1
INTERAÇÃO DO TRIPANOSSOMATÍDEO PHYTOMONAS SERPENS
COM GLÂNDULAS SALIVARES DO HEMÍPTERO ONCOPELTUS
FASCIATUS: IDENTIFICAÇÃO DO LIGANTE PRESENTE NAS
GLÂNDULAS SALIVARES E CARACTERIZAÇÃO DAS ENZIMAS
PROTEOLÍTICAS SECRETADAS PARA O MEIO DE INTERAÇÃO
FELIPE DE ALMEIDA DIAS
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências
Biológicas (Microbiologia)
Orientador: Angela Hampshire de Carvalho Santos
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO DE 2008
2
Ficha Catalográfica
Dias, Felipe de Almeida
Interação do tripanossomatídeo Phytomonas serpens com glândulas salivares do
hemíptero Oncopeltus fasciatus: identificação do ligante presente nas glândulas
salivares e caracterização das enzimas proteolíticas secretadas para o meio de
interação/ Felipe de Almeida Dias. - Rio de Janeiro: UFRJ/IMPPG, 2008.
xviii/190f.: il.
Orientador: Angela Hampshire de Carvalho Santos
Tese (Doutorado) - UFRJ/IMPPG/Programa de Pós-graduação em Ciências
(Microbiologia), 2008.
Referências Bibliográficas: f. 115-137.
1. Phytomonas serpens. 2. Oncopeltus fasciatus. 3. Interação. 4. Ligante. 5.
Proteases. I. Lopes, Angela Hampshire de Carvalho Santos. II. Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Programa de Pósgraduação em Ciências (Microbiologia). III. Interação do tripanossomatídeo
Phytomonas serpens com glândulas salivares do hemíptero Oncopeltus fasciatus:
identificação do ligante presente nas glândulas salivares e caracterização das enzimas
proteolíticas secretadas para o meio de interação.
3
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica de
Microrganismos do Departamento de Microbiologia Geral do Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG), Centro de Ciências da Saúde
(CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), sob a orientação da
Profa Dra. Angela Hampshire de Carvalho Santos Lopes.
4
“É na experiência da vida que o homem evolui.”
(Harvey Spencer Lewis)
5
AGRADECIMENTOS
6
“A vida é a arte do encontro, embora haja tantos
desencontros pela vida.”
(Vinicius de Moraes)
À minha mãe, Maria Luiza de Almeida Dias, pelo amor incondicional, por todo o
esforço, pelo imenso carinho, por tanta dedicação e pela extrema paciência. Mãe, quase
sempre me faltam palavras, mas espero que saiba que a minha admiração e o meu amor por
você não têm tamanho. Você é, sem dúvida, o exemplo que eu quero continuar seguindo.
Obrigado por TUDO.
Ao meu pai, Renato do Santos Dias, que de uma forma, e também de outra, foi um
grande exemplo na minha vida. Exemplo de que a vida é feita de escolhas. Escolhas que
ditam o rumo de nossa vida. Obrigado por todo o amor, carinho e amizade. Obrigado por
mostrar-se sempre orgulhoso em todas as minhas vitórias. Sei que, em algum lugar, estás com
aquele sorrisinho singelo, aqueles olhos brilhando e muito orgulhoso com mais uma
conquista.
Ao meu grande amor, Renata Estebanez Vollú, pelo carinho, amizade, companheirismo
e dedicação. Obrigado por me fazer feliz e por estar sempre ao meu lado, seja nos momentos
de alegria seja nos de angústia e tristeza. Saiba que tudo que penso e que faço é por nós e que
sem você nada tem valor.
À minha irmã, Renata, e ao meu cunhado, Rodrigo, por me darem de presente, a solução
mais potente contra o stress e o mau humor, o meu sobrinho Igor, que me faz lembrar, a cada
momento, que a felicidade nasce com a gente, e que esta felicidade contagia e faz mais feliz a
vida de outras pessoas.
Ao meu sogrão, Drausio Vollú, à minha sogrona, Marineth Estebanez, à Deinha, ao
Marcelo, à Laurinha, ao Rodrigo, à Samira e à Lorena, por me fazerem sentir como parte de
sua família e pelo carinho com que me recebem e me tratam no lugarzinho mais revigorante
que eu conheço, o Sítio Perua.
7
À minha orientadora, Dra. Angela Hampshire de Carvalho
Santos Lopes, pelo exemplo de profissionalismo, ética e
responsabilidade, pelo companheirismo, pela amizade e
8
dedicação, pela firmeza e benevolência e, principalmente, por
não me poupar das críticas e elogios. Obrigado por acreditar e
investir em mim e no meu trabalho.
Ao Dr. Antônio Ferreira Pereira, pela grande amizade e
carinho e pelos cafezinhos acompanhados de conversas
descontraídas e de boas gargalhadas.
Ao Dr. André Luis Souza dos Santos, pelo carinho, pela
grande amizade, pelos conselhos, ensinamentos e incentivo
constante.
À Dra. Marta Branquinnha, pelo carinho, pelos inúmeros
ensinamentos e palavras de incentivo e pela revisão desta tese.
À Dra. Cláudia d’Ávila Levy, pela amizade e pelas
palavras de conforto e incentivo.
À Dra. Patrícia Maria Lourenço Dutra, por ter me ajudado
a superar os primeiros obstáculos no mundo da ciência,
contribuindo, desta forma, para que eu chegasse até aqui.
À Dra. Elvira Saraiva, pelo incentivo constante, pelos
ensinamentos e pela ajuda referentes aos experimentos de
interação parasito-hospedeiro.
À Dra. Thaïs Souto Padrón, pelos inúmeros ensinamentos
principalmente referentes à microscopia eletrônica.
À Dra. Márcia Attias, pela valiosa ajuda nos experimentos
de microscopia eletrônica.
9
À Dra. Narcisa Leal da Cunha e Silva e aos seus alunos
Celsinho e Dani por terem me ajudado com seus
conhecimentos em todos os momentos que precisei.
Ao Dr. Mário da Silva Neto e aos seus alunos Alan, Felipe
e Raquel por estarem sempre dispostos a me ajudar.
À Dra. Geórgia Correa Atella e ao seu grupo de alunos
pela valiosa ajuda em inúmeras ocasiões.
À Dra. Yara Maria Traub-Cseko, pelas inúmeras palavras
de incentivo.
À Dra. Eliana Barreto Bergter e à Dra. Rosangela Araújo
Soares, por tamanho carinho e ajuda em inúmeras
oportunidades.
Ao Dr. Márcio Lourenço e ao Dr. Leonardo Nimrichter,
pelos ensinamentos, conselhos e palavras de incentivo.
Ao Dr. Paulo Bisch e à sua aluna Letícia Lery, pela ajuda
nos experimentos de espectrometria de massa.
Ao Dr. Jonas Perales e ao seu grupo, pelas inúmera
tentativas de seqüênciar a nossa p130.
Ao pessoal do meu laboratório, Cirilo, Fernando, Luciana,
Maria Fernanda, Marta, Milena e Paulo, pela conversas
descontraídas, e principalmente à Danielle, por segurar firme a
barra de ser sempre a escolhida na hora da zoação.
Às meninas do Laboratório de Estudos Integrados em
Bioquímica Microbiana, Ana, Bianca, Camila, Débora,
10
Fabiane, Fernanda Fonseca, Fernanda Machado, Geralda,
Mariana e Patrícia, pela amizade, pelo carinho e pela
convivência maravilhosa que tivemos nestes últimos anos.
Ao pessoal do Laboratório do Prof. Antonio Ferreira
Pereira, Aline, Geralda, Luciana, Marcos e Patrícia pelas
inúmeras gargalhadas e momentos de descontração.
Ao pessoal do Laboratório de Genética de
Microrganismos, Elisa, Diogo 1, Diogo 2, Jana, Joana,
Marcinha, Silvia e Vanessa, pelas conversas descontraídas e
pelos convites para as festinhas.
À Shirlei e à Sheila, secretárias da Diretoria do Instituto,
pelo carinho e pela ajuda contínua durante o desenvolvimento
desta Tese.
À Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq).
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES).
Ao Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX).
