Universidade Camilo Castelo Branco
Instituto de Engenharia Biomédica
VALÉRIA CRISTINA LOPES DE BARROS ROLIM
ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS DA DESINFECÇÃO DE
APARELHOS ORTODÔNTICOS REMOVÍVEIS UTILIZANDO
CLOREXIDINA OU OZÔNIO
A COMPARATIVE STUDY ON THE EFFECTS OF USING CHLOREXIDINE OR
OZONE AS A DISINFECTION METHOD ON REMOVABLE ORTHODONTIC
APPLIANCES
São José dos Campos, SP
2014
II
Valéria Cristina Lopes de Barros Rolim
ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS DA DESINFECÇÃO DE APARELHOS
ORTODÔNTICOS REMOVÍVEIS UTILIZANDO CLOREXIDINA OU OZÔNIO
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Scarparo Navarro
Co-orientadora : Profa. Dra. Dora Inês Kozusny Andreani
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da
Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção
do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
São José dos Campos, SP
2014
III
IV
V
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a Deus pela sua infinita bondade.
A TODOS da minha maravilhosa Família, especialmente à minha avó Dona Santa,
aos meus pais Jesus e Arlete, ao meu amado esposo José e ao meu maior presente
e amor nesta vida, minha filha Mariana.
Jamais conseguiria expressar com palavras minha gratidão a vocês!!!
VI
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Unicastelo, instituição que nos permitiu o acesso a este
Programa de Mestrado
Aos meus queridos orientadores Profa. Dra. Dora Inês Kozusny Andreani e Prof. Dr.
Ricardo Scarparo Navarro pela paciência e amizade reveladas durante todo este
período
A todos os meus colegas de trabalho e também amigos da Faculdade de
Odontologia da Unicastelo, Campus Fernandópolis.
Aos meus queridos alunos
Aos funcionários do Departamento de Microbiologia da Unicastelo, agradecendo
especialmente à Selma Bernardo pela amizade e dedicação
Aos amigos Prof. Nilton Cesar Pezati Boer, Prof. Dr. Roberto Raccanich
Aos amigos Dr. Conrado Ingraci e Profa. Dra. Mariângela Ingraci
Aos amigos Prof. Dr. Nagib Pezati Boer e Profa. Maria Betania Ricci Boer pelo
grande incentivo e auxílio para o desenvolvimento desta dissertação
À amiga Luciana Estevam Simonato
Quanta disponibilidade e carinho recebidos!
Minha gratidão a vocês será eterna!!!
VII
“Não serei o poeta de um mundo caduco.
Também não cantarei o mundo futuro.
Estou preso à vida e olho meus companheiros.
Estão taciturnos, mas nutrem grandes esperanças.
Entre eles, considero a enorme realidade.
O presente é tão grande, não nos afastemos.
Não nos afastemos muito, vamos de mãos dadas.
Não serei o cantor de uma mulher, de uma história,
não direi os suspiros ao anoitecer, a paisagem vista da janela,
não distribuirei entorpecentes ou cartas de suicida,
não fugirei para as ilhas nem serei raptado por serafins.
O tempo é a minha matéria, do tempo presente, os homens presentes,
a vida presente.”
Carlos Drummond de Andrade
VIII
ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS DA DESINFECÇÃO DE
APARELHOS ORTODÔNTICOS REMOVÍVEIS UTILIZANDO
CLOREXIDINA OU OZÔNIO
RESUMO
O presente estudo teve o objetivo de avaliar in vitro a ação desinfetante das
soluções: digluconato de clorexina (CH)1%, digluconato de clorexidina 0,12% “spray”
(CHS) e água ozonizada sobre aparelhos ortodônticos removíveis (AOR) - Placas de
Hawley - contaminados com os micro-organismos: Candida albicans, Streptococcus
mutans e Enterococcus faecalis. Foram confeccionados em resina acrílica
quimicamente ativada 60 aparelhos, divididos em 04 grupos de acordo com o tipo de
tratamento realizado, contendo 15 aparelhos cada e os mesmos foram divididos em
03 subgrupos, cada um com 05 aparelhos (n=5) contaminados com os microorganismos específicos. Os grupos estudados foram: G1- controle - solução salina
estéril (0,5%), G2- AOR + solução de clorexidina 1%, G3- AOR + spray de
clorexidina 0.12% e G4 – AOR + água ozonizada. Antes e após os tratamentos,
foram coletadas amostras da superfície dos AOR através de swab estéril e, após
diluições seriadas, foram inoculados 0,1mL de cada diluição em placas contendo os
meios de cultura correspondentes a cada micro-organismo, em triplicata. Depois da
incubação a 37ºC por 24 horas, a contagem das UFC/ml foi realizada. Os resultados
mostraram que os três tratamentos propostos obtiveram êxito na desinfecção de
aparelhos ortodônticos para os micro-organismos C. albicans, S. mutans e E.
faecalis, mostrando evidente diminuição da carga microbiana da superfície de resina
tratada.
Palavras-chave: Aparelho ortodôntico removível, clorexidina, água ozonizada,
desinfecção.
IX
A COMPARATIVE STUDY ON THE EFFECTS OF USING
CHLOREXIDINE OR OZONE AS A DISINFECTION METHOD ON
REMOVABLE ORTHODONTIC APPLIANCES
ABSTRACT
The present study aimed to evaluate the in vitro action of disinfectant solutions:
chlorhexidine gluconate (CH) 1%, chlorhexidine gluconate 0.12% "spray" (CHS) and
ozonated water on removable orthodontic appliances -ROA (Hawley retainers)
contaminated by microorganisms. The microorganisms were: Candida albicans,
Streptococcus mutans and Enterococcus faecalis. A number of 60 chemically
activated acrylic resins appliances were made. These 60 appliances were divided
into 04 groups of 15, according to the type of treatment carried out. Those 04 groups
were divided into 03 subgroups of 05 appliances infected by specific microorganisms
(n = 5). The groups were: G1 - control - sterile saline (0.5%), G2 - ROA +
chlorhexidine 1%, G3 - ROA + 0.12% chlorhexidine spray and G4 - ROA + ozonated
water. Before and after treatments, samples from the surface of the ROAs were
collected with a sterile swab and after serial dilutions, 0.1 mL of each dilution was
inoculated
into
plates
containing
corresponding
culture
medium
of
each
microorganism, in triplicate. After incubation at 37 °C for 24 hours, the number of
colony forming units (CFU/mL) was counted. The results showed that all three
treatments proposed were effective as a disinfectant for these microorganisms on
orthodontic appliances, showing clear reduction of the microbial load of the treated
acrylic surfaces.
Key-words: Removable orthodontic appliance, chlorhexidine, ozonated water,
disinfection.
X
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1:
Molécula de ozônio.........................................................................
Figura 2:
Representação do reator para a geração de ozônio pelo método
de descarga elétrica.......................................................................
Figura 3:
26
27
Mecanismo de ação do ozônio nos micro-organismos: 1. Imagem
da bactéria sadia gerada por computador; 2. Parede celular da
bactéria em contato com o ozônio; 3. Oxidação da parede
celular; 4,5 e 6. Ruptura e destruição da bactéria.........................
29
Figura 4:
Identificação dos AOR (aparelhos ortodônticos removíveis)..........
34
Figura 5:
Equipamento gerador de ozônio...................................................
37
Figura 6:
Local de coleta das amostras.......................................................
38
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Desinfetantes e esterilizantes mais utilizados em artigos
odontológicos................................................................................
25
Tabela 2: Controle (GRUPO 1).......................................................................
40
Tabela 3: Clorexidina 1% (GRUPO 2)............................................................
41
Tabela 4: Spray de clorexidina 0,12% (GRUPO 3)......................................... 42
Tabela 5: Água ozonizada (GRUPO 4)........................................................... 43
XII
LISTA DE ABREVIATURAS
AOR
Aparelho Ortodôntico Removível
CHX
Clorexidina
DNA
Ácido Desoxirribonucleico
LED
Light Emitting Diode
PDT
Photodynamic Therapy (Terapia Fotodinâmica)
RAAQ
Resina Acrílica Ativada Quimicamente
RNA
Ácido Ribonucleico
UFC
Unidades Formadoras de Colônias
C. albicans
Candida albicans
S. mutans
Streptococcus mutans
E. faecalis
Enterococcus faecalis
XIII
LISTA DE SÍMBOLOS
cm2
Centímetro quadrado
min
Minuto
mm
Milímetro
L
Litro
mL
Mililitro
mol
6,022 × 1023 átomos
s
Segundo
O2
Oxigênio
O3
Ozônio
NaCl
Cloreto de Sódio
µL
Microlitro
µm
Micrometro
ºC
Grau Celsius
g
Grama
W
Watt
XIV
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................
15
1.1. Objetivo geral...........................................................................................
18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................,,
19
2.1. Conceitos...................................................................................................
19
2.2. Micro-organismos utilizados na contaminação da superfície acrílica dos
AOR................................................................................................................... 19
2.2.1. Candida albicans....................................................................................
19
2.2.2. Streptococcus mutans............................................................................
21
2.2.3. Enterococcus faecalis.............................................................................
22
2.3. Soluções desinfetantes..............................................................................
22
2.3.1. Clorexidina.............................................................................................
22
2.3.2. Água ozonizada......................................................................................
