Avaliação da Actividade Antimicrobiana de Extractos e
Óleos Essenciais de Eucalipto (Eucalyptus globulus ) em
Isolados do Tracto Respiratório Humano
VÂNIA PALMIRA RIBEIRO PEREIRA
Dissertação de Mestrado em
BIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL
Vila Real, 2012
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Avaliação da Actividade Antimicrobiana de Extractos e Óleos
Essenciais de Eucalipto (Eucalyptus globulus) em Isolados do
tracto Respiratório Humano
Dissertação de Mestrado em
BIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL
Vânia Palmira Ribeiro Pereira
Orientadores
Maria José Félix Saavedra
Maria do Carmo Vasconcelos
Composição do Júri
Vila Real, 2012
Instituição: Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Curso: Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
Título:“Avaliação da actividade antimicrobiana de extractos e óleos essenciais de Eucalipto
(Eucalyptus globulus ) em isolados do tracto respiratório humano”
Autor: Vânia Palmira Ribeiro Pereira
Orientador: Maria José Félix Saavedra
Co-orientador: Maria do Carmo Barbosa Mendes de Vasconcelos
“As doutrinas apresentadas neste trabalho
são da exclusiva responsabilidade do autor.”
Este trabalho foi expressamente elaborado como
dissertação original para o efeito de obtenção do grau
de Mestre em Biologia Clínica Laboratorial
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar e por ter medo de me esquecer de alguém, gostaria de agradecer a
todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Quero agradecer à Professora Doutora Maria José Saavedra, da Universidade de Trásos-Montes e Alto Douro, que aceitou ser minha orientadora, por todos os conselhos, apoio,
incentivo e motivação. Muito obrigada por tudo.
À minha co-orientadora Doutora Maria do Carmo Vasconcelos, investigadora do
CITAB da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, pelo apoio, acompanhamento e
ajuda prestada.
Ao Doutor Alfredo Augusto de Carvalho Aires, investigador do CITAB da
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, pelos conhecimentos, apoio e simpatia com
que sempre me ajudou.
Às mestres Carla Dias e Eliana, pelo apoio e amizade, ajudando-me sempre que
precisei na realização deste trabalho.
Aos Departamentos de Ciências Veterinárias e de Agronomia da ECAV, da
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, pelo acolhimento, disponibilidade, bem como
pelas condições indispensáveis da parte experimental deste trabalho.
Às “minhas meninas” lá de casa que muito me aturaram durante o meu percurso
académico. Nunca hei-de esquecer todos os nossos momentos divertidos, toda a cumplicidade
e amizade que sempre demonstraram. Obrigada e irei sentir muito a vossa falta. À minha
afilhadinha Vera pois passamos muitos momentos juntas, adoro todas as nossas conversas
nocturnas e agradeço-te todos os conselhos produtivos que sempre me deste. À minha
afilhada Luciana por todos estes anos de amizade e mesmo passando por muito sempre
conseguimos ultrapassar todos os problema. À minha Pseudo-afilhada, mas não menos
importante, Flávia que mesmo sendo a última a conhecer demonstrou que o tempo não diz
nada e que poderei contar contigo sempre que precisar. Obrigada meninas adoro-vos.
À minha amiga Rita que mesmo este ano estando separadas estivemos unidas.
Obrigada linda, adoro-te.
Pereira, V.
v
À minha mãe, tia e avós por todo o apoio durante estes anos todos, sem vocês nunca
teria chegado onde eu cheguei, devo-vos tudo aquilo que sou. Muito obrigada do fundo do
meu coração. Amo-vos muito a todos.
Ao meu namorado que sempre me apoiou e me ajudou durante este trabalho. Obrigada
por toda a paciência que tiveste comigo e por nunca me deixares ir abaixo nos momentos mais
difíceis. Amo-te mais que tudo.
Pereira, V.
vi
TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE
V. Pereira, M.C., Vasconcelos, C. Dias, A. Aires, E. Carvalho, P. Castro, E. Rosa, M.J.,
Saavedra. Avaliação da actividade antimicrobiana de óleos essenciais de Eucalyptus globulus
em isolados de Pseudomonas aeruginosa do tracto respiratório humano. VI Jornadas de
Biologia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, 18 a 20 de Outubro (Comunicação
oral)
V. Pereira, M.C. Vasconcelos, C. Dias, A. Aires, E. Carvalho, P. Castro, E. Rosa, M.J.
Saavedra. In vitro antimicrobial activity of Eucalyptus globulus leaf extracts against 16
Pseudomonas aeruginosa isolates. ICAR 2012 – International Conference on Antimicrobial
Research 21-23 de Novembro, Lisboa (Comunicação por poster)
Pereira, V., Vasconcelos, M.C., Aires, A., Rosa, E. e Saavedra, M.J. (2012) Eucalyptus
globulus leaf extracts and essential oils activity against isolates of pathogenic bacteria
(Pseudomonas aeruginosa). Natural Product Communications (Submetido a 4 de Dezembro
de 2012)
Pereira, V.
vii
RESUMO
As plantas com propriedades terapêuticas utilizadas na medicina, constituem uma
importante fonte de novos compostos biologicamente activos, sendo utilizados especialmente
para o tratamento de doenças infecciosas. Mais recentemente, tem vindo a aumentar o
interesse pelo uso de plantas medicinais como alternativa natural às moléculas sintéticas,
particularmente contra agentes microbianos, devido ao desenvolvimento crescente da
resistência aos antibióticos. Neste contexto surge este trabalho, no qual fomos avaliar o
potencial antimicrobiano de extractos vegetais e de óleos essenciais de Eucalyptus globulus,
uma espécie largamente presente em Portugal e utilizada tradicionalmente, em infusões, chás
e vaporizações como anti-inflamatório das vias respiratórias. Assim, utilizaram-se cinco
extractos provenientes de folhas e de dois óleos essenciais (A e B) de Eucalyptus globulus em
16 isolados de P. aeruginosa um patógeno nosocomial, presente no tracto respiratório de
pacientes das Unidades de Terapia Intensiva (15 provenientes do tracto respiratório humano e
a estirpe de referência P. aeruginosa ATCC 10145). Numa primeira fase avaliou-se o efeito
do solvente no rendimento de extracção de compostos com potencial efeito antimicrobiano,
analisando-se 5 solventes (água, metanol 70%, metanol 100%, acetona e diclorometano) e
numa segunda fase procedeu-se à avaliação da actividade antimicrobiana. Para a avaliação da
actividade antimicrobiana foram utilizados os métodos de difusão em disco em meio sólido e
determinação da concentração mínima inibitória (CMI). Em função dos resultados obtidos,
verificamos que dos cinco solventes utilizados na extracção, o melhor rendimento de
extracção foi obtido com o solvente metanol a 70 % (rendimento de 33%), enquanto o
diclorometano foi o solvente que menor rendimento apresentou (9%). Dos 16 isolados
analisados, apenas 4 deles (25%) apresentaram susceptibilidade à acção antimicrobiana dos
extractos de eucalipto. Para os extractos vegetais, o valor máximo de halo de inibição foi
observado no isolado MJH 4 para o extracto extraído com o solvente diclorometano (13,33
mm). Relativamente aos óleos essenciais, todos os isolados apresentaram susceptibilidade,
sendo o valor máximo de halo de inibição observado no óleo B com 19,33 mm para o isolado
MJH 4. No entanto o antibiótico (controlo positivo) foi sempre mais eficiente que os extractos
e os óleos testados. Observou-se que na determinação das CMIs para o isolado MJH 21 o
Pereira, V.
viii
valor para todos os extractos foi significativamente inferior ao do antibiótico, o que também
se observou para os isolados MJH 21, MJH 149 e MJH 207 referente ao óleo B.
Assim poderemos inferir que os extractos e os óleos essenciais de Eucalyptus globulus
poderão vir a ser uma alternativa ao uso de antibióticos no tratamento de infecções do tracto
respiratório humano provocadas por P. aeruginosa, sendo no entanto ainda necessários
estudos complementares.
Pereira, V.
ix
ABSTRACT
Plants with therapeutic properties that are used in medicine, constitute an important
source of new biological active compounds, used specially in the treatment of infectious
diseases. Recently, there is an increase of the interest for the medicinal plants as natural
alternatives to synthetic drugs, particularly against microbial agents, due mainly to the
increase of the resistances to antibiotics. In this context, we present this study in which were
evaluated the antimicrobial potential of plant extracts and the essential oils of Eucalyptus
globulus, largely present in Portugal and used traditionally in infusions, tee and vaporizations
as anti-inflammatory of the respiratory tract. We, used five extracts from leaves and two
essential oils (A and B) of Eucalyptus globulus against 16 P. aeruginosa isolates, one
nosocomial pathogen present in the respiratory tract of the Care Units patients (15 strains
from human respiratory tract and one reference strain P. aeruginosa, ATCC 10145). Initially
we evaluate the effect of the 5 solvents in the yield extraction of compounds with potential
antimicrobial effect (water, methanol 70%, methanol 100%, acetone and dichloromethane). In
a second phase we proceed to evaluation of antimicrobial activity, with the methods of
diffusion in disc in solid medium and determination of the minim inhibition concentration
(MIC). The results achieved showed that from the five solvents used in the extraction, the best
yield extraction was obtained with the methanol 70% (yield of 33%), while with the
dichloromethane the yield extraction was the lowest (9%). From the 16 isolates analyzed,
only 4 presented susceptibility (25%) to antimicrobial action of the Eucalyptus extracts. For
the plant extracts, the maxim value of inhibition halo was reached in the MJH 4 isolate for the
dichloromethane extract (13.33 mm). In relation to essential oils, all the isolates showed
susceptibility. The MJH 4 isolate presented the maximum value of inhibition halo with 19.33
mm for the oil B. However, the antibiotic was always more efficient than the extracts and oils.
In the determination of MICs in the plant extracts, except the isolate MJH 21, all extracts
sowed a lower MIC than the antibiotics. In the case of oils, only the isolates MJH 149 and
MJH 207 for oil B, showed a MIC lower than antibiotics. Based in our results we can stated
that extracts and the essential oils of the Eucalyptus globulus could be an useful natural
source of compounds that can be used as either an alternative to antibiotics or in conjunction
with this chemicals in the treatment of infections from the respiratory tract, caused by
P. aeruginosa, but it is still necessary additional studies
Pereira, V.
x
ÍNDICE
Agradecimentos ........................................................................................................................ v
Trabalhos apresentados com base nesta tese ....................................................................... vii
Resumo ................................................................................................................................... viii
Abstract ..................................................................................................................................... x
Índice ........................................................................................................................................ xi
Índice de figuras .................................................................................................................... xiii
Índice de tabelas .................................................................................................................... xiv
1.
Introdução ......................................................................................................................... 1
1.1.
Eucalyptus ................................................................................................................... 2
1.1.1.
Caracterização do género Eucalyptus .................................................................. 2
1.1.2.
Eucalyptus globulus ............................................................................................. 3
1.2.
Óleos essenciais ........................................................................................................... 4
1.2.1.
Óleos essenciais de Eucalyptus ............................................................................ 5
1.2.2.
Terpenos ............................................................................................................... 7
1.2.3.
Efeitos biológicos dos óleos essenciais ................................................................ 9
1.3.
