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R. Mato Grosso, 306 - 5º andar - Cj. 506
Higienópolis - São Paulo / SP - Cep.: 03142-030
Checklist do Embriologista - PCR
Antes da biópsia:
• Anote todos os dados dos pacientes envolvidos e do ciclo em questão na Folha de Dados e tire
uma cópia para que esta fique em sua clínica.
• No dia anterior, congele bolsas de gelo.
• Encontre um suporte pequeno para tubos de 0,2 ml. Um porta ponteiras limpo e vazio funcionará bem.
• Encontre uma pequena caixa de isopor onde o suporte para tubos descrito acima possa ser
inserido.
• Descreva em um papel o conteúdo desta caixa.
• Contrate um serviço de entrega rápida para que a caixa seja levada até a Genesis Genetics do
Brasil.
• Leia os protocolos. Pratique a transferência de células para os tubos. Ligue se tiver dúvidas.
Se uma célula for lisada durante a biópsia isto pode ser um problema, já que um dos alelos pode
ter se perdido. É necessária a retirada de outra célula. Se você tiver dúvida se a célula enviada para
análise estava intacta ou não, por favor, anote no Relatório da biópsia e rebiopsie o embrião. Marque
os tubos de acordo com as células colocadas ( ex: “célula 1” e “célula 2”).
Se o embrião não estiver no estágio correto de desenvolvimento ao terceiro dia, rediscuta a
conduta da biópsia com o médico responsável. Estes embriões raramente produzem bons resultados
moleculares, provavelmente porque nucleases e lisozimas estão sendo liberadas pelo embrião e o
DNA esta sendo degradado. Nossa preocupação é que o embrião possua um alelo mutante e este
esteja degradado, levando a um falso resultado.
Após a biópsia e antes do envio:
• Inclua o Termo de Consentimento ORIGINAL em um envelope dentro da caixa. O diagnóstico
NÃO SERÁ REALIZADO caso o termo não esteja assinado, SEM EXCEÇÕES.
• Inclua uma CÓPIA do Termo de Consentimento para DPI de sua clínica.
• Inclua a folha de dados da biópsia e deixe uma cópia na sua clínica.
• Inclua, se possível, embriões lisados de casos prévios de DPI para nosso controle de qualidade.
• Siga as direções de armazenamento e envio das amostras. Coloque papel toalha dobrado em
cima do suporte com os tubos, para que fiquem no lugar e sele com fita. Deixe um tempo no freezer
para que a solução de lise congele. Coloque o suporte em uma caixa, certifique-se de que todos os
documentos necessários estão no envelope e adicione pacotes de gelo suficientes para manter o
material congelado.
• Informe-nos por telefone quando enviar a amostra.
Após o envio:
Lembre-se: diferente da análise de cromossomos, onde a contaminação por DNA não é um
grande problema, na análise molecular uma contaminação pode levar a um diagnóstico errado. Por
favor informe na Folha de Dados qualquer suspeita de contaminação. A impressão digital de uma
pessoa contém o equivalente a 8 genomas inteiros da mesma!
Protocolo de biópsia embrionária
Lembre-se: esta técnica deve ser feita em local 100% estéril. As impressões digitais, sua
respiração, fios de cabelo e etc. contém DNA e podem gerar sinais suspeitos que irão confundir a
análise molecular.
1- Usando luvas e trabalhando em local estéril, numere a tampa de cada tubo que irá conter um
blastômero (ex: tubo 1 para blastômero 1, tubo 2 para blastômero 2 ...).
Um conjunto paralelo de tubos deve ser nomeado 1B, 2B...para controle negativo de
cada blastômero.
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2- Use duas cores diferentes de caneta para não fazer confusão entre os tubos “AMOSTRA” e os
tubos “CONTROLE”.
3- Dentro do fluxo, coloque 5ìl da solução tampão de lise no fundo de cada tubo utilizando ponteiras
estéreis.
4- Você precisará de discos com gotas de solução para lavar os blastômeros. Para cada bastômero
extraído, a célula deve ser colocada na gota de solução e aspirada novamente com outra pipeta para
ser colocada dentro do tubo.