26
2.4. Desinfecção de aparelhos ortodônticos removíveis................................... 30
2.4.1. Métodos alternativos...............................................................................
3. MATERIAL E MÉTODO.................................................................................
3.1. Locais de estudo........................................................................................
32
34
34
3.2. Confecção dos aparelhos ortodônticos...................................................... 34
3.3. Grupos.......................................................................................................
35
3.4. Linhagens bacterianas, preparação do inóculo, descontaminação dos
AOR..................................................................................................................
35
3.5. Desinfecção...............................................................................................
36
3.5.1. Coleta do material pós-desinfecção........................................................ 37
3.6. Análise estatística......................................................................................
38
4. RESULTADOS..............................................................................................
40
5. DISCUSSÃO..................................................................................................
44
6. CONCLUSÕES.............................................................................................
49
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................
50
15
1. INTRODUÇÃO
A placa de Hawley é um aparelho ortodôntico removível, cuja base é confeccionada
em resina acrílica quimicamente ativada (RAAC). É indicada para a contenção, após
a finalização da ortodontia corretiva, com o intuito de manter a estabilidade do
tratamento, evitando recidivas.1
Também pode ser utilizada para a realização de movimentos de extrusão
dentária, rotações e manutenção de espaços. Devido à possibilidade da
incorporação de acessórios na sua estrutura, pode ser acrescida de grade palatina,
molas digitais, orifício para a reeducação lingual, parafuso expansor, dentes de
estoque para manutenção de espaços e, inclusive, arco facial para o aparelho extrabucal.1
Com a sua utilização durante o tratamento ortodôntico, um aumento
considerável de acúmulo de biofilme dental pode ocorrer sobre a superfície da base
acrílica e locais retentivos de grampos e molas. 2-4
Visualmente as resinas acrílicas aparentam superfície lisa, porém na
microscopia de luz as rugosidades e porosidades formadas no processo de
acrilização, conferem irregularidades à sua superfície, com maior retenção de
biofilme e pigmentos.5,6 Estas irregularidades podem ser minimizadas por meio do
polimento mecânico, que não pode ser realizado na região palatina devido ao risco
de perda da anatomia da mucosa do paciente e, por consequência, a retenção. É
realizado, então um polimento químico em ambas as regiões, porém este ainda
reserva as variações de superfície existentes. 7-9
A rugosidade aceita como ideal corresponde a uma medida inferior a 0,2 µm,
diminuindo a adesão de micro-organismos.7,10 Inicialmente a adesão de microorganismos depende de microporosidades presentes na superfície dos aparelhos.
Micro-organismos como as leveduras de Candida albicans podem valer-se
das irregularidades da superfície resinosa, se fixarem e se agregarem a
comunidades bacterianas como os estreptococos.11 O tamanho diminuto das
bactérias colonizadoras de superfícies acrílicas também favorece a agregação nas
superfícies com maiores imperfeições.12
Ao serem inseridas na cavidade bucal, as resinas acrílicas absorvem os
fluidos bucais e podem ser contaminadas pelos diferentes micro-organismos neles
16
contidos.13 Colonizados nas porosidades do material resinoso e, acrescidos dos
nutrientes provenientes dos fluidos da cavidade bucal, formam a camada de
biofilme.11,14
Após a instalação de aparelhos ortodônticos há evidências de aumento
significativo dos níveis de Streptococcus mutans na saliva e no biofilme dental.4
Quando organizados em biofilmes, os micro-organismos se comportam de
maneira completamente diferente de quando estão no estado planctônico. Aderemse a uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares, principalmente
polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos e lipídeos, formando uma coesa rede de
polímero tridimensional, capaz de interligar e imobilizar transitoriamente estas
células. Seu metabolismo faz com que sejam as formas mais bem sucedidas de vida
na Terra.15
O
biofilme,
através
de
sua
composição
é
também
essencial
ao
desenvolvimento de infecções por servir de nicho a patógenos altamente
resistentes.16
Gripes, resfriados, candidíases, irritações na mucosa, amidalites e outras
infecções oportunistas no decorrer do tratamento ortodôntico requerem maior
atenção, valorização, mensuração e registro, seja por ocorrência primária ou
recorrente.17
De acordo com Sesma
18
, a higienização realizada com escova e dentifrício
não é suficiente para eliminar o biofilme aderido à superfície de resina acrílica.
Visando diminuir esta agregação, são utilizadas técnicas de escovação mecânica da
superfície de resina, com o auxílio de escovas dentais e dentifrícios abrasivos,
porém se preconiza a associação de agentes desinfetantes como complementares
na redução dos micro-organismos.4,19
O biofilme exibe resistência aos agentes antimicrobianos devido à presença
de uma matriz extracelular que protege os micro-organismos, bloqueando a
penetração
do
agente.20,21
Assim,
são
necessárias
propriedades
de
alta
penetrabilidade para os agentes antimicrobianos.22,23 A interação eletrostática da
substância aplicada pode ser considerada a maior causa diferencial na velocidade
de penetração.
24,25
O peso molecular, a presença de carga na molécula e o balanço
hidrofílico-hidrofóbico dos solutos também influenciam na penetrabilidade aos
biofilmes.25,26
Há uma busca incessante de protocolos que sejam eficientes, menos tóxicos
17
e menos onerosos e, que consigam fazer uma desinfecção eficaz na prática clínica.
A clorexidina é um agente catiônico, que possui um largo espectro, contra
bactérias Gram positivas e negativas. Quimicamente classificada como uma
bisguanidina, possui propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas. Sua ação nas bactérias
faz com que ocorra a perda de componentes como nucleotídeos e proteínas, através
do rompimento da integridade das suas membranas citoplasmáticas, podendo
exercer efeitos bactericidas e bacteriostáticos, além de apresentar substantividade
dentro da cavidade bucal.27,28 É o antimicrobiano com maior indicação nos trabalhos
relativos a desinfecção na odontologia.29
Uma possível alternativa à utilização de desinfetantes químicos líquidos é a
utilização do gás ozônio. Ele apresenta biocompatibilidade com as células humanas,
capacidade de inativar diferentes espécies de micro-organismos, mostrando
evidências de ser eficaz na desinfecção da água dos equipamentos odontológicos e
também na desinfecção de próteses totais.30 Esse gás é representado por íons
catiônicos, apresentando semelhante capacidade de agregação celular da
clorexidina.31
O ozônio difundido em água, pH = 7, na temperatura de 25ºC, tem tempo de
meia-vida de 15 min em um sistema aberto.32 Seu coeficiente de difusão é de
aproximadamente 10-10 cm2/s (0,01 µm2/s) em semi sólidos, e aproximadamente 10-5
cm2/s (103 µm2/s), nos líquidos. Por ser solúvel em água apresenta alta difusão no
veículo aquoso, podendo ser transportado por todo o meio, inclusive adentrando
microporos que seriam inatingíveis por substâncias de maior peso molecular.33-35
A possibilidade da utilização de substâncias desinfetantes alternativas às
existentes é o que motiva a realização deste trabalho. Se comprovada sua
eficiência, tornam-se opção na desinfecção dos AOR e também dos muitos
dispositivos confeccionados em resina acrílica empregados na odontologia.
Este trabalho teve como objetivo avaliar, in vitro, a eficácia das soluções de
digluconato de clorexidina 1%, digluconato de clorexidina 0,12% spray e água
ozonizada sobre aparelhos ortodônticos removíveis contaminados com os microorganismos Candida albicans, Streptococcus mutans e Enterococcus faecalis.
18
1.1. Objetivo geral
Avaliar e comparar, in vitro, os efeitos de diferentes agentes desinfetantes na
redução microbiana de aparelhos ortodônticos removíveis (AOR).
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Conceitos
Micro-organismos são bactérias, fungos, protozoários, ovos de nematelminto ou
platelminto (vermes), protozoários, cistos de protozoários, ácaros e congêneres e
microalgas e vírus, cuja unidade estrutural pode ser vista ao microscópio.
Antimicrobiano: agente que pode interferir de várias maneiras nos diferentes
micro-organismos,
podendo
apresentar
atividades:
bactericida,
esporocida,
fungicida, parasiticida, virucida significa "matar" ou "destruir" respectivamente
bactérias, esporos bacterianos, fungos, parasitas e vírus. Se o sufixo for substituído
para “stático”, a atividade antimicrobiana sobre os microrganismos será no sentido
de parar sua multiplicação, mas não matar.
Esterilizante: produto ou equipamento capaz de matar ou remover todos os
microrganismos de um ambiente, inclusive os esporos.
Desinfetante: produto ou equipamento capaz de reduzir a níveis seguros,
inibindo ou degradando microrganismos indesejáveis em superfícies que não
possuem vida.
Antisséptico: utilizado no sentido de degradar ou inibir a proliferação de
microrganismos presentes na superfície da pele e mucosas.
