MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Aula 7 – Cromatografia Liquida de Alta
Eficiência – CLAE
Profa. Daniele Adão
Cromatografia a líquido clássica
O que é Cromatografia a líquido de alta
eficiência - CLAE?
 Emprego de altas pressões, diferente da CL clássica que opera
à pressão ambiente.
 A CLAE é uma técnica de ultra-microanálise podendo,
dependendo da substância e do detector empregado,
quantificar massas de componentes inferiores a 10-18g.
 Na cromatografia a líquido as espécies que estão sendo
analisadas sofrem influência enorme da FE, e ao mesmo tempo
as propriedades destas estão continuamente influenciadas pela
FM (fato que não ocorre na CG).
Cromatografia a líquido de alta eficiência
Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um
líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa
molar de 32 até 4.000.000.
Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.
Cromatografia a líquido de alta eficiência
VANTAGENS:
 Não necessita que a amostra seja volátil (requisito da CG);
 Tempo reduzido de análise;
 Alta resolução;
 Boa detectabilidade e bons resultados quali e quantitativos.
DESVANTAGENS:
 Alto custo do equipamento;
 Não existe um detector universal com boa detectabilidade e
baixo custo.
HPLC, CLAE OU CLAD?
• HIGH PRESSURE (OR PEFORMANCE) LIQUID
CHROMATOGRAPHY - HPLC
• CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA –
CLAE
• CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO DE ALTO DESEMPENHO –
CLAD
DIFERENÇAS ENTRE CG E CLAE
Parâmetros
Fase móvel
CG
CLAE
Gás inerte
Líquida
Líquida ou sólida
Líquida ou sólida
1,0 a 100,0m
Menor que 30,0cm
Gás ou líquido
Líquido
Gás
Líquido
Temperatura da coluna
100 a 300°C
Ambiente a 65°C
Identificação dos picos
Tempo de retenção
Tempo de retenção
10-12g
10-9g
Ionização em chama ou
Absorbância do UV
Fase estacionária
Tamanho da coluna
Fase do composto
- Injetado
- Detectado
Quantidade mínima
detectável
Detectores mais usados
captura de elétrons
Pratos teóricos por coluna
2.000 a 3.000.000
500 a 25.000
Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência
Aplicabilidade
Aumento de polaridade\
Insolúvel em água
Solúvel em água
Apolar
Iônico
Polar não iônico
Espécies iônicas com MM
mais baixas CTI é amplamente
usada.
Partição
102
Adsorção
Massa molecular
103
Partição
em fase
reversa
Partição
em fase
normal
Troca
iônica
104
105
106
Permeação
em gel
Exclusão
Para solutos com MM >
10.000 a CE é usada com
frequência.
Filtração
em gel
Espécies pequenas e polares,
mas não-iônicas, são mais
indicadas para os métodos de
partição (CLL).
A cromatografia por adsorção
(CLS) é escolhida para separar
espécies não polares, de
isômeros estruturais e de
classes de compostos (p.e.: HC
alifáticos de alcoóis alifáticos)
Instrumentação para CLAE
Coletor de
solvente
Reservatório
do solvente
Coluna
Sistema
computadorizado de
coletor de dados
Microsseringa
Câmara de
mistura
Injetor
Detector
loop
Bomba de
alta pressão
Registrador
Instrumentação para CLAE
Instrumentação para CLAE
Instrumentação para CLAE
FM
INJETOR
PURGA
COLUNA
DETECTOR
BOMBA
Instrumentação para CLAE
Um cromatógrafo a líquido é composto de:
• Reservatório e sistema de bombeamento da FM;
A bomba é o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da
FM (solvente).
• Sistema de injeção da amostra:
Injetor é o dispositivo que tem a função de introduzir a amostra na FM;
• Sistema analítico - Coluna cromatografia e termostato:
É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da
amostra;
• Sistema de detecção:
Detector é o dispositivo que tem a função de detectar os componentes
eluídos da coluna cromatográficas.
• Sistema de registro e tratamento de dados.