Sistema respiratório ................................................................................................... 11
1.3.1.
Tracto respiratório superior ................................................................................ 12
1.3.2.
Tracto respiratório inferior ................................................................................. 13
1.4.
Pseudomonas ............................................................................................................. 13
1.4.1.
Pseudomonas aeruginosa ................................................................................... 16
2.
Objectivos ........................................................................................................................ 18
3.
Material e métodos .......................................................................................................... 20
3.1.
Origem e preparação das amostras ..................................................................... 22
3.1.1.
Preparação dos extractos vegetais ...................................................................... 22
3.1.2.
Isolados bacterianos ........................................................................................... 23
3.2.
Avaliação da actividade antimicrobiana .................................................................... 24
Pereira, V.
xi
3.2.1.
Screening da actividade antibacteriana .............................................................. 24
3.2.2.
Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) .................................. 26
3.3.
4.
Análise estatística ...................................................................................................... 28
Resultados e discussão .................................................................................................... 29
4.1.
Rendimento de extracção........................................................................................... 30
4.2.
Avaliação da actividade antimicrobiana .................................................................... 31
4.2.1.
Screening da actividade antibacteriana .............................................................. 31
4.2.2.
Determinação da concentração mínima inibitória .............................................. 38
5.
Considerações finais........................................................................................................ 42
6.
Referência bibliográficas ................................................................................................ 44
Pereira, V.
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1. Esquema de corte transversa de folhas de Eucalipto .............................................. 3
Figura 1. 2. Eucalyptus globulus ............................................................................................... 4
Figura 1. 3. Estrutura química dos componentes principais dos óleos essenciais .................... 7
Figura 1. 4. Representação esquemática da biossíntese dos terpenos ..................................... 10
Figura 1. 5. Localização e mecanismos alvo na célula bacteriana que podem ser sítios de
acção dos componentes dos óleos essenciais ........................................................................... 10
Figura 3. 1. Representação esquemática do procedimento experimental adoptado. ............... 21
Figura 3. 2. Óleos essenciais de Eucalyptus globulus: à esquerda o óleo proveniente da loja
de produtos naturais (óleo B) e à direita o óleo de marca F.J. Campos (óleo A). .................... 22
Figura 3. 3. Preparação da suspensão bacteriana .................................................................... 25
Figura 3. 4. Avaliação da actividade antimicrobiana dos extractos e óleos essenciais. .......... 26
Figura 3. 5. Preparação das placas para a determinação da CMI. ........................................... 27
Figura 4. 1. Representação esquemática dos valores referentes aos rendimentos de extracção
dos extractos de E. globulus com diferentes solventes. ........................................................... 30
Figura 4. 2. Screening de actividade antimicrobiana: Halos de inibição obtidos. .................. 32
Pereira, V.
xiii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. 1. Propriedades aromaterapêuticas dos principais grupos existentes nos óleos
essenciais .................................................................................................................................... 6
Tabela 1. 2. Composição do óleo essencial de Eucalyptus globulus ........................................ 8
Tabela 1. 3. Doenças infecciosas mais comuns referentes ao tracto respiratório superior ..... 14
Tabela 1. 4. Doenças infecciosas mais comuns referentes ao tracto respiratório inferior ...... 15
Tabela 3. 1. Procedimento de extracção e respectivos solventes, temperatura e tempo de
extracção................................................................................................................................... 23
Tabela 3. 2. Referência dos isolados bacterianos e a sua respectiva origem .......................... 24
Tabela 4. 1. Valores dos halos de inibição (mm) dos extractos de folhas de E. globulus nas
diversas estirpes de P. aeruginosa ........................................................................................... 33
Tabela 4. 2. Propriedades antimicrobianas dos extractos de folhas de E.globulus ................. 35
Tabela 4. 3. Valores dos halos de inibição (mm) dos óleos essenciais de E. globulus nas
diversas estirpes de P. aeruginosa ........................................................................................... 36
Tabela 4. 4. Avaliação da sensibilidade dos 16 isolados aos óleos essenciais de
E. globulus. .............................................................................................................................. 37
Tabela 4. 5. Valores da concentração mínima inibitório (CMI)1: Ensaio in vitro dos extractos
das folhas de E. globulus e da ciprofloxacina. ......................................................................... 39
Tabela 4. 6. Potencial antimicrobiano (PA) dos óleos essenciais de E. globulus (A e B) e do
antibiótico (ciprofloxacina) para os isolados testados.............................................................. 41
Pereira, V.
xiv
1. Introdução
1
Introdução
1.1. Eucalyptus
Eucalyptus é um género nativo da Austrália que tem vindo a ser expandido por todo o
mundo (Hasegawa et al., 2008; Gilles et al., 2010; Mulyaningsih et al., 2010; Tohidpour et
al., 2010; Elaissi et al., 2011; Ogunwande et al., 2011; Tyagi e Malik, 2011), sendo este País,
provavelmente o único onde este grupo de plantas domina a maior parte da paisagem. Para
além de madeira Eucalyptus, fornece combustíveis, celulose, óleos para horticultura e
ornamentação. A sua grande adaptabilidade a variados habitats torna esta espécie numa das
mais cultivadas no Mundo (Brooker, 2002).
Eucalyptus foi descoberto durante a terceira viagem do Capitão James Cook para os
mares do sul. O botânico David Nelson recolheu durante essa viagem um espécime na ilha
Bruny e levou-o consigo para Inglaterra, onde este foi estudado pelo botânico francês Charles
Louis L’Héritier de Brutelle. Em 1788, este botânico publicou uma nova espécie de um novo
género, o qual denominou por Eucalyptus. A escolha deste nome deriva do grego Eu = bem e
calyptus = coberto (Brooker, 2002).
Estudos recentes demonstram que Eucalyptus tem sido utilizado há mais de
60 000 anos, pois existem evidências da sua utilização por parte dos aborígenes na Austrália
para curar feridas e infecções fúngicas (Gilles et al., 2010). Muitas espécies pertencentes a
este género são usadas na medicina tradicional como anti-inflamatórios, antipiréticos e
antibacterianos (Tohidpour et al., 2010; Tyagi e Malik, 2011). Mais recentemente tem vindo a
aumentar o interesse pelas plantas medicinais como alternativa natural às drogas sintéticas,
particularmente contra agentes microbianos devido ao desenvolvimento crescente da
resistência aos antibióticos (Prabuseenivasan et al., 2006; Fabio et al., 2007; Warnke et al.,
2009; Tohidpour et al., 2010).
1.1.1. Caracterização do género Eucalyptus
O género Eucalyptus pertence à divisão Spermatophyta, à sub-divisão Angiosperme, à
classe Dicotyledoneae, à sub-classe Polypetalae, à ordem Myrtales e à família Myrtaceae,
compreende cerca de 900 espécies e subespécies. Contudo, menos de 20 espécies são
exploradas comercialmente (Brooker, 2002; Silva et al., 2003; Gilles et al., 2010; Elaissi et
al., 2011; Tyagi e Malik, 2011; Verma, 2011).
Pereira, V.
2
Introdução
Eucalyptus é uma árvore alta e persistente (Tyagi e Malik, 2011), a semente da
maioria das espécies de eucalipto é achatada, elipsoidal, com um hilo ventral, não há
endosperma, e a maior parte da semente é o embrião. A germinação deste género é epígena.
As folhas são formadas em pares, em lados opostos da base, são geralmente pecioladas e
pendentes. As folhas da maior parte das espécies são concolores (isobilateral), no entanto uma
grande parte das espécies tem folhas discolores (dorsiventral), sendo este factor uma
característica importante para a categorização das espécies (Brooker, 2002). As folhas
pertencentes ao género Eucalyptus são também muito conhecidas pelos seus óleos aromáticos.
Estes óleos são produzidos em estruturas secretoras, em que a secrecção é formada em células
– glândulas secretoras (Figura 1.1). Estas glândulas são geralmente pequenas, e derivam do
desenvolvimento de um espaço intracelular que aumenta de volume e amadurece como uma
cavidade ovóide ou globular (Brum, 2001; Brooker, 2002).
Epiderme superior
Parênquima em paliçada
Glândula secretora
Parênquima lacunoso
Epiderme inferior
Figura 1.1. Esquema de corte transversa de folhas de Eucalipto. Adaptado de Brum (2011)
1.1.2. Eucalyptus globulus
Eucalyptus globulus é normalmente conhecido como “goma azul”, sendo por vezes
denominado por “árvore da febre” (Egwaikhide et al., 2010), devido ao seu uso pelos nativos
como remédio para a febre e denominado mais vulgarmente como “gomeiro-azul”,
“comeiro-azul”, “mogno-branco” e “eucalipto-limão”. É uma planta que se destaca muito no
reino vegetal, tanto a nível medicinal como económico por isso, a espécie mais cultivada em
todo o mundo de entre o género Eucalyptus (Brooker, 2002; Rocha e Santos, 2007).
Pereira, V.
3
Introdução
E. globulus é: (i) uma árvore de grande porte, erecta; (ii) as folhas são alternas,
pecioladas, falciforme-lanceoladas (Figura 1.2), ocorre heterofilia, cujo nome deriva do grego
heteros = diferentes, pelo facto de formar dois tipos de folhas diferentes, as formadas na
planta jovem e as formadas na planta adulta; (iii) as glândulas de óleo ocorrem isoladamente
ou em pares/trios dentro de auréolas (Brooker, 2002).
.
B
D
A
C
E
Figura 1. 2. Eucalyptus globulus. Legenda: (A) Árvore de grande porte; (B) Folhas jovens; (C) Folhas adultas;
(D) Flor; (E) Fruto. Adaptado de Rocha e Santos (2007)
Esta espécie é muito utilizada pela população nas suas necessidades básicas de saúde,
devido ao seu baixo preço, facilidade de acesso e da compatibilidade cultural com as tradições
populares. As folhas de E. globulus são ricas em tanino e óleo essencial, sendo utilizadas na
cura de chagas, úlceras e outros problemas dos tecidos e da pele; para combater constipações
e quaisquer infecções das vias respiratórias, fígado, estômago e bexiga; usam-se como
antisépticos, desinfectantes, sendo importantes ainda em casos de doenças da garganta,
brônquios e pulmões (Rocha e Santos, 2007).
1.2. Óleos essenciais
As plantas produzem uma grande variedade de produtos naturais de defesa, com
variadíssimas funções biológicas. As plantas desempenham um papel muito importante
devido à produção de compostos com origem no seu metabolismo secundário
Pereira, V.
4
Introdução
(Hemmerlin et al., 2012). Entre esses compostos podemos encontrar os óleos essenciais. Os
óleos essenciais são compostos voláteis, aromáticos, lipossolúveis em solventes orgânicos de
baixa densidade, normalmente mais baixa que a da água. Resultam do metabolismo
secundário das plantas e podem ser encontrados em vários órgãos das mesmas, tais como
folhas, caules, cascas e frutos (Burt, 2004; Corazza, 2004; Bakkali et al., 2008; Gilles et al.,
2010). Na natureza, estes desempenham funções importantes na protecção da planta contra
bactérias, vírus, fungos e insectos. Podem ainda atrair insectos de forma a favorecer a
dispersão do pólen e de sementes, ou mesmo para repelir outros insectos indesejáveis
(Bakkali et al., 2008). Os óleos podem ser denominados por: (i) óleos voláteis por
apresentarem volatilidade; (ii) óleos etéreos pelo facto de serem solúveis em solventes
orgânicos apolares e (iii) óleos essenciais devido ao seu aroma agradável e intenso. A última
denominação é a mais utilizada devido aos componentes odoríferos das plantas, que são
denominados por “essências” (Corazza, 2004).
