(51) Int C15:
AttIK 39/108
(ti) (...)
(22) Data de Depósito: 25Al2/92
REPÚBLICAFEDERATNA DO BRASIL
Mir"do da irálat* do Comércio e d° -ibrbao°
Inseto Nacional da Propriedade Industrial
(30) Prioridade Unionista:
(54)
Título:
P1 9205677-6 A
(43) Data
de
Publicação'
r7bR
2~91 SE 9100558-1
SUMO:Patente deanção PROCESSO DE
RODO O DE. UMA COMPOSIÇÃOO DE VACINA CONTRA
O ENTERICA PROVO
POR BACTÉRIAS DE E.
COU
OnXIGÊNICAS, E, PROCESSO PARA EVITAR A
INFEC
ENTERICA'. Descreveu um
para produzir
uma composição de vacina contra infecçãoentérica provocada
por bactérias E. coce enterotoxigénicas em humanos. As capas E.
ceR selecionadas dente diferentes capeie conhecidas, ceda tendo
■mandriada de expressar um certo tipo de antfgenos de fator de
colonização, são cultivadas em um melo de cultura líquido.
Finalmente, cepa E. coil exterminada com formallna, tendo
propriedades antIginIcas e hemagiufinantes substancialmente
preservadas doo referidos certos tipos de antígenos de fator de
colonização, é misturada com um excipiente e/ou dilucide
farmaceutIcamente aceitável. Ainda se descrente um processo
para enlear uma Infecção entérica provocada por bactérias E. ooll
enterotoxIgénico em humano., por melo do que uma composição
compreendendo cepa de E. coll Ensilvada é administrada a um ser
humano para a prevenção da referida Infecção.
Processo da produção de uma composição de
vacina contra Infecção entérica provocada
por bactérias de E. COU onterokudgénicas,
e, processo para evitar a Infecção entérica
(Ti) Depositante(s):
(72) inventor(es):
(n.
Jan Hoirngrem
Ann-Iteri
Svennerholm (SI&
Jen Holmgrem; Mn-Marl
Svennerholm
(74) Procurador: Momsen, Leonardo, & Cbt.
(86) Pedido Internacional:
PCT SE 92/00110
25/02/92
(87) Publicação Internacional:
17/05/94 (RPI 1224)
'1 N P 1'
CEDIN
INEIN NINIK
MI I MIM
de
soo 92/14487 de
03/09/92
FIG.
23
DIAS APÓS
37
narao ali maranito
1
Relatório Descritivo da Patente de Invenção
"PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA CONTRA
E. COLI
INFECÇÃO ENTÉRICA PROVOCADA POR BACTÉRIAS DE
ENTEROTOXIGÉNICAS, E, PROCESSO PARA EVITAR A INFECÇÃO
5 ENTÉRICA"
A presente invenção se refere à preparação e
uso de organismos E. coli expressando antígenos de fator de
colonização (CFA) exterminados por formalina para vacinação
contra infecção entérica/diarréia provocada por bactérias
10
E. coli enterotoxigênicas em seres humanos.
Especialmente, a invenção se refere a um
processo de produção de uma composição de vacina contra
E. coli
infecção entérica provocada por bactérias
enterotoxigênicas em humanos, e a um processo para evitar
15 uma infecção entérica provocada por bactérias
E. coli
enterotoxigênicas em humanos.
ANTECEDENTES
A
diarréia
provocada
por
E.
coli
enterotoxigênico (ETEC) é um problema importante de saúde,
20 particularmente em países em desenvolvimento e em viajantes
nestes áreas. Em estudos com base em hospitais e clinicas
de diarréia aguda em países em desenvolvimento, ETEC foi
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identificado em 10-50% dos casos, a média sendo cerca de
20% em crianças com menos de 5 anos, e um pouco maior em
grupos de idade maior. Do mesmo modo, ETEC foi identificado
como o agente causador em, pelo menos, um terço a uma
5 metade dos casos de diarréia aguda dentre pessoas viajando
de países industrializados para os em desenvolvimento.
A doença provocada por ETEC está na faixa de
diarréia suave sem desidratação até uma doença semelhante
a cólera. Nos primeiros 5 anos de vida, muitas crianças nos
10 países em desenvolvimento sofrem de 1-2 episódios de
diarréia provocada por ETEC cada anos. Apesar da maior
parte dos sintomas de infecções por
relativamente suaves,
ETEC
serem
ETEC é responsável por mais de um
bilhão de episódios de diarréia e um milhão de mortes
15 anuais dentre crianças em países em desenvolvimento. Assim,
quaisquer intervenções que poderiam reduzir a mortalidade
provocada por ETEC e a morbidez mesmo parcialmente seriam
de grande significado para a saúde pública.
Ainda não se encontra disponível nenhuma vacina
20 para uso em humanos contra a diarréia provocada por ETEC.
No entanto, em uma grande tentativa no campo de uma vacina
contra cólera oral recentemente desenvolvida, verificou-se
que o componente de subunidade El desta vacina, que reage
imunologicamente com a enterotoxina lábil ao calor (LT) de
25
ETEC,
conferiu proteção significante não somente contra
cólera, mas também contra diarréia provocada por
produzindo LT.
A proteção contra infecção por
ETEC
ETEC
foi
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particularmente pronunciada contra doenças associadas com
uma desidratação severa, ameaçadora da vida, que foi
reduzida em 86% pela vacina durante os primeiros três meses
após imunização.
5 MECANISMOS DE DOENÇA E IMUNIDADE
Para provocar doença, ETEC deve ser capaz de
colonizar o pequeno intestino, e elaborar LT e/ou uma
enterotoxina estável ao calor (ST, STA). LT de E. coli é
similar a toxina da cólera em estrutura e função,
10 consistindo de uma subunidade A ativa a toxina fixada a
cinco subunidades B que mediam a ligação aos receptores da
membrana da célula. A molécula ST é um pequeno polipeptídeo
de somente 19 resíduos de aminoácidos, que estimula
atividade guanilato ciclase em células intestinais.
15 Diferente de LT, que é um imunogene forte, ST é não
imunogênico salvo se experimentalmente conjugado com uma
proteína transportadora maior. Cepas produzindo somente ST
e LT/ST são importantes causas de diarréia em áreas
endêmicas, enquanto cepas somente LT frequentemente
20 provocam doenças em viajantes para países em
desenvolvimento. A proporção de cepas ETEC com diferentes
perfis de eneterotoxina varia de país a pais.
Em muitas cepas ETEC, a adesão à mucosa
intestinal é mediada por fimbrias antigenicamente
25 distintas. Em cepas patogênicas para homem, três principais
adesinas foram identificadas;
elas
são referidas como
antígenos de fator de colonização CFA/I, CFA/II, e CFA/IV
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(anteriormente denominado PCF8775). CFA/I é um único
antígeno fimbrial homogéneo, enquanto CFA/II compreende os
antígenos de superfície coli (CS) CS1, CS2, e CS3, e
CFA/IV, os antígenos CS4, CS5 e C6. Apesar da predominância
5 destes diferentes fatores de colonização variar
geograficamente, CFA/I, CFA/II ou CFA/IV são geralmente
encontrado em uma metade a três quartos de ETEC isolado de
casos com diarréia clinicamente significantes. No entanto,
adesinas adicionais também provavelmente serão
10
identificadas.
