Universidade de Brasília
Instituto de Química
Estudo da Ecologia Química do Percevejo Praga do Arroz
Oebalus poecilus (Dallas, 1851): identificação, síntese e
bioensaios em laboratório do feromônio sexual
Márcio Wandré Morais de Oliveira
Dissertação de Mestrado
Orientador: Prof. Dr. Carlos Kleber Zago de Andrade
Brasília
Julho/2011
Dedico este trabalho à minha
querida esposa Luciana,
companheira de sempre e ao
nosso filho, Marcos Vinícius.
i
AGRADECIMENTOS
À minha família, por ter sido o alicerce de minha vida.
Ao professor Carlos Kleber, pela paciência e pela grande orientação.
À Dra. Maria Carolina, pelos conhecimentos e pelas batalhas travadas
para a realização deste trabalho.
Ao Dr. Miguel Borges e ao Dr. Raul Laumann, pelos conhecimentos sobre
insetos e por mostrarem que conhecimento, caráter e simpatia podem andar
juntos na pesquisa.
Aos amigos de Embrapa, Alex, Helinho, Isabella e Dudu, pela alegria
transmitida dia após dia.
Ao Kadu, pelo companheirismo, inclusive nos momentos de maior
atividade da Lei de Murphy.
À Angélica, pela ajuda nos infravermelhos e nas dúvidas químicas.
À Otilie, pelos espectros de RMN 1H e 13C de 300 MHz.
Aos colegas de LaQMOS, pela companhia sempre saudável no
laboratório.
Ao professor Peter e ao Rafael, pela disponibilidade em ajudar, sempre
que solicitados.
ii
RESUMO
Este trabalho descreve a identificação do feromônio sexual do percevejo
Oebalus poecilus (Dallas, 1851), (Hemiptera: Pentatomidae), bem como os
procedimentos para sua síntese. O percevejo Oebalus poecilus está entre as
principais pragas de arroz no Brasil, tanto em ecossistemas de terras altas
como nos de várzeas, causando grandes prejuízos nessas lavouras. A principal
forma de controle dessa praga tem sido a utilização de inseticidas, que são
conhecidamente prejudiciais à saúde humana e a todas as espécies de animais
e insetos. A busca por alternativas ecologicamente corretas, nos guiou na
tentativa de identificação do feromônio sexual. A análise de extratos obtidos
das aerações de machos e fêmeas mostrou que os machos produziam um
composto específico, que poderia ser o feromônio sexual desta espécie. Este
composto foi identificado como zingiberenol. A síntese dos oito isômeros
possíveis do zingiberenol a partir de (S) e (R)- citronelal foi conduzida. Foram
realizadas três etapas: Adição de Michael seguida de condensação aldólica
intramolecular e posterior metilação com metil lítio. Bioensaios com os
compostos sintetizados indicam que a mistura dos dois isômeros menos
polares vindo do (S) -citronelal é atrativa para as fêmeas dessa espécie.
iii
ABSTRACT
This work describes the identification of sex pheromone of the stinkbug
Oebalus poecilus (Dallas, 1851), (Hemiptera: Pentatomidae), as well as the
procedures for pheromone synthesis. Oebalus poecilus is one of the major
pests of rice throughout Brasil, in both upland and lowland environment,
causing great grain losses. The most common method to control this pest has
been the use of insecticides, which are notoriously harmful to human health and
for all species of animals and insects. The search for environmentally friendly
alternatives, guided us in trying to identify sex pheromone of O. poecilus.
Analysis of extracts obtained from aerations of males and females showed that
males produce a specific compound, which could be the sex pheromone of this
species; this compound was identified as zingiberenol. The synthesis of the
eight possible isomers of the starting zingiberenol from (S) and (R) - citronellal
was conducted. Were performed three steps: Michael’s addition, followed by
intramolecular aldol condensation and subsequent methylation with methyl
lithium. Bioassays with these compounds indicated that the mixture of the two
less polar isomers that come from the (S) -citronellal is attractive to the females.
iv
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO .......................................................................................... 1
1.1.
FORMAS DE CONTROLE DE PRAGAS NO BRASIL ..................... 1
1.1.1.
1.1.2.
Inseticidas............................................................................................. 1
Semioquímicos ..................................................................................... 2
1.2.
FEROMÔNIOS E SÍNTESE ORGÂNICA ......................................... 6
1.3.
ANÁLISES COMPORTAMENTAIS DE INSETOS: BIOENSAIOS. ... 9
1.4.
ARROZ E SUA IMPORTÂNCIA ..................................................... 12
1.5.
OEBALUS POECILUS ................................................................... 13
2.
OBJETIVOS ............................................................................................ 17
2.1.
OBJETIVO GERAL:........................................................................ 17
2.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ......................................................... 17
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 19
3.1.
ESTUDOS DA ECOLOGIA QUÍMICA DO PERCEVEJO OEBALUS
POECILUS. ...................................................................................................... 19
3.1.1.
3.2.
3.2.1.
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
3.3.4.
3.3.5.
3.3.6.
Análise Química dos voláteis dos insetos ....................................... 19
SÍNTESE DE SEMIOQUÍMICOS.................................................... 24
Síntese dos Isômeros do bisabolol................................................... 24
SÍNTESE DO COMPOSTO (7)....................................................... 25
Formação de 2-(4-metilciclohex-3-enil)-propan-1-ol (4) ................... 25
Obtenção do 2-(4-metilciclohex-3-enil)-propanal (5)........................ 29
6-metil-2-(4-metilciclohex-3-enil)-hept-5-en-3-ol (7) ......................... 32
4-(1-bromopropan-2-il)-1-metilciclohex-1-eno (9)............................. 34
2-metil-6-(4-metilciclohex-3-enil)hept-2-en-4-ol (8) ........................ 37
Conclusão ...................................................Erro! Indicador não definido.
3.4.
SÍNTESE DOS ISÔMEROS DO ZINGIBERENOL (1-METIL-4-(6METIL-HEPT-5-EN-2-IL)-CICLOHEX-2-ENOL) ............................................... 39
3.4.1.
3.4.2.
3.4.3.
(3R)-3,7-dimetil-2-(3-oxobutil)oct-6-enal (13) ................................... 39
4-((R)-6-metil-hept-5-en-2-il)ciclohex-2-enona (14).......................... 40
1-metil-4-((R)-6-metil-hept-5-en-2-il)ciclohex-2-enol (15) ................. 43
3.5.
ANÁLISES QUÍMICAS DO ZINGIBERENOL ................................. 49
3.6.
BIOENSAIOS ................................................................................. 52
4.
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ....................................................... 55
5.
PARTE EXPERIMENTAL ....................................................................... 57
5.1.
ESTUDOS DA ECOLOGIA QUÍMICA DO PERCEVEJO OEBALUS
POECILUS. ...................................................................................................... 57
5.1.1.
5.1.2.
5.1.3.
5.2.
5.2.1.
5.3.
5.3.1.
Criação dos insetos ........................................................................... 57
Coletas dos voláteis dos insetos ...................................................... 58
Análises Químicas ............................................................................. 58
SÍNTESE DE SEMIOQUÍMICOS.................................................... 59
Procedimentos Gerais ....................................................................... 59
PROCEDIMENTOS: ....................................................................... 61
disiamilborano (2) .............................................................................. 61
v
5.3.2.
5.3.3.
5.3.4.
5.3.5.
5.3.6.
5.3.7.
5.3.8.
5.3.9.
5.3.10.
5.3.11.
5.4.
5.4.1.
5.4.2.
6.
2-(4-methilciclohex-3-enil)propan-1-ol (4) ......................................... 61
2-(4-metilciclohex-3-enil)-propanal (5) ............................................. 63
metil-(4-metilciclohex-3-enil)-hept-5-en-3 (7) .................................. 64
4-(1-bromopropan-2-il)-1-metilciclohex-1-ene (9) ............................. 65
(3R)-3,7-dimetil-2-(3-oxobutil)oct-6-enal (13) .................................. 66
(R)-6-metilhept-5-en-2-il)-ciclohex-2-enona (14) ............................... 66
zingiberenol a partir do (R)-citronelal (15) ........................................ 67
(3S)-3,7-dimetil-2-(3-oxobutil)oct-6-enal (17) .................................. 69
(S)-6-metilhept-5-en-2-il)-ciclohex-2-enona (18) ............................... 69
zingiberenol a partir do (S)-citronelal (19) ........................................ 70
BIOENSAIOS ................................................................................. 72
Bioensaios com insetos .................................................................... 72
Bioensaios com extratos de machos e compostos sintetizados.... 73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 75
vi
ABREVIATURAS E ACRÔNIMOS
CCD
Cromatografia em camada delgada
CG
Cromatografia Gasosa
CGEM
Cromatografia Gasosa acoplada a espectrômetro de massas
CTF
Catálise por transferência de fase
DEATMS
Dietilamina Trimetilsilano
Et
Etila
HMDS
Hexametildissilazana
IV
Infravermelho
J
Constante de acoplamento
m/z
Relação massa carga
Me
Metila
MVC
Metil vinil cetona
MeLi
Metil Lítio
MIP
Manejo integrado de pragas
MSTFA
N-Metiltrimetilsililtrifluoroacetamida
NBS
N-Bromossucinimida
PCC
Cloro Cromato de Piridínio
p.f.
ponto de fusão
Ph
Fenila
ppm
Partes por milhão
1
RMN H
RMN
13
C
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
TA
Temperatura Ambiente
TEA
Trietilamina
THF
Tetrahidrofurano
TMS
Tetrametilsilano
UV
Ultravioleta
µ.max
Freqüência de absorção máxima
δ
Deslocamento químico
vii
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1.1 - Bombicol ............................................................................................. 3
Fig. 1.2 - Bombical ............................................................................................. 3
Fig. 1.3 - Componentes do feromônio de agregação do bicudo-do algodoeiro. . 5
Fig. 1.4 - Serricornina ......................................................................................... 6
Fig. 1.5- Olfatômetro em Y para bioensaios de dupla escolha. ........................ 10
Fig. 1.6 – Olfatômetro de 4 escolhas................................................................ 10
Fig. 1.7 – Túnel de vento (esquerda) e seu motor (direita) .............................. 11
Fig. 1.8 - Percevejo Oebalus poecilus .............................................................. 13
Fig. 1.9 – Grãos de arroz danificados por O. poecilus- foto de H.F. Prando. ... 15
Fig. 3.1- Perfil cromatográfico gasoso do extrato de machos e fêmeas de O.
poecilus ............................................................................................................ 19
Fig. 3.2 - Espectro de massas do composto (12) dos machos de O. poecilus . 21
Fig. 3.3 - Espectro de massas do alfa bisabolol ............................................... 21
Fig. 3.4 - Espectro de massas da oxidação com PCC do extrato de O. poecilus
......................................................................................................................... 22
Fig. 3.5 – Fração do perfil cromatográfico do extrato de machos O. poecilus
antes (parte inferior) e depois de reação com PCC (parte superior) ................ 22
Fig. 3.6 - Isômeros sugeridos para a síntese inicial ......................................... 24
Fig. 3.7 – CCD do composto (4) e do limoneno (3) .......................................... 26
Fig. 3.8 - Espectro de RMN 1H de (4), p-ment-1-en-9-ol. (CDCl3, 300 MHz). ... 26
Fig. 3.9 - Espectro de RMN 13C de (4), p-ment-1-en-9-ol. (CDCl3, 75 MHz). .... 27
Fig. 3.10 Infravermelho do composto (4), (pastilha de NaCl). .......................... 28
Fig. 3.11 - Espectro de massas de (4) (CG-EM). ............................................. 28
Fig. 3.12 – CCD do composto (5) e do composto (4) ....................................... 29
Fig. 3.13 - Espectro de RMN 1H do composto (5) ........................................... 30
Fig. 3.14 - Espectro de RMN 13C do composto (5) ........................................... 30
Fig. 3.15 - Espectro de massas do composto (5) ............................................. 31
viii
Fig. 3.16 – Infravermelho do composto (5) ....................................................... 31
Fig. 3.17 - Espectro de RMN 1H do composto (7) ............................................ 32
Fig. 3.18 - Espectro de RMN 13C do composto (7) ........................................... 33
Fig. 3.19 - Espectro de massas do composto (7) ............................................. 33
Fig. 3.20 – Espectro de infravermelho da mistura de isômeros de (7) ............. 34
Fig. 3.21 - Espectro de RMN 1H composto (9) ................................................. 35
Fig. 3.22 - Espectro de RMN
13
C do composto (9) .......................................... 36
Fig. 3.23 - Espectro de massas do composto (9) ............................................. 36
Fig. 3.24 - Padrão de fragmentação do zingiberenol e do composto 12. ........ 38
Fig. 3.25 - Espectro de RMN 1H do composto (14) ........................................ 41
Fig. 3.26 - Espectro de RMN 13C do composto (14) ........................................ 42
Fig. 3.27 – Infravermelho do composto (14) ..................................................... 42
Fig. 3.28 – CCD do composto (15) (mistura de isômeros) e (14) ..................... 43
Fig. 3.29 - RMN 1H dos diastereoisômeros (15b) - isômeros mais polares. .... 44
Fig. 3.30 - RMN 13C dos diastereoisômeros (15b) - isômeros mais polares. ... 44
Fig. 3.31 - Espectro de massas do composto (15b) - isômeros mais polares. . 45
Fig. 3.32 Infravermelho de (15b) - isômeros mais polares. .............................. 45
Fig. 3.33 - RMN 1H dos diastereoisômeros (15a) - isômeros menos polares. . 46
Fig. 3.34 - RMN 13C do composto (15a) - isômeros menos polares. ................ 47
Fig. 3.35 - Espectro de massas do composto (15a) - isômeros menos polares.
......................................................................................................................... 47
Fig. 3.36 - Espectro de infravermelho de (15a) - isômeros menos polares. ..... 48
Fig. 3.37– 8 isômeros do zingiberenol divididos em dois grupos de 4 isômeros.