Os óleos essenciais têm sido seleccionados pelo seu potencial no tratamento de muitas
infecções e como conservantes naturais de alimentos (Fabio et al., 2007). Devido às suas
propriedades bactericidas, fungicidas, farmacológicas e ao seu uso alimentar crescente, são
cada vez mais utilizados como alternativa ao uso de produtos químicos sintéticos (Burt, 2004;
Bakkali et al., 2008). São misturas naturais que podem conter cerca de 20 a 60 componentes
em diversas concentrações e de um modo geral, apresentam dois a três componentes
maioritários em elevadas concentrações (20-70%) (Burt, 2004; Bakkali et al., 2008).
Os óleos essenciais são constituídos por grupos bioquímicos com propriedades aromaterapêuticas.
Entre
esses
grupos
podemos
encontrar
os
ésteres,
aldeídos,
monoterpenos/sesquiterpenos, cetonas, álcoois, fenóis, óxidos e ácidos (Corazza, 2004).
Na Tabela 1.1. são apresentados alguns exemplos de grupos funcionais normalmente
presentes nos óleos essenciais.
1.2.1. Óleos essenciais de Eucalyptus
Eucalyptus, é uma importante fonte de óleos essenciais que apresentam uma série de
actividades biológicas tais como: antibacterianas, antifúngicas, analgésicas e propriedades
anti-inflamatórias (Fabio et al., 2007; Gilles et al., 2010; Mulyaningsih et al., 2010; Sadlon e
Lamson, 2010; Tyagi e Malik, 2011).
Pereira, V.
5
Introdução
Tabela 1. 1. Propriedades aromaterapêuticas dos principais grupos existentes nos óleos essenciais
Grupos funcionais
Propriedades
Monoterpenos/sesquiterpenos
Efeito antiviral, anti-séptico, bactericida e
anti-inflamatório. Actua especialmente sobre
o fígado, auxiliando no processo de
desintoxicação do corpo e estimulante de
funções glandulares.
Agem como fungicidas, sedantes e
antiespasmódicos.
São
aromaticamente
agradáveis, motivo de seu emprego frequente
como aromatizantes em perfumes.
Têm acção sedante, anti-infecciosa e antiséptica.
Fluidificam mucosidades, actuando como
descongestionantes em casos de asma,
bronquite e resfriados.
São antissépticos potentes, antivirais e
estimulantes do sistema imunológico.
Acção
bactericida,
desinfectante
e
estimulante, ajudam na limpeza de ferimentos
e no tratamento de inflamações.
São expectorantes e bactericidas.
Ésteres
Aldeídos
Cetonas
Álcoois
Fenóis
Óxidos
Poder anti-séptico e diurético, podem ainda
ajudar a baixar a febre.
Ácidos
Fonte: Adaptado de Corazza (2004)
Actualmente considera-se que existam cerca de 3000 óleos essenciais mas em que
apenas cerca de 300 se encontram comercializados. São classificados em três grupos, de
acordo com o seu uso final: (i) óleos medicinais, (ii) óleos industriais e (iii) óleos para
perfumaria (Burt, 2004; Bakkali et al., 2008; Gilles et al., 2010).
Os óleos medicinais no caso do eucalipto, são aqueles que apresentam teores de
1,8-cineol acima de 70% e baixos teores de felandreno (Figura 1.3). Este tipo de óleo é
normalmente
encontrado
nas
espécies
E.
globulus,
E.
tereticornis,
E.
smithiie
E. camaldulensis. Os óleos usados para perfumaria têm como constituinte principal o
citronelal, sendo o óleo mais comercializado o E. citriodora. Os óleos industriais apresentam
como constituintes maioritários o felandreno, a piperitona, o α-pineno e o mentol (Brooker,
2002).
Pereira, V.
6
Introdução
Figura 1. 3. Estrutura química dos componentes principais dos óleos essenciais (medicinais, para perfumaria e
industriais). Adaptado de Brooker (2002)
Da diversa gama de compostos encontrados nos óleos essenciais (Tabela 1.2) de
eucalipto o mais importante é o éter monoterpeno 1,8-cineol (eucaliptol), isto porque, este
composto é utilizado para fins medicinais e apresenta uma actividade biológica significativa,
tendo sido reportado como inibidor da síntese do factor α de necrose tumoral, da interleucina1β, leucotrienos β4 e tromboxano β2 nas células inflamatórias (Brooker, 2002; Silva et al.,
2003). De acordo com os estudos experimentais de Hasegawa e colaboradores (2008), os
óleos essenciais têm sido aplicados na terapêutica para o tratamento de infecções pulmonares
através da inalação e de extractos monoterpénicos de E. citriodora, E. globulus e
E. teretcorni.
1.2.2. Terpenos
De entre as famílias de compostos existentes nos óleos essenciais os terpenos
constituem a família mais representativa e com a maior diversidade de compostos, com
50 000 já identificados, sendo a maior parte destes também sintetizados por outras plantas e
algumas espécies de bactérias (Hemmerlin et al., 2012). Podem ser classificados de acordo
com a sua estrutura básica e função (Berthelot et al., 2012), podendo ainda ser formados por
combinações de várias unidades base de cinco carbonos (C5), denominados por isoprenos.
São ainda categorizados de acordo com o tamanho da família destes compostos e a
nomenclatura evolui com os monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20),
triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) e politerpenos(>C40) (Leeper e Vederas, 2000; Santos et
al., 2004; Bakkali et al., 2008; Hemmerlin et al., 2012). Um terpeno que contenha oxigénio
na
sua
estrutura
Pereira, V.
é
denominado
por
terpenóide
(Bakkali
et
al.,
2008).
7
Introdução
Tabela 1. 2. Composição do óleo essencial de Eucalyptus globulus
Percentagem (%)
Composto
[1]
[2]
α-Pineno
4,2
7,2
β-Mirceno
1,5
1,5
α-Felandreno
1,2
0,6
α-Terpineno
0,4
0,1
Limoneno
17,8
0,9
1,8-Cineol
45,4
85,8
β-Ocimene
1,0
-
ϒ-Terpineno
8,8
1,2
p-Cimeno
9,5
-
Epóxi linalol
0,1
-
Óxido de linalol
0,2
-
Linalol
0,5
0,4
Terpino-4-ol
1,4
0,5
α-Humuleno
0,1
-
Mentol
0,1
-
Pinocarveol
0,4
0,4
α-Terpineol
3,6
14,0
Borneol
0,1
-
Geraniol
0,1
-
β-Pineno
-
1,1
Componentes agrupados (%)
Hidrocarbonatos monoterpénicos 44,5
Monoterpenos oxigenados
Total identificado
12,45
52
87,32
96,5
99,77
[1] Tyagi e Malik (2011)
[2] Damjanovic-Vratnicaet al. (2011)
Pereira, V.
8
Introdução
Os terpenos são sintetizados pelas plantas, pois estes participam em processos
fisiológicos fundamentais, desempenhando também um papel vital na defesa da mesma,
exercendo funções ecológicas específicas (Hemmerlin et al., 2012). Normalmente actuam
como insecticidas, pesticidas, atractor de polinizadores, hormonas, flavonóides, pigmentos,
entre outros (Berthelot et al., 2012; Hemmerlin et al., 2012).
A biossíntese dos terpenos (Figura 1.4) consiste na biossíntese de um percursor,
isopentenil difosfato (IPP) seguindo-se a adição repetitiva de IPP que forma o prenil difosfato
alílico, percursor de várias classes de terpenos, formando esqueletos de terpenos.
Seguidamente, ocorre a modificação enzimática secundária (reacção redox) do esqueleto,
atribuindo-se assim as propriedades funcionais dos diferentes terpenos (Bakkali et al., 2008;
Berthelot et al., 2012). De acordo com a enzima que actua no momento, vamos obter
diferentes terpenos. Assim, os monoterpenos são sintetizados a partir do difosfato de geranílo
(GPP), os sesquiterpenos através do difosfato de farnesilo (FPP), os diterpenos são
sintetizados a partir do difosfato de geranilgeranilo (GGPP), os triterpenos são obtidos através
da condensação de dois FPP e por fim o tetraterpenos a partir da condensação de duas
unidades de GGPP (Hemmerlin et al., 2012).
Os monoterpenos são constituídos por duas unidades de isoprenos e são as moléculas
mais representativas, constituindo 90% dos óleos essenciais em conjunto com uma variedade
de estruturas, tais como carbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres, éteres, peróxidos e
fenóis (Bakkali et al., 2008).
1.2.3. Efeitos biológicos dos óleos essenciais
Considerando os diversos grupos químicos presentes nos óleos essenciais, o mais
provável é que a sua actividade antibacteriana não seja atribuída a um mecanismo específico,
mas sim ao efeito de actuar simultaneamente sobre vários mecanismos-alvo na célula (Burt,
2004; Bakkali et al., 2008).
Pereira, V.
9
Introdução
×1
×2
×3
Figura 1. 4. Representação esquemática da biossíntese dos terpenos . Adaptado de Berthelot et al. (2012) e
Hemmerlin et al. (2012)
As localizações ou os mecanismos-alvo na célula bacteriana, que se pensa serem os
sítios de acção para os diversos componentes dos óleos essenciais encontram-se
esquematizados na Figura 1.5.
Figura 1. 5. Localização e mecanismos alvo na célula bacteriana que podem ser sítios de acção dos
componentes dos óleos essenciais Adaptado de Burt (2004)
Pereira, V.
10
Introdução
Os potenciais alvos para a acção dos componentes dos óleos essenciais na célula
bacteriana são: a degradação da parede celular, danos na membrana citoplasmática, danos nas
proteínas membranares, o vazamento do conteúdo celular, a coagulação do citoplasma e a
depleção da força motriz de protões (mecanismos de efluxo). Nem todos os mecanismos são
alvos separados, verificando-se que alguns são afectados como consequência de outro
mecanismo (Burt, 2004).
Os componentes dos óleos essenciais apresentam hidrofobicidade, que lhe permite
provocar a partição dos lípidos da membrana celular perturbando as suas estruturas e
tornando-as mais permeáveis, levando ao vazamento de iões e dos conteúdos celulares.
Embora a célula bacteriana tolere uma certa quantidade de vazamento sem perder a sua
viabilidade, quando esta perda é extrema irá levar à morte (Burt, 2004).
As propriedades citotóxicas são de grande importância aquando a aplicação dos óleos
essenciais, não só, contra os patógenos humanos, animais ou pragas, mas também para a
preservação de produtos alimentares. Os óleos essenciais são efectivos contra uma ampla
gama de organismos, incluindo bactérias, vírus, fungos, protozoários, ácaros, insectos e
moluscos. A capacidade citotóxica dos óleos essenciais baseia-se na actividade pró-oxidante,
que pode torná-los excelentes agentes antissépticos e antimicrobianos (Bakkali et al., 2008).