11
Siglas e Abreviaturas
Ac anti-beta-3
Anticorpo produzido contra cadeia beta-3 da laminina-5 humana
ACN
Acetonitrila
ATP
Adenosina trifosfato
BSA
Soroalbumina bovina
CT-IOC
Coleção de Tripanossomatídeos, Instituto Oswaldo Cruz
ºC
Graus Celsius
DNA
Ácido desoxirribonucléico
dNTPs
Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
DTT
Ditiotreitol
EDTA
Ácido etileno-diamino tetracético
EUA
Estados Unidos da América
g
Gravidade
h
Hora
HIV
Vírus da imunodeficiência humana
k-DNA
DNA contido no cinetoplasto
kb
Quilobase
kDa
Quilodalton
M
Molar
mA
Miliampere
MEV
Microscopia eletrônica de varredura
mg
Miligrama
µg
Micrograma
min
- minuto
mL
Mililitro
µL
Microlitro
mM
Milimolar
MO
Microscopia óptica
12
p130
Proteína de 130 kDa da glândula salivar de Oncopeltus fasciatus
pb
Pares de base
pH
Potencial de hidrogêneo
PBS
Tampão fosfafato-salina
PCR
Reação de polimerização em cadeia
PMSF
Fluoreto de fenilmetanosufonil
RNA
Ácido ribonucléico
SDS
Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
Solução salina
NaCl a 0,9%
Sulfo-NHS-LC-biotina
Sulfosuccinimidil-6-(biotinamida) hexanoato
TBS
Tampão tris 10 mM, NaCl 190 mM
TBS-tween
Tampão tris 10 mM, NaCl 190 mM, tween 20 a 0,05%
TE
Tampão tris 10 mM, EDTA 1 mM
TEB
Tampão tris 890 mM, EDTA 25 mM, ácido bórico 890 mM
TFA
Ácido trifluoracético
U
Unidade
V
Volts
V1, V2, V3 e V4
Ventrículos do intestino médio de Oncopeltus fasciatus
13
Resumo
Algumas espécies de Phytomonas são capazes de causar doenças letais,
enquanto outras causam menores danos à planta, pois infectam sítios restritos
como os dutos laticíferos e frutos. Em qualquer uma das situações, estes
tripanossomatídeos podem causar prejuízos em culturas de grande importância
econômica. Sabendo que a invasão das glândulas salivares dos insetos vetores é
certamente uma etapa importante dentro do ciclo biológico das espécies de
Phytomonas e que o aumento do conhecimento a respeito deste processo pode
permitir o desenvolvimento de estratégias para o controle de parasitoses
causadas por estes tripanossomatídeos, no presente estudo estabelecemos uma
colônia
de
hemípteros
da
espécie
Oncopeltus
fasciatus
livre
de
tripanossomatídeos no intuito de estabelecer a infecção por Phytomonas serpens
nestes insetos e, a partir de então, estudar os mecanismos biológicos e
moleculares envolvidos na interação deste parasito com as glândulas salivares
do inseto. Após a interação ex vivo e in vitro dos parasitos com as glândulas
salivares do inseto, por meio de microscopia eletrônica de varredura observamos
que P. serpens é capaz de aderir à membrana basal que reveste externamente as
glândulas salivares de O. fasciatus, via flagelo ou corpo celular, e atravessar esta
barreira via corpo celular. A adesão dos parasitos na glândula parece ocorrer
através do reconhecimento de uma proteína de 130 kDa das glândulas salivares,
a qual possui seqüência peptídica e antígenos similares à cadeia beta-3 da
laminina-5 humana. O tratamento prévio das glândulas salivares com o
anticorpo anti-cadeia beta-3 da laminina, assim como o tratamento prévio de P.
serpens com a laminina-5 ou com a p130 foi capaz de inibir, de forma dosedependente, a interação deste parasito com as glândulas salivares do inseto,
mostrando que a p130 pode ser a molécula-alvo para a ligação de P. serpens nas
14
glândulas salivares de O. fasciatus. Durante a interação com as glândulas
salivares de O. fasciatus, P. serpens foi capaz de liberar para o meio de
interação uma metalo-protease com massa molecular próxima de 63 kDa, que
apresenta semelhanças bioquímicas com a metalo-protease gp63 expressa por
diferentes espécies de Leishmania. Da mesma forma, na presença ou na ausência
de P. serpens, as glândulas salivares de O. fasciatus liberam para o meio de
incubação uma metalo-protease com massa molecular entre 14 e18 kDa, que foi
degradada pela cruzipaína-like de P. serpens. A participação destas proteases no
processo de interação foi discutida.
15
Abstract
Some Phytomonas species may cause lethal diseases, while others cause
minor injuries since they infect limited plant sites such as laticifer ducts and
fruit. These trypanosomatids may be the cause of damage and economic losses
in plantations. Considering that the invasion of the salivary glands of the vectors
is one of the most important events for the life cycle of Phytomonas species,
understanding this occurrence may allow the development of control strategies
against Phytomonas-caused plant disease. In the present study we have
established a trypanosomatid-free colony of the hemipteram insect Oncopeltus
fasciatus aiming to infect them with the parasite Phytomonas serpens, in order
to study the biological and molecular mechanisms involved in the parasitesalivary gland interaction. The scanning electron microscopy of O. fasciatus
salivary glands incubated ex vivo and in vitro with the parasites showed that the
binding of the parasite to the basal membrane that covers the external face of the
glands seems to occur via flagellum and cellular body. On the other hand, the
invasion of the basal membrane by the parasites seems to occur via parasite
cellular body exclusively. The attachment of the parasites to the salivary glands
seems to be mediated by recognition by the parasite of a 130 kDa salivary gland
protein that shares similarities with the peptide sequence of human laminin-5
beta-3 chain. The pre-treatment of the salivary glands with anti-(human)
laminin-5 beta-3 chain antibody as weel as the pre-treatment of P. serpens with
laminin-5 or p130 was able to inhibit the parasite-salivary gland interaction in a
dose-dependent fashion suggesting that the p130 protein may be the target
molecule for the parasite attachment to the salivary glands of O. fasciatus.
During the interaction with O. fasciatus salivary glands P. serpens parasites
shed a metalloprotease to the interaction buffer. This protease of 63 kDa
16
apparent molecular mass presents biochemical similarities with the Leishmania
metalloprotease named gp63. Regardless the presence of P. serpens in the
interaction
assay
buffer,
O.
fasciatus
salivary
glands
shed
another
metalloprotease, which presented a molecular mass between 14 and 18 kDa and
was degraded by a cruzipain-like protease of P. serpens. The role of these
proteases in the interaction between P. serpens and O. fasciatus salivary glands
was discussed.
17
ÍNDICE
INTRODUÇÃO
1-30
1) Importância médica e econômica dos tripanossomatídeos
2
2) Classificação taxonômica
2
3) Gêneros de tripanossomatídeos
3
4) Características gerais dos tripanossomatídeos
4
5) Tripanossomatídeos inferiores
10
6) Tripanossomatídeos parasitas de plantas
11
6.1) Phytomonas serpens
13
7) Tripanossomatídeos parasitas de plantas e seus insetos hospedeiros
15
8) Oncopeltus fasciatus
18
8.1) Características gerais
19
8.2) Trato intestinal
21
8.2) Glândulas salivares
23
9) Envolvimento de enzimas proteolíticas na interação tripanossomatídeo-hospedeiro
27
OBJETIVOS
31-33
METODOLOGIA
34-55
1) Insetos
35
2) Extração do trato intestinal e das glândulas salivares dos insetos
35
3) Parasitos
35
4) Microscopia óptica a fresco
36
5) Microscopia óptica de amostras coradas com solução de Giemsa
36
6) Microscopia eletrônica de varredura
36
7) SDS-PAGE
37
8) Transferência de proteínas para membranas de nitrocelulose
38
9) Estabelecimento de colônia de Oncopeltus fasciatus livre de tripanossomatídeos
38
9.1) A partir de ovos recolhidos na colônia parental
38
9.2) A partir de ovos recolhidos na colônia parental e tratados com hipoclorito de sódio
39
10) Infecção experimental de tomates para cultivo de Phytomonas serpens
40
11) Infecção experimental de Oncopeltus fasciatus com parasitos da espécie Phytomonas serpens
40
18
12) Interação in vitro de Phytomonas serpens com glândulas salivares de Oncopeltus fasciatus inseto, em
condições ex vivo
13) Determinação do perfil de proteínas totais de Phytomonas serpens e das glândulas salivares de
Oncopeltus fasciatus
41
41
14) Biotinilação de proteínas de superfície de Phytomonas serpens
42
15) Observação do perfil de proteínas de superfície de Phytomonas serpens
42
16) Interação de proteínas de superfície do parasito com proteínas das glândulas salivares do inseto por