......................................................................................................................... 49
Fig. 3.38 – Perfil cromatográfico do extrato de machos O. poecilus. e dos 4
isômeros do Zingiberenol. ................................................................................ 49
Fig. 3.39 – Padrões de fragmentação do composto (12) dos machos de O.
poecilus e do zingiberenol. ............................................................................... 50
Fig. 3.40 – Extrato de O. poecilus e Zingiberenol silanizados (perfis
cromatográficos)............................................................................................... 50
ix
Fig. 3.41– Dois grupos de diastereoisômeros do zingiberenol ......................... 51
Fig. 3.42 – Bioensaios de fêmeas versus machos/fêmeas. ............................. 52
Fig. 3.43 - Bioensaios de fêmeas versus extratos de machos/hexano............. 52
Fig.
3.44
-
Bioensaios
de
fêmeas
versus
(S)-zingiberenol
menos
polares/hexano ................................................................................................. 53
Fig.
3.45
-
Bioensaios
de
fêmeas
versus
(R)-zingiberenol
menos
polares/hexano. ................................................................................................ 53
x
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1.1 - Rota sintética da mistura de isômeros da Serricornina, principal
componente do feromônio do bicho-do-fumo. .................................................... 7
Esquema 1.2 - Rota sintética para o Grandisol (Grandlure I), um componente
do feromônio do bicudo- do-algodoeiro .............................................................. 8
Esquema 3.1 - Rota sintética para o composto 7 (isômero do bisabolol) ......... 24
Esquema 3.2 - Rota sintética para o composto 8 (isômero do bisabolol) ......... 25
Esquema 3.3 – Oxidação do zingiberenol com PCC........................................ 38
Esquema 3.4 – Rota sintética do Zingiberenol a partir do (R)-citronelal ......... 39
Esquema 3.5 – Rota sintética do Zingiberenol a partir do (S)-citronelal.......... 39
Esquema 3.6 - Rota sintética do (3R)-3,7-dimetil-2-(3-oxobutil)Oct-6-enal .....40
Esquema 3.7- Formação de zingiberenol à partir de (14).................................43
xi
1.
INTRODUÇÃO
O controle de pragas é um dos grandes problemas na agricultura. No
âmbito mundial, alternativas mais ecológicas para o controle e manejo de
pragas vem sendo utilizadas há bastante tempo. No Brasil, o principal método
de controle de pragas ainda é o uso de inseticidas,1 mas o uso de
semioquímicos vem crescendo nos últimos tempos.
1.1. Formas de Controle de pragas no Brasil
1.1.1.Inseticidas
A principal forma de controle de pragas no Brasil é por meio de
inseticidas, que embora seja eficiente, não são específicos, atuando não
somente sobre a praga-alvo, mas sobre toda a fauna. Uma importante
implicação do controle químico é a possibilidade dos insetos praga se tornarem
resistentes aos inseticidas o que favorece a recuperação mais rápida de sua
população, já que a população de inimigos naturais é diminuída. Além disso,
muitos inseticidas possuem efeitos cumulativos, portanto, causarão danos não
apenas no momento de sua aplicação, mas por um longo período.2
Em 1999, no Brasil foram utilizados cerca de 2,5 a 3 milhões de
toneladas de agrotóxicos por ano. Em 2002, o Brasil já era o quarto maior
consumidor de agrotóxicos no mundo,3 em 2008 o país se tornou o maior
consumidor mundial de agrotóxicos e em 2009 consumiu cerca de 1 bilhão de
litros destes produtos.4
Além do alto consumo de agrotóxicos, o Brasil se tornou o principal
destino para a utilização de produtos proibidos em outros comércios.7 Um
exemplo de agrotóxico proibido em países da União Européia e que continua a
1
Agência Nacional de Vigilância Sanitária - Anvisa 2010.
Moreira, J. C.; Jacob, S.C.; Peres, F.; Lima, J. S.; Araujo, A. L. Ciênc. Saúde Coletiva.
2002, 7, 299.
3
Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola – SINDAG 2009.
4
Agência Nacional de Vigilância Sanitária - Anvisa 2009.
2
1
ser utilizado no Brasil é o endossulfam. Não bastasse isso, a importação desse
produto aumentou em mais de 500 mil toneladas de 2008 para 2009.5
Uma alternativa para reduzir o uso de defensivos agrícolas no controle
de pragas é o desenvolvimento de agentes mais específicos e menos
prejudicias ao meio-ambiente, que venham a atingir apenas as espéciesalvo.6,7 Desta forma, a utilização de semioquímicos se mostra como uma
alternativa bastante viável no controle e monitoramento de insetos.
1.1.2.Semioquímicos
Semioquímicos são substâncias emitidas por plantas, animais e outros
organismos, que induzem respostas comportamentais ou fisiológicas nos
indivíduos receptores da mesma ou diferentes espécies.8
Os semioquímicos podem ser divididos em: Aleloquímicos e Feromônios.
•
Aleloquímicos:
São semioquímicos produzidos pelos indivíduos de
uma espécie que modificam o comportamento dos indivíduos de uma
outra espécie, são agentes interespecíficos.
Os Aleloquímicos podem ser divididos em:
•
Alomônios: aleloquímicos onde quem se beneficia é a espécie que
emite.
•
Sinomônios: Aleloquímicos onde as duas espécies são beneficiadas,
tanto o emissor quando o receptor.
5
Agência Nacional de Vigilância Sanitária - Anvisa 2010.
Bras. Ecol.; 1998, 8, 39.
7
Biotecnologia Cência & Desenvolvimento. 2001, 22- setembro/outubro
8
Wood, W. F.; J. Chem. Educ. 1983, 60, 531.
6
2
•
Cairomônios: Aleloquímico onde a espécie receptora é que se
beneficia.
Os feromônios são semioquímicos produzidos pelos indivíduos de uma
espécie e que modificam o comportamento de indivíduos da mesma espécie,
sendo agentes intra-específicos. Os feromônios podem ser classificados
segundo a sua função no comportamento do inseto como: sexual, de alarme,
de agregação, de trilhas, entre outros.10
Dentre os vários tipos de feromônio, os atraentes sexuais têm se
mostrado os mais interessantes para o uso no manejo de pragas, pois atingem
somente a espécie de interesse.
Na ordem Lepidoptera, em geral, a fêmea é que libera o feromônio
sexual para atrair os machos para o acasalamento.9
O primeiro feromônio sexual isolado e identificado
bicho da seda, Bombyx mori (1959).
10
O
composto
foi o da mariposa do
identificado
foi
o
bombicol (Fig. 1.1), e posteriormente foi identificado o bombical (Fig.1.
2), como parte do feromônio sexual deste inseto.
OH
Fig. 1.1 - Bombicol
O
H
Fig. 1.2 - Bombical
No geral, os feromônios são liberados pelos insetos em quantidades da
ordem de nanogramas/dia, o que dificulta a identificação estrutural com os
métodos analíticos existentes. Essa é uma justificativa, para o fato de que
pouco mais de 6000 feromônios sexuais tenham sido identificados,(levando-se
9
Metcalf, R. L.; Mikrochim. Acta. 1998, 129, 167.
Zarbin, P. H. G.; Rodrigues, M. A. C. M.; Lima, E. R. Quim. Nova. 2009, 32, 722.
10
3
em consideração que o número estimado de insetos-praga esteja em torno de
cem mil.11
Os feromônios podem ser utilizados de várias formas no controle de
pragas. Dentre elas, pode-se citar:
•
Monitoramento, que pode auxiliar na determinação do nível de
infestação de uma espécie em determinada área.
•
Coleta massal, onde se utiliza o feromônio sintético em grande
quantidade de armadilhas, para capturar o maior número possível do
inseto-praga, visando à supressão da população, mantedo-a abaixo do
nível de dano econômico.
•
“Atrai e mata”, que consiste basicamente da utilização de dois
componentes: um atrativo (feromônio, atrativo visual ou ambos) e um
controlador do inseto (inseticida de contato, regulador de crescimento,
esterilizador ou um organismo patogênico), capturando e matando o
inseto-alvo.
•
Confusão sexual, por meio da liberação de feromônio sintético na área
que se deseja controlar a praga, com o intuito de atrapalhar o inseto na
localização do parceiro, impedindo ou diminuindo o número de
acasalamentos.
Existem vários casos de usos bem sucedidos de semioquímicos no
Brasil. Dentre eles, podem-se citar os trabalhos realizados nas plantações de
algodão, que sofrem com mais de 30 diferentes pragas da Ordem Coleoptera
e Lepidoptera.12 Os feromônios são utilizados no monitoramento e na
interrupção de acasalamento, com conseqüente diminuição da população da
espécie alvo.
11
http://www.cenedcursos.com.br/manejo-integrado-de-insetos-praga.html - acesso em
02/04/2011.
12
Tamhankar, A. J.; Gahukar, R. T.; Rajendran, T. P. Integrated Pest Manag. Review.
2000, 5, 11.
4
Feromônios de várias pragas do algodão já foram identificados e
mostram-se, efetivos economicamente, nas áreas de cultivo, e não agressivos
ao ambiente.13
No Brasil, o monitoramento do bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus
grandis por meio de armadilhas de feromônio, tem sido usado desde 1983.13 O
feromônio de agregação utilizado - que atrai tanto machos quanto fêmeas consiste de uma mistura de 4 compostos de origem terpênica que são
produzidos somente pelos machos da espécie: 2-((1R)-1-metil-2-(prop-1-en-2il)ciclobutil) etano (grandlure I); (E)-2-(3,3-dimetil-ciclohexilideno) etanol
(grandlure II); (Z)-2-(3,3-dimetilciclohexilideno) acetaldeído (grandlure III) e
(E)-2-(3,3-dimetilciclohexilideno) acetaldeído (grandlure IV),14 Fig.1.3.
OH
HO
Grandlure I
Grandlure II
O
O
Grandlure III
Grandlure IV
Fig. 1.3 - Componentes do feromônio de agregação do bicudo-do algodoeiro.
O primeiro feromônio comercializado no Brasil foi o do bicho-do-fumo,
Lasioderma serricone, que é, inclusive, um dos feromônios mais utilizados no
país nos últimos dez anos.13 Seu principal componente é o (4S,6S,7S)-7hidróxi-4,6-dimetil-3-nonanona (serricornina), Fig.1.4.
13
Bento, J. S. WORKSHOP TECNOLÓGICO SOBRE “PRAGAS DA CANA-DEAÇÚCAR”, 2007, Painel 4 .
14
Mori, K. in The Total Synthesis of Natural Products, ApSimon, J.,Ed.; John Wiley: New
York, 1981; 4, 1.
5
O
OH
Fig. 1.4 - Serricornina
Além do feromônio, é empregado um atraente alimentar, que, adicionado
à armadilha, tem a finalidade de tornar o produto mais eficiente na atração
deste inseto. O feromônio vem sendo utilizado desde 1986 no monitoramento
de L. serricone em armazéns de fumo, nas principais regiões produtoras do
país e em navios usados no transporte do produto exportado.12
1.2. Feromônios e Síntese Orgânica
Os feromônios normalmente são compostos voláteis que pertencem a
diversas
classes
químicas,
tais
como:
ésteres,
alcoóis,
aldeídos,
sesquiterpenos, tendo frequentemente em sua estrutura a presença de um ou
mais centros estereogênicos, além de uma ou mais possibilidades de
configurações (E) ou (Z) (insaturações ou estruturas cíclicas). Do ponto de vista
da Química Orgânica, esses fatores fazem com que as sínteses se tornem,
muitas vezes, bastante complexas, pois devido à especificidade dos insetos em
relação aos seus feromônios, frequentemente há a necessidade de se utilizar
sínteses enantioseletivas para produzir apenas o composto produzido pelo
inseto (sem a presença de outros isômeros) . Essa especificidade é tão grande,
que muitas vezes a presença de outro enantiômero em uma mistura pode ser
suficiente para inibir a atividade biológica do(s) composto(s) feromonal(is) ou
mesmo agir como repelente.15
Em muitos casos, inicialmente, parte-se para a síntese da mistura de
isômeros (feromônio do bicho-do-fumo, por exemplo), Esquema 1.1, para ser
utilizado no campo, mas nem sempre o isômero é bioativo.15
15
Levinson, A; Levinson, H.; Naturwissenschaften 1999, 86, 138.
6
NaBH4/i-PrOH
t-BuOK/Et2O
CN
CN 5 º C (45%)
O
(80%)
O
EtMgBr/Et2O
CN
(84%)
OH
OH
O
_)
mistura de isômeros ( +
Esquema 1.1 - Rota sintética da mistura de isômeros da Serricornina, principal
componente do feromônio do bicho-do-fumo.
Na literatura, há relatos de vários métodos de síntese para se obter os
compostos com suas configurações iguais aos dos feromônios naturais.16
Um exemplo de mistura feromonal em que a presença de algum isômero
interfere na atividade biológica é o feromônio de agregação do bicudo-doalgodoeiro,15 cuja síntese está descrita no Esquema 1.2.
16
http://www.cenedcursos.com.br/manejo-integrado-de-insetos-praga.html - acessado
em 02/04/2011.
7
hv
MeMgI
CH2Cl2 (85%)
Et2O (92%)
H
O
H
O
OH
KMnO4,KH2PO4/H2O
C6H33(n-Bu)3P+Br-/CH2Cl2
HMPA
190-195ºC
94%
(72%)
H
H
OH
CO2H
H
O
H
O
H
( +_ )
Esquema 1.2 - Rota sintética para o Grandisol (Grandlure I), um componente do
feromônio do bicudo- do-algodoeiro
A mistura feromonal é formada por 4 compostos e todos eles têm
configurações que precisam ser “respeitadas” para serem bioativos.17
A síntese de feromônios é uma parte importantíssima na obtenção de
semioquímicos para uso na agricultura. A principal referência, em sínteses de
feromônios é o professor Kenji Mori, cujo nome está relacionado a uma grande
quantidade de compostos feromonais17,18,19,20 proventientes de insetos oriundos
de várias partes do mundo, inclusive do Brasil.
17
Mori, K. Tetrahedron, 1989, 45, 3233.
