BIOLOGIA MOLECULAR
Prof. Dr. José Luis da C. Silva
BIOLOGIA MOLECULAR

A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com
especial foco no estudo da estrutura e função do material genético e
seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente, a
Biologia Molecular investiga as interações entre os diversos sistemas
celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese protéica.

Relação com outras ciências biológicas de nível molecular.
Programa (Ementa)
Visão histórica do gene – 11/06
Estrutura e função do DNA e RNA – 11/06
Replicação, transcrição e tradução – 11/06
Regulação da Expressão gênica – 12/06
Tecnologia do DNA recombinante – 12/06
Genômica e Bioinformática – 09/07
PCR e Marcadores moleculares – 09/07
Aplicações da Biologia molecular – 10/07 (Seminários)
Eletroforese em gel – 10/07 (prática)
Evolução do conceito de gene
“O conceito de gene não é estático, ele se desenvolveu através de
várias fases, desde que Wilhelm Johansen criou o termo em 1909, e
continua evoluindo”
 1866 – Mendel definiu como “caráter ou fator unitário” que controlava
uma característica fenotípica, tal como a cor das flor em ervilhas.
 1900 – Garrod definiu como “um gene mutante-um bloqueio metabólico”
 1939 – Beadle e Tatum definiram como “um gene – uma enzima”
 1960 – Yanofsky e Brenner redefiniram “um gene – um polipeptídeo”
 Refinando o conceito:
“ O gene é uma unidade de informação genética que controla a síntese
de um polipeptídeo ou uma molécula de RNA estrutural”
Do gene ao efeito no organismo
Estrutura e função dos ácidos
nucléicos
Estrutura dos ácidos nucléicos
Nucleotídeos
Ribonucleotídeo
Estrutura dos ácidos nucléicos
Bases Nitrogenadas
Estrutura dos ácidos nucléicos
Fosfato
5’
Estrutura 1ária covalente
3’ OH
Polímero de nucleotídeos
Estrutura dos ácidos nucléicos
As cadeias polinucleotídicas adotam
estruturas em Hélice
Estrutura dos ácidos nucléicos
Dupla hélice do DNA – Watson e Crick (1953)
DNA B é a forma mais estável
em condições fisiológicas
Estrutura dos ácidos nucléicos
Formas de DNA
Formas A e Z são encontradas
em cristais de DNA. A forma A
é favorecida em soluções mais
concentradas.
A
forma
Z
pode
estar
associada com a regulação da
expressão
gênica
recombinação in vivo.
e
Dogma central da Biologia molecular
A replicação é semiconservativa
Processo semiconservativo:
Durante a replicação, as duas
fitas do DNA parenteral são
copiados, originando moléculas
filhas com somente uma das fitas
novas sintetizadas. (Meselson e
Stahl, 1958)
Replicação do DNA
O mecanismo de
replicação está
baseado no
pareamento das
bases da dupla
hélice do DNA.
A estrutura do
DNA contém a
informação
necessária para
perpetuar sua
sequência de
bases
Genoma procariótico
O genoma bacteriano circular constitue um único replicon
Um única origem de replicação
em E.coli (OriC, 245 pb)
DNA-POLIMERASES DNA-polimerase é a enzima que faz a síntese de uma nova fita de DNA.
Possui a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3’OH de
uma região pareada do DNA 5’ → 3’.
Movimento da forquilha de
replicação:
A partir da origem, a
replicação prossegue ao
longo da fita de DNA, em
uma ou ambas as direções,
seqüencialmente até o
termino.
Direção da replicação
A adição dos nucleotídeos
para o crescimento da cadeia
é sempre no sentido 5’ → 3’.
Forquilha de replicação
Fita contínua (líder)
Fita descontínua
DNA polimerases de E. coli
PROTEÍNAS NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
DA E. coli
Animação replicação
Transcrição
A transcrição é realizada por um sistema enzimático que
converte a informação genética de um segmento de DNA
(gene) em uma fita de RNA complementar à fita molde.
Fita molde (anti-senso) e codificadora (senso)
A transcrição de procariotos e de eucariotos possui três eventos
principais:
Iniciação - A RNA polimerase se liga a dupla fita do DNA na região
denominada promotor. A iniciação é um passo muito importante na expressão
gênica!!!
Elongamento - adição covalente de nucleotídeos a extremidade 3' da cadeia
polinucleotídica crescente; isto envolve o desenvolvimento transitório de um
curto trecho de DNA fita simples.
Término - Reconhecimento da sequência de término e liberação da RNA
polimerase. Embora a transcrição seja realizada pela RNA polimerase,