“ligand blotting”
43
16.1) Transferência de proteínas da glândula salivar para membranas de nitrocelulose
43
16.2) “Ligand Blotting”
43
17) Interação de parasitos vivos com proteínas das glândulas salivares
43
18) Eletroforese bidimensional do extrato protéico das glândulas salivares
44
19) Espectrometria de massa
45
20) “Imunoblotting” da proteína de 130 kDa, utilizando o anticorpo produzido contra a cadeia beta-3 da
laminina-5 humana
46
21) Busca do gene da cadeia beta-3 da laminina-5 em Oncopeltus fasciatus
47
21.1) Extração do DNA total
47
21.2) Reação de polimerização em cadeia
21.3) Eletroforese em gel de agarose
22) Inibição da interação do parasito com as glândulas salivares do inseto
22.1) Inibição promovida pela p130 purificada
a) Purificação da p130
48
49
49
50
50
22.2) Inibição promovida pela laminina-5 humana
51
22.3) Inibição promovida pelo anticorpo anti-cadeia beta-3 da laminina-5 humana
51
23) Enzimas proteolíticas extracelulares envolvidas na interação do parasito com as glândulas salivares do
inseto
51
23.1) Determinação da classe da enzima proteolítica liberada pelo parasito no o meio de interação
53
23.2) Caracterização da atividade proteolítica liberada pela glândula salivar no meio de interação
54
a) Modulação da expressão da protease da glândula salivar exercida pelos parasitos
54
b) Determinação do sítio de atividade da protease de 14-18 kDa da glândula salivar
54
c) Determinação da classe da enzima proteolítica liberada pela glândula salivar no meio de interação
55
RESULTADOS
1) Obtenção de colônia de insetos livres de tripanossomatídeos
56-92
57
1.1) A partir de ovos recolhidos na colônia parental
57
1.2) A partir de ovos recolhidos na colônia parental e tratados com hipoclorito de sódio
62
2) Infecção experimental de tomates para cultivo de Phytomonas serpens
66
3) Infecção experimental de Oncopeltus fasciatus com parasitos da espécie Phytomonas serpens
68
4) Interação in vitro de Phytomonas serpens com glândulas salivares de Oncopeltus fasciatus inseto, em
condições ex vivo
68
19
5) Pesquisa por molécula(s)-alvo para a ligação de Phytomonas serpens às glândulas salivares de
Oncopeltus fasciatus
70
5.1) Perfil de proteínas totais da glândula salivar de Oncopeltus fasciatus
70
5.2) Perfil de proteínas totais de Phytomonas serpens
71
5.3) Perfil de proteínas de superfície de Phytomonas serpens
71
5.4) Interação de proteínas de superfície de Phytomonas serpens com proteínas das glândulas salivares
de Oncopeltus fasciatus
71
5.5) Interação de parasitos vivos com proteínas das glândulas salivares
72
6) Identificação do ligante presente na glândula salivar
75
7) Similaridade antigênica da p130 com a cadeia beta-3 da laminina-5 humana
77
8) Busca do gene da cadeia beta-3 da laminina-5 em Oncopeltus fasciatus
78
9) Inibição da interação de Phytomonas serpens com glândulas salivares de Oncopeltus fasciatus
80
9.1) Inibição promovida pela p130 purificada
80
9.2) Inibição promovida pela laminina-5 humana
81
9.3) Inibição promovida pelo anticorpo anti-cadeia beta-3 da laminina-5 humana
81
10) Envolvimento de enzimas proteolíticas na interação de Phytomonas serpens com glândulas salivares de
Oncopeltus fasciatus
83
10.1) Determinação da classe da enzima proteolítica liberada pelo parasito no o meio de interação
85
10.2) Possível envolvimento da cisteína-protease do parasito na interação com as glândulas salivares do
inseto
87
10.3) Caracterização atividade proteolítica liberada pela glândula salivar no meio de interação
88
a) Determinação do sítio de atividade da protease de 14-18 kDa da glândula salivar
89
b) Determinação da classe da enzima proteolítica liberada pela glândula salivar no meio de interação
91
DISCUSSÃO
93-111
CONCLUSÕES
112-114
BIBLIOGRAFIA
115-137
ANEXOS
138-190
Anexo 1
139
Anexo 2
146
Anexo 3
155
Anexo 4
162
Anexo 5
171
Anexo 6
182
20
INTRODUÇÃO
21
1) Importância médica e econômica dos tripanossomatídeos
A família Trypanosomatidae possui destacada importância na medicina
humana e veterinária e no setor agropecuário, pois reune espécies de
protozoários parasitas causadoras de doenças em humanos e em animais e
plantas de interesse econômico (Mcghee & Cosgrove, 1980; Vickerman, 1994;
Camargo, 1999). Além disso, alguns trabalhos têm demonstrado a importância
dos tripanossomatídeos como patógenos oportunistas. Estes trabalhos relatam
casos de infecções viscerais e cutâneas em indivíduos immunodeficientes
causadas por alguns tripanossomatídeos classificados como não-patogênicos
(revisto por Chicharro & Alvar, 2003).
2) Classificação taxonômica
Os diferentes gêneros de tripanossomatídeos estão agrupados na família
Trypanosomatidae que, de acordo com Levine e colaboradores (1980), possui a
seguinte posição taxonômica:
Reino: Protista
Sub-Reino: Protozoa
Filo: Sarcomastigophora
Subfilo: Mastigophora
Classe: Zoomastigophora
Ordem: Kinetoplastida
Subordem: Trypanosomatina
Família: Trypanosomatidae
22
De acordo com Barnes (1984), o reino Protista agrupa os protozoários,
seres unicelulares eucariotos que, quanto à forma de vida, podem ser divididos
em comensais, simbiontes ou parasitas. Já o filo Sarcomastigophora reune os
protozoários que se locomovem por meio de pseudópodes ou flagelos. Os
protozoários flagelados compõem o subfilo Mastigophora.
A ordem Kinetoplastida foi proposta por Honigberg (1963) para agrupar
exclusivamente os protozoários flagelados, que possuem estrutura subcelular
peculiar denominada cinetoplasto, região da mitocôndria onde se encontra todo
o ácido desoxirribonucléico (DNA) mitocondrial (k-DNA) (Wallace, 1966).
Essa ordem está dividida em duas subordens, Bodonina e Trypanosomatina, que
agrupam, respectivamente, protozoários biflagelados e uniflagelados, de
mitocôndria única e ramificada, que geralmente apresenta-se distribuída por
todo o corpo celular (Vickerman, 1976; Schmidt & Roberts, 1989; Vickerman,
1990).
A subordem Trypanosomatina é constituída exclusivamente pela família
Trypanosomatidae.
3) Gêneros de tripanossomatídeos
As espécies de tripanossomatídeos estão agrupadas em dez gêneros, de
acordo, principalmente, com aspectos morfológicos e especificidade por
hospedeiros (revisto por McGhee & Cosgrove, 1980), características que nem
sempre refletem semelhanças filogenéticas entre estas espécies. Por este motivo,
a necessidade de uma revisão taxonômica na família tem sido sugerida por
alguns autores (Momen, 2001; Podlipaev, 2001; Podlipaev et al, 2004). Neste
contexto, pelo menos três outros gêneros já tiveram a sua formação sugerida
dentro da família Trypanosomatidae (Sousa e Corte-Real, 1991; Podlipaev &
Rokitskaya, 1999; Brandão et al, 2000). Dos dez gêneros que formam a família,
cinco são constituídos por parasitas monoxênicos e outros cinco por parasitas
23
heteroxênicos (Tabela 1). Enquanto os tripanossomatídeos monoxênicos
desenvolvem todo o seu ciclo de vida em um único hospedeiro (invertebrado),
os heteroxênicos, para completar seus ciclos, necessitam de um hospedeiro
intermediário/vetor (hospedeiro invertebrado) e outro definitivo (hospedeiro
vertebrado ou planta, dependendo do gênero) (Vickerman, 1994).
Tabela 1 - Gêneros da Família Trypanosomatidae e seus respectivos
hospedeiros. (*) Gêneros que tiveram a sua formação sugerida.
Gênero
Hospedeiro
* Angomonas (Sousa & Corte-Real, 1991)
Blastocrithidia (Laird, 1959)
Crithidia (Léger, 1902)
Monoxênicos
Herpetomonas (Kent, 1880)
Invertebrado
Leptomonas (Kent, 1880)
Rhynchoidomonas (Patton, 1910)
* Strigomonas (Lwoff & Lwoff, 1931; Brandão et al, 2000)
* Wallaceina (Podlipaev et al., 1999)
Endotrypanum (Mesnil & Brimont, 1908)
Leishmania (Laveran & Mesnil, 1903)
Heteroxênicos
Invertebrado / Vertebrado
Sauroleishmania (Ranque, 1973)
Trypanosoma (Grubby, 1843)
Phytomonas (Donovan, 1909)
Invertebrado / Planta
4) Características gerais dos tripanossomatídeos
Os tripanossomatídeos são organismos unicelulares eucariotos e, portanto,
possuem corpo celular, núcleo e organelas citoplasmáticas delimitadas por uma
bicamada lipídica (Wallace, 1966; McGhee & Cosgrove, 1980).
Características peculiares compartilhadas pelos diferentes gêneros de
tripanossomatídeos fazem deste um grupo singular dentre todos os protozoários.