Borges, M.; Mori, K.; Costa, M. L. M.; Sujii, E. R. J. Appl. Entomol. 1998, 122, 335.
19
Borges, M.; Schmidt, F. G. V.; Sujii, E. R.; Medeiros, M. A.; Mori, K. Zarbin, P. H. G.;
Ferreira,T. B. Physiol. Entomol. 1998, 23, 202.
20
Brézot, P.; Malosse, C.; Mori, K.; Renou, M. J. Chem. Ecol. 1994, 20, 3133.
18
8
No âmbito nacional, existem também, vários nomes relacionados à síntese
de feromônios de insetos. Dentre eles podem-se citar: Dr. Jaswant Mahajan
(prof. aposentado da UnB), Dra. Lúcia Helena Baptistella (Unicamp), uma das
pioneiras na síntese do primeiro feromônio sexual de percevejos no Brasil
(Nezara viridula ), Dr. Paulo Zarbin (UFPR), Arlene Corrêa e Luciane G.
Batista-Pereira (UFSCAR), dentre outros.
O interesse de vários químicos orgânicos na síntese de feromônios
mostra que esta é uma área rica em possibilidades de desenvolvimento de
metodologias na área sintética, além de ser de grande importância para a
agricultura.
1.3. Análises comportamentais de insetos: bioensaios.
A síntese de feromônios é uma etapa muito importante na utilização de
semioquímicos na agricultura. No entanto, apenas por meio de testes em
laboratório com os insetos (bioensaios) e testes de campo (análise da resposta
dos insetos na lavoura) é possível determinar a eficiência dos compostos
sintetizados.
Em laboratório, é bastante comum a utilização de bioensaios com
olfatômetros (em Y, 4 escolhas, túnel de vento, etc.), Fig. 1.5, 1.6 e 1.7, que
são equipamentos que permitem que se possa averiguar a “preferência” dos
insetos por uma ou mais opções (tratamentos e controles).
9
Fig. 1.5- Olfatômetro em Y para bioensaios de dupla escolha.
Fig. 1.6 – Olfatômetro de 4 escolhas
10
Fig. 1.7 – Túnel de vento (esquerda) e seu motor (direita)
Na interpretação dos resultados de bioensaios, frequentemente se faz
necessário o uso de análises estatísticas. Dentre elas, pode-se citar o uso do
teste Qui quadrado: que “é um teste de associação entre variáveis
independentes e cujas observações são discretas”
21
(escala nominal ).“O seu
objetivo é verificar se a distribuição das freqüências observadas se desvia
significativamente das freqüências esperadas”.21
Este tipo de teste é adequado para os experimentos de bioensaios com
duas escolhas, visto que se parte do princípio de que um inseto utilizado no
experimento tem igual chance de ir para qualquer um dos lados do olfatômetro
em Y. Isso permite avaliar se a predominância de escolha por um dos lados
(tratamento ou controle) é significativa ou não (normalmente se usa um
intervalo de confiança de 95%). Dessa forma, é possível saber se há atração
significativa do inseto para o tratamento utilizado.
21
http://pt.scribd.com/doc/19461644/Quiquadrado-Passo-a-Passo,
acessado
em
03/03/11.
11
1.4. Arroz e sua importância
O arroz é um dos principais alimentos consumidos no mundo, sendo um
dos mais importantes em termos de valor econômico.22 As culturas asiáticas
têm este alimento como a base de sua dieta e cerca de 90% de todo o arroz
produzido no mundo é cultivado e consumido na Ásia,
18
no entanto, também é
o principal alimento nos países da América do Sul, que é o segundo centro
consumidor e produtor deste grão.23
Fora do continente asiático, o Brasil é o principal produtor de arroz e no
âmbito mundial, se encontra entre os dez maiores. No Brasil, o arroz tem uma
importância econômica muito grande, estando atrás, em valores financeiros
brutos, apenas da soja, milho, café e cana de açúcar. A maior produção de
arroz no Brasil se encontra na Região Sul, sendo o Rio Grande do Sul o
principal produtor.23
Assim como outras culturas, o arroz enfrenta vários problemas em sua
produção, principalmente devido ao ataque de várias pragas, sendo as
principais: a lagarta Spodoptera frugiperda, os percevejos Tibraca limbativentris
(percevejo do colmo) e Oebalus poecilus (percevejo das panículas). 23
22
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Arroz/ArrozIrrigadoBrasil/ca
p01.htm- acessado em 09/11/2010.
23
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Arroz/ArrozIrrigadoBrasil/ca
p01.htm- acessado em 09/11/2010.
12
1.5. Oebalus poecilus
Não existem muitas informações sobre a ecologia química da maioria
das pragas do arroz, incluindo o percevejo Oebalus poecilus (Dallas, 1851),
(Hemiptera: Pentatomidae), Fig. 1.8. Dessa forma, a pesquisa nessa área se
torna muito importante.
Fig. 1.8 - Percevejo Oebalus poecilus
O percevejo O. poecilus é encontrado em plantações de arroz em todo
o Brasil, tanto em ecossistemas de terras altas como no de várzeas.24 Como os
outros percevejos, esse inseto possui metamorfose incompleta, pois passa
pelas fases de ovo, ninfa e adulto.25
Os percevejos O. poecilus costumam colocar suas posturas nas folhas
das plantas e, quando há grandes populações, as posturas também podem ser
colocadas nos colmos e panículas.20 Os ovos de O. poecilus são de coloração
inicial verde-clara e formato cilíndrico, levemente arredondados na base26 e se
tornam avermelhados pouco antes da emergência da ninfa. Ovos inférteis não
sofrem alteração de cor, permanecendo verde-claro ou verde-amarelado.20, 27,28
24
Costa, E. C.; Link, D. Ver. Fac. Zootec. Vet. Agro. Uruguaiana 1998/99, 5/6, 29.
Squire, F. A.; Agr. J. Brit. Guiana 1934, 4, 245.
26
Costa Lima, A. da. Escola Nacional de Agronomia Série Didática 1940, 3, 351.
27
AmaraL, S. F. do. O Biológico 1949, 15, 97.
25
13
A fase de ovo dura, em média, de 4 a 7 dias, sendo dependente da
temperatura.29 Após a eclosão, o percevejo passa por 4 períodos ninfais
(ínstares) antes de se tornar adulto. Este período dura, em média, 30 dias e
também é variável em função da temperatura.30 Os insetos adquirem
maturidade sexual com cerca de 16,4 dias para machos e 16,1 dias para
fêmeas,22 no entanto já foram visualizados acasalamentos com idades bem
inferiores a estas (cerca de 7 dias) em laboratório.
Tanto a ninfa quanto o adulto (dependendo da densidade populacional)
pode causar grandes prejuízos à cultura do arroz, visto que não só insetos
adultos se alimentam das panículas, mas também as ninfas (do 2º ao 5°
estágio).31 Eles se alimentam das espiguetas e das ramificações primárias e
secundárias da panícula.
A alimentação nas espiguetas de arroz, no início do estágio leitoso,
provoca um desenvolvimento anormal das sementes, resultando em uma
gluma vazia ou em redução do tamanho dos grãos. No estágio pastoso, os
grãos tornam-se manchados e estruturalmente enfraquecidos, podem quebrar
durante o processo de polimento reduzindo a porcentagem de grãos de arroz
inteiros.
25
Grãos atacados e que não quebram durante o processo de
polimento aparecem manchados e assim causam redução na classificação, Fig
1.9.
28
Rossetto, C. J.; Silveira Neto,S.; Link, D.; Grazia-Vieira, J.; Amante, E.; Souza, D.
de; Banzato, N. V.; Oliveira, A. M. Reunião do Comitê de arroz para as Américas FAO, 2, e Contribuições Técnicas da Delegação Brasileira, Brasília: DNPE. 19711972, 149.
29
Baughman, T. W.; Sworen, J. C.; Wagener, K. B. Tetrahedron 2004, 60,10943.
30
Squire, F. A. Agr. J. Brit. Guiana 1934, 4, 245
31
Ferreira, E; Vieira, N. R. A.; Rangel, P. H. N. Anais Embrapa Clima Temperado 1999,
432.
14
Fig. 1.9 – Grãos de arroz danificados por O. poecilus- foto de H.F. Prando.
Grãos originados de espiguetas atacadas têm menor poder germinativo
e menor valor comercial.
25
Além de atuar diretamente nas plantas, o Oebalus
poecilus atua, também, como vetor de fungos como Helminthosporium oryzae,
Nigrospora oryzae, Curvularia lunata, Fusarium spp., Cladosporium spp. e
Penicillium sp. Quatro percevejos por metro quadrado de plantação já são
suficientes para definir o nível de dano econômico na cultura do arroz.25
Em estudos feitos em 10 genótipos de arroz irrigado, as perdas
qualitativas foram superiores às perdas quantitativas.25 Estes prejuízos
quantitativos e, principalmente, qualitativos no arroz, explicam porque o
Oebalus poecilus vem sendo considerado uma das principais pragas desta
cultura.
15
OBJETIVOS
16
2.
OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral:
Estudar a Ecologia química do percevejo Oebalus poecilus.
2.2. Objetivos específicos:
2.2.1 - Identificar e sintetizar o feromônio sexual do percevejo-praga do arroz
Oebalus poecilus
2.2.2 - Identificar os compostos defensivos de machos e fêmeas de Oebalus
poecilus.
2.2.3 - Avaliar a potencialidade do uso do feromônio sexual no monitoramento
e/ou controle da praga no campo, por meio de estudos comportamentais.
17
RESULTADOS E DISCUSSÃO
18
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DISCUSS
3.1. Estudos da Ecologia Química do percevejo Oebalus
poecilus.
3.1.1.Análise Química dos voláteis dos insetos
Análises dos extratos de machos e fêmeas de O. poecilus,
poecilus obtidos das
coletas de voláteis, por CG-DIC
CG
mostraram que os extratos das aerações dos
machos continham
ntinham apenas um composto específico em relação às fêmeas, o
composto 12.. Como para outros
out
pentatomídeos, nos adultos de O. poecilus
foram identificados uma série de compostos comuns a ambos os sexos,
sexos como
hidrocarbonetos e aldeídos,
aldeídos identificados como: : 6-metil-hept-5
5-en-2-ona (1),
octanal (2), (E)-2-octenal
octenal (3), undecano (4), nonanal (5), dodecano (6), decanal
(7), tridecano (8), tetradecano (9), pentadecano (10) e hexadecano (11),
(11) Fig.
3.1.
Fig. 3.1- Perfil cromatográfico gasoso do extrato de machos e fêmeas de O. poecilus
.
19
Os compostos mais abundantes foram o (E)-2-octenal e o tridecano,
Tabela 1. Isso foi observado em 15 extratos de machos, contendo de 20 a 50
insetos e em 15 extratos de fêmeas contendo de 18 a 50 insetos.
Índice de
Quantidade média liberada (N=5)
Kováts (KI)
(ng/inseto/24 h) (média ± dp)
Composto
Machos
Fêmeas
989
12,70 ± 7,06
1,33±1,41
octanal
1005
12,16 ± 11,47
3,40 ± 4,59
(E)-oct-2-enal
1063
undecano
1100
86,95 ± 60,39
17,30 ± 15,21
nonanal
1107
22,54 ±23,53
1,88 ± 2,46
dodecano
1200
131,17 ± 96,57
66,06 ± 56,05
decanal
1206
18,94 ± 9,11
1,06 ± 1,33
tridecano
1300
4863,91 ± 2508,48
tetradecano
1400
7,97 ± 4,32
6,76 ± 5,67
pentadecano
1500
25,35 ± 14,91
18,44 ± 22,63
hexadecano
1600
3,87 ± 3,09
1,71 ± 2,24
6-metil-hept-5-en-2-ona
912,07 ± 526,15
106,74 ± 122,71
4739,92 ± 2704,15
Tabela 1 – Concentração dos compostos defensivos e índices de Kovats
A análise do padrão de fragmentação do composto (12), específico dos
machos, (Fig.3.2) sugere que o mesmo poderia ser um sesquiterpeno,
evidenciado pela presença dos fragmentos m/z 69, correspondente ao íon
C5H9+; fragmento m/z 93 relativo ao íon C7H9+ e fragmento m/z 119 para o íon
C9H11+. Observou-se também, possível íon molecular em m/z 222 e um íon em
m/z 204 (M-18) de uma provável perda de água, devido à presença de um
grupo (OH).
20
Fig. 3.2 - Espectro de massas do composto (12) dos machos de O. poecilus
Diante dessas informações,
informações procurou-se por possíveis padrões originais
que fossem isômeros do composto 12. Foram feitass injeções do padrão original
do
α-Bisabolol [6-metil
metil-2-(4-metilciclohex-3-enil)-hept-5-en-2-ol
ol] em CG e
CGEM para comparações de seu tempo de retenção e padrão de
fragmentação com o composto 12. No
N entanto, foi observado que o tempo de
retenção era diferente e seu padrão de fragmentação, apesar
apesar de semelhante,
diferia principalmente no que se refere às abundâncias dos íons, Fig.3.3.
Fig. 3.3 - Espectro de massas do alfa bisabolol
Foi realizada a reação de oxidação do extrato de machos com PCC,
PCC na
tentativa de estabelecer se o possível grupo OH era pertencente a um álcool
primário/ secundário ou terciário.
Foi observada a formação de um composto com provável íon molecular
em m/z 220. A presença do íon m/z 205 (M-15), correspondente a uma
possível perda de CH3 dá mais suporte para inferir-se que m/z 220 é o íon
21
molecular, Fig. 3.4.. Essa massa é condizente com a oxidação do grupo OH de
um composto com massa de 222.
222 Além disso, o pico no GC referente ao
composto 12 Fig. 3.5 desapareceu,
desapareceu, indicando que o mesmo reagiu com o PCC.
PCC
Diante disto, foi descartada a presença de álcool terciário,, Fig. 3.5.