Controle de microrganismos: conceitos básicos: antimicrobiano, esterilizante,
desinfetante, conservante, antisséptico, saneante, microbiocida, germicida, biocida e
outros termos.36
2.2. Micro-organismos utilizados na contaminação da superfície acrílica dos
AOR
2.2.1. Candida albicans
A Candida albicans é uma levedura comensal, comumente encontrada na mucosa
bucal de indivíduos saudáveis. Em condições propícias, pode desenvolver uma
infecção conhecida por candidíase. A estomatite protética associada à utilização de
20
próteses totais é a forma mais frequente de candidíase bucal (25 a 65%), com
localização na mucosa do palato. Entre os principais fatores predisponentes está o
acúmulo de biofilme na superfície da prótese em contato com a mucosa. Mesmo que
assintomática esta alteração deve receber tratamento, pois pode servir como
reservatório para infecções mais extensas. Tanto na terapia, como na prevenção, o
tratamento mais eficiente é a erradicação e controle do biofilme.37-39
A C. albicans apresenta-se de duas formas (dimorfismo), sendo a forma de
levedura relativamente inócua e a forma de pseudo-hifa relacionada à invasão
tecidual do hospedeiro. Na maioria dos casos a candidíase envolve superficialmente
a mucosa, mas, em pacientes imunodeprimidos, pode invadir os tecidos e
desencadear uma doença fatal e disseminada.40
A patogenicidade da C. albicans e sua permanência são influenciadas por
fatores predisponentes, como imunossupressão, xerostomia, utilização de próteses,
respiração bucal, alterações endócrinas, discrasias sanguíneas, uso de aparelhos
ortodônticos e também fatores iatrogênicos. Não está uniformemente distribuída no
interior da cavidade bucal, mas a língua é o reservatório principal para a levedura, a
partir do qual o resto da mucosa, superfícies revestidas com aparelhos bucais,
dentes e saliva podem tornar-se secundariamente colonizados.41
Foi mensurada maior presença de Candida albicans em pacientes utilizando
aparelhos ortodônticos e, analisando a saliva de indivíduos portadores de próteses
totais e parciais e de aparelhos ortodônticos com placa acrílica e extra bucal, estes
grupos
apresentaram
proporções
maiores
de
C.
albicans
com
diferença
estatisticamente significante em relação aos controles (que não utilizavam
aparelhos).42 Os fatores predisponentes locais influenciam na presença de leveduras
do gênero Candida na saliva e a adoção de medidas preventivas mais efetivas deve
ser realizada junto aos pacientes em relação às infecções que podem ser
provocadas
por
estes
micro-organismos,
cabendo
ao
profissional
este
esclarecimento com relação à melhor forma de higienização desta aparatologia.43
Para o tratamento da candidíase, de acordo com o estado geral e o quadro
clínico do paciente, vários agentes antifúngicos de uso tópico e sistêmico são
utilizados, como nistatina, anfotericina B, miconazol e fluconazol.39,40 Entretanto,
podem ocorrer efeitos indesejáveis como o surgimento de resistência de algumas
cepas aos antifúngicos convencionais, principalmente em indivíduos imunodeprimidos, e também, a presença de efeitos tóxicos destes.44,45
21
Um aspecto importante referente a este micro-organismo é que Candida
albicans se mostra capaz de aderir-se ao polimetilmetacrilato, material que compõe
a resina acrílica. A ocorrência desta adesão parece ser mediada por uma adesina
protéica, que tem sido identificada na superfície de hifas de C. albicans.46,47
2.2.2. Streptococcus mutans
Em 1924, Clarke isolou Streptococcus mutans a partir de dentes humanos cariados
e já descrevia ocorrência destes micro-organismos nessas lesões, ressaltando sua
aderência à superfície dos dentes e propriedade acidogênica. Por apresentarem a
morfologia das colônias mais ovalada, aparentavam ser uma forma “mutante” de
estreptococos.48
São bactérias Gram-positivas, anaeróbias facultativas, catalase negativas,
microaerófilas, acidogênicas, e capazes de formar polissacarídeos extracelulares,
podendo sobreviver em qualquer parte da cavidade bucal, sendo isolados também
em diversas outras regiões do organismo.
Durante o desenvolvimento da doença cárie, os S. mutans desempenham um
importante papel, mas apenas a colonização não é suficiente para que ela ocorra.
Conceitos modernos consideram a cárie como uma interação entre genética e
fatores
ambientais,
incluindo
os
sociais,
comportamentais,
psicológicos
e
biológicos.49
Devido à criação de novas áreas retentivas disponíveis para a colonização
bacteriana e retenção de substratos, o tratamento com aparelhos ortodônticos pode
alterar a ecologia da cavidade bucal. 50
Topaloglu-Ak et al.51 e Maret et al.52 analisando durante 06 meses a saliva de
crianças portadoras de aparelhos ortodônticos, verificaram que houve importante
mudança na microbiota, com um incremento de valores de Streptococcus mutans e
Lactobacilos e ressaltaram a importância de medidas preventivas durante o
tratamento ortodôntico.
As
crianças
cujos
incisivos
são
contaminados
precocemente
por
Streptococcus mutans estão mais sujeitas ao ataque mais extenso e precoce da
doença cárie na dentição decídua do que aquelas infectadas mais tardiamente.53,54
22
Além de seu papel na doença cárie, os S mutans pode estar associado à
endocardite subaguda e a infecções intra-abdominais, por adesão ao esmalte
dentário e às válvulas cardíacas.55
É necessário monitorar os pacientes tratados ortodonticamente quanto ao
risco de desenvolvimento da doença cárie 2, da doença periodontal
56-58
e também
quanto à ocorrência de doenças sistêmicas, pois micro-organismos como os
Streptococcus mutans podem obter acesso à corrente circulatória, causar
bacteremia transitória e é sabido que são isolados em células endoteliais
cardiovasculares.59
2.2.3. Enterococcus faecalis
O Enterococcus faecalis é uma bactéria Gram-positiva facultativa, de forma
esferoidal. Tem elevada prevalência principalmente nos fracassos endodônticos.60
Recebeu o nome de Enterococcus que deriva da palavra grega Enteron ou intestino.
Na Odontologia, E. faecalis está relacionado a insucessos no tratamento
endodôntico. Não apenas o E. faecalis, mas uma flora microbiana mista ocasiona a
lesão perirradicular primária, porém, quando a periodontite apical persiste após o
retratamento endodôntico, observa-se a presença dominante e às vezes única deste
micro-organismo, aparentando ser este patógeno o principal responsável por manter
infeccionado o canal radicular e a lesão periapical. Apresenta alta resistência a
medicamentos utilizados nesta terapia, tais como iodofórmio e clorexidina.61-62
São capazes de penetrar profundamente nos túbulos dentinários, dirigindo-se
à polpa. E. faecalis, podem sobreviver em ambientes com pH acima de 10,
apresentando resistência à ação do hidróxido de cálcio, crescendo em pH alcalino.
Foi demonstrado em estudo in vitro que a elevação do pH em 8,5, decorrente de
tratamentos insuficientes com medicação alcalina, como o hidróxido de cálcio, faz
com que a adesão ao colágeno de E. faecalis aumente, podendo ser este o fator
determinante da predominância deste micro-organismo em infecções endodônticas
persistentes.63,64
23
2.3. Soluções desinfetantes
2.3.1. Clorexidina
A síntese da clorexidina ocorreu nos anos 40 e, em 1954 começou a ser utilizada
com a finalidade de antissepsia em tratamentos urológicos, ginecológicos e
ferimentos de pele. Na odontologia, foi empregada a partir de 1959 durante
procedimentos cirúrgicos na assepsia das mãos e também para a realização de
bochechos.34,65
Devido à sua baixa solubilidade em água, é disponibilizada nas formas de
acetato, cloridrato, gluconato, digluconato, sendo este último mais utilizado. A
máxima atividade microbiológica e estabilidade química dessas soluções aquosas é
obtida em pH 5 a 8.66
Analisando a eficácia de soluções aquosas de clorexidina dentre as
substâncias testadas, a solução aquosa de clorexidina 1% foi a que apresentou a
melhor relação entre custo e eficácia para desinfecção de superfícies, sendo efetiva
para todas as superfícies e todos os microrganismos testados.67
Uma importante característica que amplifica o espectro de ação da bisguanida
clorexidina é a presença de cargas positivas nas extremidades moleculares. Devido
à sua natureza catiônica, ela adsorve-se a compostos aniônicos como glicoproteínas
salivares, radicais fosfatados e carboxílicos presentes no biofilme dental como
bactérias e polissacarídeos extracelulares, película dental e macromoléculas
presentes na mucosa oral. A molécula catiônica da clorexidina é atraída pela carga
negativa existente na superfície bacteriana e, através de interações eletrostáticas, é
ligada à membrana celular, na dependência da sua concentração e esta adsorção se
dá provavelmente por ligações hidrofóbicas ou por pontes de hidrogênio.31
Outra propriedade da clorexidina é sua substantividade. Tem a capacidade de
aderir-se à mucosa, película dental, hidroxiapatita, glicoproteínas salivares e, no
momento em que decresce sua concentração no meio, é então liberada, fazendo
com que seja prolongado o efeito antimicrobiano.65,68
Os efeitos antimicrobianos da clorexidina em diversas áreas da odontologia já
foram comprovados por muitos autores. Há várias referências relatando a sua
aplicação na endodontia, como solução irrigadora e medicação intracanal,69,70 na
24
redução da placa bacteriana,71 periodontia,72 na cirurgia para antissepsia das mãos,
nos procedimentos pré-cirúrgicos.73
A citotoxidade das concentrações de 0,12%, 0,2%, 1%, 2% e 5% de
clorexidina foram avaliadas por Santos et al.,74 em um estudo in vitro. Concluíram
que, em relação às outras concentrações testadas no estudo, 0,12% e 0,2%
apresentaram-se menos citotóxicas em cultura de fibroblastos.
