Coléteres em Bathysa nicholsonii K. Schum.
(Rubiaceae): ultraestrutura, composição protéica da
secreção e sua atividade antifúngica
Emilio de Castro Miguel
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
Campos dos Goytacazes
Março de 2006
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Coléteres em Bathysa nicholsonii K. Schum.
(Rubiaceae): ultraestrutura, composição protéica da
secreção e sua atividade antifúngica
Emilio de Castro Miguel
Dissertação a ser apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia como parte
das exigências do Programa de Pósgraduação em Biociências e Biotecnologia
para a obtenção do título de Mestre em
Biociências e Biotecnologia.
Orientadora: Dr. Maura Da Cunha
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
Campos dos Goytacazes, RJ
Março de 2006
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Coléteres em Bathysa nicholsonii K. Schum.
(Rubiaceae): ultraestrutura, composição protéica da
secreção e sua atividade antifúngica
Emilio de Castro Miguel
Dissertação a ser apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia como parte
das exigências do Programa de Pósgraduação em Biociências e Biotecnologia
para a obtenção do título de Mestre em
Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em 21 de Março de 2006
Comissão Examinadora
___________________________________________________
Dr. Ulysses Garcia Casado Lins – IM-UFRJ
___________________________________________________
Dra. Claudia Franca Barros - IPJBRJ
___________________________________________________
Dra. Kátia Valevski Fernandes - LQFPP-CBB-UENF
___________________________________________________
Dra. Maura Da Cunha
LBCT-CBB-UENF
(orientadora)
3
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual em
colaboração com o Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Microorganismos do Centro
de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, sob orientação da Dr. Maura Da Cunha e com financiamento da CAPES,
PETROBRAS, CNPq e FAPERJ e bolsa de mestrado concedida pela UENF/FAPERJ,
durante a vigência do curso.
4
Agradecimentos
À Dra. Maura Da Cunha pelo aprendizado, orientação, estímulo, amizade e dedicação
durante todo o tempo de nossa convivência.
À Dra. Valdirene Moreira Gomes pela ajuda nas análises bioquímicas e ensaios
antifungicos.
Ao Dr. Marco Antonio de Oliveira pela ajuda nos microscópios e excelentes dicas técnicas.
Ao Dr. Flávio Costa Miguens, pela criteriosa e bem humorada revisão.
Aos membros da Banca Examinadora Dra. Claudia Barros, Dr. Ulysses Lins e Dra. Kátia
Valevski, por aceitarem o convite.
À Érica, Isabela, André, Felipe e Suzana, pela ajuda no LFBM.
Ao Sr. Walter Silva pela ajuda da coleta do material botânico.
Ao Msc. Sebastião José da Silva Neto pela identificação no material botânico.
Ao Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, especialmente na figura dos seus técnicos,
Beatriz Ribeiro; Márcia Adriana Carvalho; Giovana Alves e Noil Freitas, pelo auxílio nos
microscópios e no setor de Preparo de Amostras para Microscopia.
Ao Programa Mata Atlântica pelo suporte técnico, e financeiro através da PETROBRAS.
Ao IBAMA e ao Dr. Luis Henrique (Diretor da Reserva Biológica de Tinguá), pela
permissão para a coleta de material botânico.
Aos colegas do nosso grupo de pesquisa.
Aos amigos Marcus Vinicius Oliveira e Leandro Mattos.
A Lucas Miguel, meu querido irmão.
A todos que eu me esqueci de agradecer mas, de alguma forma, foram importantes para a
realização desse trabalho. Vocês sabem como é final de tese.....
5
Dedicatória
Dedico esse trabalho à:
Emil Miguel Rosa,
Izaura de Freitas Castro Miguel
Lucas de Castro Miguel
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ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................
1.1 Floresta Atlântica ...............................................................................
1.2 Família Rubiaceae e Bathysa nicholsonii K. Schum .........................
1.3 Estípulas .............................................................................................
1.4 Tecidos secretores em plantas ...........................................................
1.5 Coléteres .......................... .................................................................
1.6 Aspectos subcelulares do processo de secreção vegetal ....................
1.6.1 Sistema endomembranar ........................................................
1.6.2 Transporte de substâncias em células vegetais .......................
1.6.3 Morte celular programada em plantas ....................................
1.7 Parede periclinal externa ...................................................................
1.7.1 Passagem de moléculas pela parede periclinal externa .........
1.8 Exsudatos vegetais: Características gerais e propriedades ...............
01
02
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2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 16
2.1 Objetivo geral .................................................................................... 16
2.2 Objetivos específicos ......................................................................... 16
3 MATERIAL E MÉTODOS ..............................................................................
3.1 Área de coleta .................... ...............................................................
3.2 Material botânico ...............................................................................
3.3 Microscopia........................................................................................
3.3.1 Microscopia Óptica.................................................................
3.3.2 Histoquímica............................................................................
3.3.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão..................................
3.3.4 Citoquímica..............................................................................
3.3.5 Microscopia Eletrônica de Varredura......................................
3.3.6 Microanálise de Raio-X (Energia dispersiva de Raios-X).......
3.4 Detecção de proteínas totais na secreção (SDS-PAGE).....................
3.5 Detecção de glicoproteínas................................................................
3.6 Detecção de atividade antifúngica no extrato total da secreção..........
17
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4. RESULTADOS ............................................................................................... 25
5. DISCUSSÃO ................................................................................................... 44
6. CONCLUSÃO ................................................................................................. 52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 53
8. ANEXO: Artigo aceito para publicação na revista Plant Biology ................... 66
7
RESUMO
Os coléteres são estruturas secretoras que podem ser encontrados em diversas famílias de
Angiospermae. Por definição, são estruturas secretoras constituídas por um eixo central
alongado, formado por parênquima fundamental, circundado por um estrato epidérmico em
paliçada, sendo as células epidérmicas responsáveis pela secreção. A função protetora dos
coléteres conferida pela sua secreção ainda é bastante discutível e pouco conhecida. A
secreção trata-se de um complexo fenômeno de separação ou isolamento de certas
substâncias do protoplasto, podendo incluir processo de síntese, acúmulo em determinados
compartimentos intracelulares, assim como liberação ou eliminação extracelular para
dentro de espaços internos próximos ou, então, para fora da superfície da planta. Durante
esse processo, alterações ocorrem não só no citoplasma, mas também na parede celular.
Para estudar a anatomia e ultraestrutura dos coléteres de Bathysa nicholsonii foram
utilizadas técnicas de microscopia óptica; eletrônica de varredura, incluindo microanálise
de Raios-X e eletrônica de transmissão. Para a detecção de proteínas na secreção foi feita
eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS. Foram feitos, ainda, testes de
inibição de crescimento de esporos de fungos fitopatogênicos. Na sua anatomia, os
coléteres são do tipo cilindriforme, com eixo central parenquimático e células epidérmicas
secretoras, apresentando estruturas lipídicas fortemente marcadas. Diversas fases de
maturação do citoplasma puderam ser notadas. As mudanças citoplasmáticas sugerem que
as células secretoras passam por um processo de morte celular programada não lisossomal
durante o seu desenvolvimento. A parede periclinal externa também apresentou mudanças
em sua organização durante a maturação. Foram notadas diversas fases, possivelmente
envolvidas com o processo de passagem das moléculas para o meio externo. A secreção
mostrou através de eletroforese a presença de várias bandas protéicas, com massas
moleculares variando entre 66 e 24 kDa. Foram observadas duas proteínas majoritárias com
massas moleculares de aproximadamente 26 e 36 kDa. O efeito da secreção obtida após
processamento protéico sobre a inibição do desenvolvimento dos fungos causou uma
significativa inibição no fungo Coletotrichum lindemuthianum, desde as primeiras horas de
crescimento.
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ABSTRACT
Colleters are secretory structures present in many Angiospermae families. These structures
are constituted by an elongated central axis formed by fundamental parenchyma,
surrounded by a palisade epidermis, being the epidermal cells responsible for the secretion.
The protective function of colleters conferred by their secretion is still controvesal. The
secretion is a complex phenomenon of separation and isolation of certain protoplast
substances. It may include synthesis and accumulation process in certain intracellular
compartments, well as liberation and extracelular elimination to nearby inner spaces or to
the outer side of plant surface. During this process, alteration occur not only the cytoplasm
but also in the cell wall. In orther to study the anatomy and ultrastructure of Bathysa
nicholsonii colleters, light microscopy, electron scanning microscopy, including X-Ray
microanalysis, and transmission electron microscopy were utilized. For protein detection,
the secretion was analysed by SDS-PAGE. Tests on the inhibitory potential of secretion on
the spore growth of phytophatogenic fungus were performed. In their anatomy, colleters are
cilindriform, with a parenchymatic central axis and epidermal secretory cells, presenting
lipophylic structures strongly stained. Many cytoplasm maturation phases could be noted.
Cytoplasmic changes, observed in secretory cells are indicative or a possible event of non
lisossomal programmed cell death occurring during the course of their development. The
outer cell wall was also presented organizational changes during maturation. Several phases
were noted, probably involved with molecules passage to the outside media. By
electrophoresis, the presence of different proteins, covering the range of66 to 24 kDa were
visualized in colleters secretion. Two majoritary proteins, with molecular masses of
approximately 26 and 36 kDa were noted. secretion extracted proteins presented a
inhibitory effect ont the growth of Colletotrichum lindemuthianum fungus, since the first
hours of growth.
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1. INTRODUÇÃO
Estruturas ou tecidos secretores podem estar presentes em diferentes regiões das
plantas e possuir formas variadas (Dickinson, 2000). Partindo do princípio que estruturas
secretoras formam um grupo polifilético, divergências evolutivas deram origem a diferentes
mecanismos de síntese e externalização de variados exsudatos (Dickinson, 2000). Estas
variações podem ser identificadas na anatomia e ultraestrutura das estruturas secretoras dos
coléteres, que são constituídas por um eixo central vascularizado circundado por uma
epiderme secretora, disposta em paliçada. Coléteres podem estar presentes na base das
estípulas, cálices, folhas, flores e ápices caulinares.
A morfologia, anatomia e ultraestrutura de coléteres em diversos gêneros da família
Rubiaceae foram recentemente descritas (Klein et al., 2004; Miguel, 2004; Miguel et al.,
2005-submetido; Moraes et al., 2005). Contudo, muitas questões permanecem em aberto.
Dentre estas, a morfofisiologia do processo de secreção em coléteres tem sido objetivo do
nosso grupo no setor de Citologia Vegetal – LBCT/UENF, contribuir para elucidar os
aspectos anatômicos e ultraestruturais da secreção em plantas, enfocando essas estruturas
em espécies da família Rubiaceae que ocorrem na Floresta Atlântica.
O ambiente encontrado em regiões de Floresta Atlântica é úmido, sendo propício
para o desenvolvimento de microrganismos, que apresentam diversas interações com estas
plantas, inclusive patogenia. Estudos envolvendo estas relações microrganismos/plantas são
necessários para elucidar os mecanismos de interação. Exemplifica esta abordagem, o fato
de que tem sido sugerido que o exsudato de coléter apresente papel importante na interação
bactéria/planta nos gêneros onde pode ser observada nodulação de bactérias (Horner e
Lersten, 1968; Lersten, 1975). Assim, acredita-se que a caracterização da secreção e a
avaliação de sua atividade biológica podem proporcionar o melhor entendimento do
envolvimento da secreção no mecanismo de defesa das espécies em questão.
Pelo exposto, o presente estudo tem como objetivo a análise anatômica e
ultraestrutural dos coléteres de Bathysa nicholsonii K. Schum (Rubiaceae), bem como,
analisar parcialmente a composição protéica e atividade antifúngica da secreção produzida
por estas estruturas secretoras.
11
1.1 Floresta Atlântica
O bioma Floresta Atlântica engloba vários tipos de vegetação (Rizzini, 1997) como
florestas ombrófilas densas ou mistas, florestas estacionais e ecossistemas associados como
restingas e manguezais. É uma das formações vegetais tropicais mais ameaçadas do mundo
pelo crescente desmatamento (Myers et al., 2000). Desde o início da colonização, com a
ocupação dos primeiros espaços territoriais próximos à região costeira, o Brasil passou por
diferentes ciclos de exploração como: o do pau-brasil; da cana-de-açúcar; da pecuária; do
ouro; e do café que contribuíram para a perda da cobertura florestal. Também a
industrialização e conseqüente urbanização com o surgimento das principais cidades e
metrópoles brasileiras fizeram com que a área originalmente ocupada pela Floresta
Atlântica fosse reduzida drasticamente (Quinet et al., 2000).
Mundialmente, apenas da década de 80 foram extintos cerca de 154 milhões de
hectares de florestas tropicais (FAO, 1993). Na Floresta Atlântica, possuindo altos índices
de endemismo (WCMC, 1992), estima-se que ocorram cerca de 8000 espécies de plantas
(Conservation International, 2006). No entanto, ainda é pouco conhecida em relação à
composição florística e aos processos ecológicos que envolvem suas comunidades e
populações. Originalmente, esta formação vegetal ocupava cerca de 1,2 milhões de km2,
hoje ocupa apenas 7 % do território original, sendo que desta área, somente 1-2 % tem
chances de ser preservada (Myers et al., 2000).