3.5
Fig. 3.4 - Espectro de massas da oxidação com PCC do extrato de O. poecilus
Fig. 3.5 – Fração do perfil cromatográfico do extrato
e
de machos O. poecilus antes (parte
inferior) e depois de reação com PCC (parte superior)
22
As análises dos extratos de machos e fêmeas de O. poecilus mostraram
que, como outros hemípteros, produzem uma série de compostos defensivos
em comum, tendo como composto majoritário o tridecano, no entanto a
proporção entre os componentes difere dos outros pentatomídeos já
estudados,32,33 mostrando que esses compostos também podem ser utilizados
pelos insetos como indicadores da especificidade. A função dos compostos
defensivos ainda não está totalmente esclarecida. Alguns compostos, como o
tridecano, têm função de alarme, mas ainda é necessário conduzir bioensaios e
estudos
comportamentais
para
identificar
a
função
dos
compostos
individualmente e na mistura.
Na maioria dos pentatomídeos estudados, até o momento, quem libera o
feromônio sexual é o macho da espécie29,30, o que se manteve também no
percevejo Oebalus poecilus.
O composto específico dos machos corresponde a um sesquiterpeno com
provável massa molar 222, sendo um isômero do bisabolol.
32
489.
Moraes, M. C. B.; Pareja, M.; Laumann, R. A.; Borges, M.; Neotr. Entomol. 2008, 37,
33
Aldrich, J. R.; Oliver, J. E.; Lusby, W. R.; Kochansky, J. P.; Borges, M.; J. Chem. Ecol.
1994, 20, 1103.
23
3.2. Síntese de semioquímicos
3.2.1.Síntese dos Isômeros do bisabolol
Baseado no padrão de fragmentação do composto 12 e da provável
estrutura de um álcool primário ou secundário (em função do composto gerado
da reação com PCC) foram sugeridas duas estruturas (isômeros do αbisabolol) para serem sintetizadas, Fig.3.6, de maneira que
se pudesse
comparar os tempos de retenção e padrão de fragmentação destes compostos
com o composto 12.
e
OH
H
H
(7)
OH
(8)
6-metil-2-(4-metilciclohex-3-enil)hept-5-en-3-ol
2-metil-6-(4-metilciclohex-3-enil)hept-2-en-4-ol
Fig. 3.6 - Isômeros sugeridos para a síntese inicial
Foram propostas as seguintes rotas sintéticas para os isômeros 7 e 8:
H
B
BH3, THF
2
(1)
THF
(3)
(2)
Zn, NH4Cl,
PCC
NaOH, H2O2
THF
CH2Cl2
O
OH
(4)
H
Br
H
H
(5)
(6)
(7)
OH
Esquema 3.1 - Rota sintética para o composto 7 (isômero do bisabolol)
24
Zn, NH4Cl
O
PPh3,CH2Cl2
CBr4
THF
H
H
Br
OH
(4)
OH
H
(9)
(10)
(8)
Esquema 3.2 - Rota sintética para o composto 8 (isômero do bisabolol)
3.3. Síntese do composto (7)
3.3.1.Formação de 2-(4-metilciclohex-3-enil)-propan-1-ol (4)
A primeira etapa para síntese do composto (7) é a formação do borano
impedido para a hidroboração do (-)-limoneno (3). A hidroboração direta com
BH3 em THF não seria eficiente para nossos objetivos, visto que não haveria
seletividade devido à ligação do boro a ambas as insaturações. Em função
disso, preparamos inicialmente o borano impedido (2) (Disiamilborano), de
acordo com o Technical Bulletin da Aldrich,
34
que, por causa do impedimento
estéreo iria atuar somente na ligação dupla fora do anel.
Após a preparação de (2), foi adicionado (3) seguindo-se o procedimento
descrito por Pawson et al. 35 Após a adição do NaOH e de H2O2 e transcorridos
os 30 minutos para finalizar a reação, observou-se, através de CCD, a
formação de um composto mais polar, Fig.3.7.
34
Technical Bulletin AL-109, 1996, revised.
Pawson, P. A.; Cheung, H. C.; Gurbaxani, S.; Saucy, G. J. Am. Chem. Soc. 1970, 92,
336.
35
25
CCD 30% acetato de etila/éter de petróleo
Rf = 0,88
Limoneno
composto (4)
Rf = 0,51
Fig. 3.7 – CCD do composto (4) e do limoneno (3)
A formação de (4) foi evidenciada na análise de RMN 1H, onde se observa
o aparecimento de dois multipletos na região entre 3,45 e 3,60 ppm, relativos
aos dois hidrogênios carbinólicos do produto. É possível, também, a
visualização de dois dubletos na região em torno de 0,91 ppm, referentes aos
hidrogênios do CH3 da cadeia alquílica. A presença de dois dubletos, e não
apenas um, é explicada pelo fato da reação formar uma mistura de dois
isômeros. Também é possível observar que a reação ocorreu seletivamente na
ligação dupla exocíclica, pois o pico em 5,36 ppm, referente ao hidrogênio da
insaturação no anel, permanece no espectro e não há picos na região de 4,7
ppm, referentes à outra ligação dupla do composto de partida (3), Fig.3.8.
3.1
15.1
2.1
H
3.1
OH
3.1
OH
3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 3.50 3.45 3.40
2.1
1.0
0.96 0.94 0.92 0.90 0.88
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
1
Fig. 3.8 - Espectro de RMN H de (4), p-ment-1-en-9-ol, (CDCl3, 300 MHz).
26
No espectro de RMN
13
C, os picos em 66,1 e 65,9 ppm (referentes aos
carbonos carbinólicos), também nos dão suporte para inferir que houve a
formação dos dois isômeros do álcool esperado, Fig. 3.9. Os picos em 120,5 e
133,8 ppm são respectivamente do carbono secundário e do carbono terciário
da ligação dupla no anel. Também se observa a presença de 2 isômeros na
expansão dessas regiões no espectro, Fig. 3.9.
66,10
133,8
120,45
66.40 66.20 66.00 65.80 65.60
H
OH
134.20 134.00 133.80 133.60 133.40
120.80
150
140
130
120
Fig. 3.9 - Espectro de RMN
120.60
110
120.40
100
120.20
120.00
90
80
70
60
50
40
30
20
10
13
C de (4), p-ment-1-en-9-ol, (CDCl3, 75 MHz).
27
0
Na região do IV de (4), observa-se o estiramento de O-H
H em 3390 cm-1 ,
Fig. 3.10.
H
OH
Fig. 3.10 Infravermelho do composto (4), (pastilha de NaCl).
No espectro de massas, o padrão de fragmentação do composto está de
acordo
cordo com a biblioteca NIST 2008,, sendo possível observar o íon molecular
em m/z 154 e o íon m/z 136 (M-18),
(M
referente à perda de H2O, Fig. 3.11.
3.11
H
OH
Fig. 3.11 - Espectro
spectro de massas de (4), (CG-EM).
28
3.3.2.Obtenção do 2-(4-metilciclohex-3-enil)-propanal (5)
A reação de oxidação de (4) se processou rapidamente (1 hora e meia)
com o uso do PCC, com 81% de rendimento. O fim da reação pôde ser
acompanhado por CCD onde se observou a formação de um composto menos
polar (“spot” localizado mais acima na placa eluída com 30% acetato de etila
em hexano), Fig. 3.12.
CCD 30% acetato de etila/éter de petróleo
Aldeído
Álcoois
.
Fig. 3.12 – CCD do composto (5) e do composto (4)
O espectro de RMN 1H evidenciou a presença de dois dubletos na
região de 9,60 ppm, relativos ao hidrogênio de aldeído, e de um multipleto em
2,28 ppm, relativo ao hidrogênio α-carbonila. A presença destes dois dubletos
evidencia a formação de dois isômeros de aldeídos, visto que o material de
partida (4) era uma mistura de dois isômeros. Observa-se, também, o
desaparecimento dos hidrogênios carbinólicos na região de 3,45 e 3,60 ppm,
como mais uma confirmação de que ocorreu a reação no grupo OH de (4), Fig.
3.13.
29
2.9
O
H
O
3.0
1.0
9.72 9.70 9.68 9.66 9.64 9.62 9.60
5.40 5.35 5.30
5.25
1.1
1.0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
Fig. 3.13 - Espectro de RMN H do composto (5), (CDCl3, 300 MHz).
No espectro de RMN 13C, observa-se o pico característico de aldeído em
205 ppm (dois picos, em função dos dois isômeros formados) e também os
picos característicos dos carbonos da ligação dupla no anel em 134,0 e 119,8
ppm, Fig.3.14.
119.80
119.88
133.99
205.44
205.35
133.96
O
H
O
205.80 205.60 205.40 205.20 205.00 204.80
120.40
120.20
120.00
119.80
119.60
119.40
134.05 134.00 133.95 133.90
200
175
Fig. 3.14 - Espectro de RMN
150
125
100
75
50
25
0
13
C do composto (5) , (CDCl3, 75 MHz).
30
O espectro de massas
massa do produto formado (5) condiz com o padrão de
fragmentação do composto esperado na oxidação de (4),, de acordo
ac
com a
biblioteca NIST (2008),, sendo possível observar um provável íon molecular em
m/z 152 (subsidiado ainda pela presença do íon m/z 137 correspondente a (M15).. A presença de um pico intenso em m/z 94 corresponde a C7H10+, Fig. 3.15.
H
O
Fig. 3.15 - Espectro de massas do composto (5) , (CG-EM).
No espectro de infravermelho do composto (5) é possível ver a banda
característica da carbonila em 1725 cm-1.
H
O
Fig. 3.16 – Infravermelho do composto (5) , (pastilha de NaCl).
31
3.3.3. 6-metil-2-(4-metilciclohex-3-enil)-hept-5-en-3-ol (7)
A reação de adição nuceofílica à carbonila se processa bem com
reagentes de Grignard, no entanto, estes muitas vezes são difíceis de serem
formados devido à necessidade de eliminação de qualquer quantidade de
água. Como alternativa, utilizamos a reação de Barbier-Grignard, onde o
reagente de Grignard é formado “in situ”. A reação do aldeído (5) com o
brometo de prenila (6) comercial se mostrou rápida (1 hora e meia) e com
rendimento moderado (45%). O espectro de RMN 1H evidenciou a presença
dos hidrogênios da ligação dupla no anel e na cadeia aberta em 5,40 e 5,10
ppm, respectivamente. Também é possível observar a presença do pico em
3,38 ppm, referente ao hidrogênio carbinólico, Fig.3.17
23.0
3.0
H
OH
OH
1.0
1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65
1.0
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
1.0
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
1
Fig. 3.17 - Espectro de RMN H do composto (7), (CDCl3, 300 MHz).
32
13
No espectro de RMN
C, pode-se observar o pico característico de
carbono carbinólico
lico em cerca de 71 ppm, além dos carbonos das duplas na
região entre 119 e 135 ppm, Fig. 3.18.
H
OH
OH
170
160
150
140
130
120
Fig. 3.18 - Espectro de RMN
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
13
C do composto (7) , (CDCl3, 75 MHz).
O espectro de massas do composto formado nos mostra um padrão de
fragmentação com provável íon molecular em m/z 222. O íon m/z 207 é de uma
provável perda de grupo CH3 (M-15), o que dá mais suporte para inferir-se
inferir
que
222 é realmente o íon molecular e que estaria de acordo com a massa do
composto esperado da reação de adição nucleofílica no aldeído (5). O íon m/z
189, (M-33)
33) de uma provável perda de CH3 e H2O, permite inferir a presença de
um grupo OH, Fig.3.19.
H
OH
Fig. 3.19 - Espectro de massas do composto (7) , (CG-EM).
33
-10
No
espectro
de
infravermelho
infravermelho,
é
possível
visualizar
izar
a
banda
característica do grupo OH em 3483 cm-1, Fig. 3.20.
H
OH
Fig. 3.20 – Espectro de infravermelho da mistura de isômeros de (7) , (pastilha de NaCl).
3.3.4. 4-(1-bromopropan
bromopropan-2-il)-1-metilciclohex-1-eno (9)
Utilizou-se a síntese descrita por Baughman et. al.36, utilizando CBr4 e
PPh3, em diclorometano,
metano, feita em uma única etapa, à temperatura ambiente , 4
horas e rendimento
o de 71%.
71%
A reação se
e mostrou bastante simples e na etapa de adição de hexano
para separar o composto (9) do fosfinóxido (co-produto
produto da reação), notou-se
notou
que a filtração não era tão necessária, pois mesmo contendo pequenas
peque
quantidades do fosfinóxido na amostra, a purificação seria fácil, visto que o
composto obtido foi cromatografado apenas com hexano puro e o fosfinóxido
gerado não era solúvel neste solvente. Deste modo, a realização do
procedimento de separação do fosfinóxido do composto (9), utilizando apenas
36
Baughman, T. W.; Sworen, J. C.; Wagener, K. B. Tetrahedron 2004, 60,
60 10943.
34
a separação da fração hexânica com pipeta Pasteur, se mostrou bastante
eficiente para evitar perdas do brometo produzido.
Na caracterização de (9), observou-se que este tinha o espectro de RMN
1
H muito parecido com o de (4), ambos contendo basicamente os mesmos
picos e pequenas diferenças nos deslocamentos químicos. É possível se
observar uma pequena mudança, nos multipletos na região de 3,37 a 3,51 ppm
em relação a (4) (estes se encontram mais próximos entre si do que em (4)),
Fig.3.21.
3.1
Br
14.1
H
Br
3.60
3.50
3.40
3.30
3.20
2.0
5.45 5.40 5.35 5.30 5.25 5.20
1.0
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
Fig. 3.21 - Espectro de RMN H composto (9), (CDCl3, 300 MHz).
O espectro de RMN
13
C de (9) não mostrou a presença dos picos em
torno de 66 e 67 ppm (característicos do carbono carbinólico), de forma que
podemos inferir que na reação o grupo OH (proveniente do composto 4)
desapareceu, e que houve a formação do composto (9), Fig. 3.22.
35
120.22
120.17
H
133.94
Br
Br
134.00
120.60 120.50 120.40 120.30 120.20 120.10 120.00 119.90 119.80
134.40 134.20 134.00 133.80 133.60
200
175
Fig. 3.22 - Espectro de RMN
150
125
100
75
50
25
0
13
C do composto (9) , (CDCl3, 75 MHz).