Entre estas características destacam-se:
24
(i) A presença de uma mitocôndria única e ramificada por todo o corpo celular
(Maslov & Simpson, 1995), cujo DNA possui um arranjo único na natureza e
forma uma estrutura típica, denominada cinetoplasto, que fica localizado
próximo aos cinetossomos do flagelo (revisto por Stuart & Feagin, 1992). O
DNA do cinetoplasto (k-DNA) possui forma oval ou de bastão (Vickerman,
1990) e sua estrutura consiste de uma rede de cadeias circulares de DNA (maxi e
minicírculos) concatenadas e arranjadas de forma compacta. Dependendo da
espécie, são detectadas dezenas de maxicírculos (25-50), contendo de 20-38 kb e
milhares de minicírculos (5.000-27.000), contendo de 0,46-2,5 kb (Vickerman,
1994). Os maxicírculos possuem homogeneidade na seqüência de nucleotídeos e
têm função similar ao DNA mitocondrial de outros eucariotos superiores, pois
possuem genes essenciais para a biogênese mitocondrial, genes que codificam
para ácidos ribonucléicos (RNA) ribossomais mitocondriais e subunidades de
algumas proteínas envolvidas no transporte de elétrons e na síntese de adenosina
trifosfato (ATP) (Vickerman, 1994). Já os minicírculos são heterogêneos na
seqüência de nucleotídeos e podem ser transcritos em pequenas moléculas de
RNA (RNAs guias ou g-RNAs), que são utilizadas como moldes, orientando a
inserção e deleção de resíduos de uridina em RNAs gerados na transcrição de
maxicírculos, mecanismo de modificação pós-transcricional de DNA somente
observado em tripanossomatídeos (Shapiro & Englund, 1995; Morris et al.,
2001);
(ii) A presença de flagelo único, composto basicamente por um axonema e um
corpo paraxial. Nos tripanossomatídeos, o flagelo emerge da bolsa flagelar,
localizada na região anterior do corpo celular, e encontra-se ancorado à célula
pelos corpos basais, os quais estão fisicamente associados à mitocôndria
(Webster & Russell, 1993). O flagelo possui função fundamental de locomoção,
capacitando a célula a orientar seu movimento em resposta a um estímulo. No
25
entanto, pode ter outras atribuições, em algumas espécies, como a de adesão a
tecidos de hospedeiros, por exemplo (Vickerman & Tetley, 1990; revisto por
Vickerman, 1990);
(iii) A presença de glicossoma, organela relacionada ao peroxissoma e exclusiva
da ordem Kinetoplastida. Nesta organela ocorre a compartimentalização da via
glicolítica, o que permite que o mecanismo de conversão de glicose em piruvato
nos tripanopssomatídeos seja mais eficiente do que na maioria dos outros
organismos eucariotos (revisto por Vickerman, 1994). No glicossoma estão
presentes as enzimas iniciais necessárias à produção de fosfoglicerato, a partir
de glicose ou glicerol. Como nos demais organismos eucariotos, a produção de
piruvato, a partir de fosfoglicerato, ocorre no citoplasma. Esta organela coopera
com a mitocôndria no metabolismo energético, mas possui também outras
funções relacionadas à biossíntese de pirimidinas, recuperação de purinas,
síntese de éter lipídios e β-oxidação de ácidos graxos (Opperdoes & Michels,
1993; revisto por Vickerman, 1994, e Michels, Hannaert & Bringaud, 2000);
(iv) A presença de uma camada de microtúbulos subpeliculares, que se
apresentam em associação à membrana plasmática, dando forma e sustentação à
célula. O citoesqueleto atua, também, como barreira contra a exocitose e
endocitose, que ocorrem somente na região da bolsa flagelar, região desprovida
de microtúbulos subpeliculares (Vickerman & Preston, 1976; De Souza, 1984;
revisto por Vickerman, 1994). Em alguns tripanossomatídeos de insetos e em
certos estágios do ciclo de vida de alguns protozoários do gênero Trypanosoma,
a ingestão de nutrientes pode ocorrer, também, através de uma estrutura
adicional denominada de citóstomo, que fica localizada na porção posterior do
corpo celular (revisto por Vickerman, 1990);
26
(v) A presença de acidocalcisoma, uma organela elétron-densa que apresenta
alta concentração de polifosfatos, cálcio, magnésio, sódio e zinco em seu interior
e uma variedade de bombas e proteínas trocadoras em sua membrana, o que
ressalta a sua importância na regulação do pH intracelular e na osmorregulação,
no armazenamento intracelular de energia e cálcio para inúmeros processos
bioquímicos essenciais. Esta organela, que foi caracterizada primeiramente em
tripanossomatídeos, já foi descrita em outros eucariontes e em procariontes
(revisto por Docampo et al., 2005).
Na figura 1 encontram-se esquematizados os componentes descritos acima.
Estrutura flagelar
Junção tipo
desmossoma
Microtúbulos da
citofaringe
“coated vesicles”
Microtúbulos flagelares
flagelo
Corpo basal
Vacúolo contratil
citofaringe
cinetoplasto
Vesículas e túbulos
mitocôndria
golgi
Retículo
endoplasmático rugoso
Retículo
endoplasmático liso
glicossoma
acidocalcissoma
núcleo
Inclusão lipídica
lisossoma
Microtúbulos
sub-peliculares
Figura 1: Representação esquemática da morfologia e dos principais
componetes celulares presentes nos tripanossomatídeos (adaptado de
CLAYTON, HANSLER & BLATTER, 1995).
Algumas espécies de tripanossomatídeos, tais como Blastocrithidia culicis,
Crithidia deanei, Crithidia desouzai, Crithidia oncopelti e Herpetomonas
27
roitmani possuem em seu citoplasma endossimbiontes, os quais possuem dupla
membrana, DNA com similaridade ao de bactérias e capacidade de se dividir
sincronicamente com suas células hospedeiras (revisto por De Souza & Motta,
1999). A presença de endossimbionte acarreta mudanças bioquímicas e
morfológicas no hospedeiro tripanossomatídeo. Entre as mudanças bioquímicas,
está a aquisição de vias bioquímicas realizadas pelos endossimbiontes, as quais
auxiliam o processo de nutrição da célula hospedeira (Chang, Chang & Sassa,
1975). Entre as mudanças morfológicas, podem ser citadas a forma incomum de
arranjo espacial dos mirotúbulos, a ausência da estrutura paraxial do flagelo, a
ramificação aumentada da mitocôndria e o arranjo frouxo do k-DNA. Estas
mudanças não são revertidas após a remoção do endossimbionte (Freymüller &
Camargo, 1981).
Nos tripanossomatídeos, a reprodução ocorre de forma assexuada por
divisão binária (MCGHEE & COSGROVE, 1980). No entanto, em algumas espécies
vem sendo sugerida a troca de material genético entre células (Vickerman, 1990;
Sousa, Pereira & Côrte-Real, 1997; Sousa et al., 1997; Santos et al., 2000;
Gaunt et al., 2003).
Durante o ciclo de vida, respondendo às mudanças ambientais, os
tripanossomatídeos
podem
sofrer
modificações
morfo-fisiológicas,
apresentando-se sob diferentes formas evolutivas (figura 2), as quais são
caracterizadas pela morfologia do corpo celular, pela presença ou ausência de
flagelo extracelular, local de emersão do flagelo e posição do complexo flagelobolsa flagelar-cinetoplasto em relação ao núcleo (Hoare & Wallace, 1966). As
espécies de tripanossomatídeos pertencentes a diferentes gêneros apresentam
diferentes combinações de formas evolutivas ao longo do ciclo de vida, por
exemplo, enquanto as espécies do gênero Leishmania apresentam as formas
promastigota e amastigota, as espécies do gênero Trypanosoma apresentam as
formas epimastigota, tripomastigota e amastigota (MCGHEE & COSGROVE,
1980).
28
promastigota
paramastigota opistomastigota epimastigota
tripomastigota coanomastigota
amastigota
esferomastigota
Figura 2 – Principais formas evolutivas encontradas nos gêneros da família
Trypanosomatidae (adaptado de Sousa, 2000)
Algumas espécies dos gêneros Blastocrithidia e Leptomonas, em resposta a
escassez de nutrientes, baixa humidade, baixa concentração de oxigêneo e
variações na temperatura e no pH, podem apresentar formas císticas,
comportamento ainda não observado em espécies de outros gêneros da família
Trypanosomatidae. Os cistos de tripanossomatídeos apresentam características
peculiares, que os diferenciam dos cistos de outros protozoários, como a
ausência de parede cística (Wallace, 1966).
29
5) Tripanossomatídeos inferiores
Os gêneros de tripanossomatídeos monoxênicos, juntamente com o gênero
Phytomonas,
formam
um
grupo
denominado
informalmente
de
“tripanossomatídeos inferiores” (Wallace, 1966). Esta denominação foi
atribuída, principalmente, devido à ausência de patogenicidade destes
tripanossomatídeos para vertebrados, fato que vem sendo questionado devido à
constatação de casos de doenças semelhantes a leishmanioses, causadas por
representantes deste grupo em pacientes imunocomprometidos (revisto por
Chicharro & Alvar, 2003). A ocorrência destes casos e o aumento crescente do
número de indivíduos infectados pelo HIV podem, eventualmente, levar os
tripanossomatídeos inferiores a figurar como importantes patógenos oportunistas
em áreas de clima tropical, onde insetos hematófagos da ordem Diptera estão
freqüentemente infectados por estes microrganismos (Dedet et al., 1995;
Jiménez et al. 1996; revisto por Chicharro & Alvar, 2003).
Provavelmente devido à ausência de importância médica, o estudo dos
“tripanossomatídeos inferiores” permaneceu, por certo tempo, um tanto quanto
negligenciado (revisto por Podlipaev, 2000). No entanto, devido à facilidade de
manipulação em laboratórios, à manutenção em meios axênicos, ao baixo risco
de causar infecções no homem e às semelhanças fisiológicas, bioquímicas e
antigênicas em relação aos tripanossomatídeos dos gêneros Trypanosoma e
Leishmania, os tripanossomatídeos inferiores vêm ganhando importância.
Estudos
recentes
têm
demonstrado
que
diferentes
espécies
de
“tripanossomatídeos inferiores”, incluindo a espécie utilizada no presente
estudo, Phytomonas serpens, possuem antígenos semelhantes aos presentes em
espécies dos gêneros Leishmania (d’Avila-Levy et al, 2003; 2005; 2006a ANEXO 4; 2006b - ANEXO 3; Elias et al, 2006; Nogueira de Melo et al, 2006
- ANEXO 6; Santos et al, 2007) e Trypanosoma (Breganó et al, 2003; Santos et
al., 2006 - ANEXO 5; Santos et al., 2007). Além disso, dados moleculares
30
mostram a proximidade, em termos filogenéticos, entre as espécies dos gêneros
Phytomonas e Leishmania (Hollar & Maslov, 1997; revisto por Podlipaev,
2000).
6) Tripanossomatídeos parasitas de plantas
Em 1909, Lafont descreveu, pela primeira vez, a presença de flagelados
parasitando plantas. O parasita encontrado por Lafont na planta laticífera
Euphorbia
pilulifera
foi
caracterizado
como
pertencente
à
família
Trypanosomatidae e alocado dentro do gênero Leptomonas, recebendo a
especificação Leptomonas serpens. Ainda em 1909, Donovan sugeriu a
formação do gênero Phytomonas, para agrupar todas as espécies de
tripanossomatídeos isolados de plantas, as quais, por muito tempo, continuaram
sendo agrupadas nos gêneros Leptomonas, Herpetomonas e Trypanosoma
(revisto por Camargo, 1999). Somente em 1927, foi atribuído oficialmente o
nome Phytomonas a um tripanossomatídeo de planta (Aragão, 1927). Tal
nomenclatura só viria a ganhar aceitação plena após 1970 (revisto por Camargo,
1999).