As maiores taxas de infecção por ETEC em áreas
endêmicas são encontradas em crianças pequenas. A
descoberta de uma taxa de ataque decrescente com aumentada
idade em uma maior proporção de casos assintomáticos em
15 adultos do que em crianças sugeriu que pode se desenvolver
imunidade protetora naturalmente adquirida. Similarmente,
um grau de resistência contra diarréia ETEC se desenvolve
entre os viajantes durante residência prolongada em países _
de alto risco. Os estudos experimentais em animais e
20 voluntários humanos também demonstraram que a infecção por
ETEC pode dar lugar a imunidade substancial contra um reteste com os organismos homólogos.
Existe evidência que a imunidade tanto
antibacteriana como antitOxica contribui para a proteção
25 contra diarréia ETEC. A imunidade antibacteriana contra
ETEC pode, em uma grande extensão, ser considerada como
imunidade contra os diferentes antígenos de fator de
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colonização (CFA), mesmo se os anticorpos contra antígeno-O
poderem desempenhar um papel assim como para proteção
contra ETEC ou grupos O homólogos. Em animais, anticorpos
anti-CFA tem protegido contra o ataque com ETEC expressando
5 os CFAs homólogos. Similarmente, tanto em animais como
voluntários humanos, a imunização oral ou intraintestinal
com cepas ETEC expressando CFA/I, CFA/II ou CFA/IV tem
induzido a imunidade protetora contra ataque subsequente
com E. coli transportando o fator CFA/CS homólogo.
10
A imunidade por ETEC antitóxico, naturalmente
induzido, é somente dirigida contra LT porque ST nativo não
é imunogênico. A resposta imune anti-LT é principalmente
contra a porção de subunidade B da molécula, que reage
imunologicamente com as subunidades B de toxina da cólera.
15 Isto explica porque, como mencionado, a imunização oral com
subunidade de cólera
B
pode induzir proteção contra
diarréia ETEC [1]; de modo interessante, a proteção foi
induzida não somente contra LT apenas, mas também contra
cepas ETEC LT/ST [1]; uma descoberta também suportada por
20 verificações em animais após imunização com ou cólera ou
subunidades B de LT. (dados não publicados).
Também se sabe que, em humanos, a doença ETEC
clínica evoca respostas imunológicas antitóxicas, assim
como anti-bacterianas no intestino, resultando em aumentos
25 do título de anticorpo IgA específicos em fluido de lavagem
intestinal contra LT e CFA homólogo e antígenos O [2].
Ambos os anticorpos de fator anti-enterotoxina como anti-
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colonização podem independentemente um do outro proteger
contra infecção por ETEC experimental e, quando estando
presente junto no intestino, verificou-se que estas
especificidade dos anticorpos cooperam sinergisticamente em
5 proteção contra doença ETEC [3].
Em contraste com a função protetora bem
estabelecida de imunidade anti-LT contra doença ETEC, o
significado de imunidade anti-ST para proteção permanece
não definido. Apesar de ST em seu estado natural não ser
10 imunogênico, ele pode dar lugar a anticorpos neutralizando
ST quando sondo usado copulado a uma proteína de
transporte. Isto sugere que também a imunidade anti-ST
induzida por vacina pode ser um objetivo atingível. No
entanto, diferentes conjugados de transporte de ST,
15 testados até agora, derivados ou por copulação química ou
técnicas de DNA recombinantes, reteriam todos atividade
tóxica significante, apesar de às vezes reduzida.
Até
agora, vários peptídeos ST modificados, sintéticos,
foram preparados recentemente em uma tentativa para
20 identificar epítopos relacionados com ST. Os
oligonucleotideos sintéticos codificando para peptídeos
similares também foram feitos e fundidos para o gene para
a subunidade B de cólera e quando inseridos no
Vibrio
cholerae, estes genes quiméricos codificam produção de
25 elevadas concentrações de proteína de fusão de subunidade
ST-B, completamente não tóxica. A imunização de animais
experimentais com estes conjugados de subunidade B-
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peptideo
não tóxico,
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ou
geneticamente elaborados, tem evocado respostas de
anticorpos anti-ST, mas até agora com somente uma atividade
neutralizante fraca.
5 VACINAS CANDIDATAS
Com base em seu conhecimento sobre os antígenos
protetores chaves de bactérias ETEC e dos mecanismos imunes
principais, operando contra infecções por ETEC, pode-se
concluir que uma vacina ETEC eficaz deve ser dada oralmente
10 e idealmente evocar respostas imunes tanto anti-colonização
como antitóxicas no intestino. Assim, a vacina deve conter
uma combinação de antígenos derivados de toxinas e células
bacterianas. Diferentes candidatos para vacinas ETEC
inativadas ou vivas foram recentemente considerados com
15 bases nestas considerações.
Vacinas Vivas
As bactérias vivas expressando os CFAs
principais e produzindo subunidade B ou um enterotoxóide
relacionado podem ser consideradas porque esta vacina
20 através da multiplicação no intestino pode prover uma
estimulação prolongada do antígeno do sistema imune
intestinal local. No entanto, porque os diferentes fatores
de colonização não são normalmente expressados nas mesmas
cepas, e ainda não foi possível clonar os genes para
25 diferentes CFAs no mesmo organismo hospedeiro, estas
vacinas devem - pelo menos para o presente momento - ser
baseadas em uma mistura de várias diferentes cepas. Existem
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8
várias problemas, no entanto, com este tipo de abordagem de
vacina. Dentre estes, estão o risco de super-crescimento de
uma das cepas de vacina incluídas com supressão das outras;
reversão para toxicidade por absorção de plasmídeos
5 codificando toxina; baixa produção de enterotoxóides
durante o crescimento in vivo; e fraca sobrevivência das
cepas de vacina durante armazenagem. Assim, vacinas ETEC
orais, vivas, não estão ainda à vista.
Vacinas não vivas
10
O mais importante dos antígenos somáticos a ser
incluído em uma vacina são os CFAs que tem uma elevada
predominãncia em cepas ETEC em diferentes
geográficas. Estes antígenos incluem
CFA/IV,
áreas
CFA/I, CFA/II,
e
e possivelmente alguns CFAs adicionais, ainda a
15 serem definidos. No entanto, antígenos
CFA
purificados
podem ser relativamente onerosos de preparar e, além disso,
após administração oral,
CFAs
isolados demonstraram ser
sensíveis à degradação no trato gastrointestinal humano
[4,5].
20
Um modo mais prático de construir uma vacina
pode ser preparar bactérias ETEC mortas que expressam os
CFAs mais importantes em sua superfície e combinam estes
organismos com um componente toxóide apropriado. Os
problemas de preparação de vacinas importantes a superar
25 devem ser (a) encontrar um procedimento que iria
seguramente matar as
cepas
de vacina enquanto ainda
preservando as propriedades antigênicas e adesivas
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(hemaglutinantes) de diferentes CFAs (idealmente este
procedimento deve também estabilizar os CFAs contra
degradação no meio intestinal humano), e (b) encontrar
condições permitindo expressão de alto nivel de CFAs em
5 bactérias durante o crescimento em meio liquido em um
fermentador a fim de facilitar a produção da vacina em
larga escala.