O espectro de massas do composto (9) mostra a presença de um
composto com provável íon molecular em m/z 216 e a razão isotópica em
relação ao íon m/z 218 (M+2) é típica de compostos contendo bromo,
bromo Fig.3.23.
H
Br
Fig. 3.23 - Espectro
spectro de massas do composto (9) , (CG-EM).
36
3.3.5. 2-metil-6-(4-metilciclohex-3-enil)hept-2-en-4-ol (8)
Para a síntese do composto (8), realizou-se a reação de (9) com o metil
crotonaldeído (10), na presença de zinco, cloreto de amônio em THF (BarbierGrignard) durante 2 horas, como na reação para sintetizar (7). Após duas horas
de reação, através de CCD, não se observou alteração no composto inicial.
Mantêve-se, então, a reação por 20 horas, mas o composto pretendido
não foi formado, sendo o material de partida recuperado.
Na literatura, há relatos de que reações do tipo Barbier-Grignard
funcionam muito bem com brometos de alila,37 em função disso, acredita-se
que esta foi uma das razões para que não ocorresse a reação, visto que o
brometo utilizado não era alílico. Posteriormente, reações com reagentes de
Grignard serão efetuadas para tentativa da síntese deste composto.
O padrão de fragmentação e o tempo de retenção do composto (7) não
coincidiam com o composto específico de machos de O. poecilus . Em função
disso, novas tentativas para identificação do feromônio sexual deste percevejo
foram feitas.
Recentemente, o grupo de Semioquímicos da Embrapa Cenargen, havia
identificado o feromônio sexual de outro percevejo do arroz, Tibraca
limbativentris,38 cujos machos produziam como feromônio sexual o composto
zingiberenol. O padrão de fragmentação do composto 12 era idêntico ao
padrão de fragmentação de um dos isômeros do zingiberenol, Fig. 3.24, e seu
tempo de retenção coincidia com um dos isômeros do zingiberenol.
37
Li, C. J.; Tetrahedron 1996, 52, 5643.
Borges, M.; Birkett, M.; Aldrich, J. R.; Oliver, J. E.; Chiba, M.; Murata, Y.; Laumann, R.
A.; Barrigossi J. A. F.; Pickett , J. A.; Moraes, M. C. B. J. Chem. Ecol. 2006, 32, 2749.
38
37
Fig. 3.24 - Padrão
adrão de fragmentação do zingiberenol e do composto 12,, (CG-EM).
(CG
Apesar de este composto ser um álcool terciário, é alílico e sua reação
com PCC é viável, justificando o fato do composto específico de O. poecilus ter
reagido com PCC.
OH
PCC, CH2Cl2
O
Esquema 3.3 – Oxidação do zingiberenol com PCC.
Em função disso, iniciou-se
iniciou se a síntese dos 8 isômeros possíveis para o
zingiberenol, a partir do (R) e (S)- citronelal, seguindo a rota proposta por
Hagiwara et al.39, Esquema 3.4,
3.4 para comparações do tempo de retenção e
padrão de fragmentação, além da realização de bioensaios com os insetos e
estes compostos.
39
Hagiwara, H.; Okabe, T.; Ono, H.; Kamat, V. P.; Hoshi, T.; Suzuki, T.; Ando, M.
Perkin Trans. 2002, 1,
1 895.
38
3.4. Síntese dos Isômeros do Zingiberenol (1-metil-4-(6-metilhept-5-en-2-il)-ciclohex-2-enol)
O
O
O
DEATMS
O
CH3CN
refluxo,20h
(12)
(R)-Citronelal (11)
(13)
OH
O
KOH, TBAOH
MeLi
H
H
THF, Et2O,
refluxo 16h
Et2O, - 78 °C, 1,5 h
(15)
(14)
Esquema 3.4 – Rota sintética do Zingiberenol a partir do (R)-citronelal
O
O
O
DEATMS
CH3CN
refluxo,20h
(12)
(S)-Citronelal (16)
(17)
OH
O
KOH, TBAOH
THF, Et2O,
refluxo 16h
O
MeLi
H
H
Et2O, - 78 °C, 1,5 h
(18)
(19)
Esquema 3.5 – Rota sintética do Zingiberenol a partir do (S)-citronelal
______________________
39
Hagiwara, H.; Okabe, T.; Ono, H.; Kamat, V. P.; Hoshi, T.; Suzuki, T.; Ando, M. Perkin
Trans. 2002, 1, 895.
39
3.4.1. (3R)-3,7-dimetil-2-(3-oxobutil)oct-6-enal (13)
Iniciou-se a síntese do zingiberenol a partir do (R)-citronelal (11)
seguindo o procedimento descrito por Hagiwara,39 de maneira que o composto
(13) obtido não foi purificado, sendo utilizado diretamente na síntese de (14)
O
O
O
DEATMS
CH3CN
refluxo,20h
(R)-Citronelal (11)
(12)
O
(13)
Esquema 3.6 - Rota sintética do (3R)-3,7-dimetil-2-(3-oxobutil)Oct-6-enal
3.4.2.4- ((R)-6-metil-hept-5-en-2-il)ciclohex-2-enona (14)
A segunda etapa da sequência consistia de uma condensação aldólica
intramolecular, que se processou com a utilização de TBAOH como catalisador
de transferência de fase, utilizando-se THF e Et2O como solventes. Em um
primeiro momento, realizou-se a síntese apenas com o Et2O como solvente,
mas observou-se uma redução grande no rendimento (30%), comparado com o
rendimento obtido com a utilização dos dois solventes (85%) que é bem
próxima dos valores citados em Hagiwara.39
O espectro de RMN 1H estava de acordo com os dados da ref. 39, onde
foram observados os picos em 5,10 ppm (referente aos hidrogênios da ligação
dupla na cadeia aberta do composto), 6,03 ppm e 6,87 ppm (referentes aos
hidrogênios da ligação dupla no anel). Foi possível visualizar a presença de
dois isômeros do composto, visto que foram observados dois dubletos em
cerca de 0,92 ppm, referentes ao grupo metila alquílico (se fosse apenas um
composto teríamos apenas um dubleto) Fig. 3.25.
40
16.0
O
3.1
3.1
H
0.9
0.8
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
1.1
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
1
Fig. 3.25 - Espectro de RMN H do composto (14) , (CDCl3, 300 MHz).
O espectro de RMN
13
C nos mostra a presença do carbono
característico da carbonila em 200 ppm. Em 154 e 155 ppm, observa-se a
presença do hidrogênio da ligação dupla no anel (são observados estes dois
picos e não somente um, em função da formação de dois isômeros : (R)-4-((R)6-metilhept-5-en-2-il)-ciclohex-2-enona e (S)-4-((R)-6-metilhept-5-en-2-il)ciclohex-2-enona. Esses sinais evidenciam o fechamento do anel, que ocorre
da eliminação do grupo OH, Fig. 3.26
41
200.1
O
155.47
154.37
H
200.30 200.20 200.10 200.00 199.90 199.80
158.0 157.5 157.0 156.5 156.0 155.5 155.0 154.5 154.0 153.5 153.0 152.5 152.0 151.5 151.0 150.5 150.0
200.1
225
200
175
Fig. 3.26 - Espectro de RMN
150
125
100
75
50
25
0
13
C do composto (14) , (CDCl3, 75 MHz).
No infravermelho visualiza-se
visualiza
o pico característico da carbonila em 1692
cm-1, Fig. 3.27.
Fig. 3.27 – Infravermelho do composto (14), (pastilha de NaCl).
42
3.4.3. 1-metil-4-((R)-6-metil-hept-5-en-2-il)ciclohex-2-enol (15)
Na formação de (15), tem-se a adição nucleofílica na carbonila de (14),
através da reação com metil lítio. A reação se processou rápido (cerca de 1
hora e meia) e foi monitorada por CCD onde se observou a formação de dois
“spots” mais polares (localizados mais abaixo em relação à (14), na placa
eluída com diclorometano), Esquema 3.7.
OH
O
MeLi
H
H
Et2O, - 78 °C, 1,5 h
(15)
(14)
Esquema 3.7- Formação de zingiberenol à partir de (14)
Observou-se, que os compostos formados não eram revelados na luz
UV, o que nos indicava que o sistema enona era inexistente nas estruturas
formadas, Fig.3.28.
CCD Dicloro metano
Cetona (visível no UV)
mist. zingiberenol menos polar
mist. zingiberenol mais polar
Fig. 3.28 – CCD do composto (15) (mistura de isômeros) e (14)
Na separação em cromatografia flash, foi possível separar os 4 isômeros
formados em dois grupos de dois diastereoisômeros: (15a) – os isômeros
menos polares e (15b) os mais polares. A formação de (15b) é evidenciada
pelo espectro de RMN 1H, onde se pode observar a presença dos multipletos
na região de 5,48 a 5,65 ppm, (referentes aos dois hidrogênios da ligação
dupla no anel), e na região de 5,10 ppm (hidrogênio da ligação dupla da cadeia
aberta). É possível verificar a presença de dois isômeros em função dos dois
dubletos na região de 0,80 a 0,87 ppm, referentes à metila ligada ao carbono
43
alquílico da cadeia aberta de cada diastereoisômero. Pode-se observar,
também, os singletos relativos às 3 metilas, do anel e da cadeia aberta,
respectivamente em 1,27, 1,60 e 1,69 ppm, Fig. 3.29.
3.1
OH
3.0
OH
3.0
H
2.0
1.0
3.1
3.1
5.70 5.60 5.50 5.40 5.30 5.20 5.10 5.00
2.0
1.0
0.90 0.85 0.80 0.75 0.70
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1
Fig. 3.29 - RMN H dos diastereoisômeros (15b) - isômeros mais polares, (CDCl3, 300
MHz).
No espectro de RMN
13
C, observa-se o pico típico de carbono carbinólico
em 69,7 ppm.
OH
OH
H
70.00 69.80 69.60 69.40 69.20
136 135 134 133 132 131 130 129 128 127 126 125 124
200
175
Fig. 3.30 - RMN
150
125
100
75
50
25
0
13
C dos diastereoisômeros (15b) - isômeros mais polares, (CDCl3, 75
MHz).
44
No padrão de fragmentação, evidencia-se
evidencia se a presença do íon m/z 222
como possível íon molecular. Observa-se
Observa se também a presença do íon m/z 204,
condizente com uma possível perda de água (M-18), Fig. 3.31.
OH
Isômeros mais polares
H
Fig. 3.31 - Espectro de massas do composto (15b) - isômeros mais polares,
polares (CG-EM).
O espectro de infravermelho evidencia a banda característica do grupo OH
em 3383 cm-1, Fig. 3.32.
OH
H
Fig. 3.32 Infravermelho de (15b) - isômeros mais polares, (pastilha de NaCl).
45
O espectro de RMN 1H de (15a) é bem semelhante ao espectro de (15b),
a única diferença está na região logo acima de 2,00 ppm. Observa-se que o
multipleto, relativo ao hidrogênio de um dos centros assimétricos nos
diastereoisômeros menos polares (15a), tem um deslocamento menor (2,10
ppm), Fig. 3.33, que o hidrogênio dos diastereoisômeros mais polares,
indicando que este hidrogênio deve sofrer algum tipo de interação que faça
com que seu sinal, no espectro, esteja mais deslocado para a esquerda.
OHOH
H
20.2
1.00 0.90 0.80 0.70 0.60
5.80 5.60 5.40 5.20 5.00 4.80
3.1
2.1
1.0
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1
Fig. 3.33 - RMN H dos diastereoisômeros (15a) - isômeros menos polares, (CDCl3, 300
MHz).
O espectro de RMN
13
C dos diatereoisômeros (15a), Fig.3.34 é
praticamente idêntico ao espectro de (15b).
46
-0.5
OH
OH
70.00 69.80 69.60 69.40 69.20
H
136 135 134 133 132 131 130 129 128 127 126 125 124
200
175
Fig. 3.34 - RMN
150
125
100
75
50
25
0
13
C do composto (15a) - isômeros menos polares, (CDCl3, 75 MHz).
O espectro de massas de (15a) Fig. 3.35, mostra que o íon m/z 119 possui
uma abundância maior em relação ao espectro de (15b) de maneira que se
pode inferir que a diferença espacial das estruturas, de alguma forma, interfere
na fragmentação dos compostos.
OH
H
Fig. 3.35 - Espectro de massas do composto (15a) - isômeros menos polares.
47
O espectro de infravermelho de (15a) é praticamente idêntico ao de (15b)
.Fig.3.36
OH
H
Fig. 3.36 - Espectro de infravermelho de (15a) - isômeros menos polares,
polares (pastilha de
NaCl).
A síntese doss 4 isômeros do zingiberenol a partir do (S)-citronelal
citronelal (19) foi
realizada da mesma forma que a síntese dos 4 isômeros do zingiberenol a
partir do (R)-citronelal.. Os espectros (RMN 1H, RMN
13
C, IV e massas) foram
idênticos aos do zingiberenol vindo do (R)-citronelal.
(
48
3.5. Análises Químicas do zingiberenol
Após a síntese dos 8 isômeros possíveis do zingiberenol - que foram
produzidos em dois grupos de 4 isômeros (um grupo vindo do (R) e o outro do
(S)- citronelal), Figura 3.37 - estes foram comparados com o tempo de retenção
e o padrão de fragmentação do extrato de machos de O. poecilus.
poecilus
OH
OH
H
H
OH
OH
H
H
OH
OH
OH
OH
H
H
H
H
A partir do (R)- citronelal
citr
A partir do (S)- citronelal
Fig. 3.37– 8 isômeros do zingiberenol divididos em dois
dois grupos de 4 isômeros.
Em cada grupo de 4 isômeros (vindo do (R)
( e do (S)-citronelal)
citronelal),foi possível
observar que o composto específico do O. poecilus coincidia
ncidia com um desses 4
isômeros. No
o entanto, um dos isômeros do zingiberenol, em cada grupo de 4
isômeros, não foi resolvido em CG, Fig. 3.38.