Observando os efeitos do digluconato de clorexidina na mucosa de ratos ,
Pinto
et
al.,75
encontraram
na
concentração
5%,
capacidade
citotóxica
evidentemente lesiva. Baixo poder de agressão foi manifestado na concentração de
0,5%, assim relatando ser esta ação lesiva, dependente da concentração e do
tempo de aplicação.
A clorexidina pode ser utilizada em diversas formulações na Odontologia:
solução para bochecho, gel, verniz, dentifrício, goma de mascar, irrigação gengival e
em dispositivos de liberação lenta (chip). Quando utilizada em dentifrícios pode ter
sua ação reduzida, pois estes apresentam, incluídos em suas formulações,
detergentes, como por exemplo, o laurel sulfato de sódio, que podem reduzir sua
ação devido à incompatibilidade com a clorexidina.68,76
A utilização de “spray” de clorexidina 0,12% para a desinfecção de escovas
dentais, aparelhos removíveis, próteses removíveis parciais ou totais tem se
mostrado eficiente em muitos estudos.3,4,10,77-79
Apesar de ser considerada como “padrão ouro” na desinfecção, a clorexidina
apresenta efeitos indesejáveis como descamações e dor na mucosa oral,
manchamento em restaurações e áreas proximais dos dentes e na língua, além de
favorecer a formação de cálculos supra gengivais. Sua utilização é recomendada
apenas para períodos curtos. Também pode apresentar descoloração da resina de
próteses, quando utilizada como solução desinfetante para imersão por tempo
prolongado.80,81 Quando administrada por um longo período pode ocasionar,
inclusive, alterações na percepção de gosto como salgado e quinina, doce e ácido.82
25
Tabela 1: Desinfetantes e esterilizantes mais utilizados em artigos odontológicos.
Desinfetante
Características
Indicações
Desvantagens
Ação rápida, fácil
Desinfecção de nível
Inflamável, resseca
Álcool 70% (etíllico
aplicação, viável
médio de artigos e
plástico e opacifica
e isopropílico
para artigos
superfícies
artigos acrílicos
Em forma líquida ou
Desinfecção de nível
É corrosivo para
sólida; ação rápida e
médio de artigos e
artigos e superfícies
baixo custo
superfícies e
metálicas; irrita
descontaminação de
mucosas; odor forte.
metálicos
Cloros e Composto
Cloratos
superfícies
Glutaraldeído
Não danifica
Esterilização e
Irritante para
instrumentais,
desinfecção de alto
mucosas e pele
plásticos; atividade
nível
(olhos, nariz,
germicida em
garganta, etc.)
presença de matéria
É realizada através
Esterilização de
Alto custo do
Plasma de Peróxido
de equipamento
artigos sensíveis ao
equipamento
de Hidrogênio
automatizado e
calor e a umidade
computadorizado
Ácido Peracético
Não forma resíduos
Formulações
Instável após a
tóxicos
associadas a
diluição
peróxido de
hidrogênio
Óxido de Etileno
Processo de
Esterilização de
Tóxico para pele e
esterilização
artigos
mucosas
combinado ao calor
termossensíveis
úmido da autoclave
83
Fonte: Adaptado de Brasil, 1999.
26
2.3.2. Água ozonizada
A descoberta do ozônio ocorreu por Schonbein em 1839 ao observar um odor
característico liberado após descargas elétricas na atmosfera. Devido às suas
propriedades germicidas, foi utilizado primeiramente como desinfetante para
tratamento de água potável na Holanda, França e também outros países a partir do
final do século XIX .84
O ozônio é encontrado na natureza fazendo parte da estratosfera, camada
superior da atmosfera, promovendo a absorção da radiação ultravioleta emitida
pelos raios solares.85
Para que ocorra este processo de produção do ozônio é necessária a
associação de um átomo de oxigênio com uma molécula de oxigênio (O2), reação
esta expressa por O + O2, o ozônio (O3). Forma-se, então um composto químico que
consiste de 3 átomos de oxigênio ligados covalentemente (O3 oxigênio tri atômico),
com alto poder oxidante.
Figura 1: Molécula de ozônio.
Fonte: http://www.ozoneapplications.com/info/advantages_of_ozone.htm
27
A obtenção do ozônio pode ocorrer através da passagem do oxigênio puro
por uma descarga elétrica.86 São utilizados com maior frequência os geradores do
tipo corona. A passagem de oxigênio puro entre dois eletrodos, através de uma
elevada diferença de potencial elétrico, acarreta uma dissociação do oxigênio e,
como consequência, a recombinação destas espécies radicais de oxigênio com
moléculas de O2 presentes no sistema. Dá-se, então a formação do ozônio. A
concentração estará na dependência da composição do gás empregado na
produção (se O2 ou ar), frequência, fluxo de distribuição do sistema e voltagem
aplicada nos eletrodos.87
Figura 2: Representação do reator para a geração de ozônio pelo método de descarga elétrica.
Fonte: http://www.ozoneapplications.com/info/OzoneCreationInNature.pdf
Durante a primeira guerra mundial há relatos sobre a utilização deste gás na
terapia de gangrenas pós-traumáticas, feridas infectadas, queimaduras, fístulas,
feridas em putrefação, supurações de fraturas ósseas e várias inflamações em
soldados alemães.30
O ozônio possui muitas aplicações, sendo utilizado em processos industriais,
redes de tratamento de água, desinfecção de alimentos, eliminação de odores
indesejados e inclusive no branqueamento de compostos orgânicos.85,88
28
Na medicina, é relatada sua utilização sistêmica em auto-hemoterapia maior e
menor, na insuflação retal e, devido ao seu alto poder oxidativo, com efeitos sobre
bactérias, fungos e vírus, tem indicação para o tratamento de diversas
patologias.89,90
Na odontologia, por volta de 1933, o ozônio foi utilizado por E.A. Fisch para
tratamento de cáries e infecções periodontais crônicas e também nesta época, é
relatada a utilização da água ozonizada em cirurgias, com a finalidade de promover
hemostasia, oxigenação do local e também impedir a ocorrência de proliferação
bacteriana.
Existem diversos protocolos de utilização na odontologia, sendo as principais
formas de utilização: óleo ozonizado, água ozonizada e gás oxigênio/ozônio.
Quando utilizado na forma gasosa, apresenta risco de efeitos colaterais no sistema
respiratório.30
Na prevenção e remineralização de tecido cariado pode ser utilizado visando
a eliminação de bactérias presentes em lesões cariosas. Para esta finalidade, é
administrado na forma de gás. Não requer anestesia e não provoca dor. Estudos in
vitro em curto prazo relatam a redução microbiana após breves aplicações do gás
em dentina cariada.91,92
Na periodontia tem sua utilização através da irrigação com água ozonizada
após os procedimentos de raspagem e alisamento ou cirurgias, reduzindo a carga
patogênica local e, de forma sistêmica, com insuflação do gás na região afetada.93
Também parece acelerar a regeneração dos tecidos moles em ulcerações aftosas,
herpes labial, gengivite ulcerativa necrosante aguda (GUNA) e outras infecções
gengivais, com a aplicação do óleo ozonizado.94
A aplicação do gás ozônio é relatada também na área ao redor dos implantes,
com a finalidade de redução microbiana e também no intuito de estimular a
regeneração ao redor dos tecidos.95
Na prótese dentária tem sua utilidade como desinfetante na resina acrílica de
próteses totais e removíveis, reduzindo a carga microbiana após a aplicação de gás
ou água ozonizada, com provável vantagem de não causar manchas ou desgaste na
superfície do material, nem alterar suas propriedades.92,94
Em procedimentos endodônticos, a terapia com ozônio é utilizada na
desinfecção dos canais radiculares e também com a finalidade de minimizar as
lesões nos tecidos periapicais, podendo ser administrado das seguintes formas:
29
insuflação de gás, em irrigações com água ozonizada e também óleo ozonizado.
Parece ter ação efetiva na remoção de manchas na coroa dental causadas pelo
tratamento endodôntico.93,96,97
Quanto ao mecanismo de ação, acredita-se que, primariamente o ataque do
ozônio ocorra sobre a parede celular da bactéria e, após isto, penetrando no interior
da célula, ele promova a oxidação dos glicolipídeos, glicoproteínas, fosfolipídeos
(Figura 3). De acordo com a extensão destas reações, ocorrerá a lise celular.
Promove a morte bacteriana de forma muito rápida.98,99
O pH em uma variação de 5,6 a 9,8 é o ideal para que a ação do ozônio
ocorra de maneira satisfatória na inativação de bactérias e vírus. A ozonização
possui custo baixo em relação às substâncias cloradas, não exige calor e é isenta de
resíduos tóxicos, além de ter ação até 3.125 vezes mais rápida do que o cloro
durante inativação celular.