1.3. Sistema respiratório
O sistema respiratório (Figura 1.6) é composto por uma porção condutora que traz o
oxigénio para os pulmões e uma porção respiratória onde ocorrem as trocas gasosas (Rosdahl
e Kowaiski, 2007; Seely et al., 2008; Pommerville, 2010).
O órgão humano responsável pelas trocas gasosas é o pulmão. Este encontra-se
localizado no tórax, onde está protegido pela caixa toráxica. O pulmão fornece ao corpo um
fluxo contínuo de oxigénio e limpa o sangue do seu produto residual – dióxido de carbono
(Rogers, 2010).
A respiração é fundamental para a sobrevivência humana. Este processo consiste na
troca de gases entre o ambiente externo ao indivíduo e as suas células internas. Envolve três
processos: (i) ventilação (respiração), (ii) trocas gasosas, que ocorrem nos alvéolos e nas
células corporais, e (iii) transporte dos gases (Rosdahl e Kowaiski, 2007; Rogers, 2010).
Pereira, V.
11
Introdução
Figura 1.6. Anatomia do sistema respiratório. Adaptado de Rosdahl e Kowaiski (2007).
Para ocorrer a respiração é essencial a colaboração de outros sistemas, tais como: (i) o
diafragma; (ii) os principais músculos respiratórios e intercostais; (iii) o sangue, e (iv) o
sistema circulatório. Os músculos da caixa toráxica desempenham um papel essencial, pois
permitem a extensão e contracção do espaço interno do tórax. Quanto ao sangue e sistema
circulatório são responsáveis pelo transporte dos gases (Rogers, 2010).
O sistema respiratório encontra-se dividido em tracto respiratório superior e tracto
respiratório inferior (Rosdahl e Kowaiski, 2007; Pommerville, 2010; Rogers, 2010) .
1.3.1. Tracto respiratório superior
O tracto respiratório superior é composto pelo nariz, seios nasais, faringe e parte da
cavidade oral (Rosdahl e Kowaiski, 2007; Pommerville, 2010; Rogers, 2010). O nariz, os
seios nasais e a faringe desempenham um papel vital, que consiste na filtragem e aquecimento
do ar à medida que este entra no tracto respiratório. Estas características permitem a limpeza
do ar inspirado das poeiras e outros detritos, protegendo assim a entrada para os pulmões de
agentes estranhos, que podem ser potenciais agentes infecciosos (Rogers, 2010).
As doenças infecciosas estão entre as mais comuns que afectam o sistema respiratório
humano, e são a causa mais frequente de consultas ambulatórias, sendo responsáveis pela
maior parte das ausências escolares e laborais (Diez et al., 2007; Rogers, 2010). Normalmente
as doenças mais características de infecções deste tipo (Tabela 1.3) são faringites, otites e
sinusites (Diez et al., 2007; Pommerville, 2010). Algumas destas infecções podem resolver-se
Pereira, V.
12
Introdução
com pouca ou mesmo nenhuma medicação. Em alguns casos, uma infecção do tracto
respiratório superior pode expandir-se para o tracto respiratório inferior e dar origem a
doenças que requerem a intervenção médica extensa (Rogers, 2010).
1.3.2. Tracto respiratório inferior
O tracto respiratório inferior é composto pela laringe, traqueia, brônquios e pulmões
(Rogers, 2010). A laringe e a traqueia proporcionam um canal para a passagem do ar,
facilitando o processo de troca gasosa. As infecções referentes ao tracto respiratório inferior
encontram-se entre as mais frequentes e com maiores taxas de morbidez. As etapas prévias de
infecção deste tipo são a troca qualitativa ou quantitativa da microbiota normal da orofaringe,
ou mesmo uma combinação das duas (Meseguer et al., 2008). Algumas destas infecções
apresentam risco de vida para o paciente, requerendo neste caso uma terapia antimicrobiana,
de modo a evitar danos no tecido do pulmão (Rogers, 2010). As doenças associadas a este
tipo de infecções (Tabela 1.4) são laringite, bronquite, pneumonia e tuberculose
(Pommerville, 2010).
1.4. Pseudomonas
O género Pseudomonas engloba um dos grupos mais diversificado de bactérias e os
membros deste género são encontrados numa ampla variedade de nichos ambientais, terrestres
e marinhos, bem como estando associados a plantas e animais (Sá-Correia, 2000; Kill et al.,
2008; Gava et al., 2009) .
Pseudomonas são bactérias Gram-negativas, apresentam células em forma de
bastonetes móveis com flagelos polares; são aeróbias, não formadoras de esporos, positivas
para a produção de catalase e oxidase. Algumas das espécies produzem pigmentos
fluorescentes esverdeados como é o caso da P. fluorescens e P. aeruginosa
(Sá-Correia, 2000; Gava et al., 2009).
Pereira, V.
13
Introdução
Tabela 1. 3. Doenças infecciosas mais comuns referentes ao tracto respiratório superior
Doença
Agente
Sinais e sintomas
Transmissão
Tratamento
Prevenção e controlo
Faringites
streptococcal
Streptococcus pyogenes
Dor de garganta, febre, dor de
cabeça, inchaço dos gânglios
linfáticos e das amígdalas
Gotículas respiratórias
Penincilina
Praticando boa higiene das
mãos
Escarlatina
Streptococcus pyogenes
Erupções rosa-avermelhadas no
pescoço, peito e braços, e a língua
como o morango
Gotículas respiratórias
Penincilina, claritromicina
Praticando uma boa higiene
Difteria
Corynebacterium diphteriae
Dor de garganta e febre baixa
Gotículas respiratórias
Penincilina, eritromicina
Vacinação com DTaP
Epiglotite
Haemophilus influenzae
Dor de garganta aguda, febre e voz
rouca
Gotículas respiratórias
Antibióticos intravenosos
Vacinação com Hib
Sinusite
Microbiota indígena
Dor, fragilidade e inchaços
Gotículas respiratórias
Spray nasal, antibióticos
Minimizar o contacto com
indivíduos com constipações
Otite extrema
Streptococcus, Staphylococcus,
Pseudomonas spp.
Coceira e dor de ouvido
Água contaminada
Modificações do estilo de vida,
medicamentos tópicos e orais,
antibióticos
Manter os ouvidos secos
Otite média aguda
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenza
Dor de ouvido e vermelhidão,
abaulamento do tímpano
Contacto com o ar
Antibióticos
Limitando o tempo de
exposição em crianças
Meningite
bacteriana aguda
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenza tipo B
Febre, torcicolo, forte dor de
cabeça, vómitos e náuseas, alta
sensibilidade
Gotículas respiratórias
de contacto
prolongado
Antibióticos
Vacinação
Fonte: Adaptado de Pommerville (2010)
Pereira, V.
14
Introdução
Tabela 1. 4. Doenças infecciosas mais comuns referentes ao tracto respiratório inferior
Doença
Agente
Sinais e sintomas
Transmissão
Tratamento
Prevenção e control
Tuberculose
Mycobacterium tuberculosis
TB activo: tosse, dor, perda de peso,
fadiga, febre, suores nocturnos,
calafrios, respiração
Gotículas respiratórias
Antibióticos
Prevenir a exposição a
pacientes com TB activa,
vacina BCG
Infecções brônquicas
Mycoplasma pneumoniae;
Chlamydophila pneumoniae;
Streptococcus pneumoniae; Haemophilus
influenza
Corrimento nasal, dor de garganta,
calafrios, mal-estar geral, febre ligeira
e tosse seca
Gotículas respiratórias
Antibióticos
Vacinação anual contra a
gripe, boa higiene
Pneumonia
pneumococcal
Streptococcus pneumoniae
Febre alta, fortes dores no peito,
dificuldade respiratória, expectoração
cor de ferrugem
Gotículas respiratórias
Penincilina
Cefotaxima
Vacinação, higiene das
mãos
Gotículas respiratórias, através de
sistemas de água, banheiras de
hidromassagem
Antibióticos
Praticando uma boa higiene
das mãos
Outras pneumonias
"típicas"
Mycoplasma pneumoniae; Staphylococcu Calafrios, febre alta, sudorese, falta de
saureus; Pseudomonas aeruginosa;
ar, dor no peito, tosse com espessura,
Klebsiella pneumoniae
expectoração esverdeada ou amarelada
Febre Q
Coxiella burnetti
Dor de cabeça, febre, tosse seca
Partículas de poeira, contacto com
animais infectados
Doxiciclina
Vacina para a ocupação de
alto risco
Pneumonia chlamydial
Chlamydophila pneumoniae
Dor de cabeça, febre, tosse seca
Gotículas respiratórias
Doxiciclina
Eritromicina
Praticando uma boa higiene
Fonte: Adaptado de Pommerville (2010)
Pereira, V.
15
Introdução
1.4.1. Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa é um microrganismo ubíquo, com uma competência metabólica
diversa, podendo utilizar desde simples moléculas pequenas, bem como compostos
orgânicos complexos como fontes de carbono. Apesar de ser uma bactéria aeróbia é capaz
de crescer em condições de anaerobiose. Cresce a uma ampla gama de temperaturas, desde
temperaturas de 22ºC até aos 42ºC, sendo a sua temperatura óptima a 37ºC (Kill et al.,
2008). Esta espécie é considerada como um importante patogénio nosocomial, podendo
por isso ser adquirido pelos doentes enquanto internados no hospital ou mesmo por outras
pessoas que se encontram em contacto com o meio hospitalar. Um dos seus nichos
preferenciais é o tracto respiratório de pacientes que se encontram nas Unidades de Terapia
Intensiva (UTIs) e que requerem um tratamento com antibióticos (Sá-Correia, 2000;
Zavascki et al., 2005; El-Solh et al., 2009; Riou et al., 2010).
A patogenecidade de P. aeruginosa envolve vários factores de virulência, bem
como resistência intrínseca a diferentes grupos de antibióticos (Saliba et al., 2006). O seu
genoma apresenta vários genes que codificam para proteínas que se encontram envolvidas
em funções de transporte, regulação e virulência, sendo que destes, 0.3% do total de genes
codificam para proteínas envolvidas na resistência antibacteriana (Mesaros et al., 2007).
Os mecanismos de virulência de P. aeruginosa são bastante complexos. Podem ser
mediados pela adesão por pili e outras adesinas, o que parece ser um importante factor para
ocorrer a colonização das membranas das mucosas e de outras superfícies. A formação de
biofilmes permite em geral diminuir a susceptibilidade aos antibióticos. A produção de
exoenzimas e de outros factores de virulência são controlados pelo mecanismo
“quórum-sensing” que leva a uma expressão dos genes correspondentes, quando a
densidade microbiana excede certos valores (Rossolini e Mantengoli, 2005).
A elevada resistência provoca diversas complicações terapêuticas e encontra-se
associada com a falha no tratamento e aumento da mortalidade (Martino, 2002).
P. aeruginosa apresenta um número de inerentes mecanismos de resistência aos
antibióticos, como (i) da produção de uma β-lactamase AmpC, (ii) bombas de efluxo, tais
como a MexAB-OprM que a torna impermeável a vários antibióticos, (iii) baixa
permeabilidade da membrana externa e (iv) produção de enzimas de inactivação dos
antibióticos (por exemplo cefalosporinases). Além destes mecanismos, P. aeruginosa
ainda apresenta capacidade de desenvolver ou adquirir novos mecanismos de
Pereira, V.