Fig. 3.38 – Perfil cromatográfico do extrato de machos O. poecilus. e dos 4 isômeros do
Zingiberenol.
49
Comparações do espectro de massas dos isômeros menos polares
pola
do
zingiberenol sintetizado (R
( e S), com o espectro do composto (12
12), mostraram
que estes eram bastante coincidentes,
coi
Fig.3.39.
Fig. 3.39 – Padrões de fragmentação do composto (12) dos machos de O. poecilus e do
zingiberenol.
Para uma melhor resolução dos isômeros
isômero do zingiberenol,
zingiberenol realizou-se a
silanização, com MSTFA, deste composto.. Sua comparação com o extrato de
O. poecilus silanizado mostrou que o segundo isômero do zingiberenol
zingi
silanizado (2)- (pertencente ao grupo dos isômeros menos polares) coincidia
com composto (12) silanizado,
silanizado Fig. 3.40.
Fig. 3.40 – Extrato de O. poecilus e Zingiberenol silanizados (perfis cromatográficos).
50
A única forma de realmente se poder afirmar que um composto é ou não
um feromônio é através de estudos comportamentais.
Diante
nte
destas
informações
informações,
foram
conduzidos
bioensaios
para
determinar a atividade dos compostos sintetizados,
sintetizados frente aos insetos.
Decidiu-se utilizar as misturas contendo os isômeros menos polares,
polares
vindo do (R) e do (S)-- citronelal, visto que os isômeros mais polares não
coincidiam com o composto específico dos machos,Figura
machos
3.41.
Fig. 3.41– Dois
ois grupos de diastereoisômeros do zingiberenol
Além dos bioensaios com fêmeas versus os compostos e hexano,
também foram realizados bioensaios com as fêmeas versus machos e fêmeas
como escolhas e também fêmeas
fê
versus extratos de machos e hexano.
51
3.6. Bioensaios
Nos bioensaios em olfatômetro em Y, as fêmeas foram atraídas para o
odor de machos vivos, mas não para o odor de fêmeas vivas, (X2 = 12,90, P <
0, 001, N= 57), Fig. 3.42..
Fig. 3.42 – Bioensaios de fêmeas versus machos/fêmeas.
Nos bioensaios com fêmeas versus extrato de machos/hexano, as fêmeas
foram mais atraídas para o extrato de machos (tratamento) do que para
par o
controle hexânico, ( X2 = 12,30, P < 0, 001; N= 57), Fig. 3.43
Fig. 3.43 - Bioensaios de fêmeas versus extratos de machos/hexano.
52
Os bioensaios com fêmeas versus frações do zingiberenol menos polares
(vindo do (S)- Citronelal)/hexano) mostraram que as fêmeas foram mais
atraídas para os compostos sintetizados (tratamento) do que para o controle
hexânico,
(X2 = 14,40, P < 0, 001; N= 57), Fig 3.44.
Fig. 3.44 - Bioensaios de fêmeas versus (S)-zingiberenol menos polares/hexano
Nos bioensaios com fêmeas versus zingiberenol menos polares (vindo do
(R)- Citronelal)/hexano, os resultados mostram que a mistura desses
compostos utilizados no tratamento não foi atrativa para as fêmeas, Fig. 3.45,
(X2 = 0,22; P > 0, 001, N= 57)
Fig. 3.45 - Bioensaios de fêmeas versus (R)-zingiberenol menos polares/hexano.
53
CONCLUSÃO
54
4.
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos mostram que os machos do percevejo O. poecilus
possuem um composto específico como provável feromônio sexual. Este
composto é um dos diastereoisômeros menos polares do zingiberenol.
Não foi possível estabelecer, ainda, a configuração absoluta deste
feromônio, mas experimentos posteriores poderão elucidá-la.
As respostas das fêmeas nos bioensaios com o diastereoisômeros menos
polares, formados a partir do (R) e do (S)-citronelal indicam que elas foram
atraídas pela mistura dos compostos vinda do (S)-citronelal. Embora a mistura
dos isômeros menos polares do (R)-zingiberenol não tenha se mostrado
atrativa para as fêmeas de O. poecilus, ainda não podemos definir (com os
bioensaios realizados até o momento) que o isômero aí contido não seja
atrativo. Há relatos na literatura de que a presença de algum(ns)
enantiômero(s) possa inibir a atividade de um feromônio.40 Sendo assim,
bioensaios posteriores poderão esclarecer essa questão.
Testes em campo serão feitos futuramente a fim de avaliar a efetividade
das misturas. Se os resultados forem positivos, existirão boas perspectivas
com relação à produção em grande escala de um novo produto comercial, visto
que a síntese do zingiberenol é relativamente rápida e tem altos rendimentos
em todas as etapas, além da facilidade de separação dos diastereoisômeros
mais e menos polares.
40
Levinson, A.; Levinson, H. Naturwissenschaften 1999, 86, 138.
55
PARTE EXPERIMENTAL
56
5.
PARTE EXPERIMENTAL
5.1. Estudos da Ecologia Química do percevejo Oebalus
poecilus.
5.1.1.Criação dos insetos
Adultos de Oebalus poecilus usados na pesquisa eram procedentes de
uma criação mantida em casa telada na Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antônio
de Goiás, GO (16°4'S e 49° 14'W). Os insetos eram c riados em plantas de
arroz, Oryza sativa, mantidas em vasos grandes (5 kg) em casa de vegetação.
No laboratório, os insetos foram criados em recipientes plásticos de 5 litros
contendo panículas de arroz, vagem e amendoin, sendo este alimento retirado
e reposto 3 vezes por semana,
41
a 26 ± 1 °C e 65 ± 10% de umidade relativa,
sob fotoperído de 14 horas de luz/ 10 horas de escuro. A maioria das massas
de ovos foram colocadas sobre as plantas de arroz e, 3 vezes por semana,
estas plantas foram transferidas para novos recipientes de plástico, onde as
ninfas foram criadas da mesma forma que os insetos citados anteriormente.
Para evitar interações entre os sexos, os machos foram separados das fêmeas
após a sua última muda de exúvia (5º ínstar). Para todos os experimentos,
adultos sexualmente maduros (> 8 dias de idade) foram utilizados.
41
Cavalcante, A. C. S.; Cordeiro, D. M.; Laumann, R. A.; Moraes, M. C. B., Barrigossi, J.
A. F.; Borges, M.; Embrapa-Cenargen, Bolet. Pesq. 2004, 78 ,18.
57
5.1.2. Coletas dos voláteis dos insetos
Os voláteis foram coletados de grupos de 15 a 50 machos ou fêmeas
(dependendo da disponibilidade) de Oebalus poecilus (N = 40). Para minimizar
a liberação dos compostos de defesa, os insetos foram gentilmente colocados
em recipientes de vidro de 1 litro.42 Ar foi introduzido no recipiente através de
um tubo de vidro contendo carvão ativado (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA,
EUA). Os voláteis foram coletados em um tubo (15 × 1,5 cm) contendo Super
Q como adsorvente (100 mg; Alltech Associates, Inc., Deerfield, IL, EUA), que
estava conectado a uma bomba de vácuo (~ 1 L / min). Estes adsorventes
foram eluídos com hexano (4 x 0,5 mL por amostra) e cada amostra foi
concentrada a aproximadamente 1 uL/ inseto sob um fluxo suave de nitrogênio
para posterior análise.
5.1.3. Análises Químicas
Os extratos foram quantificados por cromatografia gasosa acoplada a
detecção por ionização de chamas (CG-DIC) , (CG Shimadzu; coluna DB-5MS,
30 m x 0,25 mm , filme de 0,25 µm, J&W Scientific e CG Agilent ; coluna DB-5,
30 m x 0,25 mm d, 0,25 µm, Supelco), utilizando como programa de
temperatura de 50 °C por 1 min, 5 °C/min até 150 °C por 0,1 min, 10 °C/min até
250 °C por 10 min. Amostras de 1 µL foram injetadas usando Hélio como gás
de arraste e um detector de ionização por chama (DIC) a 270 °C.
Extratos selecionados foram analisados por cromatógrafo gasoso
acoplado a espectrômetro de massas (CG-EM), usando um equpamento
Agilent 5975C inert
diretamente
acoplado
XL EI/ CI MSD, triple axis detector, o qual estava
a
um
cromatógrafo
gasoso
Agilent 7890A.
O
cromatógrafo gasoso foi equipado com uma coluna DB-5 , 30 m x 0,25 mm d,
0,25 µm, Supelco. Hélio foi usado como gás de arraste. A ionização foi feita por
impacto de elétrons (70 eV, temperatura da fonte de 270 °C). Os dados foram
coletados e avaliados com o software ChemStation. Identificação dos
compostos dos extratos das aerações de ambos os sexos de O. poecilus foi
42
Zhang, A.; Borges, M.; Aldrich, J.; R.; Camp, M. J. Neotropical Entomol. 2003, 32, 713.
58
feita por comparação dos tempos de retenção no CG-DIC com os dos padrões
usando coluna apolares e cálculo do índice de Kovats (CG Shimadzu; coluna
DB-5MS, 30 m x 0,25 mm, filme de 0,25 µm, J&W Scientific e utilizando o
mesmo programa citado acima.
Os compostos foram identificados por comparação do padrão de
fragmentação
com
espectros da biblioteca NIST (2008) e confirmados
através da injeção de padrões autênticos no CG-EM.
Para avaliar a quantidade média dos compostos defensivos liberada
pelos insetos, cinco amostras foram selecionadas e os compostos foram
quantificados usando o método do padrão interno:
4 µL do composto 16-
hexadecanolídeo, na concentração de 0,5 mg/mL foi adicionados ao extrato e
o volume dessa mistura foi concentrado para 100 µL de volume final.
Para confirmar a presença do grupo hidroxila no composto específico do
macho, uma microsilanização foi realizada
usando N-metil-(trimetilsilil)-
trifluoroacetamida (MSTFA) em frasco de vidro de 2 mL. Uma alíquota de 50 µL
foi retirada de um extrato de aeração,
(20 machos de O. poecilus),
concentrado sob um fluxo de nitrogênio até quase secar e redissolvido em 100
µL de MSTFA. A amostra foi aquecida em banho-maria à 60 °C por 1 hora e
analisado
diretamente
no
CG-EM,
usando
as
condições
descritas
anteriormente. A mesma reação foi realizada com uma solução padrão de
zingiberenol (2 µL de 100 mg/mL ).
5.2. Síntese de Semioquímicos
5.2.1. Procedimentos Gerais
Os reagentes e solventes foram adquiridos de fontes comerciais e
utilizados sem purificação adicional, exceto nas reações que requiseram um
maior grau de pureza. A secagem de solventes, quando necessária, foi
realizada com adição de hidreto de cálcio (acetronitrila), ou sódio metálico e
benzofenona (THF e éter etílico), seguido de destilação sob atmosfera inerte.
59
Os extratos orgânicos foram secos em sulfato de sódio anidro e os
solventes removidos em rotaevaporador. As temperaturas criogênicas foram
obtidas utilizando-se gelo seco e acetona.
As análises em cromatografia em camada delgada foram efetuadas em
placas de sílica gel suportada em alumínio 60F 254 /0,2 mm (Merck), utilizando
como reveladores: luz ultravioleta e 5% de ácido molibdofosfórico em etanol.
Os produtos foram purificados por cromatografia rápida sob pressão
(Flash Column Chromatography) tendo como eluente hexano-acetato de etila
em concentrações apropriadas.
Os espectros de massas foram efetuados em um cromatógrafo gasoso
(Agilent 7890A equipado com uma coluna DB-5, 30 m x 0,25 mm d, 0,25 µm,
Supelco), acoplado a um espectrômetro de massas Agilent 5975C inert XL EI/
CI MSD, triple axis detector e utilizando-se Hélio como gás de arraste. A
ionização foi feita por impacto de elétrons (70 eV, temperatura da fonte de 270
°C) . Os dados foram coletados e avaliados com o software ChemStation
utilizando a Biblioteca NIST (2008).
As análises por cromatografia gasosa foram realizadas em cromatógrafo
modelo GC Shimadzu; coluna DB-5MS, 30 m x 0,25 mm , filme de 0,25 µm,
J&W Scientific e cromatógrafo Agilent 7890A ; coluna DB-5, 30 m x 0,25 mm d,
0,25 µm, Supelco, ambos acoplados a detector por ionização de chamas (CGDIC). Foram utilizados programas de temperatura de 50 °C por 1 min, 5 °C/min
até 150 °C por 0,1 min, 10 °C/min até 250 °C por 10
min. Amostras de 1 µL
foram injetadas usando Hélio como gás de arraste e um detector de ionização
por chama (DIC) a 270 °C.
Os espectros de IV foram registrados nos espectrômetros Bomem
Hartmann & Braun (MB – 100), com valores de
Os espectros de RMN
1
max expressos em cm -1 .
H (300 MHz) e
13
C (75,46 MHz) foram
registrados em espectrômetro Varian (7,05 T). Os deslocamentos químicos (δ)
foram expressos em partes por milhão (ppm). Os experimentos de RMN 1H
foram referenciados ao TMS (σ 0,0) como padrão interno e os de RMN
13
C ao
CDCl3 (σ 77, 0), respectivamente.
As constantes de acoplamento (J) estão expressas em Hertz (Hz). Para
indicar as multiplicidades dos sinais, foram adotadas as seguintes abreviações:
60
s (singleto), d (dubleto), t (tripleto), q (quadrupleto), qt (quintupleto), m
(multipleto), sl (singleto largo), dd (duplo dupleto).
5.3. Procedimentos:
5.3.1.diisamilborana (2)
BH
2
BH3. THF
THF, 2 horas
0°C
70,13
154,1
(1)
(2)
Em um balão de uma boca, tampado com septo de borracha, seco, com
fluxo de argônio e resfriado a 0 °C em banho de gel o, foi adicionado o borano
em THF (20,0 mL, 20,0 mmol ) e mantido sob agitação. Em seguida, adicionouse, gota a gota, o 2-metil-2-buteno (20,0 mL, 40,0 mmol). A mistura foi mantida
em agitação por 2 horas e estava pronta para reagir com a olefina.
