Fotossíntese
Transporte de protões e fotofosforilação em
cloroplastos isolados
Ana Filipa Sousa
Miguel Peixoto Almeida
Biologia Celular II
Introdução
Teórica
A fotossíntese
ƒ A vida na Terra depende da energia luminosa
do Sol. Os organismos fotossintéticos –
plantas, algas e alguns procariontes –
conseguem captar essa energia e convertê-la
em energia química. Esta fica armazenada em
compostos orgânicos, formados a partir de
substâncias minerais simples – CO2 e H2O.
ƒ Esta é a equação global da fotossíntese:
ƒ 6CO2 + 6H2O Æ C6H12O6 + 6O2
A fotossíntese
ƒ Nas plantas, a fotossíntese ocorre nos cloroplastos,
organelos grandes que se encontram sobretudo nas
células das folhas.
ƒ Estes são limitados por 2 membranas (interna e
externa), que não contêm clorofila e não participam
directamente na fotossíntese.
ƒ No entanto, estes organelos possuem uma terceira
membrana, que delimita compartimentos internos
denominados tilacóides e contém os pigmentos
fotossintéticos. É nesta membrana que ocorre a
fotossíntese.
A fotossíntese
O cloroplasto
membrana
exterior
membrana
interior
estroma
intergrana
tilacóide
espaço
intermembranar
grana
A fotossíntese
ƒ A fotossíntese pode ser dividida em
duas grandes fases:
ƒ Fase dependente da luz
ƒ Absorção de luz
ƒ Transporte de e-, com redução do NADP+ a
NADPH
ƒ Formação de ATP
ƒ Fase independente da luz
ƒ Fixação de carbono (Ciclo de Calvin)
A fotossíntese
Absorção de luz
ƒ Absorção de energia
luminosa pelos pigmentos
antena
ƒ Energia é direccionada
até às moléculas de
clorofila a, no centro de
reacção dos fotossistemas
I e II (FS I e FS II)
ƒ As clorofilas excitadas transferem um electrão
para um aceitador primário de e(plastoquinona no FS II ou ferrodoxina no FS I)
A fotossíntese
Absorção de luz
ƒ As clorofilas dos FS II oxidadas
removem e- de moléculas de H2O
(fotólise da água), libertando
moléculas de O2.
Lúmen do tilacóide
ƒ Fotólise da água:
H2O Æ ½ O2 + 2H+ + 2e-
ƒ As clorofilas dos FS I oxidadas
removem recebem os e- vindos da
oxidação da clorofila do FS II,
transportados através da cadeia de
transportadores.
estroma
A fotossíntese
Transporte de electrões
ƒ Os e- provenientes do FS II, captados pela
plastoquinona, são transferidos desta molécula e
passam por uma cadeia transportadora de e-, até
atingirem o FS I.
ƒ Este transporte é acompanhado de uma transferência
de H+ do estroma para o lúmen dos tilacóides.
ƒ Forma-se assim um gradiente de pH na membrana dos
tilacóides, em que o pH do lúmen é menor que o pH do
estroma.
ƒ Os e- provenientes do FS I, captados pela ferrodoxina,
são transferidos para o NADP+, que se reduz a NADPH
– o NADP+ é o aceitador final de e- desta cadeia.
A fotossíntese
Transporte de electrões
A fotossíntese
Formação de ATP
ƒ Devido ao “excesso” de H+ no lúmen do tilacóide,
estes movimentam-se a favor do seu gradiente de
concentração (lúmen Æ estroma), através do canal
protónico da ATPsintetase.
ƒ Este movimento, associado ao gradiente eléctrico
criado pelo movimento dos e-, cria um gradiente
electroquímico de H+, isto é, uma força
protonomotriz, que permite a síntese de ATP como
resultado da corrente espontânea de H+ através do
complexo da ATPsintetase.