Um processo bem conhecido, e assim vantajoso,
para inativar bactérias para uso como vacinas de célula
10 completa, deve
ser
o uso do tratamento com formalina.
Geralmente, uma concentração de formalina de 1M é usada
para estes fins. Verificou-se que o tratamento de CFA
expressando ETEC com processos de preparação de vacinas
comumente usados exterminou com segurança os organismos
15 ETEC, mas que isto, ao mesmo tempo, destruiu a maior parte
ou todo o teor em antígeno CFA e, assim, estes processos
não são bem apropriados para preparação de cepas ETEC
inativadas com imunogenicidade CFA retida. De acordo com
isto, Levine [6] descreveu o sucesso limitado de Tacket et
20 al em usar organismos ETEC tratados com formalina de uma
cepa para estimular a formação de anticorpos IgA e proteção
em voluntários humanos. A vacina foi preparada a partir de
cepa E. coli E1292-75-2A, uma cepa biotipo A 06:H16 que
expressa fimbrias CSI e CS3, mas não elabora LT ou ST. _
25 Quando usada previamente como uma vacina oral viva, uma
única dose de E1392-75-2A proveu proteção significante para
voluntários contra ataque experimental com uma cepa ETEC
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LT+/ST+ de sorotipo 0129:828 que expressa CS1 e CS3. (As
bactérias E1392-75-2A foram inativadas por formalina por
investigadores nas Instalações de Produção de Vacinas do
Exército Americano do Walter Reed Army Institute of
5 Research em Forest Glen, Maryland). Três doses de vacinas
(cada contendo 5x10 m bactérias inativadas) com NaRCO3 foram
dadas por Tacket et al em intervalos de duas semanas a nove
voluntários. Aumentos significantes em anticorpo CFA foram
detectados em soro em dois dos nove vacinados, enquanto
10 quatro dentre nove tinham aumentos detectáveis em
anticorpos anti-fimbriais SIgA intestinal. Um pequeno
estudo do teste foi realizado em que quatro dos vacinados
e dez controles foram atacados com cepa ETEC patogênica
E24377A (0139:828, CS1, CS3, LT+/ST+). Não se detectou
15 evidência de proteção : a diarréia ocorreu em duas de
quatro vacinados e em seis dos dez controles.
Com relação à expressão de CFAs em meio
liquido, isto não foi registrado. De fato, até agora, esta
expressão não foi considerada possível porque o meio
20 liquido é conhecido para suprimir expressão de CFAs e, de
fato, induziu expressão de tipo 1 sensível a fimbrias de
manose [7].
Esforços iniciais para desenvolver vacinas
protótipos com base em CFAs diferentes expressando ETEC e
25 proteínas CS [8] tinham de se basear no crescimento dos
organismos em placas de agar sólidas que impede seriamente
a possibilidade de produção de vacina em maior escala. Na
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presente invenção, os requerentes desenvolveram agora um
procedimento que permite uma expressão igualmente boa de
CFAs em ETEC durante mo crescimento em meio liquido em
cultura agitada, como sob condições de crescimento de placa
5 agar promovendo CFA ótimo e os requerentes também
demonstraram esta expressão de nível elevado de CFAs em L u
colidurante çõsdcultivoemfrnad.Os
requerentes também descreveram um procedimento pelo qual
estes E. coli cultivados em fermentador em meio líquido
10 foram inativados com formalina em um modo que assegura o
extermínio seguro das cepas de vacina ETEC testadas e ao
mesmo tempo tanto preserva como estabiliza os CFAs na
superfície bacteriana em um modo quantificável definido.
DESCRIÇÃO DO DESENHO
15
Legenda para Figura 1
Voluntários suecos adultos receberam três
imunizações (.I.) com a vacina ETEC protótipo em dias 0, 14
e 28 e amostras de lavagem intestinal foram coletadas
imediatamente antes e então 9 dias após a segunda e
20 terceira imunização. Os títulos IgA de ELISA contra CFA/I
purificado, CFA/II, (CS1+CS3) e CTB (GM1-ELISA) foram
determinados e divididos pela concentração IgA total de
cada amostra.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
25
Um aspecto desta invenção é dirigido para um
processo de produção de uma composição de vacina contra
infecção entérica provocada por bactérias de
E. coli
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enterotoxigênicas em humanos. No processo, pelo menos uma
cepa de
E. coli selecionada dentre cepas diferentes
conhecidas, cada tendo a capacidade de expressar um certo
tipo de antígenos de fator de colonização, é cultivada sob
5 condições apropriadas em um meio de cultura líquido
permitindo expressão em alto nível de referido certo tipo
de antígenos de fator de colonização na superfície das
bactérias
E. coli, para uma densidade predeterminada,
seguido por colheita e re-colocação em suspensão da cultura
10 bacteriana em solução salina, quando então formalina é
adicionada à suspensão sob leve agitação a uma concentração
final de formaldeido 0,2 M, seguido por incubação sob
agitação contínua a 37°C durante aproximadamente 2 h,
seguido por incubação a 4°C durante 24-48 h, resultando em
15 uma cepa de
E. coli exterminada por formalina tendo
propriedades hemaglutinantes e antigênicas substancialmente
preservadas de referido certo tipo de antígenos de fator de
colonização, quando então as referidas bactérias de E. coli
exterminadas com formalina são misturadas com um excipiente
20 farmaceuticamente aceitável e/ou diluente para concentração
apropriada.
Em uma forma de realização deste aspecto da
invenção, referido meio de cultura liquido compreende 1%
(p/v) de ácidos casamino, 0,15% (p/v) de extrato de
25 levedura, 0,4 mM MgSO 4 , 0,04 mM MnCl 2 , e água desionizada a
pH 7,4, e o cultivo é conduzido com agitação vigorosa ou
outros meios para obter aeração extensiva em
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aproximadamente 37°C durante, pelo menos, 4-6 h, antes da
colheita das bactérias ser efetuada por centrifugação ou
filtragem ou outros meios.
Em uma outra forma de realização deste aspecto
5 da invenção, as referidas cepas expressando certos tipos de
antígenos de fator de colonização são selecionados dentre
os antígenos de fator de colonização no intestino humano
CFA/I, CFA/II, (CS1, CS2, CS3) e CFA/IV (CS4, CS5, CS6).
Em outra forma de realização deste aspecto da
10 invenção, adiciona-se adicionalmente um tampão
neutralizante de ácido e componentes antigénicos
opcionalmente adicionais induzindo imunidade contra, por
exemplo, endotoxinas.