16
Introdução
resistência aos antibióticos A β-lactamase permite adquirir resistência à cefalotina e
ampicilina, no caso da bomba de efluxo permite a remoção de β-lactâmicos, clorofenicois,
fluoroquinolonas, bem como de diversos corantes e detergentes. A redução da
permeabilidade da membrana externa pode ser provocada por alterações qualitativas ou
quantitativas da porina OprD (via de absorção para carbapenemos hidrofílicos, tais como o
imipenemo), no que se refere ao aumento do efluxo de fármacos, este é um mecanismo que
confere resistência cruzada a muitas classes de antibióticos não relacionadas (Mesaros et
al., 2007; Kill et al., 2008).
Pereira, V.
17
1
2. Objectivos
Objectivos
A utilização de plantas para obtenção de compostos biologicamente activos, com
propriedades terapêuticas, é uma opção que tem vindo a ser estudada, devido ao aumento
da resistência dos agentes microbianos aos antibióticos.
Neste contexto, apresentamos este trabalho no qual propomos a contribuir para o
conhecimento científico sobre o papel de E. globulus, através do estudo dos seus potenciais
efeitos antimicrobianos contra isolados de P. aeruginosa, bactéria responsável por
infecções ao nível do aparelho respiratório e associada frequentemente ao crescente
fenómeno de resistência, provenientes de infecções hospitalares. Para atingirmos este
objectivo, foram definidos os seguintes objectivos específicos:
(i)
Determinar o valor do rendimento de extracção para os diferentes extractos;
(ii)
Avaliar o efeito antibacteriano in vitro dos diferentes extractos vegetais na
inibição do crescimento de isolados de P. aeruginosa de origem hospitalar;
(iii)
Avaliar o efeito antibacteriano in vitro de dois óleos essenciais de
E. globulus, de diferentes proveniências, sobre os mesmos isolados
hospitalares;
(iv)
Determinar o valor da concentração mínima inibitória (CMI) para os
diferentes extractos e o potencial antimicrobiano (PA) ara os dois óleos
essenciais;
(v)
Avaliar o potencial biológico de E. globulus como fonte de compostos de
elevada actividade antibacteriano contra P. aeruginosa.
.
Pereira, V.
19
3. Material e métodos
Material e métodos
Neste capítulo serão descritos todos os materiais e metodologias utilizadas para a
concretização dos objectivos. O trabalho foi estruturado em três partes: a primeira consistiu
na obtenção e preparação do material vegetal, a segunda na realização de ensaios
biológicos in vitro para determinação da actividade antimicrobiana e a terceira na
determinação da concentração mínima inibitória (Figura 3.1).
Figura 3. 1. Representação esquemática do procedimento experimental adoptado.
Pereira, V.
21
Material e métodos
3.1.
Origem e preparação das amostras
Os extractos vegetais utilizados neste trabalho foram obtidos a partir de árvores de
E. globulus existentes no Campus da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. As
amostras foram colhidas, identificadas botanicamente e devidamente catalogadas, sendo
pertencentes a folhas adultas. Os óleos essenciais testados, foram ambos obtidos
comercialmente, sendo um correspondente à marca F. J. Campos com um rendimento de
extracção de 1% - óleo A, e o outro, produzido e comercializado por uma casa de produtos
naturais, com um rendimento de extracção de 1,5% - óleo B (Figura 3.2).
Figura 3. 2. Óleos essenciais de Eucalyptus globulus: à esquerda o óleo proveniente da loja de produtos
naturais (óleo B) e à direita o óleo de marca F.J. Campos (óleo A).
3.1.1.
Preparação dos extractos vegetais
Para a obtenção dos extractos vegetais determinou-se inicialmente os pesos (Precisa
205 A SuperBal-series, Swiss Quality S witzerland) das folhas de Eucalyptus globulus.
Seguidamente, liofilizaram-se (UltraDry, FTMSystem) as amostras durante 48 horas, tendo
as amostras sido novamente pesadas, colocadas em sacos herméticos transparentes e
armazenadas num local seco e escuro até à preparação dos extractos. Posteriormente, as
amostras foram trituradas (Waring, Comercial Blender) e extraídas em diferentes
solventes: água ultrapura, metanol 70%, metanol 100%, acetona e diclorometano. Para a
extracção adicionou-se o respectivo solvente na proporção de 1:10. O processo
correspondente a cada extracção encontra-se na tabela 3.1, com a duração do período de
tempo das amostras em banho-maria e as respectivas temperaturas (Banho-maria com
agitação 1083, Labortechinik mbH D-30938 Burgwedel, Germany).Prosseguiu-se a
filtragem com papel de filtro (Watman nº1), seguida de centrifugação a 1500 rpm durante 5
Pereira, V.
22
Material e métodos
minutos (Centrifuge 5804R, Eppendorf, Hamburgo, Holanda). A amostra foi então
evaporada completamente num evaporador rotativo a 40ºC (Modelo Heidolph oB2000 B160 VacoboxBüchi – Switzerland), com a excepção do solvente, água 100%, que foi
colocado novamente no liofilizador. Por fim os extractos foram ressuspendidos com
dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração desejada.
Tabela 3. 1. Procedimento de extracção e respectivos solventes, temperatura e tempo de extracção.
Solvente
Temperatura
Tempo de extracção
Água 100%
20°C
16 h
Metanol 70%
70°C
1h
Metanol 100%
70°C
1h
Acetona 100%
20°C
16 h
Diclorometano 100%
20°C
16 h
A determinação do rendimento de extracção foi efectuada de acordo com a fórmula
que se segue:
3.1.2.
Isolados bacterianos
Os isolados bacterianos utilizados são da espécie Pseudomonas aeruginosa e
pertencem a uma colecção de isolados multirresistentes provenientes do Centro Hospitalar
de Trás-os-Montes e Alto Douro (CHTMAD), tendo sido obtidos através de um protocolo
de colaboração entre este centro Hospitalar e o Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Ciências Veterinárias/ECAV da Universidade de Trás-os-Montes e Alto
Douro. Estes isolados foram obtidos a partir de amostras das vias aéreas inferiores,
nomeadamente de expectorações e de secreções brônquicas. Foram utilizados num total de
16 isolados bacterianos (Tabela 3.2), sendo 8 provenientes de expectorações, 7
provenientes de secreções brônquicas e uma estirpe de referência, da colecção de culturas
tipo ATCC (American Type Culture Collection).
Pereira, V.
23
Material e métodos
Tabela 3. 2. Referência dos isolados bacterianos e a sua respectiva origem
Origem
Referência dos isolados
MJH 4; MJH 15; MJH 40; MJH 67; MJH
Expectoração
149; MJH 207; MJH 221; MJH 287
MJH 21; MJH 24; MJH 198; MJH 215;
Secreção brônquica
Estirpe de referência
MJH 216; MJH 260; MJH 279
ATCC 10145
3.2. Avaliação da actividade antimicrobiana
Nesta parte do trabalho foi realizada a avaliação do efeito antibacteriano dos
extractos vegetais nos diferentes solventes e dos óleos essenciais puros. Para tal procedeuse à realização de duas metodologias complementares: (i) screening da actividade
antibacteriana e (ii) determinação da concentração mínima inibitória (CMI).
3.2.1.
Screening da actividade antibacteriana
Para a realização do screening da actividade antibacteriana utilizaram-se os 16
isolados referidos anteriormente (Tabela 3.1.). Estes isolados foram semeados a partir de
culturas devidamente identificados em meio Brain Heart Agar (Oxoid CM0337) e
incubados a 37ºC, de modo a obter culturas para os ensaios in vitro.
O ensaio de susceptibilidade dos isolados aos extractos vegetais e aos óleos
essenciais foi realizado pelo método de difusão em disco, em meio agar sólido
Mueller-Hinton (Oxoid), de acordo com os procedimentos do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2009), com adaptação do método de Kirby-Bauer (Bauer et al.,
1966). (Clsi, 2009)
O método baseia-se no princípio da difusão através do agar, do composto com
potenciais propriedades antimicrobianas depositado num disco estéril de papel-de-filtro
(Oxoid CT0998B). A ocorrência de um efeito antibacteriano observa-se pela formação de
um halo de inibição do crescimento bacteriano. Trata-se de um método prático e expedito
para bactérias de crescimento rápido, apresentando uma grande flexibilidade na escolha do
número e do tipo de composto a utilizar.
Pereira, V.
24
Material e métodos
Todos
os
extractos
vegetais
foram
testados
a
uma
concentração
de
10 000 µg.mL-1 (em DMSO) e os óleos essenciais foram testados puros. O primeiro passo
da aplicação desta metodologia consistiu na preparação de placas de Petri (92×16 mm,
Sarstedt, Germany) contendo 20 mL do meio de cultura Mueller Hinton Agar, com pH 7,2
a 7,4, adequado ao crescimento da maioria das bactérias. Após a sua preparação,
esterilização em autoclave (Modelo 075-L, JSM) e distribuição em placas de Petri em
câmara de fluxo-laminar (FasterUltrasafe 48, Faster, S r. 1., Ferrara, Italy), procedeu-se à
preparação do inóculo a utilizar nos ensaios, a partir das culturas (Figura 3.3). Desta forma
e em condições de assépsia, procedeu-se à realização de uma suspensão em ± 5 mL de soro
fisiológico (Cloreto de sódio, MERCK) com a finalidade de se obter uma turvação
correspondente a 0,5 da escala de MacFarland (Figura 3.3 - C).
Figura 3. 3. Preparação da suspensão bacteriana. Legenda: A – Retirar uma pequena porção da cultura;
B- Suspensão em tubo com soro fisiológico; C- Suspensão bacteriana (0,5 da escala de MacFarland).
Seguidamente, em condições de assépsia, em câmara de fluxo-laminar, procedeu-se
à inoculação das placas pelo método de esgotamento à superfície utilizando de um
distribuidor mecânico (Inoculador 5100 5983, modelo Retro C80, Tipo 01).
Após esta operação, foram aplicados os discos brancos estéreis, de 6 mm de
diâmetro, onde foram posteriormente depositados os compostos a testar. Foram pipetados
15 µL de cada composto, sendo utilizado como controlo negativo o solvente de
ressuspensão (DMSO) e como controlo positivo um antibiótico (gentamicina). Após 24
horas de incubação a 37ºC foram registados os diâmetros dos halos de inibição dos
extractos vegetais, dos óleos essenciais e dos controlos (Figura 3.4).
A actividade antimicrobiana dos extractos vegetais foi classificada de acordo com o
referido e adaptado de Saavedra e colaboradores (2010): Não efectivo (-) quando o halo de
inibição = 0; Moderadamente efectivo (+) quando 0 < halo inibição < halo do antibiótico;
Pereira, V.
25
Material e métodos
Boa eficácia (++) quando o halo de inibição do antibiótico < halo de inibição < 2× halo de
inibição do antibiótico; e Elevada eficácia (+++) quando o halo de inibição > 2× halo de
inibição do antibiótico.
A actividade antimicrobiana dos óleos essenciais foi classificada de uma adaptação
da utilizada por Elaissi e colaboradores (2011): Não sensível (-) – halo de inibição ≤ 8 mm;
Sensível (+) – 8 mm < halo de inibição ≤ 14 mm; Muito sensível (++) – 14 mm < halo de
inibição < 20 mm; e Extremamente sensível (+++) – halo de inibição ≥ 20 mm.