100
É de extrema importância a observação da
concentração e doses de ozônio aplicadas durante a terapia para que sejam efetivos
os seus efeitos antibacterianos.101
Figura 3: Mecanismo de ação do ozônio nos micro-organismos: 1. Imagem da bactéria sadia gerada
por computador; 2. Parede celular da bactéria em contato com o ozônio; 3. Oxidação da parede
celular; 4,5 e 6. Ruptura e destruição da bactéria.
102
Fonte: Chiattone et al., 2008.
Bactérias, fungos e vírus não possuem sistemas de reparo a estruturas como
DNA e RNA e o ozônio, ao reagir com estas cadeias, prejudica a replicação celular e
produção de aminoácidos, causando, consequentemente, a desnaturação e morte
das células.103
30
Huth et al.,104 em um estudo utilizando células humanas epiteliais bucais e
fibroblastos gengivais compararam a utilização do gás ozônio, água ozonizada e
antissépticos tradicionais (digluconato de clorexidina a 2%, hipoclorito de sódio a
5,25% e 2,25% e peróxido de hidrogênio a 3%) durante o tempo de 1 min, testando
a citotoxidade destas substâncias e não observaram efeito tóxico do ozônio sobre as
células bucais.
Além da conscientização quanto ao risco nocivo às vias aéreas superiores e
outros órgãos quando inalado por tempo prolongado, é importante que sejam
observadas as dosagens corretas e proteção necessárias durante as terapias com
ozônio. Este também apresenta algumas contraindicações como gravidez,
deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (favismo), hipertireoidismo, anemia
grave, miastenia grave, hemorragia ativa, intoxicação alcoólica aguda, infarto do
miocárdio recente e alergia de ozônio.99
2.4. Desinfecção de aparelhos ortodônticos removíveis
A desinfecção de aparelhos ortodônticos removíveis pode ser realizada por métodos
mecânicos, químicos e também uma combinação entre eles (mecânicos + químicos)
na desinfecção de aparelhos ortodônticos removíveis.
A higienização realizada com a utilização de escovação, acompanhada de
pastas abrasivas, obtém, através de sua ação mecânica, pobre redução microbiana
quando comparada aos outros tratamentos, não sendo efetiva na remoção dos
micro-organismos aderidos às próteses utilizadas na cavidade bucal.105
A combinação do método de higienização mecânica ao uso de agentes
desinfetantes químicos por imersão permite reduzir o acúmulo de biofilme e também
a quantidade de micro-organismos em dispositivos acrílicos, inclusive aparelhos
ortodônticos e próteses removíveis.4
Na literatura, as publicações relativas aos métodos de desinfecção de AOR
são escassas.
Friedman et al.,106 verificaram a eficácia de um sistema de liberação
sustentada de clorexidina 0,2% na redução de micro-organismos aderidos aos
AOR.Foi realizado um ensaio clínico com um grupo de oito estudantes portadores de
AOR revestidos por polímero contendo o fármaco. O acúmulo do biofilme foi
31
reduzido eefeitos colaterais da clorexidina, como a coloração do dente e sabor
desagradável não foram observados.
No estudo realizado por Diedrich,105 foram analisados 03 grupos de
portadores de AOR, comparando a utilização dos métodos escova + creme dental;
comprimidos efervescentes e ultrassom. Os resultados comprovaram que somente a
escova + pasta obteve sucesso na desinfecção. A utilização de efervescentes e o
ultrassom conseguiram realizar a desinfecção, porém, nenhum deles eliminou
totalmente os micro-organismos presentes nos AOR.
Para a desinfecção de próteses totais contaminadas com C. albicans, Vargas
et al.107 utilizaram soluções de digluconato de clorexidina 1, 2 e 0,2%, imergindo
estas as próteses durante 10 min. Observaram maior eficácia da solução 2% na
inativação de Candida albicans.
Perdiza
79
em estudo clínico randomizado, realizado em 20 pacientes, de 7 a
11 anos de idade, em tratamento com AOR, avaliou a contaminação microbiana
destes aparelhos, com e sem a utilização de agentes antimicrobianos, observando a
eficácia do digluconato de clorexidina 0,12 % em comparação ao placebo sobre
micro-organismos cariogênicos e periodontopatogênicos. Concluíram que os
aparelhos do grupo controle estavam densamente contaminados. Após o uso do
spray de digluconato de clorexidina 0,12% duas vezes por semana, observou-se
uma
diminuição
significante
dos
micro-organismos
cariogênicos
e
periodontopatogênicos nesses aparelhos.
Nisayif
108
em um ensaio clínico, realizado em 60 crianças de 8 a 14 anos
durante a higienização de AOR, avaliaram os seguintes grupos: escovação + água,
tabletes efervescentes; escovação + pasta. Através de contagem microbiana,
concluíram que tabletes e escovação com pasta não foram diferentes entre eles,
mas foram melhores que escovação com água.
Vento-Zahra et al.109 em um ensaio clínico randomizado, realizado em 70
adolescentes de 11 a 15 anos utilizando AOR, avaliaram a ação desinfetante de
tabletes de nitradina, observaram , após contagem microbiana, que estes reduziram
a presença de Candida albicans e odor.
Peixoto et al.,4 em um ensaio clínico randomizado, utilizando aparelhos
removíveis em 22 jovens de 15 a 22 anos, observaram os grupos: Escovação +
água uma vez ao dia, escovação pasta e clorexidina 0,12% no 7º dia, escovação
pasta e clorexidina 0,12% no 4º e 7º dias. Após 01 semana de uso, os aparelhos
32
foram recolhidos e submetidos ao processamento microbiológico. Após a contagem
microbiana concluíram que escovação + pasta e a clorexidina 0,12% 1 a 2 vezes por
semana reduziram a contaminação por Streptococcus mutans.
Lessa et al.,3 em um ensaio clínico randomizado, utilizando aparelhos
ortodônticos removíveis em 20 crianças de 6 a 12 anos, avaliaram a eficácia de
sprays antimicrobianos Periogard (Colgate-Palmolive Ind. Brasileira, Osasco, SP,
Brasil) , Cepacol ( Merrell Lepetit Farmacêutica e Industrial Ltda , Santo Amaro , SP,
Brasil) , e água estéril tap (controle). Todas as soluções foram usadas em todos os
estágios por um grupo diferente de crianças. Concluíram que, após uma semana,
todos os aparelhos foram contaminados por colônias de Streptococcus mutans.
Cepacol e Periogard tiveram melhores resultados na desinfecção, comparados à
agua (controle), mas com significativa melhor eficácia do Periogard.
2.4.1. Métodos alternativos
Têm sido objeto de estudo em vários trabalhos, métodos alternativos aos
tradicionalmente utilizados para a desinfecção de próteses totais, parciais e AOR.
Em um estudo clínico, avaliando a higienização de 60 próteses totais com a
utilização de diferentes concentrações de fotossensibilizadores, divididos em 04
grupos, seguidos ou não da irradiação de luz LED, Ribeiro et al.110 observaram nos
grupos onde se utilizou a PDT (Terapia fotodinâmica), uma inativação de 90% do
micro-organismos presentes na superfície das próteses.
Em 2009, Dovigo et al.,111 realizaram um estudo in vitro, onde foram avaliadas
70 próteses totais, contaminadas por 03 diferentes micro-organismos. Os resultados
mostraram que a irradiação de microondas por 3 minutos a 650 W produziu
esterilização de próteses totais contaminadas com S. aureus e P. aeruginosa. Foram
necessários 5 min a 650 W para a inativação de B. Subtilis.
Utilizando 72 corpos de prova de resinas acrílicas para a confecção de
próteses totais, inoculadas com 03 espécies de Candida, Silva112 avaliou a
efetividade da irradiação por microondas na desinfecção da superfície de resina. No
grupo controle (que não recebeu irradiação) houve crescimento microbiano após 48
horas de incubação. No grupo experimental, após irradiação de 650 W de
microondas durante 3 min, C. albicans, C. dubliniensis e C. Tropicalis não
apresentaram colônias viáveis após incubação a 37ºC durante 48 horas.
33
Mima et al.,113 avaliaram, in vitro, a desinfecção de 37 próteses totais
contaminadas por 04 cepas diferentes de C albicans, utilizando fotossensibilizador
Photogen® com ou sem aplicação de luz. Obeservaram que para todas as espécies
de Candida, a PDT ocasionou uma redução significativa dos valores de UFC / mL de
prótees totais, quando comparada ao grupo controle.
Eubank,114 avaliou in vitro o efeito da terapia fotodinâmica em superfícies de
acrílico, como de próteses dentárias e placas de Hawley, contendo células de
Candida albicans em suspensão e em biofilme. Concluiu que a PDT em células de
C. albicans organizadas em biofilme mostrou-se ineficaz nos parâmetros testados.
No entanto, a terapia para este fungo em suspensão mostrou-se eficiente. Embora
não tenha sido observada a inativação das células em biofilme, a PDT promoveu a
desorganização desta estrutura.