Outro aspecto da invenção é dirigido a um
15 processo de evitar uma infecção entérica provocada por
bactérias E coli enterotoxigênicas em humanos, assim uma
quantidade apropriada de uma composição de vacina,
compreendendo, como componente imunizante, pelo menos uma
cepa de E. coli inativada selecionada dentre diferentes
20 cepas conhecidas, cada tendo a capacidade de expressar um
certo tipo de antígenos de fator de colonização e cada
tendo propriedades antigénicas
e
hemaglutinantes
substancialmente preservadas do referido certo tipo de
antígenos de fator de colonização, é administrada para um
25 ser humano para evitar a referida infecção.
Em uma forma de realização preferida deste
aspecto da invenção, a via de administração é oral.
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Os procedimentos são descritos em que com a
ajuda de um fermentador, cepas bacterianas de Z. coli
selecionadas podem ser cultivadas em elevadas densidades em
meio liquido sem perda na capacidade de expressar
5 diferentes CFAs incluindo CFA/I, CFA/II, e CFA/IV, e então
tratadas com meios que seguramente exterminam os organismos
sem destruir os CFAs.
Estes procedimentos permitem que
estes organismos de E. coli inativados sejam usados como
vacinas orais, não vivas, seguras, contra infecção
10 entérica/diarréia provocada por bactérias de
E. coli
enterotoxigênicas em humanos. Os procedimentos para obter
estes componentes de vacinas bacterianas e os processos
usados para documentar sua utilidade como imunogenes das
mucosas intestinais incluem os seguintes:
15
1. Processo para obter uma expressão de alto nível dos
tipos diferentes desejados de CFAs (CFA/1, CFA/II e CFA/IV)
em organismos de E. coli durante o crescimento em meio
liquido, em vez de como previamente descrito somente em
placas de agar ou outro meio sólido.
20 2. Adaptação com sucesso deste processo para expressão de
alto nível destes CFAs em E. coli cultivado em meio liquido
em um fermentador.
3. Procedimento para inativar os organismos
E. coli
selecionados com a ajuda de formalina com conservação quase
25 completa da reatividade imunológica com anticorpos
específicos e a atividade hemaglutinante dos diferentes
CFAs.
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4. Testes mostrando que a imunização de coelhos com os
organismos E. coli tratados com formalina, cultivados em
liquido, dá lugar a títulos igualmente elevados de
anticorpos específicos contra os diferentes CFAs, como
5 ocorre com a imunização com correspondente
bactéria
cultivada em agar viva.
5. Testes demonstrando que os CFAs nos organismos de vacina
tratados com formalina tem maior estabilidade do que CFAs
em bactérias vivas não tratadas quando os organismos são
10 submetidos a incubação no referido tampão ácido ou suco
gastrointestinal humano. 6. Estudos demonstrando que
organismos E. coli CFA-E inativados com formalina,
cultivados em liquido, pode ser administrados sem efeitos
laterais significantes para voluntários humanos como uma
15 vacina oral e que a administração de duas ou trás doses
desta vacina estimula a formação de anticorpos IgA no
fluido de lavagem intestinal, assim como o aparecimento de
células secretando anticorpos específicos na circulação
contra os CFAs da vacina.
20 EXEMPLOS
Um grande número de cepas ETEC expressando
CFA/I, CFA/II (incluindo cepas expressando CS1, C52 ou CS3
sozinhas, CS1+CS3 ou CS2 + CS3) ou CFA/rV (cepas
expressando CS4+CS6 ou CS5+CS6) foram testadas. Estas cepas
25 compreendiam isolados clínicos obtidos de diferentes partes
do mundo, assim como cepas manipuladas em laboratórios e
cepas incluídas representando diferentes padrões de
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produção de enterotoxina (LT+ST, LT ou ST sozinho, e
derivados negativos da toxina). Como os procedimentos
descritos nos exemplos subsequentes 1-5, na extensão
testada, foram verificados como válidos para diferentes
5 cepas de diferentes tipos de CFA ou subtipos e perfis de
enterotoxina, as experiências e resultados descritos nos
exemplos serão limitados aos resultados representativos
como obtidos com algumas cepas selecionadas.
Exemplo 1. Expressão de CFAs em organismos E. coli após
10
crescimento em meio liquido em cultura de agitacão ou
fermentador
Os procedimentos previamente usados para
expressar
CFAs
em
E. coli foram sempre baseados em
crescimento de organismos em superfícies sólidas,
15 geralmente em assim denominadas placas de agar
CFA [7],
porque se sabe que o crescimento em meio liquido geralmente
suprimiu a expressão de
CFAs
enquanto facilitando a
expressão de fimbrias de tipo 1 (comum) nas bactérias de E
coli. Para facilitar a produção em larga escala de uma
20 vacina ETEC, os requerentes desenvolveram procedimentos que
iriam permitir a expressão em alto nível de diferentes CFAs
sobre a superfície de
E. coli também sob condições de
crescimento em meio liquido (em culturas agitadas em
frascos ou em um fermentador).
25
Após ter testado sem sucesso vários diferentes
meios líquidos bacteriológicos comumente usados e condições
de cultura, os requerentes chegaram ao seguinte
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procedimento para obter e documentar os níveis requeridos
de expressão de CFAs em inicialmente cada uma das cepas de
modelo
(CFA/I),
S131.102 e SBL103 (ambos
CFA/II),
após
crescimento em um meio liquido. Então, com uma leve
5 modificação na composição de meio para expressão de CS5, os
requerentes também obtiveram uma boa expressão de CFA/IV em
outras cepas. A partir dos lotes de sementes congelados das
diferentes cepas (mantidas em glicerol a -70°C), os raspados
do laço de platina foram inoculados em placas agar CFA, que
10 foram inoculadas a 37°C durante a noite. As colônias sobre
as placas foram controladas para expressão do
CFA
apropriado por diretos testes de aglutinação com anticorpos
monoclonais específicos contra CFA/I, CS1, CS2, CS3, C34,
CS5 e CS6. Estes anticorpos monoclonais foram preparados no
15 laboratório dos requerentes. As bactérias nas placas de
agar CFA foram então colhidas solução salina tamponada com
fosfato (PBS) e 5-10x10 9 organismos desta suspensão foram
adicionados como inóculo em 400 ml de meio liquido.
A
composição deste meio CFA foi: ácidos casamino 1% (p/v),
20 extrato de levedura (p/v), MgSO 4 0,4 mM, MnCl 2 0,04 mM, água
desionizada, pH 7,4. Os frascos foram incubados com
agitação, 150 rev/min, durante cerca de 20 h, a 37°C,
quando então a densidade ótica para uma diluição 1:10 da
suspensão foi cerca de 0,25-0,5. As bactérias foram
25 colhidas por centrifugação a +4°C, a pelota bacteriana foi
lavada uma vez com PBS e as bactérias novamente
sedimentadas por centrifugação e re-colocadas em suspensão
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em PBS para dar uma suspensão que, em diluição 1:10, tinha
unta densidade ótica de 0,285. Esta suspensão, e para
comparação suspensões de bactérias colhidas de culturas
paralelas das cepas em placas de agar CFA ajustadas na
5 mesma densidade ótica, foram testadas em diluições em série
para expressão do CFA apropriado. Tanto a aglutinação
direta com anticorpo anti-CFA monoclonal como ELISA de
inibição de CFA quantitativa desenvolvidos no laboratório
dos requerentes foram usados para estas análises.