(Saavedra et al., 2010)
Figura 3. 4. Avaliação da actividade antimicrobiana dos extractos e óleos essenciais. Legenda: A- Inoculação
da estirpe bacteriana em Mueller-Hinton; B- Colocação dos discos brancos estéreis sobre a placa inoculada; CExtractos de Eucalyptus globulus; D - Deposição dos extractos sobre os discos brancos estéreis; E- Incubação
das placas na estufa a 37°C; F- Leitura do halo de inibição.
3.2.2.
Determinação da concentração mínima inibitória (CMI)
Para a determinação da concentração mínima inibitório (CMI) utilizou-se o método
descrito por Sarker et al. (2007) com modificações. Este método utiliza um indicador de
oxidação-redução, a resazurina que se torna rosa e fluorescente quando é reduzido a
“resorufina” por oxirredutases existentes no interior de células viáveis, o que nos permite a
detecção de crescimento microbiano em volumes extremamente pequenos de solução sem
a utilização de um espectrofotómetro.
Pereira, V.
26
Material e métodos
Para a realização deste método (Figura 3.5.) foram utilizadas microplacas estéreis
de 96 poços (Tissue Culture Testplates, Orange Scientific, 96 Wells Flat, USA) de fundo
chato e tampa nas quais foram distribuídos assepticamente 100 µL de caldo MuellerHinton (Oxoid), com a excepção dos poços da linha A.
Figura 3. 5. Preparação das placas para a determinação da CMI. Legenda: A e B – Transferência de uma
pequena porção de bactéria para frasco com Mueller-Hinton; C – Incubação overnight em banho-maria a
37ºC; D – Placa com 96 poços inoculada e com os extractos a testar; E – Adição da resazurina; F –
Resultados da CMI (rosa significa crescimento bacteriano).
Para a preparação do inóculo bacteriano utilizado neste ensaio, transferiu-se em
condições assépticas o isolado a testar para um frasco contendo 50 mL de caldo MuellerHinton (Oxoid) e incubou-se durante a noite a 37 ºC, com agitação de 120 r.p.m. Após 1218 horas de incubação procedeu-se à leitura da densidade óptica a 500 nm (valores entre
0,5-1,0 para ter uma concentração de 5 × 106cfu/mL). A solução de resazurina foi
preparada dissolvendo 270 mg em 40 mL de água destilada esterilizada e procedeu-se a
uma diluição desta solução para 50%.
Na placa, nos poços da linha A foram colocados 200 µL do(s) composto(s) a testar
(antibiótico, extractos vegetais e óleos essenciais), e em seguida procedeu-se às diluições
seriadas transferindo-se 100 µL da linha A até à linha H.
Para cada composto foram testadas 8 concentrações, sendo que para os extractos e o
antibiótico as seguintes: 10 000 µg/mL; 5 000 µg/mL; 2500 µg/mL; 1250µg/mL; 625
µg/mL; 313 µg/mL; 156 µg/mL e 78 µg/mL.
Pereira, V.
27
Material e métodos
No caso dos óleos consideramos as concentrações de acordo com a percentagem de
diluição do óleo, deste modo, o óleo bruto foi considerado 100% e a partir daí testou-se:
50%; 25%; 12,5%; 6.25%; 3,13%; 1,56% e 0,78%.
Nota: Em toda a coluna 1 não foi depositado nenhum composto e nem se procedeu a
nenhuma diluição, pois esta coluna foi utilizada como controlo de crescimento bacteriano.
Após as diluições adicionou-se a cada poço 20 µL do inóculo bacteriano e 20 µL de
solução de resazurina (Sigma - Aldrich). As placas foram então tapadas e incubadas a 37ºC
durante 24 horas.
A leitura foi realizada de forma visual através da observação da mudança de cor
azul (original da resazurina) para rosa (caracterizado pela redução da resazurina). Nos
poços onde a cor permaneceu azul, ou seja, não ocorreu redução do corante, indica
inviabilidade bacteriana, já nos poços onde se observou mudança de cor de azul para rosa
considerou-se que havia viabilidade bacteriana. Deste modo podemos determinar a
concentração mínima inibitória, ou seja, a menor concentração de um composto que é
capaz de inibir o crescimento microbiano.
3.3. Análise estatística
A análise estatística dos dados foi feita utilizando o programa SPSS V.17 (SPSS,
Inc. Chicago, Illionois, USA), com a análise de variância calculada por OneWay Anova.
Para a comparação e separação das médias utilizou-se o teste de Duncan, para um nível de
significância de P < 0,05.
Pereira, V.
28
(Sarker et al., 2007)
(Malik et al., 2010)
(Khan et al., 2009; Safaei-Ghomi e Ahd, 2010; Tohidpour et al., 2010; Badrunnisa
et al., 2011)
(Andrews, 2001)
4. Resultados e discussão
Resultados e discussão
Para a realização dos ensaios biológicos, in vitro, para determinação da actividade
antimicrobiana, foi realizada a preparação do material vegetal: (i) aquisição; (ii)
liofilização e trituração e (iii) extracção em 4 solventes diferentes (água; metanol 70% e
100%; acetona e diclorometano).
4.1. Rendimento de extracção
O rendimento de extractos de folhas de E. globulus obtidos com diclorometano foi
o mais baixo (9%) como podemos observar na figura 4.1. O rendimento de compostos
extraíveis é consideravelmente superior para os solventes polares, sendo o valor máximo
obtido para o metanol a 70%, seguido pelo metanol a 100% e pela água, com rendimentos
de 33.0%, 27.1% e 20.9%, respectivamente.
Rendimento de extracção
40%
30%
33,0%
27,1%
20,9%
20%
11,8%
9%
10%
0%
Figura 4. 1. Representação esquemática dos valores referentes aos rendimentos de extracção dos
extractos de E. globulus com diferentes solventes.
(Vázquez et al., 2008(Pathamanathan et al., 2010)
De acordo com os resultados obtidos podemos referir que a extracção efectuada
recorrendo aos solventes metanol e à água é a mais vantajosa, pois para uma quantidade de
material vegetal igual poderemos obter uma maior percentagem de compostos com
potenciais propriedades antimicrobianas.
Resultados semelhantes a estes foram obtidos por Vázquez et al. (2008) e
Pathmanathan et al. (2010), no entanto numa ordem de grandeza inferior. No trabalho
Pereira, V.
30
Resultados e discussão
desenvolvido por Vázquez e colaboradores (2008) na casca de E. globulus o solvente que
apresentou um maior rendimento foi a água (6,8%) e o que apresentou menor rendimento
foi a acetona (1,00%) e no estudo realizado por Pathmanathan e colaboradores (2010) em
folhas de E. citriodora o valor máximo obtido no rendimento de extracção foi de 4,2%
para o etanol, seguido da água e do metanol, com 3,8 e 3,0, respectivamente, o que não se
verificou neste estudo pois o metanol apresentou um rendimento de extracção superior ao
da água, no entanto é de referir que a espécie de Eucalyptus em análise é diferente.
No estudo efectuado por Brum (2010) os valores obtidos para o rendimento de
extracção para as folhas de E. dives foram da mesma ordem de grandeza que neste estudo,
sendo o rendimento para a água de 20,9% e no estudo de Brum (2010) de 26,0%, o mesmo
não se observou com o diclorometano onde o valor do rendimento foi de 9,00% e de 21,0%
(valor bastante superior) respectivamente.
4.2. Avaliação da actividade antimicrobiana
4.2.1.
Screening da actividade antibacteriana
Os resultados do screening da actividade antibacteriana traduzem-se nas medições
dos halos de inibição observados (Figura 4.2.) e estão expressos em milímetros (mm pela
medida do diâmetro da zona de inibição, para os diferentes compostos e para as diferentes
estirpes de P. aeruginosa.
Os resultados do screening da actividade antibacteriana dos extractos das folhas de
E. globulus encontram-se apresentados na tabela 4.1. Dos 16 isolados estudados 4 deles
(MJH 4, MJH 15, MJH 21 e MJH 40) revelaram susceptibilidade aos extractos. De entre
estes, o MJH 4 é o mais susceptível, apresentando uma maior sensibilidade que os outros
isolados em estudo, para 4 dos 5 extractos testados (metanol 70%, metanol 100%, acetona
e diclorometano). O menor valor obtido para o halo de inibição verificou-se para o isolado
MJH 21 no extracto aquoso (7,0 mm) e o maior valor de halo de inibição verificou-se para
o isolado MJH 4 no extracto com diclorometano (13,33 mm).
Pereira, V.
31
Resultados e discussão
Figura 4. 2. Screening de actividade antimicrobiana: Halos de inibição obtidos.
Legenda: (1) Extracto aquoso; (2) Extracto metanólico 70%; (3) Extracto metanólico 100%; (4) Extracto
com acetona; (5) Extracto com diclorometano; (A) Óleo A; (B) Óleo B; (-) Controlo negativo – DMSO;
(CN) controlo positivo – gentamicina.
Dos 4 isolados que apresentaram susceptibilidade aos extractos, 3 são provenientes
de expectorações (MJH 4, MJH 15 e MJH 40) e 1 proveniente das secreções brônquicas
(MJH 21). De referir que, para todos os isolados o antibiótico utilizado como controlo
positivo apresentou melhor actividade antimicrobiana.
Apesar de termos obtido um rendimento de extracção mais eficaz para os extractos
metanólicos e aquosos, verificamos que o extracto que tinha apresentado um menor valor
de rendimento de extracção foi aquele que apresentou uma maior actividade
antimicrobiana. Segundo estes resultados podemos inferir que o rendimento de extracção
para este tipo de extractos não se encontra relacionado com o seu potencial
antimicrobiano, mas poderá estar dependente da(s) substância(s) existentes no extracto
bruto obtido.
No estudo efectuado por Egwaikhide et al. (2010) com extractos de raiz de
E. globulus, o extracto que apresentou maior actividade foi o metanólico, o que se
observou também neste trabalho. No entanto, o valor do halo de inibição deste extracto
para a espécie P. aeruginosa foi de 17,0 mm, superior ao obtido neste estudo (13,0 mm)
para o extracto metanólico a 70%. Já no estudo efectuado por Khan e colaboradores (2009)
o extracto etanólico de folhas de E. globulus utilizado não apresentou nenhuma actividade
contra P. aeruginosa.
Pereira, V.