Ribeiro et al.110, através de um estudo clínico, coletaram amostras de biofilme
acumulado na superfície das próteses totais de 30 pacientes. Para a realização da
desinfecção, foram divididas em dois grupos, onde irradiações de 650 W de microondas, durante 2 ou 3 min foram aplicadas. No grupo onde se utilizou 650 W por 2
min houve apenas uma redução significativa dos micro-organismos presentes na
superfície da base de resina. Nas próteses irradiadas por 3 min houve total
eliminação dos micro-organismos.
Vlahova et al.,115 analisaram a desinfecção de 147 próteses totais, que
receberam primeiramente escovação com dentifrício, depois foram imersos em 04
diferentes fotossensibilizadores, seguido da aplicação da luz LED vermelha.
Concluíram que a terapia fotodinâmica é um método eficaz para a inativação de
patógenos nas próteses totais e que este método pode servir como parte do
tratamento para a mucosite.
34
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1. Locais de estudo
Os experimentos e a avaliação microbiológica foram realizados no Laboratório de
microbiologia da Universidade Camilo Castelo Branco – UNICASTELO, Campus
Fernandópolis SP, no mês de março de 2014.
3.2. Confecção dos aparelhos ortodônticos
Foram confeccionados 60 aparelhos ortodônticos removíveis (AOR), sendo estes
placas de Hawley da arcada superior, do modelo de gesso de um mesmo paciente
para o experimento. A confecção da base foi realizada com resina acrílica e o arco
vestibular confeccionado com fio de aço inoxidável 0,7 mm (MORELLI, SP, Brasil).
Cada aparelho recebeu uma numeração de 01 a 05, e identificação, de acordo com
o micro-organismo no qual seria imerso e a solução desinfetante utilizada (Figura 4).
Utilizamos as letras “S” para S. mutans, “E” para E. faecalis, “C” para C. albicans; “c”
para o grupo clorexidina 1%, “s” para spray e “o” para a água ozonizada. Para cada
sub grupo foi utilizada a numeração de 01 a 05.
Figura 4: Identificação dos AOR (aparelhos ortodônticos removíveis)
35
A confecção da base foi realizada com resina acrílica quimicamente
polimerizada e do arco vestibular com fio de aço inoxidável 0,7 mm (MORELLI, SP,
Brasil®). O modelo de gesso foi isolado com Cel-Lac® (S.S. White Artigos
Odontológicos,
Rio de
Janeiro,
Brasil). A
resina
acrílica
utilizada
foi a
autopolimerizável (Jet, Clássico Artigos Odontológicos Ltda., São Paulo, SP, Brasil),
com a proporção monômero-polímero recomendada pelo fabricante. A acrilização foi
feita em recipiente pressurizador com 25 libras (Polimerizador para acrílico- VH
Softiline®, Araraquara, Brasil) durante 15 min, com a finalidade de evitar, durante a
polimerização, a formação de bolhas. O recorte e acabamento foram realizados com
a utilização de instrumento rotatório de tungstênio em motor de baixa rotação. Lixas
d’água, granulação 200, montadas em mandril em baixa rotação foram utilizadas
para regularização da superfície O polimento do aparelho foi realizado em torno para
polimento, utilizando pasta de pedra-pomes em baixa rotação e, posteriormente,
solução de branco de Espanha, em disco de feltro também em baixa velocidade. O
acabamento final foi realizado em polidora química (PQ 9000 Termotron®,
Piracicaba, Brasil), com o intuito de propiciar maior lisura e brilho da superfície do
acrílico (baseado no protocolo adotado por Peixoto)4.
3.3. Grupos
Os 60 AOR foram divididos em quatro grupos, contendo 15 aparelhos cada e estes
divididos em 03 subgrupos, de acordo com o micro-organismo utilizado na
contaminação.
Grupo1: Controle – solução salina estéril (0,5%)
Grupo 2: solução aquosa de digluconato de clorexidina 1%
Grupo 3: solução aquosa de digluconato de clorexidina 0,12% na forma de spray
Grupo 4: água ozonizada
3.4. Linhagens bacterianas, preparação do inóculo, descontaminação dos
AOR.
Foram utilizadas linhagens bacterianas de Streptococcus mutans ATCC25175,
Enterococcus faecalis ATCC 18211, Candida albicans ATCC 25923, pertencentes à
coleção do laboratório de microbiologia da Unicastelo, Campus Fernandópolis, SP.
36
Para preparação do inóculo, as linhagens foram incubadas a 37ºC por 24
horas, C. albicans foi cultivada em ágar Sabouraud-Dextrose , S. mutans em ágar
SB20 e E. faecalis em Tryptic Soy agar. Cada linhagem foi transferida para 1L de
meio Tryptic Soy Broth (TSB, Oxoid®) e cultivadas a 37ºC por 24 horas, sob
agitação (200 rpm). Em seguida, suspensões fúngicas e bacterianas foram
preparadas em solução de NaCl estéril (0,5%) e ajustadas ao tubo 0,5 da escala de
McFarland, que correspondeu aproximadamente a 1,5 x 108 UFC mL-1. A partir desta
solução foram realizadas diluições seriadas resultando uma concentração de 1,5x
106 UFC mL-1. Estas soluções foram empregadas para contaminação dos AOR
(previamente esterilizados em autoclave). No processo de contaminação os AOR
foram submergidos nas diferentes suspensões microbianas por 24 horas.
Transcorrido este período foram coletadas amostras da superfície (1 cm2), (Figura
5), com auxilio de um swab e em seguida transferidas para 10 mL de solução salina,
agitadas vigorasamente por 1min. A partir desta suspensão foram realizadas
diluições seriadas. De cada diluição 0,1 mL foi retirado para inocular placas
contendo os meios correspondentes a cada linhagem, e para determinação do
número de unidades formadoras de colônias presentes em cada AOR. Este
procedimento foi realizado em triplicata.
Os resultados obtidos foram expressos em UFC cm-2.
Para cada micro-organismo foram utilizados 20 aparelhos (correspondentes
aos 05 aparelhos de cada subgrupo).
Quinze AOR foram utilizados como controle negativo, as mesmas
submergidas por cinco minutos em solução de NaCl (0,5%) esterilizada.
3.5. Desinfecção
Produção de ozônio
O ozônio foi produzido através de um gerador que utiliza o princípio do efeito corona
por descarga elétrica (Ozon & Life®) e o oxigênio puro suprido via cilindro de
oxigênio, com acoplamento de válvulas de controle de pressão e fluxo de O2 na
entrada. A produção aconteceu de forma constante pelo equipamento, sendo o gás
conduzido por um tubo de silicone para o difusor imerso em um recipiente,
esterilizado anteriormente, contendo 500 mL de água bidestilada, com vazão de
37
1L/min de O2 gerando 33 mg/L de O3, na dose de 165 mg/L x min. Antes da
desinfecção dos AOR, a água bidestilada foi exposta ao ozônio por 05 min, por meio
de difusor, de forma direta, com temperatura controlada de 18°C.
Figura 5: Equipamento gerador de ozônio.
Fonte: Acervo do autor
´
Após o período de colonização, foram coletadas amostras da superfície dos
AOR (em uma área de 1 cm2) na região das rugosidades palatinas, através de swab
estéril, tais amostrais receberam a sinonímia "Antes". Os AOR passaram então pelo
tratamento, sendo imersos durante 5 min nas soluções: solução salina estéril (0,5%)
(grupo 1), de clorexidina 1% (solução aquosa de digluconato de clorexidina 1%,
manipulação Farmácia Ponto Homeopático, Fernandópolis, SP) (grupo 2), de água
ozonizada (grupo 4). Os AOR do grupo 3 (solução de digluconato de clorexidina
0,12%), (manipulação farmácia Ponto Homeopático-Fernandópolis, SP) foram
aspergidos por 6 vezes sobre sua superfície, aguardando-se 05 min.
3.5.1. Coleta do material pós-desinfecção
Após o período de contaminação, os AOR foram removidos um a um, com auxílio de
uma pinça clínica esterilizada e passaram pelo processo de desinfecção, sendo
imersos nas soluções desinfetantes água ozonizada ou solução de clorexidina 1%
durante 05 min.
38
Após a aplicação do ozônio, clorexidina 1% ou spray 0,12% foram coletadas
amostras da superfície (em uma área de aproximadamente 1cm2 na região contralateral da primeira coleta, nas rugosidades palatinas, através de swab estéril. As
amostras que passaram pela desinfecção receberam a sinonímia “Depois”. Em
seguida transferidas para 10 mL de solução salina, agitadas vigorosamente por
1min. A partir desta suspensão foram realizadas diluições seriadas. De cada diluição
0,1 mL foi retirado para inocular placas contendo os meios correspondentes a cada
linhagem, e para determinação do número de unidades formadoras de colônias
presentes em cada AOR. Este procedimento foi realizado em triplicata.
Os resultados obtidos foram expressos em UFC cm-2.
a d
Figura 6: Local de coleta das amostras.
Fonte: Acervo do autor
3.6. Análise estatística
Para avaliação estatística dos dados estatísticos quantitativos aplicou-se o teste não
paramétrico de Mann Whitney com intuito de verificar se a contagem das UFC/mL
entre os grupos apresentou ou não diferença significante. Adotou-se nível de
significância de 5%
Objetivos da análise estatística:
39
• Verificar o efeito desinfetante da clorexidina e do ozônio em aparelhos
ortodônticos em relação aos microrganismos estudados;
• Avaliar a eficácia dos diferentes tratamentos na desinfecção desses
aparelhos.