Em 1931, Stahel fez a primeira descrição de tripanossomatídeos
parasitando plantas não-laticíferas. Este mesmo estudo demonstrou, pela
primeira vez, a associação destes microrganismos com uma fitopatologia bem
definida. Ao estudar plantações de café acometidas com uma doença letal,
causada pela necrose do floema, Stahel encontrou flagelados nos vasos
condutores de seiva e, desta forma, relacionou a doença do café com a presença
do tripanossomatídeo, denominado de Phytomonas leptovasorum.
Diversos estudos descrevendo patologias em palmeiras foram publicados
na década de 70. Coqueiros e dedenzeiros, acometidos com uma doença fatal,
foram estudados e a mesma espécie de tripanossomatídeo foi descrita como
agente etiológica da patologia, Phytomonas staheli (revisto por Camargo, 1999).
31
Em 1986, Kitajima, Vainstein e Silveira associaram protozoários
flagelados a uma doença em mandioca (Manihot esculenta), caracterizada pela
atrofia das raízes.
Sabe-se
que
tripanossomatídeos,
incluindo
os
monoxênicos,
são
frequentemente isolados de frutos. No entanto, apenas duas espécies foram
descritas, Phytomonas serpens (Gibbs, 1957), isolada de tomates (Lycopersicon
esculentum), e Phytomonas mcgheei (Jankevicius et al, 1993), isolada de
sementes de milho (Zea mays) (revisto por Camargo, 1999).
Atualmente, sabe-se que diversas famílias de vegetais são susceptíveis à
infecção (natural e/ou experimental) por parasitos da família Trypanosomatidae
(revisto por Camargo, 1999). Estes microrganismos já foram detectados em
diversas partes de plantas, como em vasos laticíferos (Aragão, 1931; Dollet,
Cambrony & Gargani, 1982; Attias & De Souza, 1986; Vainstein & Roitman,
1986) e condutores de seiva (Attias et al., 1987), frutos, como tomate, jiló e
pimenta (Gibbs, 1957; Jankevicius et al., 1989; Kastelein & Camargo, 1990;
Fiorini et al., 1993; Camargo, 1999), tangerina, pêssego, goiaba, laranja e uva
(revisto por Camargo, 1999), em sementes, como milho e feijão (Kastelein &
Camargo, 1990; Jankevicius et al., 1993) e em flores (Fiorini et al., 1995).
O parasitismo exercido pelos tripanossomatídeos em plantas pode ocorrer
sem nenhuma patogenicidade aparente, mas também pode causar doenças, que
geram prejuízos em culturas de grande importância econômica, tais como
plantações de café, côco e dendê. Absolutamente nada se sabe em relação a
patogenicidade dos tripanossomatídeos parasitas de frutos. Com isso, perguntas
simples permanecem sem resposta. Por exemplo, ainda não se sabe se o
parasitismo pode acelerar o apodrecimento do fruto ou se a atividade metabólica
do parasito pode gerar produtos que alterem o sabor e a acidez dos frutos
(revisto por Camargo, 1999).
32
6.1) Phytomonas serpens
Em 1957, Gibbs, analisando frutos da planta Solanum lycopersicum
(tomate), encontrou um parasito flagelado, o qual foi denominado de
Leptomonas serpens. Posteriormente, Podlipaev (1986) se referiu ao parasito
isolado por Gibbs denominando-o de Phytomonas serpens. Durante sua tese de
Doutorado, Jankevicius (1992) pesquisando a presença de Phytomonas em
plantas laticíferas, na cidade de Londrina (Estado do Paraná), observou que duas
espécies de insetos (Phthia picta e Nezara viridula), que se alimentavam nestas
plantas, também se alimentavam em tomates (Lycopersicon esculentum), nos
quais se constatou a presença de flagelados apresentando as mesmas
características descritas por Gibbs (1957). Em 1989, Jankevicius e
colaboradores publicaram um estudo descrevendo dois prováveis hospedeiros
naturais e o ciclo biológico deste tripanossomatídeo. Neste estudo, Jankevicius
baseado em seus resultados e em dados da literatura (Camargo et al., 1987;
Teixeira & Camargo, 1989) concorda com a referência de Podlipaev (1986) e
adota a denominação Phytomonas serpens para o parasito estudado. Desde
então, esta denominação vem sendo utilizada para tal tripanossomatídeo.
Durante a pesquisa de Jankevicius (1992), P. serpens isolada tanto dos
tomates, quanto do trato digestivo e glândulas salivares de Ph. picta e N.
viridula, se desenvolveram em meio bifásico. Neste estudo ficou demonstrado
que P. serpens possui pelo menos dois insetos vetores para tomates, Ph. picta e
N. viridula e que estes insetos, da mesma forma que se contaminam com este
parasito, quando se alimentam em tomates infectados, são capazes de transmitir
os flagelados para tomates, quando se alimentam novamente (Figura 3). Ainda
neste trabalho foi observado, em tomates, o aparecimento de manchas
amareladas nos locais onde foram picados pelos insetos, manchas estas que
foram atribuídas à atividade metabólica do tripanossomatídeo, já que tomates
picados por insetos não infectados, criados em laboratório, não apresentaram tais
33
manchas ou as apresentavam em menor tamanho e com um amarelo menos
intenso. Tomates ainda verdes, folhas, flores e caule não são infectados (FIORINI
et al., 1993). Mais estudos são necessários para se determinar se frutos
infectados por P. serpens apodrecem mais rapidamente do que os não infectados
ou mesmo se apresentam as suas propriedades naturais alteradas. No entanto,
somente o aparecimento de manchas causadas pela contaminação com este
parasita já pode representar prejuízos aos produtores (Camargo, 1999).
Figura 3 – Esquematização dos resultados obtidos por Jankevicius em sua tese de
Doutorado (adaptado de Jankevicius, 1992).
Pouco é sabido sobre a patogenicidade do tripanossomatídeo P. serpens
(revisto por Camargo, 1999). De qualquer forma, este microrganismo pode ser
utilizado como modelo para estudos que visem um conhecimento mais profundo
sobre diferentes características, que possam, eventualmente, estar presentes em
34
representantes reconhecidamente patogênicos do seu gênero ou mesmo em
tripanossomatídeos patogênicos para o homem.
Estudos recentes mostraram que a espécie P. serpens apresenta moléculas
semelhantes a dois importantes fatores de virulência presentes em diversas
espécies de Leishmania e em Trypanosoma cruzi (Santos et al., 2007). Na
superfície celular de P. serpens foi detectada uma molécula com similaridades
antigênicas com uma glicoproteína de superfície conhecida como PSP (do inglês
promastigote surface peptidase), MSP (do inglês major surface protease),
leishmanolisina ou mais frequentemente gp63 (d’Avila-Levy, 2006b - ANEXO
3). Esta proteína, que está presente em diversas espécies de Leishmania, parece
ter importância no processo de interação destes patógenos com macrófagos
(revisto por Yao, Donelson & Wilson, 2003). Santos e colaboradores (2006)
(ANEXO 5) demostraram que uma cisteína peptidase, que apresenta
semelhanças antigênicas com a principal cisteína proteinase de T. cruzi, a
cruzipaína (Cazzulo, Stoka & Turk, 2001; Santos et al., 2007), está presente na
superfície celular de P. serpens e em frações de membranas liberadas pelo
parasito para o meio extracelular. Neste estudo, Santos e colaboradores
mostraram, assim como já foi visto para T. cruzi, que inibidores de cisteína
peptidases podem interferir com o crescimento, com a ultraestrutura e com a
interação entre P. serpens e um hospedeiro experimental (Dias, 2004), o
hemíptero fitófago Oncopeltus fasciatus.
7) Tripanossomatídeos parasitas de plantas e seus insetos hospedeiros
Com cerca de 30 milhões de espécies distribuídas por todo o planeta, os
insetos possuem representantes adaptados a todo e qualquer tipo de ambiente,
desde as regiões de clima mais ameno até as áreas com condições ambientais
mais adversas, como e os desertos e os pólos (Borror, Triplehorn & Johnson,
1989).
35
Na natureza, os insetos se alimentam em animais, vegetais ou de matéria
orgânica em decomposição, embora alguns sejam onívoros, a maioria tem algum
tipo de especificidade em relação à origem de seu alimento (Chapman, 1971).
Baseando-se nas especificidades alimentares, Brues (1946) dividiu os insetos em
4 grandes grupos: parasitas, herbívoros, predadores e saprófitas, considerando
parasitas aqueles que se alimentam em animais, herbívoros aqueles que se
alimentam de plantas (fitófagos) ou fungos (micetófagos), predadores aqueles
que se alimentam de outros insetos e saprófitas aqueles que se alimentam de
matéria em decomposição.
Em lavouras, os insetos, além de serem polenizadores e controladores de
pragas, podem também agir como vetores e disseminadores de doenças. Entre
essas doenças estão as causadas por tripanossomatídeos do gênero Phytomonas,
que têm insetos fitófagos como seus vetores (revisto por Camargo, 1999).