32
Resultados e discussão
Tabela 4. 1. Valores dos halos de inibição (mm) dos extractos de folhas de E. globulus nas diversas estirpes de P. aeruginosa
Água
Metanol 70%
Metanol 100%
Acetona
Diclorometano
Gentamicina
MJH 4
MJH 15
MJH 21
MJH 24
MJH 40
MJH 67
MJH 149
MJH 198
MJH 207
MJH 215
MJH 216
MJH 221
MJH 260
MJH 279
MJH 287
8,33 ± 0,33 b ; C
9,67 ± 0,33 a ; CD
7,00 ± 0,00 c ; C
0,00 ± 0,00 d ; B
8,67 ± 0,67 b ; CD
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
13,00 ± 0,00 a ; B
11,67 ± 0,33 b ; B
11,00 ± 0,00 c ; B
0,00 ± 0,00 d ; B
11,00 ± 0,58 c ; B
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
12,33 ± 0,33 a ; B
10,67 ± 0,33 bc ; BC
11,00 ± 0,58 b ; B
0,00 ± 0,00 d ; B
10,00 ± 0,33 c ; BC
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
13,00 ± 0,58 a ; B
9,33 ± 0,33 c ; D
11,00 ± 0,00 b ; B
0,00 ± 0,00 e ; B
8,33 ± 0,33 d ; D
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
13,33 ± 0,33 a ; B
9,33 ± 0,33 c ; D
11,00 ± 0,00 b ; B
0,00 ± 0,00 e ; B
7,67 ± 0,33 d ; D
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
29,67 ± 0,33 a ; A
29,33 ± 0,33 ab ; A
24,00 ± 0,58 c ; A
19,33 ± 0,33 de ; A
27,33 ± 0,88 b ; A
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
ATCC 10145
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
*Letras diferentes na mesma linha (letras maiúsculas) significam valores diferentes (P<0,05) para diferentes estirpes
**Letras diferentes na mesma coluna (letras minúsculas) significam valores diferentes (P<0,05) para os diferentes composto
n.d. - Valor de halo de inibição não detectável
Pereira, V.
33
Resultados e discussão
Também no nosso estudo na maioria dos isolados testados (75%) não observamos
actividade para os extractos utilizados com os diferentes solventes. Apesar de a
concentração ser superior, estes autores conseguiram obter halos de inibição nos valores de
26,0-35,0 mm com o extracto metanólico, mas com espécies bacterianas diferentes,
nomeadamente o Staphylococcus mutans e S. aureus (bactérias Gram positivo). No estudo
efectuado por Malik et al. (2010) com extracto aquoso, etanólico e n-hexano os valores dos
halos obtidos, para uma concentração de 100 mg/mL em outros genéros bacterianos foram,
superiores aos obtidos no presente estudo, sendo o valor mínimo observado de 14,0 mm
para o solvente n-hexano, em Salmonella typhi, Staphylococcus epidermis e Bacillus
subtilis. No estudo efectuado por Pathmanathan et al. (2010) com extractos de folhas de E.
citriodora em várias espécies bacterianas, incluindo P. aeruginosa, observou-se a presença
de halos de inibição para os solventes metanólicos e aquosos, com valores de 6,5 mm e de
9,7 mm, respectivamente. Estes halos foram obtidos para uma concentração 100× inferior à
testada neste presente estudo. Os valores de halos de inibição obtidos neste estudo (para 4
das estirpes testadas) foram semelhantes com os obtidos por Badrunnisa et al. (2011) com
extractos de folhas de E. tereticornis contra P. aeruginosa para o solvente metanolólico e
etanólico, o que foi também observado por Safaei-Ghomi e Ahd (2010) com extracto
aquoso de E. intertexta e E. largiflorens.
Na tabela 4.2. podemos observar a comparação entre os efeitos bacterianos obtidos
pelos extractos com os obtidos pelo antibiótico (gentamicina), tendo sido a classificação
efectuada de acordo com Saavedra e colaboradores (2010).
Verificou-se que em 4 isolados (Tabela 4.2.) os extractos apresentaram uma
eficácia moderada na inibição do crescimento antibacteriano (25%) e que em 12 isolados
os extractos foram não eficazes (75%). De realçar que para a estirpe P. aeruginosa (ATCC
10145), utilizada como referência, não se verificou potencial antibacteriano para qualquer
um dos extractos testados.
Relativamente aos óleos essenciais verifica-se que, os dois óleos apresentaram
actividade contra os 16 isolados testados (Tabela 4.3). O valor máximo obtido para o halo
de inibição observa-se na estirpe MJH 4, com 19,3 mm de diâmetro, para o óleo B e o
valor mínimo foi de 7,7 mm na estirpe MJH 207 para o óleo A.
Pereira, V.
34
Resultados e discussão
Tabela 4. 2. Propriedades antimicrobianas dos extractos de folhas de E.globulus1
1
Água
Metanol 70%
Metanol 100%
Acetona Diclorometano
MJH 4
+
+
+
+
+
MJH 15
+
+
+
+
+
MJH 21
+
+
+
+
+
MJH 24
-
-
-
-
-
MJH 40
+
+
+
+
+
MJH 67
-
-
-
-
-
MJH 149
-
-
-
-
-
MJH 198
-
-
-
-
-
MJH 207
-
-
-
-
-
MJH 215
-
-
-
-
-
MJH 216
-
-
-
-
-
MJH 221
-
-
-
-
-
MJH 260
-
-
-
-
-
MJH 279
-
-
-
-
-
MJH 287
-
-
-
-
-
ATCC 10145
-
-
-
-
-
Os símbolos (+) e (-) indicam efeito positivo e negativo na inibição do crescimento bacteriano in vitro.
Para o óleo A o isolado que apresentou uma maior sensibilidade foi o MJH 216
com um halo de inibição de 13,3 mm, para o óleo B o que se mostrou mais sensível foi o
MJH 4 (19,3 mm). Ambos os isolados (MJH 4 e MJH 216) foram também dos mais
sensíveis para o antibiótico, assim como MJH 15, MJH 221 e MJH 279. Quando
comparamos a eficácia dos óleos nas estirpes, observamos que em 6 dos isolados o óleo A
foi o menos eficiente (MJH 4, MJH 15, MJH 149, MJH 198, MJH 207 e ATCC 10145) e
que em 2 dos isolados o óleo B foi o menos eficiente (MJH 216 e MJH 287). De salientar
que houve uma relação entre o potencial antibacteriano dos dois óleos em estudo
relativamente às estirpes estudadas, ou seja, observou-se em 13 estirpes sensibilidade aos
dois óleos testados.
Pereira, V.
35
Resultados e discussão
Estudos
anteriores
demonstram
valores
de
halos
de
inibição
para
P. aeruginosa na presença de outros óleos essenciais de eucalipto inferiores aos obtidos no
presente trabalho (Gilles et al., 2010; Elaissi et al., 2011).
Tabela 4. 3. Valores dos halos de inibição (mm) dos óleos essenciais de E. globulus nas diversas estirpes de
P. aeruginosa
Óleo A
Óleo B
Gentamicina
MJH 4
9,67 ± 0,33 cde ; C
19,33 ±1,76
a;B
29,67 ± 0,33 a ; A
MJH 15
8,33 ± 0,33 fg ; C
12,67 ± 0,88
b;B
29,33 ± 0,33 ab ; A
MJH 21
9,00 ± 0,00 ef ; B
10,67 ± 0,67
cd ; B
24,00 ± 0,58
c;A
MJH 24
8,00 ± 0,58
9,33 ± 0,33 cd ; B
19,33 ± 0,33
de ; A
MJH 40
10,33 ± 0,33
11,00 ± 0,57 bc ; B
27,33 ± 0,88
b;A
MJH 67
9,33 ± 0,33 de ; B
9,33 ± 0,88 cd ; B
15,67 ± 0,33
f;A
MJH 149
9,00 ± 0,00 ef ; C
10,67 ± 0,33
cd ; B
20,00 ± 0,58
d;A
MJH 198
8,33 ± 0,33fg ; C
10,00 ± 0,00
cd ; B
15,67 ± 0,33
f;A
MJH 207
7,67 ± 0,33
g;C
11,00 ± 0,58bc ; B
16,33 ± 0,33
f;A
MJH 215
8,33 ± 0,33 efg ; B
9,67 ± 0,33 cd ; B
20,33 ± 0,67
d;A
MJH 216
13,33 ± 0,33
a;B
10,33 ± 0,67cd ; C
29,33 ± 1,20 ab ; A
MJH 221
10,00 ± 0,00 cd ; B
9,00 ± 0,58
d;B
19,67 ± 0,33de ; A
MJH 260
9,00 ± 0,00 ef ; B
10,00 ± 0,00
cd ; B
15,67 ± 1,86
MJH 279
9,00 ± 0,00 ef ; B
10,67 ± 0,33
cd ; B
28,67 ± 1,33 ab ; A
MJH 287
12,00 ± 0,00
cd ; C
15,67 ± 0,33
ATCC 10145
8,00 ± 0,57
g;B
c;B
b;B
g;C
9,33 ± 0,33
10,33 ± 0,33
cd ; B
f;A
f;A
17,67 ± 0,33 ef ; A
.*Letras diferentes na mesma linha (letras maiúsculas) significam valores diferentes
(P < 0,05) para diferentes estirpes
**Letras diferentes na mesma coluna (letras minúsculas) significam valores diferentes (P < 0,05) para
diferentes compostos
Também estudos efectuados com óleos essenciais de E. globulus em diversas
espécies bacterianas demonstram valores de halos de inibição inferiores aos obtidos
Pereira, V.
36
Resultados e discussão
(Fit et al., 2009; Tohidpour et al., 2010), no entanto Damjanovic-Vratnica e
colaboradores (2011) obtiveram valores de halos de inibição para P. aeruginosa entre 15 17 mm.
Ao contrário dos resultados obtidos neste estudo, os óleos essenciais de
E. intertexta e E. largiflorens não apresentaram actividade antimicrobiana contra isolados
bacterianos de P. aeruginosa (Safaei-Ghomi e Ahd, 2010).
A avaliação da sensibilidade dos isolados testados aos óleos essenciais de
E. globulus foi classificada de acordo com a metodologia adoptada por Elaissi e
colaboradores (2011).
Os isolados foram mais sensíveis ao óleo B que ao óleo A (Tabela 4.4.),
determinando-se para o óleo A que, dos 16 isolados 3 deles apresentaram uma
classificação de “Não sensível” (MJH 24, MJH 207 e ATCC 10145). O isolado MJH 4
apresentou para o óleo B um grau de “Muito sensível”.
Tabela 4. 4. Avaliação da sensibilidade dos 16 isolados aos óleos essenciais de E. globulus. *
Óleo A
Óleo B
MJH 4
+
++
MJH 15
+
+
MJH 21
+
+
MJH 24
-
+
MJH 40
+
+
MJH 67
+
+
MJH 149
+
+
MJH 198
+
+
MJH 207
-
+
MJH 215
+
+
MJH 216
+
+
MJH 221
+
+
MJH 260
+
+
MJH 279
+
+
MJH 287
+
+
ATCC 10145
-
+
* Não sensível (-) – halo de inibição ≤ 8mm; Sensível (+) – 8 mm < halo de inibição ≤ 14 mm; Muito sensível (++) – 14
mm < halo de inibição < 20 mm; e Extremamente sensível (+++) – halo de inibição ≥ 20 mm.
Pereira, V.
37
Resultados e discussão
4.2.2.
Determinação da concentração mínima inibitória
De acordo com Andrews (2001) a concentração mínima inibitória (CMI) pode ser
definida como a concentração mínima de um agente antimicrobiano capaz de inibir o
crescimento dos microrganismos após um período de incubação de 18-24 horas. Este
método tem sido usualmente utilizado e é considerada uma ferramenta fundamental para a
determinação do perfil susceptibilidade dos microrganismos aos agentes antimicrobianos.
O método é efectuado em meio líquido e denomina-se também como método de
diluições sucessivas, nas quais podemos determinar qual a concentração mínima a que o
composto inibe o crescimento bacteriano. Utiliza-se este método essencialmente para
confirmar resistências dos microrganismos aos antibióticos e/ou estudar novos compostos
cuja acção pode apresentar um efeito antimicrobiano.