40
4. RESULTADOS
A Tabela 2 evidencia a média da contagem das unidades formadoras de colônias
nos grupos C. albicans (A/D), S. mutans (A/D), E. faecalis (A/D). Não houve
diferença estatística significativa entre C. albicans (A/D) p=0,0714; S. mutans (A/D)
p=0,801 e E. faecalis (A/D) p=0,6429.
Tabela 2: Controle (GRUPO 1)
Aparelho/
Microorg
C. albicans C. albicans
(A)
(D)
S. mutans
(A)
S. mutans
(D)
E. .faecalis
(A)
E. faecalis
(D)
AOR 1
3,2 x 106
2,4 x 106
4,5 x 106
3,2 x 106
2,0 x 106
1,8 x 106
AOR 2
2,9 x 106
2,8 x 106
8,3 x 106
6,1 x 106
2,5 x 106
1,5 x 106
AOR 3
4,9 x 106
3,5 x 106
1,4 x 106
2,4 x 106
3,1 x 106
2,9 x 106
AOR 4
3,2 x 106
2,9 x 106
5,3 x 106
5,4 x 106
9,4 x 106
7,4 x 106
AOR 5
4,4 x 106
2,6 x 106
1,9 x 106
2,3 x 106
1,3 x 106
1,8 x 106
Média
3,72x 106
2,84x 106
4,28x 106
3,88x 106
3,66x 106
3,08x 106
D. P.
8,76x 105
4,1 x 105
2,7 x 106
1,76x 106
3,28x 106
2,47x 106
p value
0,0714
0,8016
0,6429
p< 0,05
Não
Não
Não
(A) antes da desinfecção; (D) depois da desinfecção; AOR aparelho ortodôntico removível.
D.P.: desvio padrão
41
Os resultados da Tabela 3 evidenciam a média da contagem das unidades
formadoras de colônias no grupo 2 (CHX 1%), nos grupos C. albicans (A/D), S.
mutans (A/D), E. faecalis (A/D). Houve diferença estatística significativa entre C.
albicans (A/D) p=0,0079; S. mutans (A/D) p=0,0079 e E. faecalis (A/D) p=0,0079.
Tabela 3: Clorexidina 1% (GRUPO 2)
Aparelho/
Microorg
C albicans C albicans S mutans
(A)
(D)
(A)
S mutans
(D)
E faecalis
(A)
E faecalis
(D)
AOR 1
5,2 x 106
0
1,3 x 106
0
6,0 x 105
30
AOR 2
1,0 X 106
0
8,2 x 106
0
7,0 x 105
20
AOR 3
3,4 x 106
0
1,4 x 106
0
5,4 x 106
30
AOR 4
4,7 x 106
0
6,7 x 106
0
3,1 x 106
30
AOR 5
4,8 x 106
0
1,8 x 106
0
6,7 x 106
30
Média
3,82 x 106
0
3,88 x 106
0
3,3 x 106
28
D. P.
1,72x 106
0
3,31x 106
0
2,74x 106
4,47
p value
0,0079
0,0079
0,0079
p< 0,05
Sim
Sim
Sim
(A) antes da desinfecção; (D) depois da desinfecção; AOR aparelho ortodôntico removível.
D.P.: desvio padrão
A Tabela 4 evidencia a média da contagem das unidades formadoras de
colônias no grupo 3 (spray de clorexidina a 0,12%), nos grupos C albicans (A/D), S
mutans (A/D), E faecalis (A/D). Houve diferença estatística significativa entre C
albicans (A/D) p=0,0079; S mutans (A/D) p=0,0079 e E faecalis (A/D) p=0,0079.
42
Tabela 4: Spray de clorexidina 0,12% (GRUPO 3)
Aparelho/
Microorg
C albicans C albicans S mutans
(A)
(D)
(A)
S mutans
(D)
E faecalis
(A)
E faecalis
(D)
AOR 1
4,0 x 106
0
2,3 x 106
0
6,0 x 105
0
AOR 2
1,0 x 106
0
6,4 x 106
0
8,0 x 105
0
AOR 3
2,9 x 106
0
1,5 x 106
0
1,6 x 106
0
AOR 4
3,1 x 106
0
6,0 x 106
0
2,6 x 106
0
AOR 5
4,0 x 106
0
1,0 x 106
0
5,4 x 106
0
Média
3,0 x 106
0
3,44 x 106
0
2,2 x 106
0
D. P.
1,23 x 106
0
2,57 x 106
0
1,95x 106
0
p value
0,0079
0,0079
0,0079
p < 0,05
Sim
Sim
Sim
(A) antes da desinfecção; (D) depois da desinfecção; AOR aparelho ortodôntico removível.
D.P.: desvio padrão
A Tabela 5 evidencia a média da contagem das unidades formadoras de
colônias no grupo 4 (Água ozonizada), nos grupos
C albicans (A/D), S mutans
(A/D), E faecalis (A/D). Houve diferença estatística significativa entre C albicans
(A/D) p=0,0079; S mutans (A/D ) p=0,0079 e E faecalis (A/D) p=0,0079.
43
Tabela 5: Água ozonizada (GRUPO 4)
Aparelho/
Microorg
C albicans C albicans S mutans
(A)
(D)
(A)
S mutans
(D)
E faecalis
(A)
E faecalis
(D)
AOR 1
3,8 x 106
0
2,0 x 106
0
6,0 x 105
0
AOR 2
1,1 x 106
0
9,2 x 106
0
8,0 x 105
0
AOR 3
2,7 x 106
0
1,8 x 106
0
1,0 x 106
0
AOR 4
3,9 x 106
0
5,5 x 106
0
5,4 x 106
0
AOR 5
4,8 x 106
0
9,0 x 105
0
6,5 x 106
0
Média
3,26x 106
0
3,88x 106
0
2,86x 106
0
D. P.
1,42x 106
0
3,45x 106
0
2,85x 106
0
p value
0,0079
0,0079
0,0079
p < 0,05
Sim
Sim
Sim
(A) antes da desinfecção; (D) depois da desinfecção; AOR aparelho ortodôntico removível.
D.P.: desvio padrão
Os resultados mostram a inexistência de diferenças significativas das
diferenças das contagens microbianas, ou seja, os três microrganismos se
comportaram de forma semelhante nos três tratamentos de desinfecção. Não houve
diferenças significativas quando a diferença da contagem dos microrganismos foi
comparada em relação a cada um dos tratamentos.
44
5. DISCUSSÃO
A escolha das espécies de microrganismos utilizados no presente trabalho teve
como base Salerno et al.,39 que observaram uma maior presença de C.albicans em
portadores de aparelhos removíveis de resina. Maret et al.52 relataram importante
mudança na microbiota de indivíduos portadores de aparelhos ortodônticos
removíveis, com um incremento de valores de S.mutans. e o E.faecalis foi incluído
neste estudo por apresentar maior resistência a medicamentos, tais como iodofórmio
e clorexidina.62
Stewart22 verificou que o biofilme bacteriano possui taxa de crescimento de
1.000 µm em 6 dias, observou então que a difusão de clorexidina em um biofilme de
260 µm leva 298 s. O mesmo padrão de crescimento foi verificado no trabalho de
Valentini et al.116 onde o biofilme na superfície de próteses analisadas sob
microscopia eletrônica indicou crescimento exponencial entre o sétimo e vigésimo
primeiro dias de colonização, e estacionário a partir de então, quando atingida
maturidade.
O ozônio difundido em água, tem coeficiente de difusão de aproximadamente
10-10 cm2/s (0,01 µm2/s) em semi sólidos, e aproximadamente 10-5 cm2/s (103
µm2/s), nos líquidos.33-35 Comparativamente apresenta uma massa molar de 48
g/mol e solubilidade em água de 0,105 g/100mL, enquanto que a massa molecular
da clorexidina corresponde a 505,45 g/mol e possui solubilidade em água de 0,8 g/L.
Wakamatsu
e
colaboradores117
analisaram
a
cinética
de
múltiplos
antimicrobianos em biofilmes compostos por bactérias do gênero S.mutans e
verificaram que uma solução de digluconato de clorexidina a 0,12% em veículo
aquoso necessitou de um tempo relativamente longo para atingir as camadas mais
profundas do biofilme, exibindo uma velocidade de penetração de 6 µm/min. Hope e
Wilson118, em seu trabalho, demonstraram que a eficácia antimicrobiana de uma
solução de digluconato de clorexidina 0,2% em veículo aquoso, em um biofilme
multiespecífico se inicia após um intervalo de 3 a 5 min. Assim, para o controle
bacteriano em camadas mais profundas do biofilme há a necessidade de somar-se o
tempo de difusão da solução de clorexidina com seu tempo de eficácia
45
antimicrobiana. Parece razoável supor que aplicações de clorexidina em tempos
menores é ineficaz para erradicar o biofilme bacteriano.