Atualmente, a Floresta Atlântica compreende remanescentes de cobertura florestais
bastante diversificadas na sua fisionomia e florística. Com uma grande população humana
vivendo em seu domínio, ocorre uma grande pressão sobre este conjunto de ecossistemas e
sua biodiversidade. Esta ocupação desordenada acaba por causar utilização irracional de
recursos naturais. Dentre as principais atividades presentes hoje nesse ecossistema,
resultam da ação direta do homem sobre as florestas: expansão agropecuária e urbana,
inclusive loteamentos clandestinos; empreendimentos de infra-estrutura; exploração
predatória de recursos florestais, sendo exemplos a extração de madeira e o turismo
desordenado; dentre outras (Fundação SOS Mata Atlântica, 2003).A cobertura atual desta
formação vegetal apresenta uma alta diversidade de famílias botânicas. Em alguns trechos,
a família Rubiaceae está dentre aquelas que apresentam grande número de indivíduos
(Lima e Guedes-Bruni, 1997).
12
1.2 Família Rubiaceae e Bathysa nicholsonii K. Schum.
A família Rubiaceae encontra-se entre as quatro maiores famílias de Angiospermas,
considerando-se o número de espécies, depois das famílias Asteraceae, Orchidaceae e
Fabaceae (lato sensu = Leguminosae), com cerca de 13.000 espécies e 650 gêneros
(Robbrecht, 2004). No Brasil, segundo Delprete (1998), a família compreende
aproximadamente 118 gêneros e 1.600 espécies.
A última revisão taxonômica da família foi feita por Robbrecht (1988). Desde então,
muitos trabalhos descrevendo novas espécies nessa família são encontrados na literatura
como, por exemplo, Devesa e Ortega-Olivencia (2003), Ortega-Olivencia e Devesa (2003),
Markey e de Lange (2003), Norton e de Lange (2003). Também são reportadas revisões do
gênero Xantophytum (Axelius, 1990); Ernode (NegronOrtiz e Hickey, 1996) e Simira
(Silva Neto, 2000)
Diversas espécies da família Rubiaceae apresentam um alto valor importância (VI)
no bioma Floresta Atlântica. Lima e Guedes-Bruni (1997) demonstraram que
aproximadamente 5 % das espécies catalogadas no remanescente de Floresta Atlântica da
Reserva Biológica de Macaé de Cima pertenciam a esta família. Guedes-Bruni (1998)
demonstra a importância desta família em outros remanescentes de Floresta Atlântica do
Estado do Rio de Janeiro.
Desde o início do século XIX, com a extração e caracterização da cafeína, a família
Rubiaceae tem se destacado pela presença de substâncias de propriedades terapêuticas em
suas estruturas. Atualmente, a família Rubiaceae vem se destacando pela produção de
substâncias medicinais ou potencialmente medicinais, por exemplo, microbicidas, anti
plasmódio, analgésicos, anti inflamatórios, anti tumores dentre outras (Abdel-Kader et al.,
1997; Capasso et al., 1997; Germano et al., 1999; Staerk et al., 2000; Kayser et al., 2001;
Jayasinghe et al., 2002; Hamerski et al., 2003; Dongmo et al., 2003; Suksamrarn et al.,
2003; Jangde e Bansod, 2004; Gattuso et al., 2004; Lorence et al., 2004).
Muitas características são marcantes na família Rubiaceae como folhas opostas com
estípulas e ovário ínfero, além da presença de estípulas cobrindo e protegendo o meristema
apical caulinar (Robbrecht, 1988). Embora, seja bem caracterizada como uma família, as
delimitações de subfamílias, de tribos, e de gêneros têm sido discutidas em razão da grande
riqueza e da variedade morfológica de seus caracteres, o que vem provocando muitas
13
mudanças na classificação hierárquica infrafamiliar (Andersson e Rova, 1999; Andreasen e
Bremer, 2000; Piesschaert et al., 2000).
O gênero Bathysa é representado por cerca de 15 espécies, sendo árvores, arvoretas
ou arbustos, distribuídos no Panamá, Guiana Francesa, Venezuela, Colômbia, Peru, Bolívia
e Brasil. B. nicholsonii foi escolhida para este estudo pela presença de estípulas grandes
que, em suas bases, apresentam coléteres com secreção abundante (Miguel, 2004). Bathysa
nicholsonii K. Schum. é uma árvore com até sete metros que apresenta casca castanha, com
placas longitudinais e ramos crassos, possuindo estípulas persistentes. No Estado do Rio de
Janeiro, ocorre no Parque Nacional da Tijuca e na Reserva Biológica de , onde é encontrada
na orla da mata associada com indivíduos de B. cuspidata, sendo conhecida vulgarmente
por “bapebucu” e “quina-do-mato”. Segundo os critérios da IUNC (International Union for
Nature Conservation), a espécie pode ser considerada rara. Indícios levam a crer que B.
nicholsonii tenha populações de tamanho reduzido, nos Estados do Rio de Janeiro e Minas
Gerais (Germano-Filho, 1999).
1.3 Estípulas
São apêndices presentes aos pares na base do pecíolo e, em sua maioria, fusionadas
a uma estrutura interpeciolar em ambos os lados do caule, entre as folhas opostas, podendo
ser de diferentes formas (Robbrecht, 1988). Em determinadas plantas, estas estruturas
podem ser verdes, semelhantes às folhas e tendo capacidade fotossintética, mas sua
principal função é, de fato, a proteção das folhas jovens em desenvolvimento (Fahn, 1990).
A presença de estípulas é uma das características vegetativas mais importantes da família
Rubiaceae. Contudo, pouco se sabe sobre a origem evolutiva e as funções das estípulas em
dicotiledôneas (Cronquist, 1968; Rutischauser e Dickinson, 1989).
Em Rubiaceae sabe-se que, após o crescimento do ápice caulinar, as estípulas
podem ser decíduas ou persistentes. Ocorrendo no ápice caulinar, sendo decíduas ou
persistentes,
freqüentemente,
cobrem-no
inteiramente.
Estípulas
persistentes
são
encontradas próximas às gemas axilares, cobrindo-as (Robbrecht, 1988). Assim, oferecem
proteção aos meristemas apicais e/ou axilares na forma de uma barreira física. Esta forma
de proteção em camadas de estípulas sobre o ápice é encontrada, principalmente, em
dicotiledôneas arbóreas (Fahn, 1990). Em diversas espécies, podemos encontrar, na
14
superfície adaxial das estípulas, estruturas secretoras denominadas de coléteres.
Ocasionalmente, as estípulas assumem uma tonalidade marrom em seus ápices, sendo
indício de sua senescência.
1.4 Tecidos secretores em plantas
Estruturas ou tecidos secretores podem estar presentes em diferentes órgãos das
plantas, possuindo formas variadas (Dickinson, 2000). A variação de formas destas
estruturas reflete a variação de exsudatos produzidos. Atualmente, a classificação das
estruturas secretoras é feita com base na morfologia ou no conteúdo do exsudato. Tal
classificação é discutível devido ao fato de que tecidos secretores, geralmente, sofrem
transformações relativamente rápidas. Em função disto, a estrutura, a ultraestrutura e o
conteúdo bioquímico das células podem ser modificados em dias ou até em horas. Tal fato
dificulta a classificação, pois tecidos iguais podem ser considerados diferentes somente por
se encontrarem em uma etapa diferente da maturação (Fahn, 1979).
Fahn (1988) organizou uma listagem de diferentes tipos de estruturas secretoras de
plantas e classificou-as, principalmente, quanto à sua morfologia e à composição química
da secreção, sendo estas características complementares. No entanto, é senso comum na
literatura que estruturas secretoras formam um grupo polifilético (Fahn, 1979; Laurence et
al., 2000).
Estudos morfofisiológicos têm sido realizados sobre estruturas secretoras em
diferentes famílias. Dentre estes, se destacam os estudos de Gaffal e Heimler (1998),
investigando a estrutura do nectário floral de Digitalis purpurea; Fahn e Shimony (1998),
sobre a ultraestrutura das células secretoras de duas espécies de Fagonia (Zygophyllaceae);
Silva e Machado (1999a e 1999b), com relação aos tricomas secretores em folhas de Piper
regnellii (Piperaceae); Fahn (2000), investigando a estrutura e função das células
secretoras; Bottega e Corsi (2000), sobre a estrutura e função de tricomas glandulares do
cálice de Rosmarinus officinalis (Labiatae); Knight et al. (2001), sobre as glândulas de óleo
do fruto de Citrus sinensis; Machado e Carmello-Guerreiro (2001), investigando a estrutura
e desenvolvimento de canais secretores em frutos de Schinus terebinthifolius
(Anacardiaceae); Miguel (2004), investigando os coléteres de espécies de Bathysa
(Rubiaceae); e Klein et al. (2004), estudando coléteres de Simira (Rubiaceae).
15
Ultraestruturalmente, tem sido observado que células de tecidos secretores são
caracterizadas por conterem numerosas mitocôndrias, pequenos vacúolos e citoplasma
denso (Fahn, 1988). Segundo Fahn e Shimony (1998), células secretoras de Fagonia mollis
(Zygoplhylaceae) possuem núcleo relativamente grande e numerosas mitocôndrias
modificadas. Nas células secretoras dos ductos de goma de Lannea coromandelica
(Anacardiaceae), o citoplasma é rico em ribossomos, retículo endoplasmático rugoso,
mitocôndrias, vacúolos, corpos paramurais e inclusões lipídicas e, em algumas etapas de
sua diferenciação, foram encontrados dictiossomos em abundância (Venkaiah, 1992).
Werker e Kislev (1978) argumentam que a produção de secreção, em tricomas secretores da
raiz de Sorghum, está relacionada ao complexo de Golgi.
1.5 Coléteres
São estruturas secretoras que podem ser encontradas em diversas famílias de
Angiospermae. Por possuírem forma e funções variadas e estarem presentes em diversos
grupos taxonômicos, estas estruturas foram descritas sob vários nomes. Os mais usuais são:
squamallae (Ramayya e Bahadur, 1968); glândulas estipulares (Van Hove e Kagoyre
(1974); nectário extra-floral (Dave e Patel, 1975); e glândula de resina (Curtis e Lersten,
1980).
Coléteres têm sido definidos como estruturas secretoras constituídas por um eixo
central alongado, formado por parênquima fundamental, circundado por um estrato
epidérmico em paliçada, sendo as células epidérmicas responsáveis pela secreção (Thomas,
1991; Da Cunha e Vieira, 1997). Essas estruturas foram inicialmente, descritas em 1848,
por Hanstein (apud Thomas, 1991). Curiosamente, estes não constam na classificação de
estruturas secretoras, proposta por Fahn (1988); embora sejam reconhecidos como
estruturas secretoras por outros autores (Esau, 1974). O termo coléter deriva do termo
grego “colla”, que quer dizer cola e refere-se à secreção pegajosa que o mesmo libera
(Thomas, 1991). Lersten (1974a; 1974b) caracterizou morfologicamente dois tipos de
coléteres em Rubiaceae, o "dendroid" e o "brushlike", classificando o tipo mais comum
(padrão) como "standard". Da Cunha (2005) subdividiu morfologicamente o tipo standard
em: cilindriforme e claviforme. Para a distinção de famílias, as variações dos coléteres
16
afazem-se pouco úteis, mas em termos de gêneros e subgêneros em Rubiaceae, esta
característica se torna bastante consistente (Robbrecht, 1988).
De acordo com Thomas (1991), este tipo de estrutura secretora é encontrado na face
adaxial de diferentes órgãos de membros de 60 famílias de Angiospermae. Robbrecht
(1988) aponta que os coléteres podem ocorrer também em partes florais de Rubiaceae,
Loganiaceae, Apocynaceae e outras famílias. González (1998) mostra que os coléteres de
diferentes espécies da família Turneraceae estão distribuídos nos primórdios foliares.
O número de coléteres e a sua distribuição nos órgãos são variáveis. Estas estruturas
podem estar; cobrindo o interior da estípula e/ou do cálice, com gradação variável; na
estípula podem estar localizadas na borda ou podem estar inseridos em uma fileira única na
base, sendo a última a ocorrência mais freqüente. Klein et al. (2004) mostraram que os
coléteres de Simira pikia se encontram distribuídos em uma linha na base da estípula
enquanto o conjunto dos coléteres de S. glaziovii forma dois triângulos na base da estípula.
Miguel (2004) mostrou que os coléteres em três espécies de Bathysa são distribuídos na
base das estípulas.
A variação de formas, que acarreta uma variação de nomenclatura, pode ser
claramente notada na literatura. Robbrecht (1988) aponta que as estruturas secretoras
pluricelulares que ocorrem no interior das estípulas e em outros órgãos, como encontrado
em partes florais, de Rubiaceae, Loganiaceae, Apocynaceae e outras famílias de Asteridae,
já foram chamadas por uma longa série de termos, como “Squamallae” por Ramayya e
Bahadur (1968), "glândulas estipulares" por Van Hove e Kagoyre (1974), nectário
extrafloral por Dave e Patel (1975) ou glândulas de resina por Curtis e Lersten (1980).
González (1998) reconhece a variação de formas nos coléteres de Turneraceae e adiciona
termos, à classificação, para os coléteres observados em gêneros de Turnera e Piriqueta.
Coléteres do tipo "standard" se mostram similares em muitos aspectos , contudo, é
descrita uma grande diversidade de tamanhos, formatos, grau de desenvolvimento e
diâmetro relativo do eixo central além da presença ou não do desenvolvimento da
constrição basal (Robbrecht, 1988; Klein, 2002; Miguel, 2004). Há, ainda, estruturas
vascularizadas e outras não vascularizadas. Tal fato é discutido por Thomas (1991) e
Apezzato-da-Gloria e Estelita (2000), devido a sua importância para a nutrição da estrutura.
Estas variações podem apresentar valor taxonômico (Robbrecht, 1988).
17
Em relação à ultraestrutura dos coléteres, Miller et al. (1983) mostram que as
células secretoras dos coléteres de Allamanda cathartica (Apocynaceae) possuem retículo
endoplasmático perinuclear, numerosas mitocôndrias, vacúolos ocupando grandes áreas do
citoplasma, complexo de Golgi e plastídeos. Em Bathysa gymnocarpa, há evidências de
que as células secretoras dos coléteres apresentam complexo de Golgi com cisternas mais
abundantes do que B. stipulata (Miguel, 2004). Idioblastos cristalíferos e taníferos foram
observados no eixo central de coléteres de Psychotria kirkii (Rubiaceae) (Thomas e Dave,
1989) e P. nuda (Moraes et al., 2005).
Tem sido proposto que a função protetora dos coléteres é conferida pela sua
secreção (Mueller, 1985; Williams et al., 1982; Ramayya e Bahadur, 1968). De acordo com
estes autores, o exsudato protege o meristema, que fica, algumas vezes, completamente
coberto por secreção. Em espécies de Rubiaceae, esta secreção pode estar envolvida na
formação de nódulos de bactérias (Horner e Lersten, 1968). No entanto, não é elucidada
ainda a nodulação nestas plantas.
Paralelamente ao desenvolvimento do meristema apical, os coléteres tendem a
senescer. Durante este processo, sua coloração torna-se gradativamente marrom. O
processo de senescência inicia-se na epiderme da parte apical da estrutura e finda na basal
central. A lignificação, intimamente ligada ao processo de senescencia dos coléteres, é um
fenômeno centrípeto iniciando-se pelas paredes celulares da epiderme (Thomas e Dave,
1989; Miguel, 2004). A anatomia dos coléteres durante o processo de senescência encontrase parcialmente descrita. No entanto, persiste a lacuna quanto às descrições ultraestruturais.
1.6 Aspectos subcelulares do processo de secreção vegetal
A secreção é um fenômeno complexo que, usualmente, envolve síntese,
compartimentalização intracelular, liberação ou secreção propriamente dita para o
apoplasto e, alternativamente, para a superfície da planta (Castro, 2000; Machado, 2000).
Por isso, têm sido descritas peculiaridades intracelulares no processo de secreção. Dentre
estas, Machado (2005) descreve características das células secretoras durante a secreção.
Entre as organelas que mostram variações consideráveis, ao longo do processo secretor,
estão os plastídios dos tricomas glandulares no gineceu de Zeyheria digitalis
18
(Bignoniaceae) (Machado et al., 1995) e os cloroplastos no parênquima secretor de
Citharexylum mirianthum (Verbenaceae) (Machado, 1999).
Considerando, ainda, que a secreção é um processo que envolve peculiaridades
intracelulares, o estudo detalhado das células secretoras permite avaliar tanto a dinâmica do
processo secretor, como fazer correlações entre a estrutura e o funcionamento de
determinadas organelas envolvidas na secreção.
Estruturas secretoras, como tricomas glandulares e nectários, podem combinar
simplicidade estrutural com atividade secretora intensa, mostrando-se modelos adequados
para a investigação de questões fundamentais da biologia celular de plantas. Dentre estas,
transporte à curta distância; síntese e transporte intracelular de macromoléculas; origem de
vacúolos de estocagem ou com função lisossomal (Silva e Machado 1999a; Machado,
1999). Ultraestruturalmente, estas células possuem características particulares. Segundo
Fahn e Shimony (1998), as células secretoras de Fagonia mollis (Zygoplhylaceae) possuem
núcleo relativamente grande e numerosas mitocôndrias modificadas. Nas células secretoras
dos ductos de goma de Lannea coromandelica (Anacardiaceae), o citoplasma é rico em
ribossomos, retículo endoplasmático rugoso, mitocôndria, vacúolos, corpos paramurais e
gotas lipídicas e em algumas etapas de sua diferenciação foram encontrados complexos de
Golgi (Venkaiah, 1992). Werker e Kislev (1978) argumentam que a produção de secreção,
em tricomas secretores da raiz de Sorghum (Poaceae), está relacionada com o complexo de
Golgi.
1.6.1 Sistema endomembranar
O retículo endoplasmático é uma projeção do envelope nuclear para as regiões
corticais da célula e pode ser subdividido em domínios funcionais distintos (Staehelin,
1997). O retículo endoplasmático é o ponto de entrada no sistema endomembranar para
proteínas recém sintetizadas. Depois da remoção da seqüência sinal, por peptidases do
lúmem do retículo, as proteínas mudam sua estrutura com a ajuda de chaperonas (Vitale e
Denecke, 1999). Proteínas defeituosas parecem ser reconhecidas por um mecanismo de
controle de qualidade, sendo transportadas para o citosol, onde são degradadas (Brandizzi
et al., 2003). A glicosilação de proteínas tem um papel fundamental na entrada destas no
retículo (Vitale e Denecke, 1999). Arabidopsis mutantes, defeituosas para N-glicosilação
19
ou faltando α-glicosidase I, são letais no embrião (Lukowitz et al., 2001; Gillmor et al.,
2002; Boisson et al., 2001). Proteínas residentes do retículo são retidas nessa organela ou
recicladas de volta do complexo de Golgi (Vitale e Denecke, 1999). O retículo
endoplasmático segrega, ainda, compartimentos de membrana para seqüestro de lipídios ou
proteínas, alguns desses evoluem para vacúolo de estocagem (Chrispeels e Herman, 2000).
O complexo de Golgi é conhecido desde 1843, quando foi descrito por Camillo
Golgi. Em microscopia eletrônica de transmissão, foi visualizado nos anos 50. Essa
organela não foi alvo de muitos estudos nas décadas seguintes, contudo, a partir da década
de 90, foi redescoberta (Mollenhauer e Morré, 1994). Em células vegetais, é formado por
várias pequenas pilhas de cisternas, reconhecidas, individualmente, também pelo nome de
dictiossomos (Dupree e Sherrier, 1998). A quantidade dessas pilhas pode variar muito de
acordo com a função da célula em questão. A variação é notada não somente na quantidade
das cisternas, mas também na sua morfologia. Essas pilhas são polarizadas
individualmente, diferenciando as faces cis e trans. Essa organela é extremamente dinâmica
e móvel no citoplasma da célula, principalmente, no inicio do processo de divisão celular
(Nebenführ e Staehelin, 2001) tendo grande importância na síntese de precursores de
parede celular.
Dentre as muitas funções atribuídas ao complexo de Golgi se destacam, além da
síntese de polissacarídeos da parede celular, a modificação de proteínas, como, por
exemplo, proteínas de estocagem ou enzimas, que serão subseqüentemente distribuídas para
outras partes da célula como o vacúolo e a membrana plasmática. Para exercer com
precisão essas funções, a organela possui compartimentalização bioquímica, sendo as
cisternas da face cis diferentes das da face trans. Pakelka e Robinson (2003) confirmam a
existência de relação estrutural e funcional do complexo de Golgi com o retículo
endoplasmático.
1.6.2 Transporte de substâncias em células vegetais
O movimento intracelular de moléculas é de vital importância na manutenção da
identidade e funcionalidade dos compartimentos intercelulares (Jürgens, 2004). O
transporte e endereçamento de proteínas para os vários compartimentos foram estudados
extensivamente em células vegetais (Jürgens, 2004). Estes estudos permitiram a
20
identificação de várias seqüências de sinais de endereçamento. Essas seqüências são
especificas não só para organelas, mas também para seus subcompartimentos.
O tráfego vesicular entre retículo endoplasmático, complexo de Golgi, vacúolo e
membrana plasmática é complexo, podendo seguir muitas vias diferentes do transporte das
vesículas (Hawes et al., 1999). Diferentes tipos de estresse podem afetar essas vias e
modificá-las de várias formas. Estes efeitos podem ser suprimidos por mecanismos
celulares (Levine, 2002). Os mecanismos de tráfego vesicular em plantas têm se
demonstrado semelhantes aos de mamíferos e fungos com respeito ao transporte, ao
ancoramento e a fusão vesicular. Contudo, moléculas únicas de vegetais também controlam
esse fenômeno (Ueda e Nakano, 2002). Estudos mostram o envolvimento do gradiente de
concentração de íons, especialmente cálcio e cloro, no processo de exocitose de células
animais (Marengo, 2005) e em células vegetais (Zonia et al., 2001).
1.6.3 Morte celular programada em plantas
O processo de morte celular programada (MCP) muda a ultraestrutura e dinâmica da
célula vegetal (Doorn e Woltering, 2005). Durante esse processo as vias metabólicas são
desviadas; ou seja, toda a maquinaria celular que funciona para a manutenção celular, e/ou
processos secretores, passa ser direcionada para suprir as necessidades do processo de MCP
(Rose et al., 2006). Tal processo é de fundamental importância no desenvolvimento,
resposta de defesa contra patógenos (McCabe e Leaver, 2000) e senescência (Doorn e
Woltering, 2005).
De um modo geral, dois tipos de MCP são predominantes: autofagia e apoptose. Há,
ainda, uma forma incomum, chamada de morte celular programada não-lisossomal (Doorn
e Woltering, 2005). Uma das abordagens na diferenciação entre autofagia e apoptose é
baseada na ultraestrutura das células durante o processo e pelas organelas que estão
envolvidas.
Resumidamente, autofagia é um processo altamente regulado, durante o qual
materiais citoplasmáticos são envolvidos por vesículas, constituídas de dupla membrana,
que são então destinadas aos vacúolos ou lisossomos para degradação (Levine e Klionsky,
2004).
21
Em linhas gerais, a autofagia é um mecanismo pelo qual a célula degrada parte ou o
citoplasma completo, exceto núcleo (Aubert et al., 1996). Esse processo pode ocorrer em
todos os organismos eucariontes, seja como um processo natural, no curso do
desenvolvimento ou em reposta aos estresses ambientais, como, por exemplo, depleção de
nutrientes (Rose et al., 2006).
A via do processo autofágico envolve o seqüestro de porções do citoplasma por
endomembranas, formando então o vacúolo autofágico. Em seguida, ocorre a degradação
das estruturas capturadas por essas endomembranas, ao invés de sua reciclagem para
manter as funções essenciais e homeostase celular (Rose et al., 2006). Podem existir
variações, e outras classificações para o processo de autofagia em plantas, como a micro e
macroautofagia (Doorn e Woltering, 2005).
A apoptose tem sido alvo de algumas revisões recentes (Yoshida et al., 2005; Doorn
e Woltering, 2005; Selga et al., 2005). Três características principais podem ser observadas
durante esse processo: fragmentação nuclear; formação de corpos apoptóticos; e
engolfamento e degradação dos corpos apoptóticos nos lisossomos de outras células
(Clarke, 1990). Outras características também são marcantes na apoptose como, por
exemplo, a participação das caspases e a condensação da cromatina com degradação do
DNA (Doorn e Woltering, 2005). Já que a apoptose inclui a degradação dos corpos
apoptóticos em outras células, alguns autores argumentam que a apoptose verdadeira não
ocorre em plantas (Doorn e Woltering, 2005).
Alguns exemplos de MCP em células de mamíferos mostram uma morfologia
intermediária. Em algumas células, o processo autofágico precede a formação dos corpos
apotóticos (Doorn e Woltering, 2005).
O processo de morte celular programada menos comum é a morte celular
programada não lisossomal, que se diferencia das demais por não envolver lisossomos. A
célula se mata, aparentemente, pela inibição das principais vias biossintéticas, pela
desestabilização das membranas, ou por vias ainda não elucidadas (Doorn e Woltering,
2005). Esse processo também é chamado morte celular programada necrosis-like (Doorn e
Woltering, 2005). Por ser menos freqüente, pouco se sabe sobre esse processo.
22
1.7 Parede periclinal externa
A parede periclinal externa é a fronteira entre a planta e o ambiente. Esta estrutura é
formada por macromoléculas e constitui uma barreira ao fluxo bidirecional em grande parte
dos tecidos de revestimento nas plantas. A parede periclinal externa tem sido relacionada
também à proteção contra radiação, danos mecânicos, patógenos e pragas. A variedade de
funções dessa estrutura tem sido associada à sua estrutura, complexidade e diversidade. A
distribuição de seus componentes, usualmente, é heterogênea. A nomenclatura de seus
estratos tem sido baseada nesta peculiaridade. Tenberge (1992) propõe que a parede celular
é dividida em cera epicuticular e três camadas distintas: a cutícula propriamente dita, as
camadas cuticulares, divididas em camada reticulada e camada arborescente, e camada rica
em polissacarídeos. Outros autores também utilizam esta nomenclatura (Barros e Miguens,
1998; Klein et al., 2004 e Miguel, 2004, Moraes et al., 2005). A composição e estrutura das
paredes celulares vegetais podem variar durante o crescimento e a diferenciação da célula e
em resposta a fatores ambientais (Barros e Miguens, 1998; Marques, 1998). No entanto, a
morfologia e fisiologia, sobretudo os mecanismos de secreção, da parede periclinal externa
têm sido considerados espécie-específicas.
1.7.1 Passagem de moléculas pela parede periclinal externa
O transporte de moléculas pela parede periclinal externa ainda não foi elucidado. A
maioria dos trabalhos, que se referem de alguma forma a passagem de moléculas pela
parede periclinal externa, utilizou microscopia eletrônica de transmissão, e apenas citam a
presença ou ausência de cutícula. Quanto ao mecanismo de secreção, Ascensão e Pais
(1998) relatam o acúmulo da secreção no espaço periplasmático. A secreção passa pela
parede celular e se deposita em um espaço subcuticular, formado pelo deslocamento da
cutícula. Esse espaço recebe o nome também de espaço subcuticular (Possobom e
Machado, 2005).
Kim e Mahlberg (1997), utilizando técnicas de imunolocalização, marcaram o
Tetra-hidro-canabinol na parede periclinal externa de tricomas criofixados, reafirmando a
função dessa cavidade na passagem de substâncias pela parede. Os mesmos autores
descreveram a formação de vesículas secretoras em tricomas de espécies da família
23
Cannabacea (Kim e Mahlberg, 2003). Mesmo assim ainda ficam duvidas com relação a esta
passagem.
Mahlberg e Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que, em tricomas
glandulares de Cannabis, a passagem da secreção através da parede periclinal externa é
feita através de “cavidades secretoras” na parede que servem para a saída do exsudado após
toda a passagem pelo tráfego de vesículas, sendo a parede celular o meio de exteriorização
da secreção. Alguns aspectos dessa passagem ainda permanecem obscuros, pois nenhum
estudo mostrou de maneira convincente todo esse processo em células de estruturas
secretoras de vegetais. Estruturas semelhantes a essas “cavidades secretoras” forma
descritas na parede periclinal externa dos coléteres de B. nicholsonii (Miguel, 2004). Estas
estruturas tiveram a sua formação descrita (Miguel et al., 2005) e aparentemente estão
envolvidas no processo de tráfego da secreção pela parede periclinal externa. No entanto,
Jefree (1996) aponta outros mecanismos para este tráfego, dentre os quais, microcanais
perpendiculares ao maior eixo da parede periclinal e acúmulo da secreção nas camadas
cuticulares da parede celular. Esse acúmulo acaba por levar a ruptura física dessa camada.
1.8 Exsudatos vegetais: Características gerais e propriedades
Os exsudatos vegetais, que são classificados de acordo com sua composição
química, têm uma ampla distribuição entre as famílias de vegetais superiores chamando a
atenção de muitos pesquisadores, não só pela sua função na planta, como também pelo seu
aproveitamento econômico. Os materiais secretados podem exercer várias funções na
própria planta e, após serem eliminados das estruturas secretoras, geralmente não são
reutilizados nos processos metabólicos do organismo produtor (Fahn, 1979). Diferentes
espécies exsudam diferentes produtos, como pode ser visto ao se comparar os trabalhos de
Curtis e Lersten (1974; 1980) e Durkee et al. (1984), em que o exsudato, nas espécies
estudadas, é classificado como uma resina. Mueller (1985) classifica o exsudato de Alstonia
scholaris como sendo semelhante ao látex. Os trabalhos de Dexheimer e Guenin (1981) e
Horner e Lersten (1968) em Psychotria bacteriophila (Rubiaceae) e Miller et al. (1983) em
Psychotria kirkii (Rubiaceae) mostram que os coléteres destas espécies secretam
substâncias mucilaginosas. Ramayya e Bahadur (1968) caracterizaram o exsudato do
coléter de Allamanda cathartica (Anacardiaceae) como uma substância parda e
24
transparente, considerada como resina de grandes polímeros. Ao investigar esta mesma
secreção, Thomas e Dave (1989) não encontraram aminoácidos, no entanto, acharam alguns
açúcares (glicose e rhamanose) e caracterizaram seus elementos químicos majoritários: Na
(25 %), Fe (14 %) e Zn (13 %). A presença de proteínas na secreção dos coléteres foi
identificada por Klein et al. (2004). Kristen (1976) aponta a necessidade de análises
bioquímicas para determinação da composição de mucilagens.
O uso dos exsudatos vegetais na medicina popular é bastante amplo. Por isso, a
etnofarmacologia pode crescer bastante nos últimos anos. O exsudato de Plectranthus
(Lamiaceae) é utilizado em casos de dores de cabeça, dores de garganta, queimaduras,
dermatite, náuseas e, até, picadas de escorpião (Riviera Nuñez e Óbon de Castro, 1992 e
Bown, 1995). O extrato foliar de Piper regnellii (Piperaceae) é utilizado no tratamento de
dores, infecções, febres reumáticas já que apresenta uma forte propriedade analgésica (Di
Stasis, 1987 apud Silva e Machado, 1999b). Muitas espécies de Plectranthus são cultivadas
como plantas ornamentais e como fontes de óleos essenciais utilizados na culinária, pelo
seu sabor (Ascenção et al., 1999). Existem registros do uso da secreção dos coléteres de
Bathysa como cicatrizante (Sr. Walter Silva, comunicação pessoal). A utilização em
medicina popular dos exsudatos vegetais sugere o potencial terapêutico destas secreções.
25
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Caracterizar a anatomia e a ultraestrutura dos coléteres de Bathysa nicholsonii K.
Schum., bem como analisar o perfil protéico da secreção e sua ação antifúngica.
2.2 Objetivos específicos
ü Descrever a anatomia e ultraestrutura de coléteres de B. nicholsonii;
ü Caracterizar morfológica e temporalmente as células da epiderme secretora dos
coléteres de B. nicholsonii;
ü Caracterizar citoquimicamente as células da epiderme secretora de coleteres de B.
nicholsonii;
ü Investigar preliminarmente a presença de proteínas na secreção dos coléteres de B.
nicholsonii;
ü Examinar a atividade antifúngica do extrato protéico da secreção dos coléteres de B.
nicholsonii;
26
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Área de coleta
O material foi coletado na Reserva Biológica de Tinguá, com licença concedida
pelo IBAMA (171/2003). Esta reserva localiza-se na porção central da cadeia da Serra do
Mar, no trecho compreendido pelas serras do Tinguá, de São Pedro e do Macuco (22º28’ e
22º39’ S, 22°35' e 43º34’ W), municípios de Nova Iguaçu e Duque de Caxias. Os desníveis
altimétricos da reserva variam entre 220 e 1.600 metros, destacando-se o maciço do Tinguá
como a maior elevação. O solo é representado pelos tipos Cambissolos, Latossolos e
Podzólicos. A temperatura média anual é de 21,6 °C e pluviosidade média anual de 2.268
mm. A vegetação local é reconhecida como Floresta Ombrófila Densa. A Reserva
Biológica de Tinguá foi criada pelo Decreto de Lei Federal número 30.97.780 de 1989;
sendo considerada Reserva de Biosfera pela Unesco em 1992. É a maior reserva florestal
do Estado do Rio de Janeiro e, sofre sérios problemas com caça predatória, despejo de lixo,
grileiros e extrativismo, representado principalmente pela presença de palmiteiros e
madeireiros (SOS Mata Atlântica, 2002).
3.2 Material botânico
Ápices caulinares de indivíduos adultos, incluindo as estípulas e o meristema apical
caulinar, de Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae) foram coletados com o auxílio de
podão. Amostras testemunhas foram depositadas no Herbário do Jardim Botânico do Rio de
Janeiro. As estípulas foram dissecadas dos ápices caulinares com o emprego de bisturis e
pinças. Para microscopia, este material foi fixado quimicamente no local de coleta; e, para
extração da secreção as estípulas foram levadas ao laboratório, acondicionadas de maneira
a preservar as estruturas a temperatura ambiente, para os procedimentos. Na identificação
das estípulas, seguiu-se descrição proposta por Klein (2002); o par de estípulas mais
próximo ao meristema apical caulinar foi denominado estípulas do primeiro nó e o par
seguinte, como do segundo nó.
27
3.3 Microscopia
3.3.1 Microscopia Óptica
Fragmentos da base da estípula, contendo coléteres, foram fixados em solução
aquosa contendo glutaraldeído 2,5 %, formaldeído 4,0 % diluídos em tampão cacodilato de
sódio 0,05 M, pH ~ 7,2, sob temperatura ambiente, durante 2 horas. Após serem lavados
por 45 minutos no mesmo tampão, os fragmentos foram pós-fixados em solução aquosa
contendo tetróxido de ósmio 1,0 % diluído em tampão cacodilato de sódio 0,05 M, pH ~
7,2, temperatura ambiente, durante 1 hora na ausência de luz. Após três lavagens de 45
minutos no mesmo tampão, os fragmentos foram submetidos à série cetônica ascendente
[50 %, 70 %, 90 %, 100 % (3X)], durante 1 hora em cada etapa, para desidratação. Então,
os fragmentos foram infiltrados com resina epóxi (Epon Polibed), utilizando-se serie
crescente de resina em propanona. A polimerização da resina foi realizada a 60 ºC. Cortes
semifinos, aproximadamente 1 µm de espessura, foram obtidos com navalhas de vidro em
ultramicrótomo (REICHERT ULTRACUT-S®). A coloração foi realizada com solução
aquosa de azul de toluidina 1,0 % acrescido de 0,1% de Bórax. Lâminas permanentes foram
montadas com Entellan®. A documentação analógica foi realizada em microscópio óptico
Axioplan ZEISS (Oberkohen, Germany), utilizando-se filme fotográfico Kodalit, 35 mm,
32 ASA (Kodak, USA); dados digitais foram obtidos no mesmo equipamento, utilizando-se
câmera digitalizadora Hamamatsu C3077 e software Analysis®- LINK/ISIS/ZEISS
(Oxford, UK).
3.3.2 Histoquímica
Os testes histoquímicos da estípula foram realizados em cortes a mão livre de
material recém coletado. A documentação analógica e digital foi realizada conforme
descrito anteriormente.
Carboidratos (hidroxilas vicinais)
Cortes a mão livre de ápices caulinares foram lavados em água destilada e imersos
em solução aquosa de ácido periódico de Schiff 1,0%, durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Após lavagem em água destilada, estes foram imersos em reagente de Schiff
28
durante 15 minutos, a temperatura ambiente, sendo então, lavados em água destilada,
durante 5 minutos a temperatura ambiente (Hotchkiss, 1948).
Proteínas totais
Proteínas totais foram evidenciadas em cortes expostos a solução aquosa de Azul
Brilhante de Coomassie G 0,25 % contendo 5 % de ácido acético, durante trinta minutos.
Este procedimento foi seguido de lavagem em solução aquosa de ácido acético 5 % por três
vezes, durante 5 minutos em cada etapa. Lâminas permanentes foram obtidas com glicerina
50%.
3.3.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Para microscopia eletrônica de transmissão foram utilizados os mesmos
procedimentos que para microscopia óptica, exceto a ultramicrotomia e a contrastação.
Cortes ultrafinos, com aproximadamente 70 nm de espessura, foram obtidos, utilizando-se
navalha de diamante (Diatome®) em ultramicrótomo (REICHERT ULTRACUT-S®); os
cortes, foram coletados em grades de cobre de 300 mesh. A contrastação foi realizada em
solução aquosa saturada de acetato de uranila, durante 40 minutos, seguida de lavagem em
água destilada e de 5 minutos em citrato de chumbo 1% (Reynolds, 1963). A documentação
analógica foi realizada em microscópio eletrônico de transmissão (ZEISS EM 900),
operando a uma aceleração de voltagem de 80 kV, em chapas fotográficas, 6” x 9”, Kodak
4489.
3.3.4 Citoquímica
As características ultraestruturais evidenciadas pelos métodos citoquímicos
empregados foram documentadas como descrito no tópico anterior, relativo a microscopia
eletrônica de transmissão.
Carboidratos (hidroxilas vicinais)
Para detecção de hidroxilas vicinais, predominantemente carboidratos, foi utilizado
o método de Thiéry (1967), utilizando-se tiosemicarbazida-proteinato de prata (PATAg).
Cortes ultrafinos, das amostras processadas para microscopia eletrônica de transmissão,
29
foram coletados em grades de ouro de 300 mesh e tratados com solução aquosa de ácido
periódico 1 %, durante 30 minutos. Após lavagem em água destilada, as grades foram
sobrepostas em gotas de solução aquosa de tiosemicarbazida 1 % contendo ácido acético a
10 %, durante 72 horas; segue-se uma série decrescente de ácido acético (10 %, 5 %, 2 %
em água destilada). Então, os cortes ultrafinos foram expostos à solução aquosa de
proteinato de prata 1 %, durante 30 minutos, seguindo-se lavagem em água destilada. O
controle foi realizado pela exclusão do tratamento com solução aquosa de ácido periódico.
Detecção de lipídios insaturados
Objetivando detectar lipídios insaturados foi utilizada a técnica de tetróxido de
ósmio-imidazol (Angermüller e Fahimi, 1982). Para tanto, fragmentos da base da estípula,
contendo coléteres, foram fixados em uma solução aquosa contendo glutaraldeído 2,5 %,
formaldeído 4,0 % diluídos em tampão cacodilato de sódio 0,05 M, pH ~ 7,2, em
temperatura ambiente, durante 24 horas. Posteriormente, imersos em tampão imidazol 0,05
M, pH 7,2, temperatura ambiente, durante 24 horas, sendo, então, pós-fixados em solução
aquosa de tetróxido de Ósmio 1,0 % e tampão imidazol 0,05 M, por 72 horas, na ausência
do espectro visível da radiação eletromagnética. Em seguida, as amostras foram lavadas no
mesmo tampão e, posteriormente, em tampão cacodilato de sódio 0,05 M As etapas
subseqüentes foram as mesmas utilizadas para análise por microscopia eletrônica de
transmissão. No material controle, o tampão imidazol 0,05 M foi substituído por tampão
cacodilato de sódio 0,05M.
Detecção de moléculas orgânicas insaturadas
Fragmentos, após a fixação descrita anteriormente, foram tratados com solução
aquosa contendo tetróxido de ósmio 1,0 % e iodeto de potássio 1,0 % diluídos em água
destilada, durante 48 horas na ausência do espectro visível da radiação eletromagnética, a
temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram lavadas, por duas vezes, em solução
aquosa de iodeto de potássio 1,0% diluído em água destilada, durante 1 hora na ausência do
espectro visível da radiação eletromagnética, a temperatura ambiente (Locke e Huie, 1983).
Seguiram-se, então, os procedimentos para microscopia eletrônica de transmissão, descrita
anteriormente. O controle foi realizado pela exclusão do iodeto de potássio.
30
3.3.5 Microscopia Eletrônica de Varredura
Foram utilizados para a microscopia eletrônica de varredura os procedimentos para
microscopia eletrônica de transmissão como descrito anteriormente. Após a desidratação, as
amostras foram secas pelo método do ponto crítico de CO2 utilizando o aparelho CPD-030
BAL-TEC (Liechtenstein). Fragmentos secos de estípula e ápices contendo coléteres foram
aderidos com fita adesiva de carbono dupla-face (3M) e cola de carbono em suportes
adequados. As amostras foram cobertas por sputtering com uma camada de
aproximadamente 20 nm de ouro, utilizando-se aparelho SCD-050 BAL-TEC
(Liechtenstein). A observação e documentação digital (512X480 TIFF) foram realizadas
em microscópio eletrônico de varredura (DSM 962 – ZEISS), a uma aceleração de
voltagem de 15 kV ou 25 kV.
3.3.6 Microanálise de Raio-X (Energia Dispersiva de Raios-X)
A análise qualitativa dos elementos químicos constituintes presentes na secreção
dos coléteres e das estípulas foi realizada pela detecção da energia dispersiva de Raios-X
em microscopia eletrônica de varredura. Estípulas, de ápices caulinares recém coletados,
foram congeladas em nitrogênio líquido, por aproximadamente um minuto e, em seguida,
liofilizadas. Pequenos fragmentos de estípula foram aderidos em suportes em fita adesiva
de carbono dupla-face e com adesivo líquido a base de carbono e cobertos com carbono em
aparelho XCD-010 BAL-TEC (Liechtenstien).
A análise qualitativa e o mapa de distribuição dos elementos foram realizados em
microscópio eletrônico de varredura DSM 962 ZEISS (Oberkohen, Germany), acoplado a
detector de raios-x de silício/lítio OXFORD Microanalysis Group (Oxford, UK) com
resolução nominal de 138 eV, operando nas condições apresentadas abaixo (Quadro 1). Os
resultados foram analisados em software LINK-ISIS, OXFORD Microanalysis Group
(Oxford, UK).
31
Quadro 1
Microscópio Eletrônico de Varredura DSM 962 ZEISS
EDX - condições de operação
Parâmetro
Configuração
Aceleração de voltagem
30 KeV (SE)
Distância de trabalho
12-16 mm
Detector de Si/Li 1024 canais
0 - 15 KeV
Tempo de captação da microanálise
300 seg
Janela do detector
UTW
Calibração EDX
99.9 Cu
MEV Imagens
SE e BSE
3.4 Detecção de proteínas totais na secreção (SDS-PAGE)
A secreção foi analisada com relação ao perfil protéico utilizando o método de
eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) em sistema de gel
descontínuo como descrito por Laemmli (1970). Para tanto, aproximadamente 70 ápices
caulinares, que se encontravam visualmente mais cobertos pela secreção, tiveram as
estípulas dissecadas. A parte interna das estípulas foi lavada em solução contendo tampão
Tris-HCl 0,1 M e Triton X-100 0,1 %, pH 8,0, para extrair a secreção. As amostras
resultantes foram filtradas em papel de filtro e submetidas à precipitação de proteínas com
solução aquosa de sulfato de amônio 90 %. Após 16 horas do tratamento de precipitação, as
amostras foram centrifugadas a 10.000 g, por 30 minutos sendo o sobrenadante descartado
e o precipitado diluído em água destilada. A suspensão foi então dialisada com membrana
de diálise Merck, a 4 oC por 48 horas e, posteriormente liofilizado.
Para eletroforese, as proteínas liofilizadas, extraídas de 1 mL de secreção foram
ressuspendidas em 100 µL de tampão de amostra (Tris-HCl 0,1 M em pH 8,0 contendo
SDS 2 %, sacarose 10% e azul de bromofenol 0,025 %) com e sem a presença de 5 % de βmercaptoetanol. As amostras foram aquecidas por 5 min a 100 °C e centrifugadas a 16 000
rpm por 3 min. Após este procedimento, 25 µL das amostras foram aplicadas no gel 15 %
32
de concentração. A corrida do gel se processou a uma corrente constante de 100 V por 2
horas.
A coloração foi realizada por imersão em solução corante de Azul brilhante de
Coomassie R 0,05 %, durante 1 hora. Após este período, o corante foi retirado e o gel
mantido em uma solução descorante de ácido acético glacial 10 %, metanol 20 % em água
destilada, até visualização das bandas protéicas.
3.5 Detecção de glicoproteínas
Para a detecção de glicoproteínas, os procedimentos foram realizados de
acordo com as recomendações do fabricante do kit de detecção de glicoproteínas, SIGMA
ALDRICH. Os géis obtidos foram fixados em metanol 100 %, durante 30 minutos,
seguindo-se de lavagem em água mili-Q, durante de 20 minutos, por duas repetições. Em
seguida, o gel foi exposto à solução de oxidação (acido periódico), durante 30 minutos.
Após lavagem em água mili-Q, durante de 20 minutos, por duas vezes, a coloração do gel
foi realizada com solução corante por 2 horas, na ausência do espectro visível da radiação
eletromagnética. Subseqüentemente, os géis foram expostos à uma solução aquosa de
redução (metabisulfito de sódio) e estocados em solução aquosa de acido acético 5 % por
12 horas. A documentação fotográfica foi realizada com câmera digital SONY P-63, com
3,2 megapixels/polegada2.
3.6 Detecção de atividade antifúngica no extrato total da secreção
Para o ensaio de atividade antifúngica do extrato total da secreção, amostras de
fungos filamentosos fitopatogênicos foram retirados de culturas mantidas no Laboratório de
Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos. Foram inicialmente colocados para crescer em
placas de Petri contendo o meio ágar Saboraud durante 10 dias a temperatura ambiente.
Após esse período de crescimento, 10 mL de solução salina estéril de 0,15 M foi vertida
sobre as placas e para a liberação de esporos foi utilizada uma alça de Drigalski. Os esporos
extraídos foram recuperados e quantificados em câmara de Neubauer.
Para o ensaio de atividade antifúngica do extrato total da secreção amostras dos
fungos C. musae, C. lindemutianum e F. oxysporum, mantidos no Laboratório de Fisiologia
e Bioquímica de Microrganismos, foram inoculados em meio sólido ágar Sabouraud em
33
placas de Petri, durante dez dias, a temperatura ambiente. Após este período, 10 mL de
solução salina estéril de 0,15 M foi vertida no recipiente e para a liberação de esporos foi
utilizada uma alça de Drigalski. Os esporos extraídos foram recuperados com uma pipeta e
quantificados em câmara de Neubauer. A germinação foi determinada através da
inoculação de esporos em meio líquido, 1x104 esporos/200 µL de meio de cultura
Saboraud, contendo 250 µg/mL de proteínas do extrato total da secreção. O ensaio foi
realizado em placas de cultura de células de 96 poços, a temperatura de 28 ºC, por um
período de 60 h. O crescimento micelial foi determinado por densidade óptica com leitura
de 6 em 6 h em um leitor de ELISA a 600 nm. Todo o ensaio foi feito sob condições
estéreis em capela de fluxo laminar e em triplicatas (Broekaert et al., 1990).
34
4. RESULTADOS
Os exemplares coletados de Bathysa nicholsonii na Reserva Biológica de Tinguá
mostraram poucos sinais de herbivoria nas estípulas no ápice caulinar (fig. 1A). Nas
estípulas, que medem aproximadamente 5 cm (fig. 1C e 1D) a herbivoria foi menor que nas
folhas. Quando as estípulas são destacadas do ápice caulinar é possível identificar,
macroscopicamente, os coléteres (fig. 1E e 1F). Estas numerosas estruturas ocorrem
distribuídas na forma de dois triângulos na base da face adaxial (fig. 1E), contornando o
primórdio foliar do nó subseqüente. Ao destacar as estípulas, observou-se que a secreção
produzida pelos coléteres, freqüentemente, se apresentava translúcida ou raramente
amarelada e cobria as estruturas do ápice caulinar. Após exposição ao ambiente, esta
secreção torna-se vítrea e friável. A secreção encontrada no ápice caulinar dificultou a
separação das estípulas devido a sua viscosidade. Sob estereomicroscópio, coléteres
caracterizavam-se por formato cilíndrico, superfície lisa e coloração uniformemente
amarela brilhante (fig. 1F). Alguns coléteres apresentavam ápice com coloração
amarronzada, sugerindo a sua senescência.
A microscopia eletrônica de varredura confirmou que os coléteres de B. nicholsonii
são estruturas cilíndricas de base estreita, às vezes de ápice afinalado, sendo este um sinal
de senescência (fig. 2A) na base das estípulas. Freqüentemente, a secreção cobria parte dos
coléteres (fig. 2B), sendo este um indicativo de sua abundância. Em vista frontal, as células
epidérmicas apresentavam perfil retangular e superfície lisa (fig. 2 A e 2B). Em cortes
longitudinais (fig. 2C) e transversais (fig. 2D) foi identificado uma epiderme unisseriada
dispostas em paliçada, e o eixo central parenquimático. Na região de ocorrência dos
coléteres na estípula, foram identificados tricomas próximos a estas estruturas (dado não
mostrado).
Em microscopia óptica, cortes transversais e longitudinais revelaram que coléteres
de B. nicholsonii apresentavam eixo central vascularizado, formado por parênquima
fundamental circundado por um estrato epidérmico em paliçada (fig. 3A-B, D-F). Estas
estruturas inserem-se na estípula por uma região basal de menor diâmetro, apresentando
constricção na base. Nesta foram observadas 2 ou 3 células epidérmicas isodiamétricas,
seguidas de células de aspecto cilíndrico, cujo maior eixo aumenta gradativamente (fig.
3A). Em cortes longitudinais, evidenciou-se o formato cilíndrico das células
35
parenquimáticas, dispostas, tendo como referencial seu maior eixo, perpendicularmente à
epiderme (fig. 3A e 3C). Neste eixo central, os feixes vasculares apresentavam-se discretos,
em forma de traços vasculares. Em cortes transversais, eram observados o eixo central
parenquimático e a epiderme. Estruturas grandes e osmiofílicas eram evidentes no
citoplasma das células epidérmicas (fig. 3B e 3D). Em maiores aumentos, era clara a
distinção entre estas estruturas e o núcleo celular, sendo também evidente a densidade
citoplasmática (fig. 3C). Cortes a mão livre de material fresco não revelaram diferenças na
organização tecidual dos coléteres (fig. 3E e 3F) quando comparados com material
processado para microscopia (fig. 3A-3D). O método histoquímico de Schiff revelou a
presença de açúcares, predominantemente no ápice das células epidérmicas e na secreção
(fig. 3G e 3H); enquanto que a coloração com Azul Brilhante de Coomassie revelou
proteínas com localização similar a dos polissacarídeos revelados pelo método de Schiff
(fig. 3I).
Em microscopia eletrônica de transmissão foi possível flagrar diferentes momentos
da epiderme secretora dos coléteres. No momento secretor, as células epidérmicas
encontravam-se túrgidas e com aparato ultraestrutural típico de células altamente
envolvidas em processos de síntese (fig. 2 a 5); e, um segundo momento senescente, em
que eram evidentes o desmantelamento do aparato celular e progressiva plasmólise (fig. 6 e
7).
No primeiro momento, o citoplasma apresentou abundância de organelas,
característica típica de células altamente funcionais, sendo evidente a distinção entre núcleo
celular e inclusões osmiofílicas (fig. 4A). Tais inclusões são freqüentes no citoplasma e as
imagens fortemente sugerem que se formam a partir de acréscimo de inclusões menores
(fig. 4B). Elementos do retículo endoplasmático liso foram comumente observados
lateralmente às inclusões (fig. 4B e 4C). O teste citoquímico de tetróxido de
ósmio/imidazol confirmou a natureza lipídica desta estrutura (fig. 4C). O núcleo apresentou
distinção clara entre eucromatina e heterocromatina, seu envelope nuclear aparece
preservado (fig. 4D). Dispersos no citoplasma foram observados elementos do retículo
endoplasmático rugoso dispostos concentricamente (fig. 4E) e paralelamente (fig. 4F).
Retículo endoplasmático liso e rugoso e complexos de Golgi eram abundantes no
citoplasma (fig 4F – 4H); enquanto que, as mitocôndrias, apresentando um grande número
36
de cristas na membrana interna, e pequenos vacúolos, com conteúdo eletronluscente, foram
menos freqüentes (fig. 4F). Complexos de Golgi apresentando profícuo trans-Golginetwork (fig. 4G) e ribossomos livres (fig. 4H) também foram abundantes. Não foram
observados espaços entre a parede celular e a membrana plasmática.
Vesículas osmiofílicas foram identificadas emergindo de complexos de Golgi desde
a região cis até a região de trans-Golgi-network, em amostras processadas por métodos de
rotina para microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 5A). A proximidade de elementos
do retículo endoplasmático rugoso (fig. 5B – 5D) e de extremidades dilatadas destas
estruturas com a membrana celular foi identificada (fig. 5B). No entanto, figuras de fusão
de membrana do retículo endoplasmático rugoso com a membrana celular não foram
observadas. Fusões de membrana de grandes vesículas com a membrana plasmática, e
conseqüente extravasamento de seu conteúdo para o apoplasto, foram identificados (fig.
5F). Plastídios (fig. 5E) e retículo endoplasmático liso (fig. 5F) foram abundantes. Um
marco da transição do momento de síntese para o de senescência é o surgimento de um
espaço entre a membrana celular e a parede celular (fig. 5E e 5F).
No momento senescente era evidente a gradativa desestruturação citoplasmática
paralelamente à plasmólise. A principal evidência da desestruturação citoplasmática era a
degradação do sistema de membranas das organelas. No início deste processo,
determinadas organelas, como complexo de Golgi e retículo endoplasmático (fig. 6A),
podiam ser identificadas apresentando membranas fragmentadas. Inclusões lipídicas de
diferentes diâmetros eram freqüentes (fig. 6A). O núcleo celular era identificável, porém
apresentando-se parcialmente degradado, com discreta diferenciação entre eucromatina e
heterocromatina; o envelope nuclear apresentava-se estruturalmente alterado (fig. 6B). Em
outros casos, era perceptível a diferenciação entre eucromatina e heterocromatina (fig. 6C).
Núcleos celulares condensados não foram identificados. As membranas dos plastídios
também se encontravam desorganizadas (fig. 6B). A degradação citoplasmática avançou
paralelamente à plasmólise (fig. 6C e 6D). Em áreas destas células, não foram observadas
membranas estruturadas, exceto as do envelope nuclear (fig. 6C). Endomembranas com
morfologia atípica foram identificadas (fig. 6E), as quais se assemelhavam a elementos do
retículo endoplasmático. Mitocôndrias puderam ser identificadas, porém apresentando
diferentes níveis de desorganização de suas membranas (fig. 6F e 6G) e matriz condensada
37
(fig. 6G). Finalmente, o citoplasma se apresentava praticamente degradado, com grandes
vacúolos, e não justaposto à membrana (fig. 7A e 7B). Ausência de limites celulares,
ruptura dos grandes vacúolos (fig. 7A e 7B), debris eletrondensos (fig. 7C) e estruturas que
morfologicamente podiam ser inferidas como mitocôndrias (fig. 7C), e retículo
endoplasmático rugoso (fig. 7D) evidenciam o término da degradação celular.
De forma assincrônica em relação aos fenômenos citoplasmáticos, foi possível
identificar diferentes fases de diferenciação da parede periclinal externa das células das
epidermes secretoras. Assim, a parede periclinal externa de B. nicholsonii apresentou três
camadas morfologicamente distintas. Uma camada basal rica em polissacarídeos, uma
membrana cuticular, rica em lipídios, subdividida em arborescente e reticulada, e uma fina
camada de cutícula propriamente dita (fig. 8A), sendo inicialmente, estruturalmente similar
à parede celular da estípula (fig. 8B).
Sítios de acúmulo de secreção, presentes exclusivamente na camada basal e
caracterizados por serem regiões da parede celular pobres em material fibrilar, foram
identificados durante o processo de diferenciação da parede periclinal externa (fig. 8C).
Estes sítios apresentaram-se fortemente marcados pelo método do iodeto de potássio (fig.
8D) e pelo método do tetróxido de ósmio/imidazol; enquanto que, a marcação pelo método
de Thiéry foi fraca ou inexistente (fig. 8F). Em relação à parede periclinal externa,
polissacarídeos, revelados pelo método de Thiéry, apresentaram forte marcação na camada
basal, nas regiões arborescentes da membrana cutícula e fraca ou ausência de marcação nas
outras regiões (fig. 8F). A cutícula propriamente dita não apresentou marcação por este
método. O método do tetróxido de ósmio/imidazol revelou intensa marcação na membrana
cuticular e nos sítios de acúmulo de secreção (fig. 8E); a camada basal e a cutícula
propriamente dita foram fracamente marcadas. A marcação pelo método de iodeto de
potássio revelou-se heterogênea na membrana cuticular, sendo intensa nas regiões próximas
à camada basal (fig. 8D), em contraste com a fraca marcação observada na camada basal e
na cutícula propriamente dita.
Os sítios de acúmulo de secreção aumentam gradativa e relativamente de tamanho
em relação à camada basal, sendo que, em determinadas regiões atingem a membrana
cuticular (fig. 9A e 9B). Os métodos citoquímicos apresentaram resultados similares aos
descritos anteriormente; ressaltando-se a intensa marcação da membrana cuticular próxima
38
à camada basal pelo método do iodeto de potássio (fig. 9C), a continuidade de marcação
pelo do tetróxido de ósmio/imidazol na membrana cuticular (fig. 9D), e a marcação dos
sítios de acúmulo de secreção por estes dois métodos.
A partir de determinado momento, os sítios de acúmulo de secreção não eram mais
individualmente identificáveis; e, as imagens fortemente sugerem a dispersão do material
acumulado pela parede periclinal externa (fig. 9E). Cortes transversais aparentemente
revelaram um aumento relativo da membrana cuticular em comparação com a camada
basal, a qual se projetam regiões pontuais da membrana cuticular (fig. 9E – 9G). Os
métodos citoquímicos revelaram o mesmo padrão de marcação, anteriormente descrito,
diferindo no aumento de intensidade de marcação.
Subseqüentemente, evidenciou-se desestruturação da parede periclinal externa (fig.
10A - 10D). A camada basal apresentou-se menos condensada que anteriormente (fig. 10A)
e os sítios de acúmulo de secreção não foram identificáveis (fig. 10A e 10B). As projeções
da camada polissacarídica, nos estratos cuticulares, tornam-se menos evidentes (fig. 10A).
A marcação com iodeto de potássio revelou-se heterogênea na membrana cuticular (fig.
10B); enquanto que, o emprego de tetróxido de ósmio/imidazol foi homogênea nesta
região. Finalmente, evidenciou-se a desestruturação da camada arborescente da membrana
cuticular (fig. 10C), que praticamente desapareceu ao termino da diferenciação (fig. 10D).
A diferenciação da parede periclinal externa das células da epiderme secretora dos coléteres
foi observada.
A análise qualitativa dos elementos químicos, realizados por energia dispersiva de
elétrons em microscopia eletrônica de varredura (MEV/EDX), revelou predominância de
potássio na parede periclinal externa dos coléteres (fig. 11A) e das estípulas (fig. 11B);
enquanto que, na secreção, a predominância foi de cálcio (fig. 11C).
A presença de proteínas na secreção dos coléteres, com massas moleculares
variando entre 66 e 24 kDa, foi revelada por eletroforese (SDS-PAGE), havendo duas
proteínas majoritárias, com massas moleculares de aproximadamente 26 e 36 kDa (fig. 12
raia A). Não foram notadas diferenças nas amostras quando submetidas ao tratamento com
β-mercaptoetanol; exceto, uma única banda protéica de aproximadamente 29 kDa (fig. 12
raia B). O tratamento do gel para detecção de glicoproteínas também revelou um padrão
39
similar ao anteriormente descrito (fig. 12 raia C); inclusive, quando tratado com βmercaptoetanol (fig. 12 raia D).
As curvas de crescimento de Fusarium oxysporum, Colletotrichum musae em meio
sólido Sabouraud revelaram uma discreta inibição de crescimento destes patógenos quando
tratados com 200 mg.mL-1 do estrato total da secreção. Esta inibição pode ser detectada no
intervalo entre 50 e 60 horas de cultivo (Figura 13 A e 13 B). Em relação a C.
lindemuthianum, o mesmo procedimento revelou uma significativa inibição de crescimento
após 26 horas de incubação, culminando com cerca de 60 % de inibição do crescimento
após 62 horas de tratamento (Figura 13 C).
40
Figura 1: Folhas, ápices caulinares e base da estípula de Bathysa nicholsonii. A – Folhas e
ápice caulinar; B – Detalhe do ápice caulinar mostrando a estípula (seta); C e D – Ápices
caulinares com sinais de herbivoria. E – Base da face adaxial da estípula vista ao
microscópio estereoscópico. Note a distribuição dos coléteres em dois triângulos, na base
das estípulas; F – Detalhe dos coléteres vistos em microscópio estereoscópico. Barras: E 0,6 cm; F - 0,5 mm.
41
Figura 2: Microscopia eletrônica de varredura dos coléteres de Bathysa nicholsonii. A –
Visão da base da estípula mostrando coléteres cilindriforme embebido, em parte, na
secreção; B – Detalhe dos coléteres embebidos na secreção; C – Corte longitudinal de um
coléter evidenciando a superfície, a epiderme em paliçada e o eixo central parenquimático.
D – Corte transversal do coléter. Note epiderme e eixo central parenquimático. Coléteres
(asterisco); Secreção (triângulo); Superfície (S); Epiderme em paliçada (EP); Traço
vascular (TV); Eixo central vascularizado (quadrado). Barras: A - 250 µm; B - 200 µm; C e
D - 20 µm.
42
Figura 3: Microscopia óptica dos coléteres de Bathysa nicholsonii. A-D – Coloração com
azul de toluidina. A – Corte longitudinal do coléter evidenciando a constricção na base
(seta), eixo central e epiderme em paliçada; B e D – Cortes transversais dos coléteres
mostrando estruturas lipídicas fortemente marcadas (circuladas) nas células da epiderme; C
– Detalhe da epiderme mostrando estruturas fortemente marcadas (circuladas) em
contraposição ao núcleo (cabeça de seta); E-I – Cortes à mão livre dos coléteres
submetidos a testes citoquímicos; E e F – Controle; G e H – Amostras submetidas ao
reagente de Shiff; I – Amostra submetida ao teste com Azul Brilhantes de Comassie. Note,
em ambos os casos, marcação na secreção, predominantemente. Epiderme em paliçada
(EP); eixo central parenquimático (quadrado). Barras: A e E - 100 µm; C - 20 µm; B, D, F
, G e H - 50 µm;
43
Figura 4: Microscopia eletrônica de transmissão das células secretoras dos coléteres de
Bathysa nicholsonii. A – Visão geral do citoplasma evidenciando o núcleo e as estruturas
lipídicas; B – Detalhe da formação das estruturas lipídicas com contrastação de rotina; C –
Detalhe das estruturas lipidicas marcadas com a técnica Ósmio-Imidazol; D – Núcleo
mostrando individualização entre eucromatina e heterocromatina; E – Citoplasma
mostrando retículo endoplasmático digitiforme; F e H – Detalhe do citoplasma mostrando
cisternas do reticulo endoplasmático rugoso e complexo de Golgi; G – Visão geral do
citoplasma. Note a grande quantidade de retículo endoplasmático e complexo de Golgi. Nu
- núcleo; Lip - corpos lipidicos; Seta - corpos lipidicos; RER - retículo endoplasmático
rugoso; RED - retículo endoplasmático digitiforme; CG - complexo de Golgi; V - vesícula.
Barras: A - 2,5 µm; B, C e D - 0,6 µm; E e F - 0,4 µm; G - 0,12 µm; e H - 0,25 µm.
44
Figuras 5: Microscopia eletrônica de transmissão das células secretoras dos coléteres de
Bathysa nicholsonii. A – Citoplasma das células epidérmicas mostrando vesículas
elentrondensas do complexo de Golgi; B – Área do citoplasma onde o RE se encontra
muito próximo a membrana plasmática; C e D – Detalhe da eletromicrografia anterior. Não
foi observada conexão entre as duas membranas; E – Visão do citoplasma no inicio do
processo de contração do citoplasma para a formação do espaço intermembranar; F –
Detalhe fusão de uma vesícula com a membrana plasmática, descarregando seu conteúdo
no espaço intramembranar. CG – Complexo de Golgi; RER – Retículo endoplasmático
rugoso; PC – Parede periclinal externa; V – Vesícula; P – Plastídeo; EIM – Espaço
intremembranar; REL – Retículo endoplasmático liso. Barras: A e B - 0,25 µm; C - 0,9 µm;
D - 0,05 µm; E - 0,4 µm e F - 0,15 µm.
45
Figura 6: Microscopia eletrônica de transmissão das células secretoras dos coléteres de
Bathysa nicholsonii. A – Visão geral do citoplasma no início da formação do espaço
intramembranar. Note a desorganização das membranas e a presença das estruturas
lipidicas, um pequeno vacúolo e retículo endoplasmático; B –Citoplasma mostrando o
núcleo, sem individualização de eucromatina e heterocromatina, e plastídeos; C e D – Corte
transversal das células secretoras evidenciando o espaço intramembranar e raros vacúolos;
E – Citoplasma desorganizado; F e G – Mitocôndrias em estágios de degradação. EIM –
Espaço intremembranar; Lip – Inclusões lipidicas; Vac – Vacúolo; PC – Parede celular; RE
– Retículo endoplasmático; Nu – Núcleo; P – Plastídeo. Barras: A - 0,6 µm; B e E - 0,4 µm;
C e D - 2,5 µm; F - 0,25 µm e G - 0,15 µm.
46
Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão das células secretoras dos coléteres de
Bathysa nicholsonii. A e B – Visão geral do citoplasma das células secretoras com o
citoplasma degradado. Note o grande vacúolo central, algumas vezes rompido; C – Detalhe
do citoplasma degradado, em uma região onde é impossível diferenciar organelas; D –
Detalhe de uma região onde é possível notar o retículo endoplasmático rugoso com grandes
espaços entre as cisternas. EXT – Espaço extracelular; PPE – Parede Periclinal Externa;
EIM – Espaço intremembranar; Seta – Provável sítio de ruptura do vacúolo; PC – parede
celular; Cit – Citoplasma; VAC – Vacúolo; RER – Retículo endoplasmático rugoso; M –
Mitocôndria. Barras: µm.
47
Figura 8: Microscopia eletrônica de transmissão da parede periclinal externa das células
secretoras dos coléteres e da estípula de Bathysa nicholsonii. A – Parede periclinal externa
no primeiro estágio de desenvolvimento contrastada com acetato de uranila/citrato de
chumbo (rotina); B – Parede anticlinal das células secretoras; C a F – Segundo estágio de
desenvolvimento da parede periclinal externa. C – Marcação de rotina. Note o inicio da
formação dos sítios de acúmulo de secreção na camada polissacarídica. D – Marcação com
KI. Note marcação heterogênea das camadas lipidicas e fraca marcação na camada
polissacarídica. E – Marcação com Ósmio/imidazol. Note marcação homogênea nos sítios
de acúmulo de secreção e camadas lipidicas. F – Marcação pelo método de Thiéry. Camada
polissacaridica fortemente marcada, contudo os sítios de acúmulo de secreção não são
marcados. Pol – camada polissacarídica da parede periclinal externa; Ext cut – Extratos
cuticulares, subdivididos em camada reticulada (Ret) e arborescente (Arb); Cut – Cutícula
propriamente dita; SAS – Sítio de acumulo de secreção. Barras: A e C – 0,15 µm; B e F –
0,09 µm; D e E – 0,4 µm.
48
Figura 9: Microscopia eletrônica de transmissão da parede periclinal externa das células
secretoras dos coléteres de Bathysa nicholsonii. A-D – Terceiro estágio de diferenciação da
parede periclinal externa; A e B – Marcação de rotina. Note os sítios de acumulo de
secreção ocupando a maior parte da camada polissacarídica, invadindo as camadas
lipidicas; C – Marcação com iodeto de potássio. Note marcação heterogênea das camadas
lipidicas e fraca marcação na camada polissacarídica. Os sítios de acúmulo de secreção
também são marcados; D – Marcação com Ósmio/imidazol; E-G – Quarto estágio de
diferenciação da parede periclinal externa; E - Marcação de rotina. Observe as projeções
das camadas polissacaridicas nas camadas lipidicas; F – Marcação com KI; G – Marcação
com Ósmio/imidazol. Os padrões de marcação são os mesmos descritos anteriormente. Ext
– Espaço extracelular; Cit – Citoplasma; Pol – camada polissacarídica da parede periclinal
externa; SAS – Sítio de acumulo de secreção; Seta – Projeções das camadas
polissacaridicas nas camadas lipidicas. Barras: A – 0,12 µm; B – 0,3 µm; C-G – 0,4 µm.
49
Figura 10: Microscopia eletrônica de transmissão da parede periclinal externa das células
secretoras dos coléteres de Bathysa nicholsonii. A e B – Quinto estágio de maturação da
parede periclinal externa; A – Marcação de rotina. Observe desorganização dos estratos
cuticulares, especialmente na suas camadas arborescentes; B – Marcação com iodeto de
potássio, revelando marcação heterogênea nos extratos cuticulares; C e D – Sexto estágio
de maturação da parede periclinal externa, marcação de rotina. Desorganização, seguida de
provável degradação, da camada arborescente dos estratos cuticulares Barras: A – 0,25 µm.
B, C, D – 0,4 µm.
50
Figura 11: Microanálise de Raios-X (janela UTW) da parede periclinal externa dos
coléteres, das estípulas e da secreção. A – Gráfico do perfil de elementos químicos da
parede periclinal externa dos coléteres. Note predominância de potássio; B – Gráfico do
perfil de elementos químicos da parede periclinal externa das estípulas. Note
predominância de potássio; C – Gráfico do perfil de elementos químicos da secreção dos
coléteres. Note predominância de cálcio. A – Janela de berílio; B e C – janela UTW.
51
Figura 12: Eletroforese das proteínas da secreção de Bathysa nicholsonii. A – Amostra da
secreção sem o tratamento com β-mercaptoetanol; B – Amostra da secreção tratada com βmercaptoetanol; C e D – Marcação de Glicoproteínas nas mesmas amostras. Setas indicam
bandas de proteínas majoritárias. MA- marcador de massa molecular de alto peso; albumina
bovina (66KDa), ovalbumina (45KDa), anidrase carbônica (29KDa), tripsinogênio
(24KDa) e α-lactoalbumina (14KDa)
52
Figura 13: Gráfico do ensaio de inibição do crescimento de esporos de fungos
fitopatogênicos. A - Fusarium oxysporum; B - Colletotrichum musae; C - Colletotrichum
lindemuthianum. A fração causou uma significativa inibição no fungo C. lindemuthianum,
desde as primeiras horas de crescimento e nenhuma inibição significativa foi visualizada
quando testamos essa fração sobre os fungos F. oxysporum e C. musae durante o decorrer
da curva de crescimento na mesma concentração de 200 mg.mL-1. (▲) Controle; (■)
Tratamento.
53
5. DISCUSSÃO
Coléteres, presentes na base das estípulas, encontradas nos ápices caulinares
vegetativos de Bathysa nicholsonii foram caracterizados estruturalmente. Este estudo
contribuiu para elucidar a anatomia, a ultraestrutura e os fenômenos temporais nas células
da epiderme secretora dos coléteres de B. nicholsonii. Os métodos microscópicos utilizados
permitiram investigar o mecanismo de secreção, focando na extrusão desta através da
parede periclinal externa das células da epiderme secretora. Foram determinadas,
preliminarmente, as proteínas presentes na secreção e avaliadas as atividades antifúngicas
do extrato protéico total.
As estípulas apresentam capacidade fotossintética, mas sua principal função é a de
proteção das folhas jovens em desenvolvimento (Fahn, 1990). Os resultados obtidos neste
trabalho, para B. nicholsonii corroboram esta afirmativa generalista. O tamanho das
estípulas de B. nicholsonii variou pouco, sendo as suas medidas semelhantes às citadas por
Germano-Filho (1999). A morfologia e tamanho das estípulas aparentemente não
influenciam na função protetora (Miguel, 2004). Os ápices caulinares de B. nicholsonii
apresentavam reduzidos sinais de herbivoria, em contraste com as folhas, sendo este um
indicio da eficiência das estipulas e coléteres. Nesta espécie, a secreção é viscosa tornandose vítrea após seca, podendo ser indicativos de proteção física por dificultar o acesso ao
meristema apical caulinar. Por outro lado, tem sido sugerido que o aumento na produção de
goma do cajueiro representa uma resposta à infecção microbiana (Marques e Xavier-Filho,
1991). Os resultados apresentados, ainda que preliminarmente, sugerem que a secreção dos
coléteres de B. nicholsonii pode interferir na interação microrganismo/planta,
considerando-se, ainda, a abundância nesta espécie, quanto comparada a outras espécies do
gênero (Miguel, 2004).
A distribuição dos coléteres nas estipulas de B. nicholsonii são compartilhadas com
outros gêneros da família Rubiaceae, formando conjuntos em Simira glaziovii (Klein et al.,
2004), em Rustia formosa (Miguel et al., 2002) formam dois triângulos na base da estípula,
em B. gymnocarpa, B. stipulata (Miguel et al., 2005), S. pikia, S. rubra (Klein et al., 2004)
e Psychotria nuda (Moraes et al., 2005) estão distribuídos em linhas na base da estípula. A
54
distribuição dos coléteres em dois triângulos na base da estípula parece ser característica
diagnóstica para B. nicholsonii em relação ao gênero Bathysa (Miguel, 2004).
A morfologia dos coléteres tem gerado diversas classificações. Lersten (1974a;
1974b) identificou tipos distintos de coléteres e os classificou em: dendróides, tipo escova
(“brush-like”) e padrão. Thomas (1991) enriquece a classificação e acrescenta os tipos:
reduzido, alado e filiforme. Da Cunha (2005) sugere os termos cilindriforme e claviforme,
subdividindo o tipo padrão em duas categorias. De acordo com essa classificação, os
coléteres de B. nicholsonii são denominados cilindriformes. No entanto, as características
morfológicas, como a constrição da base, e anatômicas, como a vascularização no eixo
central, dos coléteres desta espécie são compartilhadas com espécies do mesmo gênero
(Miguel et al., 2005), de outros gêneros da família Rubiaceae, Pavetta, Neorosea e
Tricalysia (Lersten, 1974a) e Simira (Klein et al., 2004), e de outras famílias, Mandevilla
illustris e M. velutina, Apocynaceae (Appezzato-da-Gloria e Estelita, 2000). Estas
características parecem não ser importantes para diagnóstico à família Rubiaceae, mas
podem auxiliar a classificação no nível genérico; uma vez que, pequenas variações
presentes em poucos casos, devem ser consideradas como caracteres taxonômicos (Lersten,
1975; Da Cunha, 2005).
A definição de coléteres é controversa; principalmente, em nossa opinião, por ser
baseada exclusivamente na estrutura desconsiderando outros parâmetros. Thomas (1991)
sugeriu que as estruturas descritas por Mohan e Inamdar (1986) e Durkee e colaboradores
(1984) como nectários extraflorais em Plumeria e Passiflora, respectivamente, sejam
denominadas coléteres, devido às semelhanças morfológicas destas estruturas com
coléteres. Horner e Lersten (1968) e Williams et al. (1982) enquadram coléteres como
tricomas. Há estruturas denominadas de tricomas elaióforos em flores de Monttea da
família Scrophulariaceae (Sersic e Cocucci, 1999) que possuem células secretoras
colunares no ápice e células basais parenquimáticas e, apesar de apresentarem tênue
semelhança, poderiam ser enquadradas como coléteres. Os tricomas secretores descritos por
Renobales et al. (2001) poderiam ser classificados como coléteres. Objetivando aumentar o
grau de precisão do tema, preconizamos uma classificação que abranja anatomia,
ultraestrutura, fisiologia e composição da secreção para coléteres. Neste contexto, coléteres
são estruturas secretoras, de origem epidérmica e de camadas subepidérmicas, constituídas
55
por eixo central alongado, formado por parênquima fundamental, podendo apresentar traço
vascular, limitado por
extrato epidérmico em paliçada, sendo as células epidérmicas
responsáveis pela secreção; esta é uma estrutura de defesa constitutiva da planta.
Em células secretoras, durante o processo de secreção, mudanças citoplasmáticas
são comuns. No entanto, grande parte da literatura enfoca a ontogênese da estrutura
secretora, desconsiderando etapas terminais, como a senescência (Unzelman e Healey,
1974; Ascenção et al., 1999; Sacchetti et al., 1999; Silva e Machado; 1999; Pascal et al.,
2000; Rio et al., 2002; Rocha et al., 2002). De acordo com Unzelman e Healey (1974), o
desenvolvimento de tricomas secretores de Pharbitis pode ser dividido em quatro fases:
fase de crescimento, fase de atividade de secretora, fase de maturidade e fase de
senescência; sendo a ultima fase, aparentemente, relegada a uma importância inferior. Estes
autores fazem uma descrição sucinta, relatando a redução do número de cisternas do
complexo de Golgi, vesículas cobertas e mitocôndrias, além da diminuição da fusão de
membranas entre retículo endoplasmático rugoso e vesículas cobertas com a membrana
plasmática. Sacchetti et al. (1999) descreve a ontogênese de tricomas glandulares de
Calceolaria adscendens (Scrophulariaceae). A estrutura é descrita; contudo, nada é
mencionado com relação à sua senescência. Outros estudos têm ainda um enfoque apenas
morfológico, tais como: Rio et al. (2002) apenas descreve anatomicamente os coléteres
foliares de Prestonia coalita, não mencionando aspectos ultraestruturais ou do seu
desenvolvimento; Rocha et a. (2002) descreve vários tipos de estruturas secretoras que
denomina coléteres em folhas de Hibiscus tilianceus e H. pernambucensis, utilizando
microscopia
óptica
de
campo
claro.