5.3.2.2-(4-methilciclohex-3-enil)propan-1-ol (4)
BH
THF, 2 h, t.a.
H
OH
NaOH, H2O2
154,1
(2)
136,23
(3)
154,25
(4)
61
No balão contendo o disiamilborano (20,0 mmol, 40,0 mL) em fluxo de
argônio, resfriado a 0 °C, foi adicionado, gota a g ota, o (-)-limoneno (2,64 g,
19,0 mmol, 3,04 mL) dissolvido em THF seco (15,0 mL). Após a adição do
limoneno, a mistura foi mantida sob agitação por 2 horas à temperatura
ambiente. Foi adicionado NaOH 2 M (40,0 mmol, 20,0 mL) e resfriou-se a
mistura em banho de gelo para adição, gota a gota, do peróxido de hidrogênio
30% (12 mL). Após a adição, manteve-se a reação à temperatura ambiente por
30 minutos sob agitação. Evaporou-se a mistura e extraiu-se com CH2Cl2 (3 x
de 20 mL) .A fase orgânica foi lavada com brine (3 x de 20 mL)e água (3 x de
20 mL) e foi seca com Na2SO4 e evaporada. A mistura foi purificada por
cromatografia flash com 20% de EtOAC/hexano, fornecendo 4 em 67% de
rendimento (1,93 g).
IV (NaCl, max , cm -1): 3390, 2964,2929, 2857, 1452, 1374, 1121.
CG-EM: m/z 154 (16), 136 (16), 121 (44), 107 (41), 94 (100), 79 (69), 67
(63), 55 (37), 41 (28),
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ (multiplicidade, J)]: 0,91 (d; 6,7; CH3), 0,94 (d,
6,6; CH3), 1,64 (s, CH3, anel), 1,21–2,07 (m, 13H), 3,50 (m, CH, carbinólico),
3,67 (m, CH, carbinólico), 5,38 (m, CH, dupla no anel).
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 133,7; 120,5; 66,1; 40,0; 35,0; 30,5; 27,4;
23,3, 13,5.
62
5.3.3.2-(4-metilciclohex-3-enil)-propanal (5)
PCC
CH2Cl2,
H
ta.,1,5 h
H
O
OH
154,25
(4)
152,23
(5)
Em um balão de 50 mL, seco e com septo, foi adicionado o PCC (700,0
mg, 1 eq., 3,2 mmol) e colocado na bomba de vácuo por 1 hora para retirar a
água, após isso foi adicionada a peneira molecular (que foi ativada a 350 °C
por 4 horas) e o álcool (500,0 mg, 1 eq, 3,2 mmol) diluído em dicloro metano
(20,0 mL). A reação foi mantida por agitação por 1 hora e meia e acompanhada
por cromatografia camada delgada. Após este tempo, a mistura foi filtrada em
Florisil® utilizando-se diclorometano como eluente. O material foi separado em
coluna flash com EtOAC/hexano (1%), fornecendo 5 em 81% de rendimento
(400,0 mg).
IV (NaCl, max , cm -1): 2963, 2920,1725, 1451, 1374.
CG-EM: m/z 152 (1), 137 (15), 119 (13), 94 (7), 79 (2), 67 (14), 55 (19),
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ (multiplicidade, J)]: 1,06 (d; 3,7; CH3), 1,09 (d,
4,0; CH3), 1,91 (s, CH3, anel ), 1,30–2,30 (m, 8H), 5,37 (m, CH, dupla no anel),
9,66 (d; 2,6; CH3), 9,67 (d, 2,42; CH3) .
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 205,4; 134,0; 119,9; 50,2; 40,0; 35,0; 30,5;
27,4; 23,3, 13,5.
63
5.3.4.metil-(4-metilciclohex-3-enil)-hept-5-en-3 (7)
Zn, 2 h
NH4Cl(aq)/THF
H
H
Br
O
152,23
149,03
222,37
(6)
(7)
OH
(5)
Em um balão de 50 mL, seco e com uma barra magnética, foi adicionado
o aldeído (65,0 mg, 0,43 mmol). Adicionou-se em seguida o THF (10,0 mL) e a
solução saturada de cloreto de amônio (10,0 mL). À solução de aldeído, sob
agitação vigorosa e à temperatura ambiente, foi adicionado o brometo de
prenila (128 mg, 0,86 mmol) e logo em seguida o zinco em pó (0,85 mg, 1,27
mmol) (ativado com ácido clorídrico e lavado com água destilada e em seguida
com etanol e depois éter, filtrado e colocado na bomba de vácuo para secar). A
mistura foi mantida sob agitação por 2 horas. O material foi separado em
coluna flash com EtOAC/hexano (5%), fornecendo (7) em 45% de rendimento
(42,0 mg).
IV (NaCl, max , cm -1): 3483, 2964, 2913, 2832, 1452, 1119.
CG-EM: m/z 222 (5), 207 (1), 189 (2), 135 (16), 121 (9), 107 (25), 94 (100),
79 (25), 70 (29), 55 (18)
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ (multiplicidade, J)]: 0,84 (d; 3.6; CH3), 0,87 (d,
3,7; CH3), 1,61 (s, CH3, 3H), 1,68 (s, CH3 cadeia alquílica e cíclica),; 1,10–2,16
(m, 9H), 3,43 (m, CH, 1H carbinólico), 5,04 (m; CH, dupla da cadeia aberta ),
5,32 (m, CH, dupla do anel) .
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 134,8; 131,7; 124,5; 120,6; 71,0; 40,5; 36,1;
30,5; 25,5; 23,3, 15,6.
64
5.3.5. 4-(1-bromopropan-2-il)-1-metilciclohex-1-ene (9)
PPh3, CBr4
CH2Cl2,
t.a.,3 h
H
H
Br
OH
154,25
(4)
217,15
(9)
Em um balão de 3 bocas, foi adicionado o álcool (4) (340,0 mg, 2,20
mmol) e o tetrabrometo de carbono (925,0 mg, 2,27 mmol), dissolvido em
dicloro metano (20,0 mL). O balão foi resfriado a 0 °C e adicionou-se
trifenilfosfina (680,0 mg, 2,59 mmol) em pequenas porções, via adicionador de
sólidos, com vigorosa agitação. Após a adição da trifenilfosfina, a solução foi
agitada por 4 horas à temperatura ambiente. A mistura foi evaporada e
concentrada para um óleo marrom e rapidamente foi adicionado hexano (20,0
mL). Formou-se um precipitado branco e o filtrado foi retirado com pipeta
Pasteur e coletado em um balão. O material foi purificado em cromatografia
flash com hexano puro, fornecendo 8 em 71% de rendimento (315,0 mg).
CG-EM: m/z 218 (4), 216 (4), 195 (7), 123 (11), 95 (100), 81 (29), 67 (34),
55 (12), 41 (17),
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ ( multiplicidade, J)]: 1,02 (d; 6,6; CH3), 1,05 (d,
6,6; CH3), 1,64 (s, CH3, anel ), 1,21–2,09 (m, 8H), 3,37-3,51 (m, CH2 ligado ao
bromo), 5,37 (m, CH, dupla no anel).
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 134,1; 120,2; 40,3; 36,7; 30,4; 27,6; 23,4,
16,1.
65
5.3.6. (3R)-3,7-dimetil-2-(3-oxobutil)oct-6-enal (13)
O
O
O
DEATMS
CH3CN
refluxo, 20 h
(11)
O
(12)
(13)
Uma solução de (R)-(+)-citronelal 90% (2,78 g; 16,21 mmol; 3,3 mL),
metil vinil cetona (3,16 g; 40,52 mmol; 3,8 mL) e dietilamina trimetilsilano (2,43
mg; 16,21 mmol; 3,3 mL) em acetonitrila (200 mL) foi refluxada por 20 h com
agitação e em atmosfera de nitrogênio. Após este período, a mistura foi
evaporada em evaporador rotatório e posteriormente em bomba de vácuo para
eliminação do excesso de MVC. O produto bruto foi utilizado na etapa seguinte
sem purificação prévia.
5.3.7. (R)-6-metilhept-5-en-2-il)-ciclohex-2-enona (14)
O
O
KOH, TBAOH
O
THF, Et2O, refluxo 16h
(13)
H
(14)
Ao resíduo da reação anterior, em THF (60,0 mL) e Et2O (250 mL), sob
agitação e em atmosfera de nitrogênio, adicionou-se solução aquosa de
hidróxido de potássio 5% (250 ml) e de tetrabutilamônio 30% (10,0 mL). A
mistura foi aquecida (35 °C) e mantida em refluxo p or 16 horas. A fase orgânica
foi extraída com acetato de etila (3 x 20 mL), lavada com água (2 x 20 mL) e
66
brine (2 x 20 mL) e seca com sulfato de sódio anidro. A mistura foi purificada
por cromatografia flash (EtOAc/hexano)- 2% a 10% de EtOAc, fornecendo (14)
em 85% de rendimento (2,96 g).
IV (NaCl, max , cm -1): 3023, 2960, 2854, 1693, 1453, 1382.
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ (multiplicidade, J)]: 0,91 (d; 6,9; CH3), 0,95 (d,
6,8; CH3), 1,61 (s, CH3), 1,63 (s, CH3), 1,12–2,6 (m, 11H), 5,1 (m, CH da dupla
na cadeia aberta), 6,04 (d, CH, dupla no anel), 6,86 (m, CH, dupla no anel).
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 200,1; 155,5; 131,7; 129,8; 124,0; 41,5;
37,6, 35,9; 34,0; 25,7; 17,6; 16,4.
5.3.8. zingiberenol a partir do (R)-citronelal (15)
O
OH
MeLi
H
(14)
Et2O, - 78 °C, 1,5 h
H
(15)
Em um balão seco, tampado com septo de borracha e em atmosfera de
nitrogênio, foi adicionada a cetona (14) (2,60 g, 12,60 mmol) diluída em éter
(50,0 mL) e manteve-se sob agitação. Resfriou-se a mistura a -78 °C e
adicionou-se gota a gota o metil lítio (1,6 M em éter etílico), (35,0 mL, 56,0
mmol). A solução adquiriu uma coloração amarelo claro. Manteve-se a mistura
em agitação por 1 hora e meia e parou-se a reação adicionando-se solução
saturada de cloreto de amônio até a neutralização completa (testada com fita
de pH). Extraiu-se a mistura com acetato de etila (3 x de 20 mL) , lavou-se
com água (2 x 20 mL) e brine (2 x de 20 mL), secou-se com sulfato de sódio
anidro e evaporou-se o resíduo orgânico. A mistura foi purificada em
67
cromatografia flash (EtOAc/hexano)- 1% a 15% de EtOAc, fornecendo (15) em
71% de rendimento (1,98 g) na forma de 2 grupos de diastereoisômeros:
menos polares (15a) e mais polares (15b).
(15a) :
IV (NaCl, max , cm -1): 3383, 2964, 2927, 2856, 1453, 1377, 1121.
CG-EM: m/z 222 (5), 207 (15), 204 (13), 189 (7), 179 (2), 161 (14), 137
(19), 119 (62), 109 (28), 93 (41), 77 (19), 69 (100), 55 (30), 41 (50).
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ (multiplicidade, J)]: 0,85 (d; 6,7; CH3), 0,89 (d,
6,6; CH3), 1,26 (s, CH3, anel ), 1,60 (s, CH3), 1,70 (s, CH3), 1,11–2,12 (m, 11H),
5,10 (m, CH, alilico cadeia aberta) e 5,67 (m, CH, alílico anel).
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 134,1; 133,5; 133,4; 133,0; 131,3; 124,8
124,7; 67,4; 67,3; 41,0; 40,3; 37,4; 37,3; 36,2; 34,1; 33,5; 29,6; 25,9; 25,8;
22,2; 20,0; 17,6; 16,3; 15,7.
(15b) :
IV (NaCl, max , cm -1): 3377, 2965, 2935, 2860, 1453, 1378, 1121.
CG-EM m/z 222 (4), 207 (20), 204 (28), 189 (6), 179 (4), 161 (25), 137
(28), 119 (93), 109 (31), 93 (68), 77 (28), 69 (100), 55 (29), 41 (50).
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ (multiplcidade, J)]: 0,87 (d; 6,7; CH3), 0,83 (d,
6,6; CH3), 1,27 (s, CH3, anel ), 1,61 (s, CH3), 1,69 (s, CH3), 1,21–2,22 (m, 11H),
5,12 (m, CH, alilico cadeia aberta) e 5,67 (m, CH, alílico anel).
68
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 134,8; 134,3; 132,1; 131,4; 130,8; 124,6;
68,8; 40,6; 40,0; 38,4; 38,2; 36,3; 36,1; 34,1; 33,8; 28,4; 28,2; 25,9; 25,6; 24,0;
22,2; 17,6; 16,3; 15,6.
5.3.9.(3S)-3,7-dimetil-2-(3-oxobutil)oct-6-enal (17)
O
O
O
DEATMS
CH3CN
refluxo,20h
(16)
O
(12)
(17)
Uma solução de (R)-(+)-citronelal (1,88 g; 13,61 mmol; 2,2 mL) , metil
vinil cetona (2,13 g; 34,04 mmol; 2,5 mL) e dietilamina trimetilsilano (1,75 g;
13,61 mmol; 2,2 mL) em acetonitrila
(144 mL) foi refluxada por 20 h com
agitação e em atmosfera de nitrogênio. Após este período a mistura foi
evaporada por evaporador rotatório e posteriormente em bomba de vácuo para
eliminação do excesso de MVC. O produto bruto foi utilizado na etapa seguinte
sem purificação prévia.
5.3.10.