Na tabela 4.5. encontram-se representados os valores obtidos para a concentração
mínima inibitória dos 4 isolados (MJH 4, MJH 15, MJH 21 e MJH 40) que no screening
inicial apresentaram alguma susceptibilidade aos extractos testados (água, metanol 70%,
metanol 100%, acetona e diclorometano).
Para os isolados MJH 4 e MJH 15 não se observaram diferenças significativas para
as CMIs dos extractos. Para o isolado MJH 4 o valor da CMI para todos os extractos foi de
1250 µg/mL. Verificou-se que no isolado MJH 15 houve algumas diferenças, sendo o valor
da CMI obtido para a água e o metanol a 100% o mais elevado (2500 µg/mL) e o valor
encontrado para o metanol 70% foi o mais baixo (625 µg/mL). Para o isolado
MJH 21 os extractos tiveram uma actividade microbiana superior à obtida pelo antibiótico,
pois apresentam um valor de CMI inferior, observando-se assim um potencial
antibacteriano dos extractos utilizados neste ensaio experimental.
Para o isolado MJH 21 o valor da CMI para o antibiótico foi superior ao observado
nos extractos (2500 µg/mL), em contrapartida para o isolado MJH 40 o valor da CMI para
o antibiótico foi inferior ao observado nos extractos (625 µg/mL). Os valores de CMI para
os extractos variam entre 625 µg/mL e 2500 µg/mL. Valores semelhantes foram obtidos no
estudo realizado por Adeniyi e Ayepola (2008), com extractos metanólicos e com
diclorometano de folhas de E. camaldulensis e E. torelliano contra P. aeruginosa, sendo
observado 313 µg/mLo valor de CMI mais baixo encontrado (extracto metanólico de
E. camaldulensis) e 2500 µg/mL (extracto metanólico de E. torelliano) o mais elevado.
Pereira, V.
38
Resultados e discussão
Tabela 4. 5. Valores da concentração mínima inibitório (CMI)1: Ensaio in vitro dos extractos das folhas de E.
globulus e da ciprofloxacina.
MJH 4
MJH 15
MJH 21
MJH 40
Água
1250 ± 0
2500 ± 0
1250 ± 0 b
2500 ± 0 a
Metanol 70%
1250 ± 0
625 ± 0
625 ± 0 c
1250 ± 0 b
Metanol 100%
1250 ± 0
2500 ± 0
625 ± 0 c
1250 ± 0 b
Acetona
1250 ± 0
1250 ± 0
625 ± 0 c
1250 ± 0 b
Diclorometano
1250 ± 0
1250 ± 0
625 ± 0 c
1250 ± 0 b
Ciprofloxacina
< 78
> 10 000
2500 ± 0 a
625 ± 0 c
1
MIC expressa em µg/mL
Dupont e colaboradores (2006) reportaram que extractos etanólicos e de hexano de
folhas de E. olida e E. staigerana foram eficazes contra P. aeruginosa. Assim, analisando
os seus resultados, verificamos que os extractos apresentaram uma actividade
antimicrobiana mais elevada e portanto CMIs mais baixas, do que aquelas obtidas neste
estudo, com CMIs de 250 µg/mL e 62,5 µg/mL para o extracto etanólico e de 250 µg/mL e
31,3 µg/mL, para o extracto em hexano. De realçar que parece haver uma relação entre o
potencial antimicrobiano do extracto em função do solvente utilizado, considerando o(s)
género(s) utilizado(s) nos ensaios, pra a determinação da actividade antimicrobiana.
No estudo de Badrunnisa et al. (2011) com extractos etanólicos e metanólicos de
E. tereticornis contra P. aeruginosa o valor foi superior para o extracto metanólico
(10 000 µg/mL) e inferior para o extracto etanólico (2000 µg/mL). Em contrapartida, nos
estudos efectuados por Safaei-Ghomi e Ahd (2010) em que avaliaram a actividade de
extractos de folhas de E. intertexta e E. largiflorens em diversas espécies bacterianas,
obteve resultados de CMI de extractos aquosos para P. aeruginosa de 32 µg/mL, valor
muito inferior ao obtido neste estudo que variaram entre 1250-2500 µg/mL. Já no estudo
efectuado por Boulekbache-Maklouf e colaboradores (2013) que avaliou a actividade de
extractos de frutos de E. globulus (n-hexano) contra bactérias de Gram positivo os valores
obtidos situaram-se entre 30 – 80 µg/mL.
Pereira, V.
39
Resultados e discussão
Os valores obtidos no nosso trabalho experimental para a concentração mínima
inibitória são inferiores aos obtidos por Khan et al. (2009) em extracto etanólico de folhas
de E. globulus contra bactérias de Gram positivo (3130 µg/mL).
Assim de acordo com os estudos referenciados e tendo por base também os nossos
resultados observamos que o solvente utilizado nos extractos é importante relativamente ao
potencial antimicrobiano e a eficácia, nomeadamente a concentração mínima inibitória,
depende não só do solvente utilizado assim como do microrganismo em estudo. Verifica-se
que, considerando o mesmo tipo de extracto, a eficácia é diferente entre bactérias Gram
positivo e Gram negativo. Tal resultado seria expectável pois as diferenças na constituição
da parede celular, entre estas bactérias, estará directamente relacionada com o modo de
acção destes compostos (localização e mecanismo-alvo na célula bacteriana).
Relativamente ao estudo do potencial antibacteriano (PA) dos óleos essenciais, os
resultados obtidos encontram-se descritos na tabela 4.6.
Em 3 dos isolados testados (MJH 21, MJH 149 e MJH 207) os óleos foram
significativamente mais eficientes que o antibiótico. Como já observado no screening
inicial o óleo B é mais eficaz que o óleo A, apresentando valores de PA inferiores aos
obtidos para óleo A, ou seja, é necessária uma concentração inferior (expressa em
percentagem) de óleo para inibir o crescimento bacteriano.
Analisando a relação entre os valores de PA obtidos entre os óleos e o antibiótico,
verificamos que o óleo A foi mais eficaz que o antibiótico em 5 dos isolados testados
(MJH 15, MJH 21, MJH 149, MJH 207 e MJH 287), enquanto para o óleo B observamos 9
isolados (MJH 15, MJH 21, MJH 24, MJH 40, MJH 67, MJH 149, MJH 207, MJH 287 e a
ATCC 10145). De salientar, que para o óleo A o isolado MJH 15 foi onde se observou uma
maior discrepância entre o valor do PA do antibiótico e do óleo, sendo o valor do óleo 16×
inferior ao do antibiótico, enquanto para o óleo B, dois dos isolados (MJH 15 e MJH 207)
também apresentaram esta discrepância (16× inferior) entre o PA do antibiótico e o do
óleo.
No estudo efectuado por Damjanovic-Vratnica e colaboradores (2011) também se
observou um maior potencial antibacteriano para o óleo essencial de E. globulus do que
para os antibióticos utilizados como controlo positivo (ceftriaxona, amicacina e
tetraciclina), contra P. aeruginosa. No entanto, é de salientar que o potencial antibacteriano
dos óleos varia com o antibiótico de referência, dado que estes autores referem que se
Pereira, V.
40
Resultados e discussão
compararem com a eritromicina (também utilizado no seu estudo) o PA á menos
para o óleo testado.
Tabela 4. 6. Potencial antimicrobiano (PA) dos óleos essenciais de E. globulus (A e B) e do antibiótico
(ciprofloxacina) para os isolados testados
Óleo A
Óleo B
Ciprofloxacina
MJH 4
6,25 ± 0,00
6,25 ± 0,00
< 0,78
MJH 15
6,25 ± 0,00
6,25 ± 0,00
> 100
MJH 21
6.25 ± 0,00 b
6,25 ± 0,00 b
25,00 ± 0,00 a
MJH 24
100,00 ± 0,00
12,50 ± 0,00
50,00 ± 0,00
MJH 40
6,25 ± 0,00
3,13 ± 0,00
6,25 ± 0,00
MJH 67
100,00 ± 0,00
12,50 ± 0,00
100,00 ± 0,00
MJH 149
6,25 ± 0,00 b
6,25 ± 0,00 b
12,50 ± 0,00 a
MJH 198
100,00 ± 0,00 a
12,50 ± 0,00 b
12,50 ± 0,00 b
MJH 207
25,00 ± 0,00 b
3,13 ± 0,00 c
50,00 ± 0,00 a
MJH 215
100,00 ± 0,00 a
100,00 ± 0,00 a
25,00 ± 0,00 b
MJH 216
100,00 ± 0,00a
25,00 ± 0,00 b
12,50 ± 0,00 c
MJH 221
25,00 ± 0,00
25,00 ± 0,00
1,56 ± 0,00
MJH 260
25,00 ± 0,00
25,00 ± 0,00
12,50 ± 0,00
MJH 279
25,00 ± 0,00 a
12,50 ± 0,00 b
1,56 ± 0,00 c
MJH 287
12,50 ± 0,00
12,50 ± 0,00
50,00 ± 0,00
ATCC 10145
100,00 ± 0,00
12,50 ± 0,00
25,00 ± 0.00
*PA - calculado com valores da percentagem de diluição dos compostos.
Após análise global de todos os resultados obtidos podemos referir que compostos
extraídos de E. globulus (extractos e óleos essenciais) apresentam um potencial
antimicrobiano. Na maioria dos isolados bacterianos estudados, o antibiótico apresenta
melhores propriedades antimicrobianas que os compostos testados, no entanto, com o
crescente aumento da resistência bacteriana, a moléculas actualmente em uso, os nossos
resultados demonstram que o eucalipto pode ser uma alternativa viável para a obtenção de
novas substâncias com potencial terapêutico.
Pereira, V.
41
(Boulekbache-Makhlouf et al., 2013)
(Adeniyi e Ayepola, 2008)
(Dupont et al., 2006)
5. Considerações finais
Considerações finais
De acordo com os resultados obtidos, no ensaio delineado para avaliar o potencial
antimicrobiano dos extractos e óleos essenciais, observa-se que a actividade antibacteriana
encontra-se dependente dos compostos utilizados, bem como da estirpe bacteriana
analisada. Acresce ainda que a percentagem do rendimento de extracção não é
directamente proporcional à actividade antimicrobiana e que este difere consoante o
solvente utilizado. Verificámos que, E. globulus pode representar uma importante fonte de
compostos para o tratamento de doenças infecciosas do tracto respiratório provocadas por
P. aeruginosa.
Considerando os resultados alcançados revela-se fundamental ampliar este tipo de
trabalho experimental a outros géneros bacterianos, com importância a nível do tracto
respiratório, sobretudo a espécies associadas a fenómenos de resistência bacteriana aos
antibióticos. Também testar extractos de E. globulus provenientes de outros órgãos
vegetais que não as folhas (por exemplo: casca e fruto), poderá contribuir para mais
informações sobre os efeitos antimicrobianos, assim como alargar o estudo a outras
espécies do género Eucalyptus, igualmente em Portugual.
Pereira, V.
43
(Lavoie et al., 2011)
(Vázquez et al., 2008)
(Fit et al., 2009; Damjanovic-Vratnica et al., 2011)
6. Referência bibliográficas
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