10
Os resultados são resumidos na tabela 2. Eles
demonstram que as suspensões obtidas após crescimentos dos
organismos em frascos no meio liquido tinham expressão
comparável de CFAs (quando ajustadas para a mesma
concentração bacteriana) como bactérias cultivadas em
15 placas de agar CFA.
Os plasmideos em cepas SBL102 e SBL103
codificando para as diferentes proteínas CFA/II CS também
codificaram para resistência bacteriana contra amplicilina
e canamicina. Assim, culturas paralelas foram realizadas
20 destas cepas em meio liquido e em agar suplementado com
estes antibióticos. Apesar dos valores na tabela 2 serem os
obtidos na ausência de antibióticos, os obtidos na presença
de antibióticos foram praticamente idênticos (não
mostrados). Do mesmo modo, as condições de crescimento no
25 meio liquido, que foram usadas para a experiência descrita
na tabela 2 provaram ser igualmente satisfatórias com
relação ao crescimento em placas agar de CFA para expressão
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de CFA/I, CFA/II, e CFA/IV cada uma das subproteínas CS4,
CS5 e CS6) a partir de várias outras cepas testadas; para
expressão ótima de CS5, tanto o agar CFA usado para a précultura como o meio CFA liquido foram suplementados com
5
sais de biles 0,15% Bacto 1,5 g/1 (Difco).
Em experiências subsequentes, este procedimento
para expressão em alto nível de CFAs e ETEC em culturas
liquidas foi adaptado para crescimento em meio liquido em
um fermentador. O seguinte procedimento, exemplificado
10 abaixo para cepa
CFA/I,
mas encontrado
ser
igualmente
utilizável para outras cepas produzindo CFA/II ou CFA/IV,
foi verificado como resultando em expressão similar de CFA
por número de bactérias, como cultivadas de agar CFA ou em
culturas de agitação.
As placas de agar CFA foram inoculadas com cepa
15
SBL101
(CFA/I)
e cultivadas a 37°C durante a noite; as
bactérias em lote de sementes congeladas foram usadas como
inoculo. As bactérias foram colhidas das placas de agar CFA
com solução salina fisiológica e 5 x 10' das bactérias
20 foram adicionados como inoculo em 4 litros de meio CFA• uma
cultura de agitação em fase log das bactérias em meio CFA
poderia ser também usada como inoculo. As bactérias estavam
então em um fermentador Bio-flo III (New Brunswick
Scientific Co., Edison,
25
NJ, USA),
cultivadas a 37°C com
agitação vigorosa (800 rev/min), sem ajuste de pH. Já 4-5
h após o inicio da cultura do fermentador, a densidade
ótica da cultura foi de 4-5, isto é, uma diluição 1:10 da
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de
agitação
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cultura
As amostras
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coletadas
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fermentador em
início da cultura - e para
bactérias
frascos)
preparadas
de
do
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mesmo
uma
bacteriano - foram testados para expressão de CFA/1 após
ajuste
da
mesma
concentração
bacteriana,
isto
é,
1010
bactérias por ml. Como mostrado na tabela 3, a expressão de
10 CFA/1 (por número de bactérias) foi ótima já após 4-5 h de
cultura no fermentador e comparável à expressão CFA/1
vista na bactéria cultivada em culturas de agitação em
frascos durante 20 horas.
Exemplo 2. Procedimentos para inativacão de formalina de
15
bactérias E.coli com conservacão de imuno-reatividade de
CFA assim como atividade hemanlutinante
Diferentes processos de inativação física e
química incluindo tratamento com formalina sob diferentes
condições foram testados com resultados insatisfatórios,
20 antes de um procedimento apropriado descrito neste exemplo
ser obtido. Este procedimento, que inclui tratamento com
formalina suave em diferentes temperaturas durante vários
dias, atendeu ao critério de resultar em completo
extermínio de organismos de vacina de E. coli putativos sem
25 provocar perda significante em seu teor em antígeno CFA ou
qualidade. Este foi testado por determinação das
quantidades de diferentes CFAs em bactérias antes e após o
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21
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tratamento com formalina, usando um ELISA de inibição de
CFA quantitativo com base em anticorpos monoclonais contra
os diferentes componentes CFAs/CS como descrito no exemplo
1. Este processo permite determinações precisas de CFAs em
5 superfícies bacterianas. As exigências do ajuste incluíam
que a preparação bacteriana, após extermínio, tinha retido
pelo menos um terço do teor em antígeno CFA, como comparado
com os organismos de partida vivos, e também tinham retido
atividade hemaglutinante detectável, em suporte da
10 antigenicidade CFA retida.
O seguinte exemplo descreve o procedimento e
sua utilidade em outros detalhes. As bactérias expressando
ambos os antígenos CFA/I ou CFA/II/CS foram cultivadas em
meio liquido e colocadas em suspensão em PBS usando os
15 mesmos procedimentos como descrito no exemplo 1. A seguir,
formalina (HCRO) foi adicionada à suspensão sob leve
agitação da suspensão bacteriana para uma concentração
final de 0,2 M formaldeido. A suspensão foi então incubada
sob agitação continua a 37°C durante cerca de 2 h, após o
20 que foi transferida para uma sala fria e mantida a 4°C
durante mais 24-48 h. Após incubação completa com
formalina, as sub-amostras foram removidas e testadas pela
falta de organismos viáveis tanto no caldo como nas placas
agar; as placas agar e os frascos de caldo foram
25 inspecionados diariamente durante 14 dias. O procedimento
resultou consistentemente em extermínio completo de todos
os organismos de E. coli testados.
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Após completar o tratamento com formalina
no frio, as suspensões bacterianas foram analisadas para o
teor em CFA por meios do estudo da atividade hemaglutinante
das amostras respectivas [7] e para capacidade de inibir
5 ligação de anticorpos monoclonais correspondentes em ELISA
de CFA como descrito [9]. Uma cultura preparada
recentemente, não tratada, da cepa respectiva, ajustou à
mesma concentração bacteriana como os organismos tratados
com formalina, foi incluída em cada experiência para
10 comparação. Como mostrado na tabela 4, as preparações
tratadas com formalina tinham retido a capacidade
hemaglutinante e tinham pelo menos 50% retido a
antigenicidade de CFA, como avaliado nos testes de inibição
ELISA CFA respectivos. Estes resultados demonstram que as
15 bactérias tratadas com formalina inibiram a ligação dos
anticorpos monoclonais correspondentes para CFA purificado
ligado em fase sólida em 50% em concentrações
correspondendo a 50-100% das bactérias não tratadas, foram
verificados em várias experiências consecutivas.
20
Exemplo
3
Comparacão
de
estabilidade
à
armazenaaemtincubacão de CFAs em organismos ETEC
formalinizados e não tratados (vivos)
Os estudos de outros laboratórios demonstraram
que fimbrias de CFA não tratadas, isoladas, eram muito
25 sensíveis ao ácido gástrico [4,5]. A neutralização anterior
a ácido gástrico para pia neutro não pareceu evitar seu
efeito adverso sobre a antigenicidade de CFA da proteína
9205677
23
fimbrial [4]. Contra esta base, os requerentes compararam
a antigenicidade de CFAs como expressados em bactérias de
E. coli não tratadas e em E. coli tratado com formalina
correspondente após incubação no suco gastrointestinal
5 ácido e fluido jejunal, respectivamente. As amostras também
foram incubadas em PBS ajustado a diferentes pHs.
Em experiências iniciais, diferentes suspensões
bacterianas tratadas com formalina e não tratadas foram
incubadas em diferentes pHs, de pH 3 a pH 11, durante 30
10 min, a 37°C, antes do reajuste a pH neutro. Em nenhum caso
a incubação nestes pHs afetou a antigenicidade do CFA de
preparações exterminadas não tratadas ou tratadas com
formalina. Em experiências subsequentes, a incubação de
bactérias vivas e inativadas com formalina em tampão a pH
15 2, em suco gastrointestinal ácido e em fluido jejunal foi
comparada. O suco gastrointestinal e fluidos jejunais foram
coletados de suecos adultos no Sahlgrenska Hospital em
Goteborg. Como mostrado na tabela 5, as bactérias tratadas
com formalina foram somente afetadas marginalmente, ou não
20 afetadas de todo por incubação em tampão a pH2 ou em suco
gastrointestinal ácido e nenhuma diminuição na
antigenicidade de CFA foi observada após incubação em suco
jejunal. A antigenicidade de CFA de bactérias vivas não
tratadas, por outro lado, foi, na maior parte dos casos,
25 marcadamente reduzida tanto após incubação em tampão a pia,
como em suco gastrointestinal ácido. Estas análises indicam
que o tratamento com formalina protege as fimbrias de CFA
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da degradação em suco gástrico.
Exemplo 4 - Comparacão de propriedades imunocrénicas de CFAs
em ETEC formalinizado e não tratado (vivo)
A capacidade de bactérias de E. coli positivas
5 para CFA formalinizadas e não tratadas (vivas) para induzir
respostas de anticorpos anti-CFA foi comparada. Coelhos
brancos da Nova Zelândia, adultos, pesando 2-3 kg no inicio
da imunização, receberam injeções sub-cutâneas com doses
correspondentes (bactérias 5x10 8-2x10 9 ) de bactérias vivas
10 formalinizadas ou não tratadas; as injeções iniciais foram
dadas em adjuvante completo de Freund, as segundas injeções
em adjuvante incompleto e subsequentes imunizações sem
adjuvante. As bactérias formalinizadas foram preparadas no
inicio da imunização e_foram armazenadas a +4°C até usadas;
15 as bactérias vivas foram recentemente preparadas no dia de
cada imunização. As bactérias formalinizadas tinham sido
cultivadas em meio CFA e bactérias vivas não tratadas em
agar CFA; ambas as bactérias vivas formalinizadas ou não
tratadas foram lavadas duas vezes em PBS antes da
20 imunização.
Os animais foram sangrados imediatamente antes
do inicio da imunização e então 7-10 dias após a última
injeção. Os soros foram preparados e congelados em porções
a -30°C até serem analisados. As respostas de anticorpos
25 especificas contra o CFA da cepa imunizante foram
determinadas usando diferentes processos ELISA. As placas
de microtitulação ELISA foram revestidas com CFAs
•
9 205677
25
purificados, isto é CFA/I, CFA/II
(CS1+C53), CS2, CS4 ou
CS5, dissolvidos em PBS em uma concentração final de 1-5
µg/ml, por incubação das placas com a solução de CFA a 37°C
durante a noite. Diluições em série de cinco vezes de soros
5 foram então tituladas nas placas como previamente descrito
[2,3]. Os títulos foram determinados como a recíproca da
diluição intrapolada dando uma absorbáncia de 0,3 acima da
base, quando reagindo a enzima com seu substrato durante 20
min.
10
Nenhuma das sangrias de pré-imunização tinham
níveis de anticorpos CFA significantes, isto é, títulos CFA
excedendo 50. Após completa imunização, por outro lado,
todos os soros tinham títulos de anticorpos contra o
homólogo variando entre 25.000 e 300.000 (tabela 6).
CFA
A
15 imunização com bactérias formalinizadas induziram títulos
muito similares contra o CFA homólogo, como organismos não
tratados correspondentes (tabela 6).
Exemplo 5 - Testes de ETEC formalinizado Para secturanca e
capacidade de estimular formacão de anticorpos
20
IqA
específicos em intestino humano
Uma preparação da vacina ETEC consistindo de
bactérias exterminadas com formalina, expressando
CFA/I,
CS1, CS2 e CS3 (isto é, as cepas SBL 101, SBL 102 e SBL 103
apresentadas na tabela 1) foi preparada pelo National
25 Bacteriological Laboratory na Suécia para tentativas
clinicas em pequena escala. Este componente de vacina foi
dado junto com sub-unidade B de cólera (CTB [1]). Um estudo
9205677
26
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foi conduzido em voluntários suecos adultos para testar
esta vacina CEA-ETEC-CTB combinada para segurança e
imunogenicidade localmente no intestino. As respostas de
anticorpos em soro, assim como a produção de anticorpos
5 específicos por linfócitos de sangue periférico também
foram avaliadas.
Cada um dos voluntários recebeu três
imunizações orais com organismos E. coli exterminados 10 11
e1mgdCTBintervalosduemna.Avcifo
10 dada em 150 ml de solução de bicarbonato tamponadas, usando
os mesmos comprimidos de bicarbonato-citrato CACO,
Stockholm, Suécia), com para a vacina contra cólera oral na
tentativa em campo em Bangladesh [1]. As amostras
intestinais e soro foram coletados imediatamente antes e
15 então 9 dias depois da segunda e terceira imunizações, os
linfócitos de sangue periférico foram obtidos no dia da
imunização inicial e então 7 dias após a primeira, segunda
e terceira imunizações.
As
respostas de anticorpos IgA intestinais
20 contra os mais importantes antígenos protetores foram
examinadas em fluido de lavagem intestinal como previamente
descrito [2]. As lavagens intestinais foram realizadas
deixando os voluntários beber uma solução de sal isotónica
(geralmente 3-5 litros) até ocorrer uma diarréia semelhante
25 a água. As fezes liquidas que foram coletadas foram
filtradas através de gaze, tratadas com várias inativadores
de enzimas, centrifugadas e concentradas por secagem por
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congelamento. Em estudos anteriores, os requerentes
demonstraram que o fluido de lavagem intestinal é uma fonte
rica de anticorpos IgA secretários, produzidos localmente,
contra antígeno aplicado intestinalmente; anticorpos IgA
5 secretários sintetizados localmente no intestino são
provavelmente de primordial importância para imunidade
protetora contra diarréia ETEC. Os imunócitos estimulados
localmente no intestino, por exemplo, por uma vacina oral,
geralmente migram via a linfa para o sangue e então
10 retornam para o intestino onde eles maturam em células de
plasma secretando principalmente IgA. Ao coletar linfácitos
de sangue periférico em um tempo definido logo após a
vacinação oral - otimamente no dia 7 [10] - estas células
secretárias de anticorpos intestinais (ASCs) podem ser
15 obtidas e analisadas para produção de anticorpos
específicos contra os antígenos usados para estimulação.
Finalmente, em um menor grau, os anticorpos de
particularmente
classe
IgA podem também refletir estas
respostas imunes intestinais.
20
26 voluntários receberam três doses da vacina.
Em nenhum caso ocorreram quaisquer reações locais ou
sistêmicas adversas que poderiam ser associadas com a
imunização notada. Os fluidos de lavagem intestinal que
foram coletados de 11 dos vacinados foram examinados para
25 anticorpos contra CTB/LT, CFA/I, CFA/II e 0-antígeno de uma
das cepas imunizantes [2]. Os títulos IgA ELISA específicos
divididos pelo teor em IgA total de cada amostra foram
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determinados. Como mostrado na tabela 7, respostas de
anticorpos IgA significantes foram observadas contra CFA/I,
e CFA/II, assim também como contra CTB na maior parte das
vacinas. A frequência de respostas em intestino foi
5 comparável à previamente observada em Bangladeshianos
convalescentes da infecção com E. coli CFA positivo. As
grandezas das respostas de anticorpos contra CFA/I e CFA/II
foram comparáveis (figura 1) com as previamente vistas em
Bangladeshianos convalescentes da doença ETEC. Os
10 voluntários também responderam com marcas respostas de
anticorpos IgA intestinais para o componente CTB da vacina
(figura 1) e estas respostas foram maiores do que as
respostas anti-LT observadas após doenças a ETEC clinica.
Estes resultados mostram que a vacina contra
15 ETEC foi capaz de induzir respostas de anticorpos CFA
substanciais localmente no intestino, estas respostas foram
previamente difíceis de induzir em humanos por imunização
oral com fimbrias isoladas [4,5]. A imunização também
resultou na aparência de ASCs específicos no sangue como
20 determinado por um ensaio ELISPOT [10] contra CFA/I, CFA/II
e LT/CTB na maior parte das vacinas (tabela 7). Números
elevados de ASCs anti-CFA foram notados já após uma única
dose da vacina.
As
respostas de células produzindo
anticorpos CFA foram somente um pouco maiores após a
25 segunda e terceira doses do que após a imunização inicial,
enquanto que números ótimos de células produzindo anti-LT
foram verificados após a segunda imunização. Os anticorpos
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anti-CFA foram predominantemente da classe IgA, mas alguns
ASCs produzindo IgM foram também verificados; ASCs anti-CTB
foram predominantemente do isotipo IgA, mas algumas células
produzindo IgG também foram identificadas. A vacina também
5 deu lugar a respostas de anticorpos de soro significantes
contra CFAs, assim como CTB/Lt na maior parte dos
voluntários (tabela 7).
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10
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TABELA 1. Propriedades de Cepas E. coli usadas nos exemplos citados
Designação
da Cepa
SBLIO2
SBL103
Fonte
Tipo
CFA
Padrão Sorotipo
toxina
CFA/I
ST* ,LT- 078:1112
Strain 325542,
GAteborg,
Sveden
CFA/II
(C8I)
ST- ,LT- 0139:H28
60R936,
M McConnell,
Collndala, UB
CFA/II
(C82+CS3) Se,LT - 06:11I6
58R61
Ibld
▪
N
o
o
ut
Tabela 2. Expressão de CFAs em bactérias E. coli após
crescimento em meio CFA liquido em comparação
com crescimento em placas Agar CFA.
Titulo CFA espec. a) com
anticorpos monoclonais
Cepa
Condição
(tipo CFA) crescimento
SBL101
(CFA/I)
SBL102
(CFA/II;
CS1)
Aglutinação
Inibição
ELISA
Liquido
1/32
1/40
Agar
1/32
1/50
Liquido
1/32
1/200
• D•D ••
Agar
1/32
1/200
• • •
•
.••• •
•...
SBL103
(CFA/II;
CS2+CS3)
Liquido
1/16°)
1/200)
Agar
1/16
1/230
••. . •
•• •• ••
••••
a) Após ajuste todas as culturas a 10 10 bactérias/mi
o) Como ensaiado com MAb anti-CS2
••• • •e
••
U,
tO
N
Vi
O
tn
O
Tabela 3. Expressão de CFAs em cepas bactérias E. coli SBL101
(CFA/I) após crescimento em meio liquido e em um agitador,
respectivamente.
Tempo de cultura
(horas)
2
3
4
5
7
9
20
Titulo CFA especificou)
Cultura Fermentacior
Cultura c/agitação
1/80
1/160
1/200
1/250
1/250
1/250
1/250
N.T.
1/80
N.T.
N.T.
1/250
N.T.
1/250
w
s.
a) Após ajuste de culturas bacterianas a 10 10 organismos/mi
e usando o processo ELISA de inibição de CFA/I (9).
•
•
14
•
CIO
•
•
o
o
VI
Tabela 4. Conservação dos imunos reatividade e atividade hemaglutinante
de CFAs em bactérias E. Coli tratadas com formalina como
comparadas com não tratadas (vivas)
Cepa
(Tipo CFA/CS)
- a)
Preparação
Titulo CFAb%
especifico
881.101
(CFA/I)
F
1.
1/81
1/91
58L102
(C81)
F
L
1/243
1/243
Atividade c)
Hemagl.
4
Cal
581.103
(CS2+CS3)
F
1.
1/81
1/81
1/54
1/81
•
•• •
• ••
• •
a) F = bactérias inativas com formalina;
L = bactérias vivas, não tratadas.
b) Como testado por ELISA de inibição de CFA com diluições em série, 3X, de
suspensões bacterianas com 10 1 u bactérias/mi, os títulos dados são
a última diluição provocando 550% inibição da reação obtida na
ausência de bactérias.
c) Testado por mistura 50 ml de suspensões bacterianas não diluídas
com 1% eritracitos humanos na presença de 1% p/v de D-mannose.
• en e
• e e
I
•
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111
•11
•
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•
.
•
••••
•
q,
IND
ha
H
Lr'
o
01
o
Tabela 5. Estabilidade de CFAs tratado em formalina quando comparado com bactéria E.coli
não tratada (viva) após a incubação em secreções gastrointestinais de seres
humanos e em pH ácido.
881.101
a)
Encubado em
58L103
1.41)
titulo CFA especifico /2
antleCrA/I
PDS, pN7.2
PDS. pN2
Suco gastrointestinal ácido
Fluído jejunal
1/100
1/200
(% antigenicida de CFA retida c )
anta-CS7
anil-Cs2
1/150
1/250
1/25
1/80
1 /75 ( 751 )
1 00 ( 101 )
1/100 (70%)
1/9 (4%)
1/15 ( 101 )
1/8 (10%)
1/50 (50%)
1/40 (20%)
1/125 (85%)
1/27 (12%)
1/25 (100%)
1/8 (10%)
1/100 (100%)
1/200 (100%)
1/150 (100%)
1/250 (100%) 1/25 (100%)
1/25 (152):
a) F = inativado em formalina; L = bactérias não tratadas, vivas
b) Como testado em ELISA inibição CFA, usando apropriados MAbs anti CFA ou
anti CS (ver Tabela 3)
c) Em comparação com incubação em PBS, pH 7,2.