outras enzimas são necessárias para produzir o transcrito, além de outras
proteínas. Estes fatores ou se associam diretamente com a RNA polimerase
ou auxiliam na formação do aparato transcricional. O termo utilizado para
descrever estas proteínas é fatores de Transcrição.
Iniciação: Reconhecimento dos promotores
Reconhecimento dos promotores pela subunidade σ70 da RNA polimerase
em E. coli. Em condições fisiológicas a RNA pol está provavelmente ligada
ao DNA, mas o reconhecimento depende da subunidade sigma.
ATG
Extremidade 5’ do gene (Montante)
Sequências consenso
Regiões -35 e -10 (TATA box ou Pribnow box)
Essas sequências são reconhecidas pela subunidade sigma70. Outros
promotores apresentam alguma variação nas sequências consenso.
Após a ligação ao promotor e início da síntese, a subunidade sigma é
liberada e funciona como um catalisador para outra RNAP ligada à um
outro promotor ou ao mesmo promotor.
O reconhecimento do promotor depende de seqüências consensuais.
Um promotor típico possui três componentes, sendo formado pelas
seqüências consensuais em –10 e –35 e pelo sítio de início da transcrição.
A comparação com mais de 100 genes de E. coli, chegou-se as seguintes conclusões:
1)
O primeiro nucleotídeo a ser transcrito (+1) é geralmente uma purina (A ou G).
2)
Duas seqüências são altamente conservada nos genes comparados: uma
localizada na região –10, que tem como consenso a seqüência TATAAT (TATA
box ou Pribnow box), e outra localizada na região –35, que tem como consenso a
seqüência TTGACA,
3)
Que as regiões –10 e –35 são separados por 17±1 nucleotídeos (equivale a duas
voltas da hélice).
Os fatores sigma de E. coli reconhecem promotores
com diferentes seqüências consensuais
Complexo de Iniciação
Complexo fechado
Complexo aberto e
iniciação
Liberação do
sigma
Complexo aberto – bolha de transcrição
Fase: Alongamento
Após o desligamento da subunidade sigma ocorre uma
alteração conformacional na RNAP tornando-a mais esférica
e ativa durante o processo de alongamento.
O processo não é contínuo em algumas regiões,
principalmente porque ocorre tradução simultânea do mRNA
em bactérias. Ocorrem paradas rápidas e retomadas da
transcrição.
A processividade é alta e a transcrição tem um índice de
erro de 10-5.
Ação da toposiomerases no relaxamento dos
supercoil positivo
Fase: Término da transcrição
O RNA sintetizado participa ativamente do término de sua
síntese, formando estruturas secundárias ou ligando-se a
outros fatores.
Em E. coli:
Terminação dependente de rho (ρ)
Terminação independente de rho (ρ)
Terminação independente de rho (ρ)
Este tipo de terminação é responsável pelo término da
transcrição de 90% dos genes bacterianos.
Uma sequência na região 3’ do gene, sinaliza o final da
síntese do RNA.
É uma sequência repetida de As na fita molde (Us no RNA)
que ocasiona uma longa pausa no alongamento da cadeia.
Nessa pausa ocorre o pareamento A:U entre a fita molde e
o RNA desestabilizando o híbrido RNA/DNA. Este processo
é auxiliado por uma proteína denominada NusA.
15-20 nucleotídeos antes do término rico em As é formado
por sequências autocomplematares que formarão grampo
de RNA.
Terminação dependente de rho (ρ)
Não existem sequências ricas em As
específicas, mas podem haver sequências
autocomplementares.
A proteína Rho migra até encontrar a RNA pol
parada e sua atividade helicase DNA/RNA
dependente de ATP auxilia no desligamento do
RNA sintetizado.
Transcrição em Eucariotos
RNA - POLIMERASES

RNA - Polimerase I: rRNA

RNA - Polimerase II: mRNA

RNA - Polimerase III: tRNA e outros RNAs nucleares
pequenos
Um gene tipo transcrito pela RNA-polimerase II possui um promotor que se
estende a montante a partir do sítio onde a transcrição é iniciada. O promotor
contém vários elemento de seqüências curtos (<10pb), aos quais se ligam os
fatores de transcrição, espalhados por >200pb. Um reforçador (enhancer),
contendo elementos mais compactamente organizados, ao qual também se ligam
fatores de transcrição, freqüentemente são alvos para a regulação tecidoespecífica ou temporal.
Etapas são similares
na transcrição,
contudo o processo
é muito mais
complexo e
regulado
Animação da
transcrição
Síntese de proteínas
Código Genético
Tradução - poliribossomos
Animação da
tradução