A transmissão de tripanossomatídeos de plantas aos insetos hospedeiros,
ocorre pela ingestão de fluidos da planta infectada, como a seiva e o látex
(Wallace, 1966; Jankevicius, 1992), ou por coprofagia direta e indireta (Gibbs,
1950; Mcghee & Hanson, 1962). Isso torna possível a transmissão de
tripanossomatídeos de inseto para inseto e permite que esses atuem não somente
como vetores, mas também como reservatórios de doenças de plantas. Em outras
palavras, é possível que flagelados de plantas circulem por longos períodos de
tempo entre insetos da mesma espécie ou de espécies diferentes (revisto por
Camargo, 1999).
Nos insetos, parasitos do gênero Phytomonas colonizam sítios intestinais,
onde ocorre a passagem para a hemolinfa, veículo de acesso até a face externa
das glândulas salivares. Da hemolinfa, os flagelados passam ativamente para o
lúmen das glândulas salivares (McGhee & Hanson, 1964; Jankevicius, 1992).
A transmissão para vegetais ocorre quando o inseto, com as glândulas
salivares infectadas, se alimenta em plantas. Antes ou durante a sucção de
fluidos da planta, o inseto injeta saliva contendo os flagelados (Camargo e
36
Wallace, 1994; Jankevicius et al., 1989; Jankevicius, 1992). Um esquema
simplificado do ciclo biológico das espécies de Phytomonas em seus insetos
hospedeiros pode ser observado na figura 4.
A dispersão dos tripanossomatídeos inferiores entre os insetos ocorre em
diversas ordens. No entanto, as ordens Diptera e Hemiptera são as que agrupam
o maior número de espécies hospedeiras e, portanto, são as mais investigadas.
Entre os hemípteros, conhecidos popularmente como percevejos, estão
agrupados insetos fitófagos, hematófagos e predadores. Na natureza, certos
hematófagos estão freqüentemente infectados com espécies de Trypanosoma,
Leishmania e Endotrypanum (Wallace, 1966; Vickerman, 1976). Até o presente
momento, todos os insetos descritos como hospedeiros de espécies de
Phytomonas pertencem à ordem Hemiptera e se distribuem pelas famílias
Coreidae, Lygaeidae e Pentatomidae, todas agrupadas na subordem Heteroptera.
Glândula
Salivar
PLANTA
INSETO
Hemolinfa
Intestino
Figura 4 – Esquema simplificado do ciclo biológico das espécies de
Phytomonas.
A família Lygaeidae, segunda maior família de hemípteros, possui cerca de
duzentos e cinqhenta espécies descritas, sendo vinte e uma hospedeiras de
tripanossomatídeos e dentre essas, nove hospedeiras de espécies de Phytomonas
37
(Wallace, 1966; Camargo & Wallace, 1994; revisto por Camargo, 1999).
Pertencente à família Lygaeidae, o gênero Oncopeltus possui três espécies
hospedeiras de tripanossomatídeos parasitas de plantas, são elas o Oncopeltus
famelicus (Vickerman, 1962), Oncopeltus varicolor (Sbravate et al., 1989) e O.
fasciatus (Holmes, 1925; McGhee & Hanson, 1964).
8) Oncopeltus fasciatus
O O. fasciatus (figura 5), devido a sua facilidade de manutenção em
colônias populosas e em laboratórios, vem sendo utilizado como modelo para
estudos relacionados a interação de tripanossomatídeos com hospedeiros.
Inespecífico quanto a infecção por estes protozoários, o O. fasciatus é descrito
como hospedeiro natural da espécie Phytomonas elmasiani, que coloniza sítios
intestinais e suas glândulas salivares (Holmes, 1925; McGhee & Hanson, 1964)
e C. acanthocephali (Hanson & McGhee, 1961), Leptomonas oncopelti (Mcghee
& Hanson, 1962) e Leptomonas wallacei (Romeiro et al., 2000), que colonizam,
exclusivamente, sítios do seu trato intestinal, podendo também albergar, por
meio de infecção experimetal, tripanossomatídeos isolados de outros insetos
(Hanson & Mcghee, 1963).
Figura 5 – Oncopeltus fasciatus na fase adulta.
38
8.1) Características gerais
Este inseto, descrito como Lygaeus fasciatus por Dallas (1852) e,
posteriormente, renomeado como O. fasciatus por Slater (1964) tem sido
mantido em colônias artificiais e utilizado como modelo de estudo em diferentes
áreas da pesquisa científica desde 1934. Andre (1934) foi quem descreveu pela
primeira vez a utilização deste inseto como modelo, devido à facilidade de
manutenção em laboratório durante todo o ano, devido ao curto ciclo de vida e
ao tamanho ideal para a utilização em diversos procedimentos (revisto por Feir,
1974).
O. fasciatus é um inseto de hábito migratório, que se distribui por uma
ampla área geográfica, a qual se estende da região central e Sul dos Estados
Unidos da América (EUA), passa pelo México e chega ao Brasil (revisto por
Feir, 1974). Na natureza, diversas são as famílias de plantas onde O. fasciatus se
alimenta. No entanto, este hemiptero é visto com maior freqüência se
alimentando em plantas da família Asclepiadaceae (figura 6) (revisto por Feir,
1974). Em laboratório, diversos grupos tentaram estabelecer colônias utilizando
variados tipos de alimentos como a avelã e a castanha do Pará, sementes de
melancia e abóbora, frutas como o cajú e a uva e, até mesmo, hamburger e pasta
de amendoim. No entanto, o único alimento que permite manter colônias
populosas de forma estável e prolífera é a semente do girassol (revisto poir Feir,
1974).
39
A
B
C
Figura 6 – Ninfas (A) e insetos adultos (B) da espécie Oncopeltus fasciatus alimentando-se
em planta da espécie Asclepias syriaca (C).
A impressionante capacidade do O. fasciatus de sobreviver a invernos
rigorosos na região central dos EUA incentivou Saini e Chiang (1966) a testar os
índices de sobrevivência deste inseto em temperaturas extremamente baixas.
Neste estudo, ficou comprovado que mesmo após um período de 12 min
congelados a -35oC, os insetos parecem não sofrer nenhum dano, apresentando
todas as atividades metabólicas normais. Com este tratamento estendido a 48 h,
a taxa de mortalidade é de 79%.
Como todo hemíptero, O. fasciatus é um inseto hemimetábolo, isto é, após
a eclosão do ovo, o inseto passa por cinco estágios de ninfa, até a mudança para
a fase adulta (figura 7). Cada estágio de ninfa se estende, em média, por cinco
dias e, já na fase adulta, o inseto vive em média cerca de trinta dias (revisto por
Feir, 1974). No entanto, em nosso laboratótio, observamos que a longevidade na
fase adulta pode ser muito maior, chegando perto do cem dias. Machos e fêmeas
adultos medem cerca de 1,5 cm e são facilmente distinguidos, pois nos machos é
observada na região ventral do abdome duas linhas negras contínuas, enquanto
40
que nas fêmeas uma das linhas é segmentada (Figura 7). Já por volta do quinto
dia da fase adulta, os insetos iniciam a atividade reprodutiva. Quatro dias após a
postura ocorre a eclosão dos ovos. Cada fêmea é capaz de ovipor cerca de trinta
ovos por dia, chegando a um total de dois mil ovos durante o seu período fértil.
Todos essas características foram observadas em temperatura média de 29,5 oC e
em regime de 16 h na presença de luz para 8 h na ausência de de luz (revisto por
Feir, 1974).
B
A
Figura 7 – Fases de vida do inseto Oncopeltus fasciatus. (A) Da esquerda para direita:
ovos com 1 e 3 dias após a oviposição, ninfas do 1o ao 5o estadios de ninfa e fase adulta
(B) Macho à esquerda e fêmea à direita.
8.2) Trato Intestinal
O canal alimentar nos hemípteros é um tubo alongado, que se estende da
boca ao ânus, e apresenta-se dividido em 3 regiões principais: intestino anterior
ou estomodeo, intestino médio ou mesentério e intestino posterior ou proctodeo
(Figura 8) (Borror, Triplehorn & Johnson, 1989). O intestino anterior é formado
por células epiteliais cubóides revestidas por uma fina camada de cutícula e
pode ser dividido anatomicamente em 3 partes: faringe, esôfago, papo. Ao
contrário da maioria dos insetos, os hemípteros não possuem proventrículo
(Goodchild, 1966). O intestino médio, que possui função de digerir os alimentos
e absorver água, é formado por células epiteliais colunares, que não são
recobertas por cutícula, mas sim por um conjunto de membranas lipoprotéicas
41
denominadas de membranas perimicrovilares (Borror, Triplehorn & Johnson,
1989; Silva et al, 1995). Nos hemípetros fitófagos, o intestino médio é dividido
em 4 ventrículos (V1, V2, V3 e V4), que apresentam anatomia e fisiologia
distintas (Silva et al., 1995). O intestino posterior pode ser dividido em 3 regiões
anatômicas: piloro, íleo e reto. Assim como o intestino anterior, é formado por
células epiteliais cubóides que, no entanto, são resvestidas por uma camada de
cutícula mais fina e permeável (Borror, Triplehorn & Johnson, 1989). No trato
alimentar de O. fasciatus, enquanto os tripanossomatídeos monoxênicos
colonizam os intestinos médio e posterior, a espécie P. elmassiani infecta apenas
o intestino médio (McGhee & Hanson, 1962; Vickerman, 1962; McGhee &
Hanson, 1964; Romeiro et al., 2003).
in tes tin o
a n terior
esô fa g o
fa rin g e
in tes tin o
m é d io
papo
in tes tin o
p osterior
p iloro
ven trícu los
reto
ânus
íleo
p roven trícu lo
Tú b u los d e
M a lp ig h i
b oca
v1
v2
v3
v4
Figura 8 - Divisão anatômica do trato alimentar de hemípteros fitófagos
(adaptado de Chapman, 1971 e Silva et al., 1995). V1, V2, V3 e V4 –
ventrículos do intestino médio.