O ozônio em comparação à clorexidina teria então a vantagem de apresentar
rápida difusão no veículo aquoso e no biofilme bacteriano. Soma-se ao fator da
velocidade da desinfecção, onde o ozônio apresenta capacidade desinfetante quase
momentânea assim que a concentração ideal é atingida no líquido, enquanto a
clorexidina demora em latência até adentrar camadas mais profundas do biofilme
numa taxa de difusão muito menor. Isso pode ser exemplificado pelo trabalho de
Nagayoshi et al.119 onde a utilização de água ozonizada na concentração de 4
mg/mL, durante apenas 10 segundos, resultou na eliminação de S.mutans.
Neste trabalho foi assumido que o tempo de 5 min seria suficiente para a
eficaz ação da clorexidina em ambas as concentrações e, comparativamente, o
ozônio deveria apresentar semelhante ação nesse período.
Os resultados mostram a existência de diferenças significativas na contagem
microbiana de C.albicans para três tratamentos: Clorexidina 1%, Spray de
clorexidina 0,12% e ozônio, sendo que a mediana de todos os tratamentos foi igual a
zero. Esse resultado indica a eficiência desses três tratamentos na desinfecção dos
aparelhos ortodônticos no que se refere ao desenvolvimento de C.albicans. Assim é
possível supor que esses três tratamentos são eficazes para zerar a carga
microbiana de C.albicans nos aparelhos avaliados.
Os resultados para S.mutans mostram a eficácia somente do tratamento
Spray de clorexidina 0,12%, que apresentou diferenças significativas da contagem
microbiana antes e após o tratamento (p<0,05). Para os demais tratamentos, a
diferença da contagem microbiana não foi significativa, pois todos os valores p
referentes ao teste estatístico resultaram superiores ao nível de significância
adotado.
Embora os resultados estatísticos tenham expressado a inexistência de
diferenças significativas para os tratamentos Clorexidina 1% e ozônio, a contagem
microbiana pós-tratamento zerou, mostrando a tendência, também, desses dois
tratamentos na desinfecção dos aparelhos em relação a S. mutans.
Para E. faecalis não houve diferenças significativas na contagem microbiana,
mostrando que, para esse microrganismo, a contagem inicial não se diferenciou de
forma significativa da contagem final. No entanto, dois tratamentos zeraram a
contagem microbiana, sendo eles: Spray de clorexidina 0,12% e ozônio,
46
pressupondo que esses tratamentos de desinfecção são os mais eficazes para esse
tipo de microrganismo.
Dentre os três microrganismos avaliados, a C.albicans se mostrou mais
vulnerável aos tratamentos de desinfecção, visto que a diferença da contagem
microbiana antes e após o tratamento foi significativa para os três tratamentos,
exceto o controle. No entanto, E.faecalis mostrou-se o mais resistente aos
tratamentos de desinfecção por não apresentar diferenças significativas entre as
contagens microbianas pré e pós-tratamento.
Na endodontia, a clorexidina é utilizada na concentração de 2% em vários
estudos, tendo ressaltada a sua eficácia na redução dos micro-organismos e a
propriedade de substantividade, permitindo um efeito prolongado da sua ação.120-122
Os trabalhos de Michelotto et al.123 e Marion et al.124 revisando a literatura,
concluíram que a clorexidina na concentração 2% apresentou uma maior efetividade
bactericida em comparação às demais concentrações desta solução, sendo a mais
utilizada nesta especialidade.
Vargas et al.107 comparando a efetividade das soluções de clorexidina na
desinfecção de próteses totais contaminadas com C. Albicans resistentes a
fluconazol, utilizaram um grupo controle de solução salina e compararam-no a
concentrações de 1, 2 e 0,2 % de clorexidina para a imersão das próteses por 10
min. Após a análise das amostras coletadas e contagem microbiana, concluíram que
a concentração 2% foi a mais eficaz.
No presente estudo, utilizou-se a concentração 1% da solução, que pode em
estudos futuros ser aumentada para imersão ou mesmo ter aumentado o seu tempo
de exposição durante o processo de desinfecção.
A solução de digluconato de clorexidina 0,12% spray (Grupo 3) se mostrou
eficiente na desinfecção frente a todos os micro-organismos testados, concordando
com os resultados do estudo de Peixoto4, onde a desinfecção dos AOR com spray
de digluconato de clorexidina nesta mesma concentração uma ou duas vezes por
semana, apresentou eficiência na redução de contaminação da superfície da resina
acrílica. Também Lessa et al.3 encontraram uma eficácia significativamente maior na
redução de S. mutans da superfície de acrílico de AOR, recomendando a utilização
do spray de digluconato de clorexidina a 0,12% para a desinfecção destes.
Sassone et al.125 ,em contrapartida, avaliaram in vitro a ação antimicrobiana
do hipoclorito de sódio 1% e 5% e da clorexidina 0,12%, 0,5% e 1% frente a cepas
47
de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Porphiromonas
gingivalis e Fusobacterium nucleatum submetidas a teste por contato. Analisaram
amostras nos tempos: imediatamente, 5 min, 15 min e 30 min após contato com
cada solução. A clorexidina 0,12% não foi capaz de eliminar as amostras de E.
faecalis em nenhum intervalo de tempo, sugerindo que as concentrações de
clorexidina devem ser superiores a 0,12%.
Meier et al.126, em um estudo sobre a desinfecção de escovas dentais,
comparou a ação da clorexidina para a imersão e o método do spray de distribuição.
A solução para imersão requer abertura constante durante a utilização, estando mais
sujeita à contaminação e perda das suas propriedades, enquanto que na forma de
spray, apresenta as vantagens de praticidade, baixo custo e fácil armazenamento.
Para todos os microrganismos o grupo controle apresentou o resultado
esperado, não apresentando diferença da carga microbiana ao início e final do
período de tratamento. O valor deste grupo controle foi agregado às tabelas a fim de
comprovar a manutenção da colonização e servir como comparativo às colheitas
realizadas nos outros tratamentos.
No grupo onde foi utilizada a imersão na água ozonizada (Grupo 4) também
ocorreu a redução total dos micro-organismos. O ozônio, por ser altamente reativo,
através de seus radicais oxidantes, atua sobre a membrana celular dos microorganismos, podendo promover uma lise celular e, desta maneira exercer seu efeito
antimicrobiano.99
Em 2001, Velano et al.127 já comprovavam a ação da água ozonizada,
constatando a inativação de 99% das cepas de Staphylococcus aureus em 5 min 25
s utilizando a água bidestilada previamente ozonizada frente aos micro-organismos
testados, assim como Arita et al.128, em um estudo imergindo próteses totais em
água ozonizada na concentração de 2 a 4 mg/mL, observaram eficiente eliminação
de Candida albicans da superfície da resina acrílica. Por outro lado, Estrela et al.129,
em um estudo in vitro utilizando dentes anteriores superiores humanos cujos canais
radiculares foram inoculados com E. faecalis, testaram as soluções água ozonizada
(4 mg/L), ozônio gasoso , hipoclorito de sódio a 2,5 %, clorexidina a 2% e nenhuma
solução usada como irrigante durante um tempo de contato de 20 min demonstrou
efeito antimicrobiano contra E. faecalis.
Embora o gás ozônio difundido em água tenha se apresentado como um
promissor agente desinfetante, mesmo em curtos intervalos de tempo, são
48
necessários mais estudos acerca de sua segurança e biocompatibilidade. Novos
protocolos devem ser elaborados pesquisando-se a concentração ideal do gás e o
menor intervalo eficiente.
De acordo com o as evidências científicas do Guidelines for the Care and
Maintenance of Complete Dentures (American College of Prosthodontists), próteses
totais devem ser limpas anualmente por um profissional da área odontológica,
utilizando produtos de limpeza ultrassônica para minimizar o acúmulo de biofilme ao
longo do tempo.130
Segundo Bocci131, desde 1995, Stübinger et al.92 utilizavam a água ozonizada
sob pressão, como um spray, durante o tratamento odontológico e cirurgias. O jato
de água removeria o material purulento, promovendo a desinfecção da área.
Estudos futuros podem investigar a eficácia da associação spray/ água
ozonizada, verificando se a ação mecânica do spray facilitaria a penetração do
ozônio nas camadas mais profundas do biofilme, auxiliando na sua desintegração e
também da associação do ozônio ao ultrassom, cuja ação já foi descrita por Estrela
et al.,129 Fonseca et al.,132 e Fonseca, 133 com resultados promissores.
Cabe ao cirurgião-dentista informar aos portadores de AOR sobre a
necessidade de se realizar a desinfecção dos mesmos e, também, de indicar os
métodos mais eficientes para esta higienização, de acordo com sua a realidade
sócio-econômica.
A elaboração de protocolos alternando os procedimentos realizados pelo
cirurgião-dentista em seu consultório e pelo próprio paciente para promover a
desinfecção de AOR, próteses totais, parciais e demais dispositivos utilizados na
cavidade bucal é de suma importância na manutenção da saúde bucal e geral do
paciente.
49
6. CONCLUSÕES
•
Pela comparação in vitro do efeito antimicrobiano os três tratamentos propostos
obtiveram êxito na desinfecção de aparelhos ortodônticos para os três microorganismos propostos: C. albicans, S. mutans e E. faecalis.
50
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