Instrumentação para CLAE
Reservatórios para FM
A linha do solvente possui em sua extremidade um
filtro de aço inoxidável que permite reter as partículas
sólidas.
Instrumentação para CLAE
Bombas de alta pressão
As bombas empregadas devem apresentar:
 Devem operar a pressões de até 500
atm com a mesma precisão e exatidão
de operações a pressão quase
ambiente;
 Resistentes a alta pressão;
 Devem ser constituídas de material
inerte;
 As vazões normalmente empregadas
vão de 0,005 até no máximo 4 ou 5
ml/min.
 Os controles eletrônicos devem permitir
programação da vazão
Instrumentação para CLAE
Componentes auxiliares
Válvula de purga:
• É o dispositivo que permite a troca rápida de solvente
desviando o fluxo de solvente para o dreno.
Misturador:
• É o dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes
quando operando com gradiente de eluição.
Instrumentação para CLAE
Sistema de Injeção
Existem basicamente 3 tipos de injetores: seringa, válvula
e automáticos.
1. INJETORES TIPO SERINGA:
VANTAGENS: são baratos
DESVANTAGENS:
- Aplica a amostra diretamente na coluna;
- Dificuldade de injetar volumes precisos;
- Deve-se vencer a pressão da bomba.
Instrumentação para CLAE
Sistema de Injeção
2. INJETORES TIPO VÁLVULA: Introdução da amostra é
efetuada com um “loop” externo.
VANTAGENS:
- injeta volumes precisos;
- “loop” de diferentes tamanhos (mais utilizados: 20 e 100 μL).
Instrumentação para CLAE
Sistema de Injeção
Posição para injetar
Posição para carregar
Instrumentação para CLAE
Sistema de Injeção
3. INJETORES AUTOMÁTICO: São injetores de válvula
controlados por microprocessador;
- Permite Injetar diferentes volumes das amostras que são
colocadas em um carrossel, conforme programação prévia;
-A pressão da seringa é suficiente para a amostra passar a
válvula de controle.
VANTAGENS:
- todas as do injetor tipo válvula;
- injeta amostras automaticamente.
DESVANTAGENS:
- preço.
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
Na CLAE podem ser usados três tipos de colunas: a coluna de
saturação, a coluna de guarda e a coluna de separação.
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
COLUNA DE SATURAÇÃO: é colocada entre a bomba e o
injetor sendo usada pra condicionar a fase estacionária.
 Muito empregada no passado quando se utilizava a CLL com
a finalidade de saturar a FM com o líquido da FE, não sendo tão
necessária atualmente.
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
COLUNA DE GUARDA: é colocada entre o injetor e a coluna
analítica, esta possui normalmente de 2 a 5cm e tem o mesmo
diâmetro interno e FE da coluna analítica.
 É utilizada para prevenir que impurezas e compostos fortemente
retidos, contaminem a coluna de separação.
Satura rapidamente.
Aumenta o tempo de vida útil da coluna analítica.
O custo das diversas trocas desta coluna ainda
é menor do que uma nova coluna analítica.
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
COLUNA DE SEPARAÇÃO: responsável pela separação dos
componentes da amostra. Podem ser separadas em colunas
analíticas e colunas preparativas.
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
COLUNA PREPARATIVA: Cromatografia de filtração em gel –
separação, isolamento e purificação de proteínas.
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
COLUNA PREPARATIVA
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
COLUNAS ANALÍTICAS: Permitem a separação de pequenas
quantidades do material a ser analisado.
 São constituídas de um tubo de algum material inerte. O aço
inoxidável é o material mais frequentemente utilizado;
Tem diâmetro interno uniforme, capaz de resistir às
pressões em que será usada e a possíveis sobrepressões
Ocasionais.
São normalmente retas, pois apresentam uma perda na
eficiência quando são dobradas.
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
DESVANTAGEM das colunas de vidro e plástico –
BAIXA RESISTÊNCIA A PRESSÃO
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
Instrumentação para CLAE
Colunas cromatográficas
CONDICIONAMENTO DA COLUNA: necessário para que
haja um perfeito equilíbrio da FM e da FE.
