neste estudo,
bem como não terá nenhum tipo de gasto.
Confidencialidade
Todas as informações obtidas serão mantidas em poder dos pesquisadores
envolvidos com o projeto de pesquisa, sendo que você terá acesso a elas sempre
50
que desejar. Sua identidade ficará em sigilo. Seus dados pessoais não serão
apresentados em relatórios e nem na publicação deste estudo.
Riscos e desconfortos
Serão coletados cerca de 24mL de sangue que será obtido com auxilio de
agulha e seringa, no laboratório de hematologia, urinálise e citologia clínica,
localizado no bloco E1, 2º andar, nº 208, na UNIVALI, sendo a responsável pelos
procedimentos de coleta e técnicos a Prof.ª Dr.ª Anna Paula de Borba Batschauer.
Ao participar desta pesquisa, você poderá sentir um pequeno desconforto no
momento da picada da agulha necessária para a coleta. Eventualmente poderá
ocorrer à formação de pequenos hematomas no local onde a agulha foi inserida,
devido à coleta, aconselha-se a colocar uma compressa de gelo no local. Com o
passar de dias esse hematoma desaparecerá.
Benefícios
Embora a informação coletada neste estudo possa não trazer benefícios
diretamente a você, os resultados podem ajudar profissionais da área da saúde no
desenvolvimento de novos tratamentos médico.
Caso você aceite fazer parte deste estudo, duas vias do termo serão
entregues, onde todas as páginas deverão ser rubricadas e todos os dados
respondidos corretamente.
Assim que os primeiros resultados sejam publicados, em revistas ou
congressos, você será informado e terá acesso a essas informações por e-mail ou
correspondência, por isso é importante que você preencha este item corretamente.
CONSENTIMENTO DE PARTICIPAÇÃO DO SUJEITO
Eu,_________________________________________,
RG_______________,
abaixo assinado, concordo em participar do presente estudo como sujeito. Fui
devidamente informado e esclarecido sobre a pesquisa, os procedimentos nela
envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios decorrentes de minha
participação. Foi-me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer
momento, sem que isto leve a qualquer penalidade ou interrupção de meu
acompanhamento/assistência/tratamento.
51
Nome: ___________________________________________________________
Assinatura do Sujeito ou Responsável:____________________________________
Telefone para contato: __________________________
E-mail: ____________________________________________________________
Local e data:__________________________________
Anna Paula de Borba Batschauer (orientador)
47 96074849
Assinatura:
Flávia Cristina Fiori Sant’Ana (acadêmico)
47 9921-6442
Assinatura:
52
53
APÊNDICE B- TERMO DE UTILIZAÇÃO DE DADOS PARA COLETA
DE DADOS DE PESQUISAS ENVOLVENDO SERES HUMANOS
Declaro que conheço e cumprirei os requisitos da Res. CNS 196/96 e suas
complementares no desenvolvimento do projeto de pesquisa, Avaliação da
hemocompatibilidade in vitro de partículas magnéticas de derivados da
quitosana, assim como afirmo que os dados descritos no protocolo 332/11a serão
obtidos em absoluto sigilo e utilizados apenas para os fins especificados no
protocolo aprovado pelo Comitê de Ética.
Anna Paula de Borba Batschauer
Nome completo do pesquisador principal (orientador):
Assinatura:
Flávia Cristina Fiori Sant’Ana
Nome completo do acadêmico:
Assinatura:
54
55
ANEXO A- PARECER ÉTICA Nº 332/11a
56
57
58