TEORIA QUIMIOSMÓTICA DE MITCHELL
Gradiente de
concentração
de protões
+
Potencial
eléctrico
Força
protonomotriz
A fotossíntese
Formação de ATP
A fotossíntese
Fixação de carbono
ƒ O ATP e o NADPH formados nas etapas
anteriores são utilizados na fixação do
CO2 e na síntese de compostos
orgânicos.
ƒ As reacções que constituem esta etapa
ocorrem no estroma dos cloroplastos e
de uma forma cíclica – Ciclo de Calvin.
A fotossíntese
Esquema-síntese
Objectivo do
trabalho
Objectivo do trabalho
ƒ O objectivo deste trabalho prático
consiste em demonstrar que a
iluminação de tilacóides livres em
solução (resultantes de cloroplastos
osmoticamente rebentados) faz
aumentar o pH do meio externo, de
acordo com a Hipótese Quimiosmótica.
Métodos
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Como pretendemos estudar reacções
que ocorrem nos tilacóides, é
necessário rebentar os cloroplastos
para permitir que os tilacóides fiquem
livres em solução.
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Pesaram-se 20g de folhas de espinafres
(sem nervura mediana) e rasgaram-se as
folhas em pedaços pequenos.
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Homogeneizaram-se as folhas em 40 mL
de tampão de homogeneização frio (~
4ºC), as quais foram mantidas em gelo.
Teve-se o cuidado de não manter o homogeneizador ligado por mais de 5 seg.
ƒ Passou-se o homogeneizado através de
8 camadas de gaze e espremeu-se de
forma a sair todo o líquido, mantendo o
filtrado em gelo.
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Centrifugou-se o filtrado em tubos frios a
500 g durante 2 min.
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Transferiu-se o sobrenadante para tubos
frios e centrifugou-se a 6000 g durante 2
min.
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Decantou-se o sobrenadante e
ressuspendeu-se o sedimento de
cloroplastos em 25 mL de tampão de
homogeneização.
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Centrifugou-se a suspensão de
cloroplastos a 6000 g durante 2 min.
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Decantou-se o sobrenadante e
ressuspendeu-se o sedimento de
cloroplastos em 4 mL de meio de
isolamento frio.
A – Isolamento de cloroplastos de
Espinafre-da-Nova-Zelândia (Tetragonia expansa)
ƒ Guardou-se a suspensão de cloroplastos
em gelo, a qual foi agitada de cada vez
que se retirou uma amostra.
B – Determinação da concentração de clorofila e ajuste
da concentração de membranas.
ƒ Adicionou-se a 9,9 mL de
acetona 80% (V/V) 0,1 mL de
suspensão bem
homogeneizada de
cloroplastos.
B – Determinação da concentração de clorofila e ajuste
da concentração de membranas.
ƒ Após aguardar 1 min., filtrou-se o
extracto através de papel de filtro
Whatman #1.
B – Determinação da concentração de clorofila e ajuste
da concentração de membranas.
ƒ Transferiu-se o filtrado para uma cuvete
de vidro e leu-se a absorvância a 652
nm, usando acetona a 80% como
branco.
ƒ Calculou-se a concentração de clorofila
na suspensão de cloroplastos.
Tendo em conta que esta foi diluída 100 vezes.
B – Determinação da concentração de clorofila e ajuste
da concentração de membranas.
ƒ Diluir a suspensão de cloroplastos com
meio de isolamento de modo a que a
concentração final de clorofila seja de
150 μg mL-1 (cf).