 Coluna nova – 4 a 8 horas
 Coluna para a alguns dias – 2 horas
 Coluna de uso diário – 15 minutos
A COLUNA DEVE SER GUARDADA EM SOLVENTE
ORGÂNICO OU FM
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
Basicamente são dois tipos de FE:
• PELICULAR:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico,
com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm, recoberto com
uma camada fina e porosa de:
• Sílica
• Alumina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina trocadora de íons
• PARTÍCULA POROSA:
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10
mm. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do
recobrimento pelicular.
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
TAMANHO DAS PARTÍCULAS:
• Macropartículas, quando apresentam diâmetro entre 20 e 40μm;
• Intermediárias, quando tem entre 20 e 10μm; e
•Micropartículas, de 3 a 10μm.
Quanto menor for a partícula, maior será a eficiência da
separação.
Porque isso ocorre?
Partículas menores reduzem a distância de contato do soluto com
as FE e FM, facilitando o equilíbrio e, consequentemente,
melhorando a eficiência da coluna.
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
TAMANHO DAS PARTÍCULAS:
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
• A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas
microporosas de sílica.
• São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial
de varias centenas de metros por gramas.
• Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
Superfície de sílica tem cerca de 8μmol de grupos silanol (Si-OH)
por metro quadrado, em pH entre 2,0 e 3,0.
Acima de pH 3,0, os grupos Si-OH se dissociam em Si-O-, podem
reter fortemente bases protonadas (como RNH3+), provocando a
formação de caudas nos picos.
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
• A sílica sozinha pode ser usada como FE para a
cromatografia de adsorção, e o desenvolvimento
cromatográfico é dito fase normal.
Mecanismo de separação: ADSORÇÃO
- FE: + POLAR que a fase móvel
- FM: mistura de solventes orgânicos
Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária quimicamente ligada
• Para utilização da sílica na cromatografia de partição, esta
deve estar quimicamente ligada.
• Dependendo do radical R ligado, o método cromatográfico
pode ser desenvolvido como fase normal ou fase reversa.
• A FE de octadecil (C18) é a mais utilizada na CLAE, sendo
representada por ODS (octadecilsilano).
C1
PFP
C-18
C8
Oxy-Phenyl
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária quimicamente ligada
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária quimicamente ligada
Como classificamos o método cromatográfico de acordo com a
polaridade?
C8
média
C18 (ODS)
Amostra
apolar
forte
Amostra
apolar
C4
fraca
Amostra
apolar
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária quimicamente ligada
Mecanismo de separação: PARTIÇÃO
INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO
SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
FE: APOLAR
FM: H2O, MeOH, CH3CN
ÁREA DE C SOLUTO
RETENÇÃO
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária quimicamente ligada
Tempo de Retenção e Hidrofobicidade
OH
C18 (ODS)
forte
OH
Interação
fraca
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária quimicamente ligada
 Se
a amostra possui
 CH3CH2CH2--- :

 Se
cadeia carbônica
: grupo aromático
A hidrofobicidade
será forte
a amostra possui
 -COOH
 -NH2
 -OH
: grupo carboxílico
A hidrofobicidade
: grupo amino
será fraca
: grupo hidróxi
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária quimicamente ligada
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária quimicamente ligada
VANTAGENS:
• Alta estabilidade química;
• Liberdade de escolha da FM, vazão e temperatura;
• Eluição por gradiente.
DESVANTAGENS:
• Preparo é trabalhoso;
• Menor recobrimento da superfície (apenas 50% dos silanóis);
• Restrição ao pH – 2 < pH < 8.
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária polimérica
• Alternativa a FE quimicamente ligada – combinam a
resistência mecânica do suporte inorgânico com a
seletividade e inércia química dos polímeros orgânicos.
VANTAGENS:
• Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte;
• Possibilidade de maior seletividade da FE (escolha do
polímero apropriado);
• Grande variedade de polímeros orgânicos disponíveis.