42
8.3) Glândulas Salivares
O inseto O. fasciatus possui um par de glândulas salivares trilobulares
pareadas lateralmente, em relação ao canal alimentar, na região entre o esôfago e
o papo. Cada glândula mede cerca de 3 mm de comprimento por 1 mm de
largura e está associada a uma glândula acessória. Os três lóbulos e a glândula
acessória se conectam numa região denominada de hilus, de onde emerge o
ducto salivar (Bronskill, Salkeld & Fiend, 1958) (figura 9).
Os insetos da subordem Heteroptera da ordem Hemíptera, como é o caso
do O. fasciatus, possuem glândulas salivares do tipo reservatório, pois são
constituídas por células organizadas de tal modo, que formam uma espécie de
vesícula, onde é armazenado todo o material secretado (revisto por Ribeiro,
1995).
lóbulo lateral
lóbulo posterior
lóbulo anterior
glândula acessória
duto salivar
hilus
Figura 9 - Glândula salivar do Oncopeltus fasciatus.
Adaptado de Miles (1960) e Bronskill, Salkeld & Friend
(1958).
43
Diferentes tipos de material secretado estão associados aos diferentes
lóbulos das glândulas de O. fasciatus. Nos lóbulos anterior e lateral é produzida
uma substância viscosa que, ao se misturar a um agente oxidante produzido na
glândula acessória, endurece formando uma espécie de revestimento no local da
picada. A função deste revestimento é evitar o extravasamento de seiva e saliva.
A substância viscosa, que não endurece no interior da glândula devido às
condições redutoras, é liberada em resposta a uma maior ou menor resistência
do tecido vegetal. Quanto maior a resistência, menor é a deposição da
substância. No lóbulo posterior é produzida uma substância mais fluida, que é
liberada na superfície do tecido vegetal e sugada novamente antes que ocorra a
picada. Tal substância pode ser liberada dentro do tecido vegetal para aumentar
a fluidez do alimento (Miles, 1960; Ribeiro, 1995).
Nos hemípteros fitófagos, a saliva também atua como lubrificante das
peças bucais e possui componentes importantes na prevenção das respostas de
defesa da planta, que podem interromper a alimentação. Tais componentes são
substâncias análogas àquelas presentes na saliva de hematófagos, as quais
impedem a resposta disparada após a injúria do tecido animal (revisto por
Ribeiro, 1995).
Muitas doenças de interesse médico, agrário e veterinário são transmitidas
via saliva de artrópodes. Tanto doenças de vertebrados, como a doença do sono
ou tripanossomíase africana, quanto as doenças de plantas causadas por
Phytomonas são transmitidas desta maneira. Sabe-se que componentes da saliva
têm papel importante durante a alimentação dos vetores hematófagos (revisto
por Ribeiro, 1995) e também no curso da resposta de hospedeiros vertebrados
contra a infecção por diferentes espécies do gênero Leishmania (revisto por
Kamhawi, 2000). Neste contexto, em 2007, nosso grupo juntamente com o
grupo do Dr. José Marcos Ribeiro (National Institute of Allergy and Infectious
disease, National Institute of Health, EUA) elucidamos o transcriptoma das
glândulas salivares de O. fasciatus (Francischetti et al., 2007 - ANEXO 2) e
44
disponibilizamos importantes informações acerca da composição da saliva deste
inseto. Neste estudo, ficou demonstrado que a saliva de O. fasaciatus é rica em
substâncias semelhantes à mucinas, que sabidamente exercem importantes
funções durante a alimentação de fitófagos, como a lubrificação das peças
bucais e revestimento do canal formado no tecido vegetal (Miles, 1972). Além
disso, foram descritas enzimas como lipases e serina proteases, com provável
importância na digestão do alimento. Neste estudo, foi demonstrado que a saliva
de O. fasciatus possui uma variedade de cistatinas, potentes inibidores de
cisteína proteases. As cisteína proteases são enzimas que certamente podem
causar dano ao epitélio intestinal dos insetos, pois estão presentes em grandes
quantidades em sementes de leguminosas, que na natureza são frequentemente
atacadas pelo O. fasciatus. A presença de inibidores de cisteína proteases tem
particular importância para o nosso grupo, pois sabemos que inibidores de
cisteína proteases interferem com o crescimento, com a ultraestrutura e com o
processo de interação de P. serpens com o O. fasciatus (Santos et al., 2006 ANEXO 5).
Tanto as glândulas principais, quanto as acessórias, de O. fasciatus são
formadas por uma camada simples de células epiteliais cubóides, mas, ao
contrário das glândulas acessórias, as glândulas principais têm seu epitélio
montado sobre uma membrana basal (Bronskill, Salkeld & Fiend, 1958), que,
além de oferecer suporte físico, pode modular o crescimento, a migração e a
diferenciação das células, sendo importante para o desenvolvimento e o
funcionamento do tecido (Yurchenco, & O`Rear, 1994; revisto por
Quondamatteo, 2002). Evidências indicam que a estrutura da membrana basal
do intestino de mosquitos do gênero Aedes é bastante similar à descrita para
vertebrados (Rudim & Hecker, 1979; Houk, Chiles & Hardy, 1980).
Pouco se sabe sobre a composição da membrana basal que reveste as
glândulas salivares do inseto O. fasciatus. Sabe-se, no entanto, que a membrana
basal de diferentes tecidos é frequentemente composta por glicoproteínas
45
(colágeno IV, lamininas e nidogêneos) e proteoglicanas, que formam uma malha
molecular aparentemente composta por duas camadas, sendo uma mais rígida e
formada por moléculas de colágeno IV ligadas covalentemente e a outra mais
flexível e formada por polímeros de lamininas. Sabe-se que estas duas camadas
são interligadas por diferentes moléculas, entre elas o nidogêneo (revisto por
Quondamatteo, 2002).
As lamininas pertencem a uma família de glicoproteínas montadas como
heterotrímeros de cadeias α, β e γ (figura 10) (Beck, Hunter & Engel, 1990;
Ohno, Ohno & Kefalides, 1991), que combinados entre si formam as quinze
isoformas de laminina conhecidas até o presente momento (revisto por
Quondamatteo, 2002). Diferentes cadeias de lamininas já foram descritas em
insetos (Chi & Hui, 1989; Fessler & Fessler, 1989; revisto por Colognato &
Yurchenco, 2000), incluindo vetores de protozoários (Vlachou et al., 2001),
algumas delas mostrando homologia com as cadeias presentes em vertebrados
(revisto por Colognato & Yurchenco, 2000).
Muitos trabalhos descrevem a presença de receptores para laminina em
diversos microrganismos, tais como bactérias (Switalski et al., 1984; Lopes, dos
Reis & Brentani, 1985), fungos (Vicentini et al., 1994; Bouchara et al., 1990;
Tronchin et al., 1997), helmintos (Zhang et al., 1997) e protozoários (Furtado,
Cao & Joiner, 1992; Casta e Silva Filho, de Souza & Lopes, 1988), incluindo os
tripanossomatídeos T. cruzi (Giordano et al., 1994) e L. donovani (Ghosh et al.,
1996). Estes estudos mostram a importância das lamininas como alvo para a
ligação de parasitos em tecidos hospedeiros. Para as espécies de Phytomonas
nada se sabe sobre moléculas-alvo ou receptores para a ligação na face externa
de glândulas salivares de insetos vetores.
46
Figura 10 - Representação esquemática da estrutura das
lamininas. Laminina 5 - heterotrímero formado pelas cadeia
α3 β3 γ2 (adaptado de Hisamatsu, 2003).
9. Envolvimento de enzimas proteolíticas na interação tripanossomatídeohospedeiro
As proteases, peptidases ou peptídeo-hidrolases são enzimas encontradas
em muitos organismos, desde os mais simples até os mais complexos, cuja
função básica é catalisar a quebra de ligações peptídicas, tendo participação
importante em inúmeros processos biológicos (Barret, Rawlings & O’Brien,
2001). As proteases são classificadas de acordo com seu sítio-alvo de clivagem
na proteína e também de acordo com a natureza química de seu sítio catalítico.
Em respeito ao primeiro critério, as proteases podem ser classificadas como
exopeptidases, quando degradam os terminais das cadeias polipeptídicas ou
endopeptidases, quando catalisam a clivagem de ligações internas. As
exopeptidases hidrolisam aminoácidos na porção amino- ou carboxi-terminal de
um polipeptídeo, podendo ser genericamente denominadas amino- ou carboxipeptidases. As endopeptidases são também denominadas de proteinases. De
acordo com o segundo critério, as endopeptidases podem ser divididas entre as
seis subclasses seguintes, serina-, cisteína-, aspártico-, metalo-, treonina- ou
glutâmico-peptidases. Algumas peptidases têm seu mecanismo catalítico
47
desconhecido e, por isso, não se encaixam em nenhuma destas subclasses
(Barret, Rawlings & O’Brien, 2001).
As enzimas proteolíticas podem exercer papéis relevantes na patogênese de
inúmeras doenças parasitárias, tendo participação especial durante a ligação e
penetração de protozoários parasitas nos tecidos e nas células hospedeiras
(McKerrow, 1989; McKerrow et al., 1993).