Assim,
o
presente
trabalho
caracteriza
morfologicamente e ultraestruturalmente a estrutura; e, sugere etapas de desenvolvimento
das células secretoras, fornecendo uma visão desde a síntese da secreção até a senescência
dessa estrutura , levando em conta o conjunto dos parâmetros analisados.
As células das estruturas secretoras, em geral, são caracterizadas por apresentar
citoplasma denso, núcleo, numerosas mitocôndrias, retículo endoplasmático e numerosos
complexo de Golgi e inúmeros vacúolos (Rachmilevitz e Fahn, 1972; Fahn, 1979; Da
Cunha et al., 1998). Vários estudos mostram que o complexo de Golgi e o retículo
endoplasmático são as organelas mais importantes na produção de mucilagem (Dexheimer
e Guenin, 1981). Contudo, Werker e Kislev (1978) mostram que as mitocôndrias também
56
podem participar ativamente no processo de produção de mucilagem em pêlos radiculares
de Sorghum. Embora, de uma forma geral, o processo de secreção seja complexo e o
exsudato constituído por numerosos compostos, ou grupos de compostos, nota-se uma
especificidade na atividade das células secretoras, evidenciada ultraestruturalmente. Sendo
assim, análises ultraestruturais permitem correlacionar as características celulares com a
natureza do material secretado e a dinâmica do processo de secreção. Assim, as células que
secretam material de natureza predominantemente hidrofílica mostram complexo de Golgi
evidente, especialmente em células secretoras. As células secretoras de substâncias
predominantemente lipofílica apresentam retículo endoplasmático liso desenvolvido e
numerosos plastídios. A presença de retículo endoplasmático rugoso está ligada à produção
de proteínas (Machado e Carmelo-Guerreiro, 2001). Outras características como a
abundância de mitocôndrias, ribossomos, corpos multivesiculares, presença ou ausência de
espaços periplasmáticos devem ser utilizadas na compreensão da dinâmica das estruturas
secretoras (Machado e Carmelo-Guerreiro 2001). Durante o estudo dos coléteres de B.
nicholsonii foi possível identificar ultraestruturalmente diferentes estágios das células
secretoras, baseado na freqüência de organelas como o complexo de Golgi, o retículo
endoplasmático e as mitocôndrias; da presença ou ausência de vacúolo, espaços
periplasmáticos e de inclusões lipídicas no citoplasma; e na integridade das estruturas
citoplasmáticas e, finalmente, na integridade celular.
Os presentes resultados sugerem que o processo secretor nos coléteres de B.
nicholsonii é temporal. Uma evidência para tanto é a ocorrência de alterações morfológicas
nas organelas das células secretoras durante a o processo global de secreção. Por exemplo,
o complexo de Golgi que hora apresenta vesículas eletrondensas, hora apresenta vesículas
eletronluscentes. Um exemplo polêmico são os plastídios. Esta organela já foi descrita em
diversas estruturas secretoras, inclusive em coléteres. Especula-se a participação no
processo de síntese, acumulo e liberação de substâncias lipídicas da secreção (Horner e
Lersten, 1968; Kristen, 1976; Miller et. al., 1983; Mohan e Inamdar, 1986; Klein et al.,
2004).
Alterações dos produtos secretados durante diferentes fases das células secretoras
dos coléteres foram observadas por Thomas e Dave (1968) e Mohan e Inamdar (1986). De
acordo com Machado (2001), mudanças citoplasmáticas ao longo do ciclo secretor também
57
são comuns. Estes dois eventos, mudança de exsudato e ultraestrutura, sugerem ser bastante
íntimos e dependentes. Por decorrência, as mudanças no citoplasma em células secretoras
podem ser relacionadas com o processo intrínseco do ciclo de vida, como a morte celular
programada. O processo de morte celular programada é de fundamental importância para a
planta, desde o inicio do desenvolvimento do corpo vegetal (McCabe e Leaver, 2000). A
apoptose pode ser reconhecida morfologicamente por sinais clássicos como a contração do
citoplasma, alteração na morfologia nuclear e posterior clivagem do DNA (Green e
Kroemer, 1998; McCabe e Leaver, 2000; Doorn e Woltering, 2005). Alguns autores
afirmam que, em células vegetais, não existe o processo de apoptose real, já que para esse
processo é necessário que os corpos apoptóticos sejam degradados em outras células
(Doorn e Woltering, 2005). De fato, a ultraestrutura das células secretoras sugerem que o
processo corrente é do tipo menos comum de morte celular programada, a morte celular
programada não lisossomal (Doorn e Woltering, 2005). Nossos dados sugerem que as
mudanças estruturais em coléteres de B. nicholsonii são decorrência do processo de morte
celular programada não lisossomal que normalmente ocorre nestas células secretoras.
Em Biologia Celular Vegetal o fluxo apoplástico pela parede periclinal externa da
epiderme das partes aéreas é motivo de debate. No entanto, tem sido considerado que a
parede periclinal externa da epiderme constitui uma barreira física na fronteira entre o
vegetal e o ambiente (Tenberge, 1992). A construção tridimensional das macromoléculas é
marcante e heterogênea, formando camadas características. Em coléteres, a microscopia
eletrônica de transmissão tem sido utilizada para enfocar a presença ou ausência de cutícula
(Klein, 2002). Os resultados permitiram distinguir três camadas na parede periclinal externa
das células secretoras da epiderme dos coléteres de B. nicholsonii, similares as presentes
em tricomas secretores de Cannabis sativa (Mahlberg e Kim, 1992); coléteres de Simira
glaziovii e S. pikia (Klein et al., 2004), Bathysa stipulata e B. nicholsonii (Miguel, 2004).
Diversas imagens, por microscopia eletrônica de transmissão, das células
secretoras da epiderme dos coléteres de B. nicholsonii fortemente sugerem alterações
estruturais da parede periclinal externa, durante o processo de secreção. Assim,
inicialmente surge um sítio de acúmulo de secreção na camada basal. Posteriormente, este
sítio expande-se em direção ao meio externo. Neste momento, há aparentemente uma
inversão em espessura relativa entre a camada basal e a membrana cuticular, sugerindo o
58
fluxo da secreção. A literatura revela processos semelhantes. Já que a secreção é lipídica e
protéica, ela passa mais fácil pelas camadas lipídicas, nesse momento maior. Mahlberg e
Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que, em tricomas glandulares de
Cannabis sativa, a passagem da secreção pela parede periclinal externa se da através de
estruturas semelhantes, demoninadas cavidades secretoras. Kim e Mahlberg (1997)
localizaram o tetra-hidro-canabinol (THC) nas cavidades secretoras, fortalecendo esta
idéia. Utilizando criofixação e criosubstituição, os mesmos autores, observaram a formação
de vesículas secretoras que se encaminham para as cavidades secretoras (Kim e Mahlberg,
2003). Possobon e Machado (2005) denominaram estruturas semelhantes às cavidades
secretoras de sítios de acúmulo de secreção. Veys et al. (2002) mostra que a externalização
de moléculas em cavidades secretoras de folhas de Azolla se dá por projeções na parede
periclinal externa. Sugerimos, então, que as paredes periclinais externas de estruturas
secretoras assumam uma dinâmica diferente.
Jefree (1996) aponta mecanismo diverso do citado anteriormente para o fluxo de
secreção, sugerindo a presença de microcanais, perpendiculares a membrana plasmática, e
acúmulo da secreção nas camadas cuticulares da parede celular. Este acúmulo acaba por
levar a ruptura física da parede periclinal externa. Outros autores argumentam que não
existem microcanais ou estruturas equivalentes, e que a secreção flui através da parede
periclinal externa por difusão (Veys et al., 2002). Nenhuma estrutura semelhante às
vesículas secretoras foi observada, provavelmente pela técnica utilizada. Mais estudos
utilizando técnicas de criofixação, criosubstituição e marcadores imunológicos devem ser
conduzidos para melhor elucidar a passagem da secreção pela membrana plasmática, até a
parede celular, bem como sua passagem por essa.
O método citoquímico de iodeto de potássio (Locke e Huie, 1983) evidenciou os
compostos lipídicos da membrana cuticular, marcando-a heterogeneamente; enquanto que,
método do tetroxido de ósmio / imidazol (Angermuller e Fahimi, 1972) revelou marcação
homogênea dos mesmos compostos nesta mesma camada. A diferença entre os dois
métodos indica a necessidade de refinamento metodológico que permita esclarecer tal
questão. O primeiro teste aponta para que a heterogeneidade desses extratos possa estar
relacionada com o processo de passagem de moléculas pela parede periclinal externa.
59
Nenhum estudo relacionou, ainda, a composição das camadas lipídicas da parede celular
com o mecanismo de passagem de moléculas por essa.
A presença de açúcares na secreção dos coléteres for observada inicialmente por
Thomas e Dave (1989), estudando coléteres de Allamanda (Apocynaceae). Resultados
similares foram obtidos na secreção dos coléteres de B. Nicholsonii. No entanto, pode-se
questionar a marcação positiva exclusivamente na secreção pelos métodos histoquímicos
utilizados, Azul de Comassie e reagente de Shiff. Inferimos que tempos de incubação
maiores poderiam revelar marcação em estruturas intracelulares nas células da epiderme
secretora.
A microanálise de raio-X revelou predominância de potássio na parede periclinal
externa dos coléteres e das estípulas de B. Nicholsonii; enquanto que, na secreção
identificou-se a predominância de cálcio. A presença de cálcio na secreção pode fornecer
informações sobre o mecanismo de secreção. Zonia et al. (2001) mostram que o gradiente
de íons cloro e cálcio influenciam diretamente na exocitose durante o crescimento do tubo
polínico. No entanto, não foram encontrados relatos sobre a composição elementar em
coléteres.
Os exsudatos vegetais têm amplo uso terapêutico na medicina popular e podem ser
utilizados no tratamento de dores de cabeça, garganta, queimaduras, dermatites, náuseas,
picadas de escorpião, infecções, febre reumática, cicatrizante, entre outros (Riviera Nuñez e
Óbon de Castro, 1992; Bown, 1995; Ascenção et al., 1999; Di Stasis, 1987 apud Silva e
Machado, 1999). Este amplo emprego dos exsudatos vegetais reflete sua diversidade. A
presença de proteínas na secreção dos coléteres foi descrita por Klein (2002). O perfil
protéico da secreção de B. nicholsonii mostrou-se diferente do perfil obtido da secreção de
S. glaziovii (Klein, 2002), havendo aparentemente uma proteína comum, com
aproximadamente 29 kDa. Aparte o papel físico-químico, outras funções destas proteínas
não são claramente descritas. Whitmoyer e Horner (1970) mostram que, em folhas de
Psychotria bacteriophila, se estabelece uma relação harmônica entre bactérias e plantas
através de nódulos bacterianos. Em Rubiaceae, tem sido sugerida sua importância na
nodulação bacteriana (Lula, 2010). Pode-se também especular, um papel inibitório ao
crescimento de bactérias e fungos. Uma gama de produtos vegetais é notoriamente
conhecida por sua atividade antimicrobiana (Cowan, 1999). Klein et al. (2004) sugerem
60
que proteínas presentes na secreção de coleteres de Symira servem para a defesa da planta,
por isso, é possível que as proteínas não sejam a única a atuar nesse sentido. A função
antimicrobiana da secreção ainda é questionável, apesar dos resultados promissores na
inibição de crescimento de fungos fitopatogênicos revelados neste estudo. Pelo exposto,
novas abordagens devem ser empregadas para compreensão do papel da secreção de
coléteres na interação microrganismo/planta.
61
6. CONCLUSÃO
ü
As estipulas, junto com as propriedades físicas da secreção dos coleteres, reforçam
o mecanismo de defesa para os ápices caulinares.
ü
Coléteres de Bathysa nicholsonii são do tipo cilíndrico e se encontram distribuídos
na base das estípulas formando dois triângulos.
ü
As características citológicas das células epidérmicas sugerem a temporização do
processo secretor dos coléteres.
ü
As células secretoras dos coléteres de B. nicholsonii, durante seu desenvolvimento,
passam por mudanças citoplasmáticas indicando um processo de morte celular
programada não lisossomal.
ü
A dinâmica dos sítios de acúmulo de secreção, na parede periclinal externa, sugere
o envolvimento destes na externalização das moléculas.
ü
Métodos histoquímicos e citoquímicos reforçam o aspecto temporal do processo de
secreção em coleteres. A parede periclinal externa das células secretoras foi marcadas de
forma heterogeneamente no teste citoquímico de KI e homogeneamente no teste de
ósmio-imidazol;
ü
A microscopia analítica – SEM/EDX - revelou presença de potássio na parede
periclinal externa dos coléteres e das estípulas de B. Nicholsonii; enquanto que, na
secreção, a presença foi de cálcio.
ü
As proteínas presentes na secreção dos coléteres de B. Nicholsonii, são
predominantemente
glicoproteínas
e
sua
função
ainda
é
obscura.
Contudo,
experimentalmente esta secreção apresentou papel inibitório no crescimento de fungos,
sugerindo envolvimento no mecanismo de defesa de plantas.
62
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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