5- Durante a biópsia, coloque cuidadosamente cada blastômero imediatamente abaixo
do menisco de cada tubo. Tenha apenas um tubo aberto por vez. Anote nas folhas de protocolo: a)
qualidade embrionária, b) se o núcleo foi observado dentro do blastômero, c) se a célula foi vista
entrando dentro do tubo.
6- Para cada amostra, coloque no tubo “CONTROLE” (ex: tubo 1B) aproximadamente o mesmo
volume de líquido expelido com o blastômero para o tubo “AMOSTRA” (ex: tubo 1). Estes tubos serão
analisados para potencial contaminação por DNA.
7- Tampe os tubos que você acabou de preparar e passe para os próximos. Os tubosjá prontos
podem ficar a temperatura ambiente.
8- Quando todos os embriões tiverem sido biopsiados, certifique-se de que todos os tubos estejam
bem fechados e cheque se a numeração está correta e se os números permanecem visíveis.
9- Coloque o suporte com todos os tubos dentro do congelador, para que a solução tampão de lise
congele.
10- Faça o pacote para o envio das amostras. Inclua o Termo de Consentimento enviado no manual e
o termo de consentimento utilizado em sua clínica. Inclua também a Folha de Dados da biópsia. Tenha
em mente que é necessário que as amostras cheguem congeladas em seu destino.
As empresas aéreas não recomendam o uso de gelo seco, pois este pode interferir no sistema de
troca de oxigênio-CO2.
Certifique-se de que todas as etiquetas foram retiradas da caixa de isopor que será enviada para nós.
Procedimento recomendado para biópsia
Os meios de cultura normalmente usados nos ciclos de FIV contém inibidores da amplificação de
DNA e, portanto, é essencial que se lave os blastômeros antes de colocá-los nos tubos que irão para
análise. As taxas de sucesso de obtenção de resultados claros são maiores se os tubos não
contiverem meio de cultura. A lavagem também reduz a chance de contaminação exógena de DNA,
das células da granulosa, por exemplo.
1
2
3
5
12
Local da gota de biópsia
Gota de lavagem
1- Numere os tubos que serão utilizados para as amostras com o número correspondentes aos
blastômeros analisados (1,2,3...) e os tubos que serão utilizados como controle (1B, 2B, 3B...).
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2- Adicione 5ìl de Solução Tampão de Lise cuidadosamente no fundo de cada um dos tubos e tampe-os.
3- Em uma placa de petri limpa marque com um lápis de diamante ou tungstênio os números dos
embriões onde as gotas de biópsia e de lavagem. Pipete duas colunas de gotas de 5 ìl de Solução de
Lavagem de blastômeros na placa. Não use óleo e não faça as gotas em estação quente pois as gotas
irão evaporar.
4- Biopsie o blastômerodo embrião em estágio de clivagem. Coloque o blastômero no local
demarcado para a gota de biópsia , expelindo todo o volume da pipeta. Se preferir, faça a seqüência
biópsia-lavagemtransferência para o tubo, um embrião por vez. Você pode biopsiar alguns embriões
por vez mas cuidado ao transferir para as gotas de número correto e também para os tubos
corretamente. O ideal é realizar o procedimento em no máximo 5 embriões por vez.
5- Pegue a célula localizada na primeira gota colocada na placa e passe para a gota de lavagem.
Imediatamente pegue a célula com o menor volume possível de líquido (menos de 1ìl) para transferir
ao tubo demarcado corretamente com o mesmo número. Não é necessário trocar de ponteira ou
esperar. Abra a tampa do tubo e coloque a célula no menisco da solução de lise. Feche a tampa. Deixe
aberto apenas um tubo por vez. Após o término, volte à gota de lavagem e pipete aproximadamente o
mesmo volume de líquido, colocando-o no tubo “CONTROLE” numerado corretamente.
6- O tampão dentro do tubo irá lisar a célula. Assim, esteja certo de que este seja completamente
expelido da pipeta antes de ir para a próxima célula.Caso você leve um pouco de solução de lise na
pipeta, existe o risco de esta solução começar a agir enquanto você lava o próximo blastômero. Se
uma célula lisar durante qualquer uma dos passos, troque de ponteira para que não haja
contaminação.