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária polimérica
PRINCIPAIS SUPORTES:
 Sílica
 Zircônia
 Titânia
 Alumina
PRINCIPAIS POLÍMEROS:
• Poli(etileno)
• Poli(butadieno)
• Poli(estireno)
• Poli(dimetilsiloxano)
• Poli(metiloctilsiloxano)
• Poli(metiloctadecilsiloxano)
• Poliéteres
• Polissacarídeos
• Poliaminas
• Polinucleotídeos
• Poliamidas
• Proteínas
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária polimérica
Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa
- Maior estabilidade
- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária iônica
Mecanismo de separação:
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
FE: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)
FM: Tampão (pH, força iônica, temperatura)
Aniônicas: amônio quaternário, aminas
Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária iônica
Fluxo da FM
Resinas Catiônicas
e Aniônicas
FE altamente carregada
Maior Interação:
• Íons de alta carga
• Íons de menor tamanho
A diferença de afinidade entre os
íons da FM pode ser controlada
por pH e força iônica.
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária iônica
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
Instrumentação para CLAE - FE
Descrição
Polaridade/ interação
Octadecil (C18)
Altamente apolar
Octil (C8)
Moderadamente apolar
Etil (C2)
Fracamente apolar
Metil (C1)
Fracamente apolar
Fenil (PH)
Moderadamente apolar
Cicloexano (CH)
Moderadamente apolar
Cianopropil (CN)
Moderadamente apolar/polar
Diol ( 2 OH)
Polar
Sílica (Si)
Polar
Ácido Carboxílico (CBA)
Troca catiônica fraca
Ácido Propilsulfônico (PRS)
Troca catiônica forte
Ácido Benzenossulfônico (SCX)
Troca catiônica forte
Aminopropil (NH2)
Troca aniônica fraca/polar
Amina Primária/Secundária (PSA)
Troca aniônica fraca/polar
Dietilaminopropil (DEA)
Troca aniônica fraca/polar
Amina Quaternária (SAX)
Troca aniônica forte
Ácido Fenilborônico (PBA)
Covalente
Instrumentação para CLAE
Escolha da FE mais adequada
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
C18
Fenil
Polar
Figure 1: Comparison of chromatograms from same manufacturer.
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária
Figure 2: Comparison of separations obtained using (a) a C18 column
from one manufacturer with (b) an embedded-polar-group column from a
second manufacturer
Instrumentação para CLAE
Fase estacionária reversa - Otimização
Exercícios
1) Em uma coluna de C18 encontra-se um composto com tempo
de retenção igual a 14 min quando a FM é metanol.
– Qual solvente, água ou éter etílico, aparentemente
reduziria o tempo de retenção? Justifique.
R: Éter de petróleo por apresentar menor polaridade que o metanol. A
água é mais polar que o metanol, e pode elevar o tR do composto.
– Como esse método cromatográfico pode ser classificado?
Fase normal ou reversa? Justifique.
R: Fase reversa, pois a FE (C18) é apolar e a FM (metanol) é polar.
Exercícios
2) Uma mistura contendo 7 compostos foi separada em três
colunas diferentes (contendo grupos quimicamente ligados:
C1, C6 e C14). Justifique o tempo de retenção do composto
fenilfenol nos cromatogramas.
Exercícios
3) A FE foi preparada através da reação da sílica Kromasil 5 um
com agente sililante contendo um organossilano
monofuncional e grupo C8 para obtenção de uma fase com
grupo polar embutido. As colunas cromatográficas de 60 x 3,9
mm foram recheadas com 0,7 g da fase (10 %, v/v em
clorofórmio) a uma pressão de 38 MPa. O cromatograma dos
compostos paracetamol e cafeína utilizando a FM
água:metanol:ácido acético (68:28:3 v/v/v); vazão 0,7 mL/min;
temperatura 40 °C; detecção UV a 275 nm; volume de injeção
5uL. Qual a ordem de eluição?
Exercícios
R: