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Caracterização das Famílias de Carreadores Mitocondriais de
Ânions Di- e Tricarboxílicos
André G. Madeira1, Antônio S. Kimus Braz1, Hana P. Masuda1 e Jiri Borecky1.
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Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André, SP, Brasil.
As proteínas da super família de proteínas carreadoras mitocondriais de anions (MACF) realizam a comunicação entre o
citoplasma da célula eucariótica e o interior da mitocôndria. Por possuírem uma alta semelhança estrutural, existe uma grande
dificuldade na classificação dessas proteínas em subfamílias e também nas análises de evolução dos genes que as codificam. Para
entender melhor a evolução e função dos membros dessa superfamília, 202 sequências de aminoácidos de proteínas carreadoras
mitocondriais de ânions de diversos organismos foram analisadas. Foram construídas árvores filogenéticas com métodos de inferência
Bayesiana e máxima verossimilhança e foi feita uma análise de predição de motivos. A árvore filogenética construída mostrou que
carreadores de 2-oxoglutarato/malato (M2OMs) de diversos organismos se agrupam em um único ramo da árvore. As proteínas
desacopladoras (UCPs) se agrupam em um ramo separado dos M2OMs e foi possível esclarecer as relações entre os diversos isotipos de
UCPs e incluir os carreadores de di/tricarboxilato (DITRICs) entre as M2OMs. Foi possível ainda estimar que os principais eventos de
duplicação gênica responsáveis pela grande variedade da superfamília ocorreram ainda na base de Eukarya.
Palavras Chave—Carreadores mitocondriais de ânions, M2OM, UCP.
I. INTRODUÇÃO
N
dos organismos eucariotos, um fato de crucial
importância foi o surgimento da mitocôndria, que está
associada principalmente com o metabolismo energético e a
geração de calor. Uma das hipóteses mais aceitas para o seu
surgimento é a teoria endossimbiótica, segundo a qual uma
célula procariótica aeróbica teria sido englobada por uma
célula ancestral das células eucarióticas. Teria então evoluído
uma relação de endossimbiose, onde a célula procariótica teria
se especializado na geração de energia – mitocôndria – e se
tornado dependente da nutrição provida pela célula
eucariótica, ao passo que a célula eucariótica também teria se
tornado dependente da energia produzida por essa organela,
uma vez que quase não existem organismos eucarióticos
desprovidos de mitocôndrias.
Tendo em vista que a mitocôndria exerce papéis tão
importantes na célula eucariótica e tem uma origem
procariótica, o que é refletido no seu material genético, tornase necessária uma comunicação muito refinada entre o
citoplasma da célula e o interior da mitocôndria, tanto para o
transporte de metabólitos quanto para a sinalização. Essa
comunicação é exercida através de canais e trocadores
protéicos.
As proteínas mitocondriais carreadoras de ânions são
proteínas integrais da membrana mitocondrial interna que
atuam no transporte de metabólitos aniônicos, participando no
metabolismo de energia (glicólise, gliconeogênese, lipólise e
síntese de ácidos graxos). A superfamília dessas proteínas
(Mitochondrial Anion Carrier Family, MACF) possui pelo
menos dez membros e todos os carreadores possuem três
repetições de cerca de 100 aminoácidos com dois domínios
hidrofóbicos transmembrana cada [1].
Os membros estudados nesse trabalho foram os carreadores
de dicarboxilato (DICs; [1,2]), carreadores de tricarboxilatos
(TRICs; [1,3]), carreadores de di/tricarboxilatos (DITRICs,
A ORIGEM
encontrados somente em plantas; [4]), carreadores de 2oxoglutarato/malato (M2OMs; [1]) e as proteínas
desacopladoras (uncoupling proteins, UCPs; [1]). Todas essas
proteínas apresentam alta similaridade entre si em sua
estrutura, porém, diferem quanto a função. Portanto, estudos
focados na caracterização dos novos membros da MACF em
relação estrutura-função, como análises de inferência
filogenética, são necessários para sua verdadeira classificação
dentro da MACF e para determinar a validade das diversas
famílias encontradas na literatura.
Foram coletadas diversas sequências de aminoácidos e
foram construídas árvores filogenéticas a fim de se estabelecer
as relações entre as subfamílias estudadas, e foram também
caracterizados motivos específicos para determinadas
subfamílias. Foram estabelcidas as relações entre os M2OMs e
as UCPs, que foram identificadas como subfamílias separadas,
através de inferência Bayesiana e por análises de máxima
verossimilhança, enquanto que as DITRICs foram
classificadas como M2OMs modificadas.
II. METODOLOGIA
Busca pelas sequências
A busca pelas sequências de aminoácidos foi realizada
utilizando
o
banco
de
dados
do
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) pela ferramenta BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Foram buscadas
sequências anotadas como DICs, TRICs, DITRICs e M2OMs,
além de sequências de UCPs para comparação. Além desta,
outra estratégia foi adotada: as sequências foram coletadas de
acordo com os valores de e-value, similaridade e identidade
com sequências “isca” na ferramenta BLAST. As sequências
utilizadas como “iscas” foram o M2OM humano (Q02978.3),
UCP1 humana (AAH69556.1), UCP5 humana (NP003942.1) e
UCP4 humana (NP004268.3).
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Alinhamentos
Foram realizados alinhamentos com o software clássico
Clustal X versão 2.0 [5] e com o software AMAP versão 2.2
[6], que utiliza o método de alinhamento por anelamento de
sequências.
Árvores filogenéticas
Com base nos alinhamentos, foram construídas nove
árvores filogenéticas não enraizadas com o software MEGA
versão 4 [7], variando-se os modelos utilizados (neighborjoining, evolução mínima ou máxima parcimônia) e o valor do
teste de bootstrap. Foram construídas ainda mais duas árvores
filogenéticas, uma com o método de inferência Bayesiana
através do software MrBayes versão 3.1.2 [8], que contou com
um número reduzido de sequências devido ao pesado
processamento envolvido, e outra com o método de máxima
verossimilhança, através do software PhylML vesão 3.0.1[9].
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram encontradas 202 sequências de proteínas da MACF
Foram encontradas 78 sequências com a isca M2OM, 79
sequências com a isca UCP1, 19 sequências com a isca UCP5
e 26 sequências com a isca UCP4. Entre as sequências obtidas
com a isca UCP1, estão uma série de proteínas anotadas como
UCP2 e UCP3, o que indica que essas três isoformas de UCP
formam um grupo bastante relacionado. Entre as sequências
de M2OM foram coletadas sequências anotadas como DIC, o
que indicaria confusão na classificação, e DITRIC, cuja
posição na árvore filogenética construída será discutida
adiante.
As sequências de membros da MACF foram encontradas
em diversos grupos de eucariotos. Os grupos onde as mesmas
não foram encontradas provavelmente carecem de dados
depositados em bancos de dados públicos, uma vez que se
espera que estas proteínas estejam presentes em todos os
grupos de eucariotos que possuem mitocôndrias.
Foram então realizados alinhamentos com o software
AMAP versão 2.2, que utiliza a tecnologia do alinhamento por
anelamento de seqüências [6]. A partir desse alinhamento,
foram construídas árvores por inferência Bayesiana e máxima
verossimilhança.
Isotipos de UCPs se encontram agrupados na árvore porém
em um ramo separado dos M2OMs
A árvores aqui apresentada (Figura 1) foi construída com
base em alinhamentos realizados no software AMAP,
utilizando a metodologia de máxima verossimilihança
(Maximmum Likelihood, ML).
Podemos observar que M2OM é um grupo monofilético se
considerarmos os DITRICs como sendo M2OMs modificados,
uma vez que DITRICs foram encontrados juntos no mesmo
ramos de M2OMs de plantas. Foram identificados dois
grandes grupos de M2OMs – um com proteínas de plantas e
fungos e outro com proteínas de animais, ambos com
proteínas de eucariotos unicelulares na base do ramo. Isso nos
leva a crer que houve uma duplicação gênica no início da
evolução de Eukarya e que os animais mantiveram uma
isoforma enquanto a outra foi mantida pelas plantas e pelos
fungos, ocorrendo perdas secundárias diferentes nos diferentes
grupos.
Todas as UCPs analisadas também formam um grupo
monofilético, porém é perceptível a distinção entre um ramo
com as UCPs 1, 2 e 3 (onde ainda ocorre um agrupamento das
duas últimas em relação à primeira) e outro com as UCPs 4 e 5
(também separadas como famílias irmãs). De acordo com a
árvore, essa divisão deve ter ocorrido ainda na base de
Eukarya, pouco depois da divisão entre M2OMs e UCPs.
IV. CONCLUSÃO
Pela árvore construída, foi possível observar uma clara
separação dos ramos que representam as famílias de M2OMs e
UCPs. Proteínas anotadas como DICs, uma de fungo
Aspergillus fumigatus Af293 (AfumDIC) e duas proteínas
putativas de fungo Aspergillus clavatus NRRL1 (AclaDIC) e
da planta Mesembryanthemum crystallinum (McryDIC)
apareceram no ramo das M2OMs, indicando que muito ainda
deve ser feito para esclarecer as origens de todas essas
proteínas mitocondriais, se é que existem tantas famílias
distintas.
Um fato interessante é a inclusão das DITRICs intimamente
relacionadas com as M2OMs, porém, formando um grupo
monofilético. As DITRICs teriam evoluído recentemente de
um gene muito parecido com o gene das proteínas M2OMs.
Apesar dos resultados dos trabalhos recentes, muitos
problemas ainda existem na classificação dos membros da
MACF. Uma série de proteínas tem anotações inconclusivas e
frequentemente errôneas. O que teria grande influência nesse
aspecto é o fato de essas proteínas terem divergido muito
antigamente, há bilhões de anos, no início da história dos
eucariotos, e em um curto período de tempo, o que torna
difícil a tarefa de estabelecer relações entre as famílias e
classificar as sequências encontradas.
AGRADECIMENTOS
À UFABC, pela oportunidade de realizar o trabalho. Esse
trabalho foi suportado pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq.
REFERÊNCIAS
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[3] M. E. Mycielska, A. Patel, N. Rizaner, M. P. Mazurek, H. Keun, A.
Patel, V. Ganapathy e M. B. Djamgoz “Citrate transport and metabolism in
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2009, 31: 10-20.
[4] N. Picault, M. Hodges, L. Palmieri e F. Palmieri “The growing family
of mitochondrial carriers in Arabidopsis” Trends. Plant. Sci., 2004, 9: 138146.
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Fig. 1. Árvore filogenética construída com o programa PhylML. O ramo em
azul representa os M2OMs. O ramo em vermelho representa as UCPs 1, 2 e 3.
O ramo em verde representa as UCPs 4 e 5. As proteínas destacadas em
negrito representam as DITRICs.
[5] M. A. Larkin, G. Blackshields, N. P. Brown, R. Chenna, P. A.
McGettigan, H. McWilliam, F. Valentin, I. M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J.
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[7] K. Tamura, J. Dudley, M. Nei e S. Kumar. “MEGA4: Molecular
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Evol., 2007, 24: 1596-1599.
[8] F. Ronquist e J. P. Huelsenbeck. “MrBayes 3: Bayesian phylogenetic
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[9] S. Guindon e O. Gascuel “A simple, fast, and accurate algorithm to
estimate large phylogenies by maximum likelihood” Syst. Biol., 2003, 52:
696-704.