•
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• ..
• .•
•• ••••
••••
•
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• •••
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•••• ••
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O
ca
Ch
N
ut
o
ri
tn
o
vi
Tabela 6. Respostas anti-corpo CFA contra E. Coli CFA positivas tratadas com formalina
e nao tratadas (vivas).
Imunização
Cepa (Fatores CFA/CS)
(eram
Anti-corpo
contra
Titulo ELISA
Bactérias
Bactérias
Formalinizadas
não-tratadas
cru!
11.000 142.000-53.000)
"102 (CS1)
CS1
47.000 09.000-100.000s
$51.103 (C32*C53)
CS2
24.000 122.000-511.0001
SSL101
247425 (CS1+C33)
CS145CS3
50.000 (30.000-100.000)
%.1
250.000
270.000 (150.000 - 300.000)
C110111C (CS44c54)
CS4
40.000
30.000
50.000 (30.000 - 70.000)
E1701$A (CS5oCSi)
CS5
25.000
25.000
40.000 (20.000 - 70.000)
G
90
a Coelhos receberam 3-5 imunizações subcutâneas com 5x10 8 - 2x10 9
bactérias em cada.
•••• ••
Um
hà
o
r
r
o
o
tn
Tabela 7. Freguancia de respostas anti-corpos IgA significante
em lavagem intestinal, em linfócitos no sangue
periférico e em soro após imunização com 3 doses orais
da vacina ETEC protótipo.
Respostas anticorpo IgA para:
intestina)
Sangue
ABC
Soro
CFA/I
9/11 (82%)
16/19 (79%)
8/12 (75%)
CFA/II
8/11 (73%)
16/19 (84%)
6/12 (50%)
CTB/LT
9/11 (82%)
19/19 (89%)
11/12 (92%)
to
co
• •••••
• .•
9205677
CO
• •
•
•
••• ••
•• •••• •• •••• •••••
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• • • •
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•
••
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•
00
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•
• • • •
E • • ••• •••
•
•
• •
• • • • 11/ • •
IDO
1
pEIVINDICACOES
1. Processo de produção de uma composição de
vacina contra infecção entérica provocada por bactérias de
E. coli enterotoxigênicas em humanos,
caracterizado pelo
5 fato de que pelo menos uma cepa de E. coli selecionada
dentre cepas conhecidas diferentes, cada tendo a capacidade
de expressar um certo tipo de antígenos de fator de
colonização, é cultivada sob condições apropriadas em um
meio de cultura liquido permitindo expressão em alto nível
10 de referido certo tipo de antígenos de fator de colonização
na superfície das bactérias
E. coli, para uma densidade
predeterminada, seguido por colheita e re-colocação em
suspensão da cultura bacteriana em solução salina, quando
então formalina é adicionada à suspensão sob leve agitação
15 a uma concentração final de formaldeido 0,2 M, seguido por
incubação sob agitação continua a 37°C durante
aproximadamente 2 h, seguido por incubação a 4°C durante 2448 h, resultando em uma cepa de E. coli exterminada por
formalina tendo propriedades hemaglutinantes e antigênicas
20 substancialmente preservadas de referido certo tipo
de
antígenos de fator de colonização, quando então as
referidas bactérias de E. coli exterminadas com formalina
são misturadas com um excipiente farmaceuticamente
9205677
uni
• ••
•
2
•••
•• • •• •••• ••••
• ••••
•
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•
• ••••
•• •••
• •• •••••••
• • •
••
•••
• • • • ••• •••• •
•••••••
•
IND
aceitável e/ou diluente em uma concentração apropriada.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1,
caracterizado pelo fato de que referido meio de cultura
liquido compreende 1% (p/v) de ácidos casaminos, 0,15%
5 (p/v) de extrato de levedura, 0,4 mM MgSO 4 , 0,04 mM MnCl 2 ,
e água desionizada a pA 7,4, e o cultivo é conduzido com
agitação vigorosa ou outros meios para obter aeração
extensiva em aproximadamente 37°C durante pelo menos 4-6 h
antes da colheita das bactérias ser efetuada por
10 centrifugação ou filtragem ou outros meios.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1,
caracterizado pelo fato de que referidas cepas expressando
certos tipos de antígenos de fator de colonização são
selecionadas dentre antígenos de fator de colonização do
15 intestino humano CFA/I, CFA/II (CS1, CS2, CS3, e CFA/IV
(CS4, CS5, CS6).
4. Processo de acordo com a reivindicação 1,
caracterizado pelo fato de que se adiciona adicionalmente
um tampão neutralizante ácido e opcionalmente componentes
20 antigênicos adicionais induzindo imunidade contra, por
exemplo, endotoxinas.
5. Processo para evitar a infecção entérica
provocada por bactérias
humanos,
E. coli enterotoxigênicas em
caracterizado pelo fato de que uma quantidade
25 apropriada de composição de vacina compreendendo, como
componente imunizante, pelo menos uma cepa de
E. coli
inativada selecionada dentre cepas conhecidas diferentes,
••
9205677
••
••
3
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•
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• • •
em em' ame. .."
1..:
cada tendo a capacidade de expressar um certo tipo de
antígenos de fator de colonização e cada tendo propriedades
antigênicas e hemaglutinantes substancialmente preservadas
de referido certo tipo de antígenos de fator de
5 colonização, é administrada a um ser humano para a
prevenção da referida infecção.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5,
caracterizado pelo fato de que a via de administração é
oral.
E
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FIG•1
23
37
DIAS APC6 ntcio DA IMUNIZAÇÃO
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OU 41144 •
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80
1
RESUMO
Patente de Invenção "PROCESSO DE PRODUÇÃO DE
UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA CONTRA INFECÇÃO ENTÉRICA PROVOCADA
POR BACTÉRIAS DE E. COLI ENTEROTOXIGÉNICAS, E, PROCESSO
5 PARA EVITAR A INFECÇÃO ENTÉRICA"
Descreve-se um processo para produzir uma
composição de vacina contra infecção entérica provocada por
bactérias E. coli enterotoxigénicas em humanos. As cepas E.
cola selecionadas dentre diferentes cepas conhecidas, cada
10 tendo a capacidade de expressar um certo tipo de antígenos
de fator de colonização, são cultivadas em um meio de
cultura liquido. Finalmente, cepa E. coli exterminada com
formalina, tendo propriedades antigénicas e hemaglutinantes
substancialmente preservadas dos referidos certos tipos de
15 )antígenos de fator de colonização, é misturada com um
excipiente e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. Ainda
se descreve um processo para evitar uma infecção entérica
provocada por bactérias E. coli enterotoxigénico em
humanos, por meio do que uma composição compreendendo cepa
20 de:E. coli inativada é administrada a um ser humano para a
prevenção da referida infecção.
4'
;
•