ƒ Para isso foram efectuados os seguintes
cálculos:
Cálculos
ƒ A=εxcxl
ƒ
ƒ
ƒ
A = 0,121
ε = 34,5 mL.mg-1.cm-1
l = 1 cm
c = A/(ε x l) = 0,121/(34,5 x 1) Ù
c = 3,51 x 10-3 mg.mL-1
Cálculos
ƒ Tendo em conta que a solução se
encontra diluída – 100x:
c = 3,51 x 10-3 x 100 Ù
c = 351 μg.mL-1
Cálculos
ƒ Vsuspensão cloroplastos = 10 mL
ci x Vi = cf x Vf Ù 351 x 10 = 150 x Vf Ù
Vf = 23,6 mL
Temos de adicionar à solução inicial:
V = 23,6 – 10 = 13,6 mL
C – Medição do transporte de protões
ƒ Manteve-se a temperatura do banho de
água a 10ºC.
ƒ Adicionou-se ao banho uma pequena
quantidade de CuSO4, para absorver
radiação de infra-vermelhos.
C – Medição do transporte de protões
ƒ No tubo que continha o eléctrodo de pH
foram adicionados 20-30 mL de
suspensão de cloroplastos.
ƒ Colocaram-se as barras magnéticas.
ƒ Com uma pipeta, aspirou-se suavemente
a suspensão, para a homogeneizar bem.
C – Medição do transporte de protões
ƒ Ligou-se o agitador a baixa velocidade e
confirmou-se que a barra magnética não
afectava o eléctrodo. De seguida aumentou-se
a velocidade do agitador, para conseguir boa
homogeneização na vizinhança do eléctrodo.
ƒ Ajustou-se lentamente o pH da mistura para 6
- 6,2.
ƒ Esperou-se cerca de 1 min. para estabilizar a
leitura de pH e leu-se o pH inicial.
C – Medição do transporte de protões
ƒ Ligou-se a fonte de luz e registou-se a
variação de pH durante 1 min.
ƒ Desligou-se a luz e registou-se o pH
durante 1 min.
ƒ Repetiram-se os dois últimos passos
algumas vezes.
Resultados
Resultados
Registo dos valores de pH na luz / obscuridade
t/min
pH luz
pH obscuridade
0
1
2
3
4
5
6
7
8
6,00
6,07
6,13
6,13
6,13
6,14
6,13
6,09
6,10
6,10
-
Resultados
Gráfico da variação do pH com a luminosidade
Discussão de
Resultados
Resultados
ƒ Luz Æ Aumento de pH
ƒ Obscuridade Æ Decréscimo de pH
O que se passa nos
cloroplastos?
ƒ Vamos observar o
que ocorre nos
cloroplastos nas 3
fases referidas:
ƒ
ƒ
ƒ
Fase 1
Fase 2
Fase 3
> pH
= pH
< pH
O que se passa nos cloroplastos?
Na presença da luz:
Fotólise da água
origina e-, O2 e H+
[ H+ ]
aumenta dentro dos
tilacóides
O que se passa nos cloroplastos?
Os e- também produzidos
durante a fotólise da
água vão ser
transportados pela
cadeia transportadora
de e-. Durante este
processo há
transferência de H+ do
estroma para o
tilacóide. Dá-se a
redução do NADP+,
com consumo de H+.
pH aumenta (1)
O que se passa nos cloroplastos?
A ATPsintetase encontra
um gradiente óptimo de
actuação, começando a
bombear H+ para o
exterior, mas é
compensada pelo
processo descrito
anteriormente.
pH mantém-se (2)
O que se passa nos cloroplastos?
Na ausência da luz:
Redução do NADP+
deixa de ocorrer
Só a ATPsintetase
actua
O que se passa nos cloroplastos?
H+ passa em grande
quantidade para o
exterior das
membranas
pH diminui (3)
Conclusão
ƒ Pela intervenção de vários processos,
enquanto na presença de luz o pH da
solução aumenta, na obscuridade o pH
da solução diminui.
Bibliografia
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http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookPS.html
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http://photoscience.la.asu.edu/photosyn/education/photointro.html
Ana Filipa Sousa
Miguel Peixoto Almeida
Biologia Celular II :: Junho de 2005
Trabalho disponível em:
http://biodigital.com.sapo.pt/trabalhos.htm