(S)-6-metilhept-5-en-2-il)-ciclohex-2-enona (18)
O
O
KOH, TBAOH
O
THF, Et2O, refluxo 16h
(17)
H
(18)
69
Ao resíduo da reação anterior, em THF (40,0 mL) e Et2O (170 mL),
agitação e em atmosfera de nitrogênio, adicionou-se solução aquosa de
hidróxido de potássio 5% (170 mL) e de tetrabutilamônio 30% (7,0 mL). A
mistura foi aquecida (35 °C) e mantida em refluxo p or 16 horas. A fase orgânica
foi extraída com acetato de etila (3 x 15 mL), lavada com água (15 mL) e brine
(2 x 15 mL) e seca com sulfato de sódio anidro. A mistura foi purificada por
cromatografia flash (EtOAc/hexano)- 2% a 10% de EtOAc, fornecendo (18) em
86% de rendimento (2,0 g).
IV (NaCl, max , cm -1): 3023, 2960, 2854, 1693, 1453, 1382.
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ (multiplicidade, J)]: 0,91 (d; 6,9; CH3), 0,95 (d,
6,8; CH3), 1,61 (s, CH3), 1,63 (s, CH3), 1,12–2,60 (m, 11H), 5,1 (m, CH da dupla
na cadeia aberta), 6,04 (d, CH, dupla no anel), 6,86 (m, CH, dupla no anel).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 200,1; 155,5; 131,7; 129,8; 124,0; 41,5; 37,6,
35,9; 34,0; 25,7; 17,6; 16,4.
5.3.11.
zingiberenol a partir do (S)-citronelal (19)
O
OH
MeLi
H
(18)
Et2O, - 78 °C, 1,5 h
H
(19)
Em um balão seco, tampado com septo de borracha e em atmosfera de
nitrogênio, foi adicionada a cetona (14) (1,70 g, 8,30 mmol) diluída em éter
(35,0 mL) e manteve-se sob agitação. Resfriou-se a mistura a -78 °C e
adicionou-se gota a gota o metil lítio (1,6 M em éter etílico), (23,0 mL, 37,0
mmol). A solução adquiriu uma coloração amarelo claro. Manteve-se a mistura
em agitação por 1 hora e meia e parou-se a reação adicionando-se solução
70
saturada de cloreto de amônio até a neutralização completa (testada com fita
de pH). Extraiu-se a mistura com acetato de etila (3 x de 15 mL) , lavou-se
com água (15 mL) e brine (2 x de 15 mL), secou-se com sulfato de sódio anidro
e evaporou-se o resíduo orgânico . A mistura foi purificada por cromatografia
flash (EtOAc/hexano)- 1% a 15% de EtOAc, fornecendo (19) em 80% de
rendimento (1.48 g ) na forma de 2 grupos de diastereoisômeros: menos
polares (19a) e mais polares (19b).
(19a) :
IV (NaCl, max , cm -1): 3383, 2964, 2927, 2856, 1453, 1377, 1121.
CG-EM: m/z 222 (5), 207 (15), 204 (13), 189 (7), 179 (2), 161 (14), 137
(19), 119 (62), 109 (28), 93 (41), 77 (19), 69 (100), 55 (30), 41 (50). Isômero
coincidente com composto específico dos machos de O. poecilus.
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ (multiplcidade, J)]: 0,85 (d; 6,7; CH3), 0,89 (d,
6,6; CH3), 1,26 (s, CH3, anel ), 1,60 (s, CH3), 1,70 (s, CH3), 1,11–2,12 (m, 11H),
5,10 (m, CH, alílico cadeia aberta) e 5,67 (m, CH, alílico anel).
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 134,1; 133,6; 133,3; 133,0; 131,3; 124,7
124,6; 67,4; 67,3; 41,0; 40,4; 37,4; 37,2; 36,2; 34,1; 33,5; 29,6; 25,9; 25,8;
22,1; 20,0; 17,6; 16,3; 15,7.
(19b) :
IV (NaCl, max , cm -1 ): 3377, 2965, 2935, 2860, 1453, 1378, 1121.
CG-EM m/z 222 (4), 207 (20), 204 (28), 189 (6), 179 (4), 161 (25), 137
(28), 119 (93), 109 (31), 93 (68), 77 (28), 69 (100), 55 (29), 41 (50).
71
RMN 1H [300 MHz, CDCl3, δ ( multiplcidade, J)]: 0,87 (d; 6,7; CH3), 0,83 (d,
6,6; CH3), 1,27 (s, CH3, anel ), 1,61 (s, CH3), 1,69 (s, CH3), 1,21–2,22 (m, 11H),
5,12 (m, CH, alilico cadeia aberta) e 5,67 (m, CH, alílico anel).
RMN
13
C (75 MHz, CDCl3) δ : 134,7; 134,4; 132,0; 131,2; 130,8; 124,6;
68,8; 40,6; 40,0; 38,3; 38,2; 36,2; 36,1; 34,1; 33,6; 28,3; 28,2; 25,9; 25,6; 24,0;
22,2; 17,6; 16,3; 15,6.
5.4. Bioensaios
5.4.1. Bioensaios com insetos
Os experimentos foram realizados para determinar se as fêmeas eram
atraídas pelo machos como acontece com outras espécies de percevejos.4346
A atração das fêmeas pelo odor de machos e fêmeas foi testada em um
olfatômetro em Y, no qual foi colocado um macho em um dos braços, uma
fêmea no outro braço e a fêmea a ser testada na extremidade do
olfatômetro em Y. Nos braços, foram colocadas mangueiras conectadas a
seringas de vidro limpas e ligadas a uma pequena bomba de ar com fluxo
de 0,4 L/min e um filtro de carvão (20/40 mesh). O ar foi umidificado
fazendo-o passar através de um recipiente contendo água destilada,
localizado entre o filtro de carvão e os braços do olfatômetro.
Na
extremidade do Y, foi conectada uma mangueira ligada a uma bomba de
vácuo com fluxo de 0,3 L/min.
43
Borges, M.; Ann. Soc. Entomol. Brasil. 1995, 24, 215.
Mcbrien, H. L.; Millar, J. G. CABI Publishing,London, UK, 1999, 1797.
45
Millar, J. G. Springer Verlag, Berlin, Heildel, Germany, 2005, 240, 37.
46
Moraes, M. C. B.; Millar, J. G.; Laumann, R. A.; Suii, E. R.; Pires, C. P. S.; Borges, M.
J. Chem. Ecol. 2005, 31, 1405.
44
72
Foram consideradas como respostas a primeira escolha da fêmea
testada, isto é, o primeiro braço do olfatômetro que o inseto escolheu e
permaneceu por tempo igual/superior a 60 segundos, ou o braço que o
inseto escolheu por 3 vezes e permaneceu por pelo menos 30 segundos
em cada escolha.
A posição dos braços do olfatômetro foram invertidas entre controle e
tratamento após cada três repetições para evitar vício de resposta em
função da posição. Os aparatos foram limpos com detergente neutro sem
fragrância, enxaguados com água e secos ao ar. Estes eram limpos sempre
que necessário.
Os insetos eram gentilmente colocados dentro das seringas (insetostratamento e controle) e mantidos por 3 minutos antes de ligar o sistema
(para minimizar a liberação de compostos defensivos). As fêmeas a serem
liberadas eram gentilmente colocadas na entrada da base do Y e seu
padrão de comportamento (resposta) foi registrado por 15 minutos. Os
machos e fêmeas (tratamento e controle) eram trocados a cada 3
bioensaios ou quando não se obtivesse resposta alguma.
5.4.2. Bioensaios com extratos de machos e compostos
sintetizados
Os
bioensaios
com
extratos
e
compostos
sintetizados
(diastereoisômeros menos polares, vindo do (R) e do (S)- citronelal,
separadamente), foram realizados como descrito acima. As soluções de
teste de estímulo (extratos de machos)
eram correspondente a 1
equivalente individual liberado pelo macho em 24 horas e foram colocadas
em um pedaçõ de papel de filtro (1,5 cm de comprimento/ 0,5 cm de
largura). O controle consistia de papel de filtro tratado com hexano.
Os bioensaios com os compostos sintetizados,foram realizados da
mesma maneira que os extratos de machos, utilizando-se uma solução 0,1
mg/mL (10 µL por papel- seguindo o mesmo padrão utilizado na referência
28).
73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
74
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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76
ANEXOS
77
3.1
15.1
2.1
3.1
OH
3.1
H
OH
3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 3.50 3.45 3.40
2.1
1.0
0.96 0.94 0.92 0.90 0.88
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
Espectro de RMN 1H do composto (4)
78
66.10
65.97
H
133.8
OH
OH
66.40 66.20 66.00 65.80 65.60
120.45
134.20 134.00 133.80 133.60 133.40
120.80
150
140
130
120
110
120.60
120.40
100
120.20
120.00
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Espectro de RMN 13C do composto (4)
79
H
OH
Espectro de infravermelho do composto (4)
80
H
OH
Espectro de massas (ESI) do Composto (4)
81
2.9
O
H
O
3.0
1.0
9.72 9.70 9.68 9.66 9.64 9.62 9.60
5.40 5.35 5.30
5.25
1.1
1.0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Espectro de RMN 1H do composto (5)
82
119.80
119.88
133.99
205.44
205.35
133.96
O
H
O
120.40
205.80 205.60 205.40 205.20 205.00 204.80
120.20
120.00
119.80
119.60
119.40
134.05 134.00 133.95 133.90
200
175
150
125
100
75
50
25
0
Espectro de RMN 13C do composto (5)
83
H
O
Espectro de massas do composto (5)
84
H
O
Espectro de infravermelho do composto (5)
85
3.1
2.9
3.1
HH
OH
OH
1.1
0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65
1.0
1.1
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
Espectro de RMN 1H do Composto (7)
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
86
H
OH
OH
170
160
150
Espectro de RMN
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
13
C do Composto (7)
87
H
OH
Espectro de massas do compostos (7)
88
H
OH
Espectro de infravermelho da mistura dos 4 isômeros de (7)
89
3.1
Br
14.1
H
Br
3.60
3.50
3.40
3.30
3.20
2.0
5.45 5.40 5.35 5.30 5.25 5.20
1.0
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
Espectro de RMN H do Composto (9).
90
120.22
120.17
H
Br
Br
133.94
134.00
120.60 120.50 120.40 120.30 120.20 120.10 120.00 119.90 119.80
134.40 134.20 134.00 133.80 133.60
200
Espectro de RMN
175
150
125
100
75
50
25
0
13
C do Composto (9).
91
H
Br
Espectro de massas do Composto (9)
92
16.0
O
3.1
3.1
H
0.9
0.8
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
1.1
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
Espectro de RMN 1H do Composto (14) – Cetona zingiberenol [(R)- Citronelal]
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
93
-0.5
200.1
O
155.47
154.37
H
200.40 200.30 200.20 200.10 200.00 199.90 199.80 199.70
158.0 157.5 157.0 156.5 156.0 155.5 155.0 154.5 154.0 153.5 153.0 152.5 152.0 151.5 151.0 150.5 150.0
200.1
225
200
175
150
125
100
Espectro de RMN 13C do Composto (14) – Cetona zingiberenol [(R)- Citronelal]
75
50
25
0
94
Espectro de infravermelho do composto (14)
95
3.1
OH
3.0
OH
3.0
H
2.0
1.0
3.1
3.1
5.70 5.60 5.50 5.40 5.30 5.20 5.10 5.00
2.0
1.0
0.90 0.85 0.80 0.75 0.70
8.5
8.0
7.5
1
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
Espectro de RMN H de (15b) - zingiberenol mais polares [(R)- citronelal
96
OH
OH
H
70.00 69.80 69.60 69.40 69.20
136 135 134 133 132 131 130 129 128 127 126 125 124
200
Espectro de RMN
175
150
125
100
75
50
25
0
13
C de (15b) - zingiberenol mais polares [(R)- citronelal]
97
OH
Isômeros mais polares
H
Espectro de massas de (15b) - zingiberenol mais polares [(R)- citronelal]
98
OH
H
Espectro de infravermelho do (R)- zingiberenol mais polares (15b)
99
OH
OH
H
20.2
1.00 0.90 0.80 0.70 0.60
5.80 5.60 5.40 5.20 5.00 4.80
3.1
2.1
1.0
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
1
Espectro de RMN H de (15a) - zingiberenol menos polares [(R)- citronelal]
100
OH
OH
70.00 69.80 69.60 69.40 69.20
H
136 135 134 133 132 131 130 129 128 127 126 125 124
200
175
Espectro de RMN
150
125
100
75
50
25
0
13
C de (15a) - zingiberenol menos polares [(R)- citronelal
101
OH
H
Espectro de infravermelho do (R)- zingiberenol menos polares (15a)
102
19.0
O
2.9
2.9
H
4.65 4.70 4.75 4.80 4.85 4.90
1.0
0.9
1.2
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
Espectro de RMN 1H do Composto (18) – Cetona zingiberenol [(S)- Citronelal
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
103
O
155.42
154.32
H
200.08
162 160 158 156 154 152 150 148 146 144 142
200.50 200.40 200.30 200.20 200.10 200.00 199.90
200
Espectro de RMN
199.80 199.70
175
150
125
100
75
50
25
0
13
C do Composto (18) – Cetona zingiberenol [(S)- Citronelal
104
23.1
OH
OH
H
3.0
2.9
3.0
1.60 1.80 2.00 2.20 2.40
2.3
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
1.0
5.0
0.90
4.5
4.0
3.5
0.85
3.0
0.80
2.5
0.75
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
Espectro de RMN 1H de (19b) - zingiberenol mais polares [(S)- citronelal]
105
OH
OH
H
69.85 69.80 69.75 69.70 69.65
200
175
150
125
100
75
50
25
0
Espectro de RMN 13C de (19b) - zingiberenol mais polares [(S)- citronelal]
106
OH
H
Espectro de infravermelho do (19b) - zingiberenol mais polares [[(S)- citronelal]
107
OH
OH
20.4
H
1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50
3.3
2.2
1.0
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
1
Espectro de RMN H de (19a) - zingiberenol menos polares [(S)- citronelal]
108
OH
OH
67.37
67.30
H
67.80 67.60 67.40 67.20 67.00 66.80 66.60
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Espectro de RMN 13C de (19a) - zingiberenol menos polares [(S)- citronelal]
109
OH
H
Espectro de Infravermelho de (19a) - zingiberenol menos polares [[(S)- citronelal]
110