A função de uma protease está diretamente relacionada com sua localização
na célula. Recentes evidências sugerem que algumas proteases associadas à
membrana são multifuncionais. Estas enzimas, além de catalisar processos
proteolíticos, podem agir como receptores de membrana e, desta forma,
desempenhar papel-chave na interação parasito-hospedeiro (Sedo, Mandys &
Krepela, 1996).
Certas proteases de tripanossomatídeos foram sugeridas como alvo
potencial de novas drogas antiparasitárias e como reagentes para diagnóstico
laboratorial (McKerrow et al., 1993; Selzer et al., 1999; Cazzulo; Stoka & Turk,
2001).
Nestes
microorganismos,
as
proteases
desempenham
funções
importantes, que estão ligadas não somente a processos básicos, como a
disponibilização de aminoácidos para a nutrição, mas também a processos bem
mais complexos, como a degradação e invasão de tecidos, além da modulação e
escape do sistema de defesa do hospedeiro (revisto por McKerrow et al, 1993;
Sajid & McKerrow, 2002).
Vários protozoários apresentam, em pelo menos um estágio dos seus ciclos
de vida, alta atividade de cisteína proteases. Estas enzimas são localizadas
principalmente em lisossomas e, geralmente, apresentam homologia com as
catepsinas L ou B, embora possuam pesos moleculares geralmente maiores que
as enzimas de mamíferos e plantas (revisto por North, Mottram & Coombs,
1990).
Atividades de serina e treonina proteases foram detectadas em
tripanossomatídeos (Burleigh et al, 1997; Paugam et al., 2003; Silva-Lopez &
48
Giovanni-De-Simone, 2004). No entanto, as classes das metalo e cisteína
proteases têm recebido maior atenção (McKerrow et al, 1993; Cazzulo, Stoka &
Turk, 1997; Santos et al, 2006 - ANEXO 5; Santos et al., 2007). Na espécie P.
serpens, até o presente momento só foram descritas atividades de metalo e
cisteína proteases (Branquinha et al, 1996; Vermelho et al, 2003; Santos et al,
2005; revisto por Santos et al., 2006 - ANEXO 5; Santos et al., 2007).
A principal cisteína proteinase de Trypanosoma cruzi, denominada gp57/51
ou cruzipaína, é uma glicoproteína monomérica altamente imunogênica (Murta
et al., 1990). A cruzipaína está presente em todas as cepas e clones até hoje
testados, assim como em todas as formas evolutivas deste tripanossomatídeo,
com os maiores níveis de atividade sendo detectados na forma epimastigota
(Tomas & Kelly, 1996). Esta enzima possui homologia com a catepsina L de
mamíferos e está associada principalmente ao sistema endocítico/lisossomal e
reservossomas em epimastigotas (Murta et al., 1990; Souto-Padrón et al., 1990;
Soares, Souto-Padrón & de Souza, 1992), podendo também estar presente na
superfície de amastigotas e epimastigotas e na bolsa flagelar das três formas
evolutivas (Souto-Padrón et al., 1990). Várias funções já foram atribuídas a esta
enzima, como degradação protéica, participação na metaciclogênese in vitro
(Bonaldo et al., 1991; Tomas, Miles & Kelly, 1997), invasão celular (SoutoPadrón et al., 1990; Meirelles et al., 1992; Harth et al., 1993, Scharfstein et al.,
2000; Aparício, Scharfstein & Lima, 2004), multiplicação do parasito nas
células do hospedeiro (Meirelles et al., 1992) e, provavelmente, no escape do
sistema imune (Gruppi, Cerbán & Votter-Cima, 1997). Estudos recentes
mostraram semelhanças antigênicas e funcionais de uma císteína protease de P.
serpens com a cruzipaína de T. cruzi (Santos et al, 2006 - ANEXO 5; Santos et
al., 2007).
As
metalopeptidases
também
são
amplamente
detectadas
nos
tripanossomatídeos. Destas, a mais estudada e melhor caracterizada é uma
glicoproteína expressa em abundância na superfície celular das formas
49
promastigotas de diferentes espécies de Leishmania, denominada gp63 (revisto
por Yao et al., 2002). Esta glicoproteína, ligada à membrana por uma âncora de
glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Bordier et al., 1986), é abundantemente expressa
na superfície das formas promastigotas, tem sua expressão aumentada nas
formas promastigotas metacíclicas, tendo um baixo, porém detectável nível de
expressão nas formas amastigotas intracelulares (Medina-Acosta et al., 1989;
Frommel et al., 1990; McGuire & Chang, 1994); entretanto, nem todas as
espécies de Leishmania expressam a gp63 na forma amastigota (Schneider et al.,
1992).
Diversos estudos mostraram a importância da gp63 em diferentes processos
envolvidos na interação com o hospedeiro vertebrado, incluindo a interação com
macrófagos (Brittinghan et al., 1999) e a degradação de matriz extracelular de
tecidos (McGwire, Chang & Engman, 2003). Em Leishmania amazonensis,
Hajmová e colaboradores (2004) mostraram que a gp63 tem papel importante na
colonização do trato intestinal do hospedeiro invertebrado. A espécie P. serpens
apresenta um polipeptídeo com massa molecular de 60 kDa, que foi reconhecido
por anticorpos produzidos contra a gp63 de L. amazonensis. Ao contrário da
gp63, o polipeptídeo reconhecido em P. serpens não apresentou atividade
proteásica detectável através de zimografia (d’Avila-Levy et al., 2006b ANEXO 3). No entanto, da mesma forma que a gp63, o poliptídeo de P. serpens
está ligado à membrana celular por uma âncora de glicosilfosfatidilinositol e
pode ser liberado para o meio extracelular (d’Avila-Levy et al., 2006b ANEXO 3). O envolvimento da gp63-like de P. serpens no processo de
interação com o hospedeiro experimental O. fasciatus foi sugerida, já que os
anticorpos produzidos contra a gp63 de Leishmania foram capazes de inibir a
ligação deste parasito na face externa das glândulas salivares do inseto (d’AvilaLevy et al., 2006b - ANEXO 3; revisto por Santos et al., 2007).
50
OBJETIVOS
51
Enquanto algumas espécies de Phytomonas são capazes de causar doenças
letais, outras causam menores danos à planta, pois infectam sítios restritos como
os dutos laticíferos e frutos. Em qualquer uma das situações, estes
tripanossomatídeos podem causar prejuízos em culturas de grande importância
econômica.
Sabendo que a invasão das glândulas salivares dos insetos vetores é,
certamente, uma etapa importante dentro do ciclo biológico das espécies de
Phytomonas e que o aumento do conhecimento a respeito deste processo pode
permitir o desenvolvimento de estratégias para o controle de parasitoses
causadas por estes tripanossomatídeos, no presente estudo tivemos como
objetivos:
1) A partir de uma colônia de insetos da espécie O. fasciatus infectados com o
tripanossomatídeo L. wallacei, estabelecer uma colônia de insetos livres de
tripanossomatídeos;
2) Analisar a curva de crescimento de P. serpens nas variedades esculentum,
pyriforme e cerasiforme de tomates da espécie L. esculentum;
3) Analisar, por meio de microscopia eletrônica de varredura, a interação in vitro
de P. serpens com glândulas salivares de O. fasciatus, em condições ex vivo;
4) Identificar a(s) molécula(s)-alvo para a ligação de P. serpens às glândulas
salivares de O. fasciatus;
5) Utilizar técnicas moleculares, assim como experimentos de inibição da
interação entre P. serpens e glândulas salivares de O. fasciatus, para comprovar
52
a natureza da molécula alvo para a ligação deste parasito à glândula salivar do
inseto;
6) Caracterizar as proteases secretadas, seja pelas glândulas salivares de O.
fasciatus, seja por P. serpens, durante o processo de interação deste parasito
com as glândulas do inseto.
53
METODOLOGIA
54
1) Insetos
Neste trabalho foram utilizados insetos da espécie Oncopeltus fasciatus,
naturalmente infectados com o tripanossomatídeo monoxênico da espécie
Leptomonas wallacei (Romeiro et al., 2000). A partir de exemplares cedidos
pelo Dr. Alexandre Romeiro (Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ)
conseguimos estabelecer uma nova colônia em nosso laboratório (colônia
parental). Os insetos foram mantidos em potes plásticos em regime de 16 h na
presença de luz para 8 h na ausência de luz, a 26oC, e alimentados com água
mineral e sementes de girassol descascadas.
2) Extração do trato intestinal e das glândulas salivares dos insetos
Ninfas ou insetos adultos, previamente anestesiados a 4oC, foram
cuidadosamente dissecados e o trato intestinal e as glândulas salivares extraídas
em banho de gelo e em tampão fosfato-salina (PBS) contendo fosfato 0,1 M
(pH 7,2) e NaCl 1,5 M.
3) Parasitos
Os parasitos da espécie Phytomonas serpens (isolado 9T, CT-IOC-189)
foram mantidos em meio Warren modificado (infusão de cérebro e coração a 37
g/L, ácido fólico a 10 µg/L e hemina a 1mg/L), suplementado com 10% de soro
fetal bovino, a 26oC. Os repiques das culturas foram realizados a cada 48 h, em
tubos de rosca, contendo 5 mL de meio.
A massa celular para os experimentos foi obtida, cultivando-se os parasitos,
por 96 h, nas mesmas condições citadas anteriormente.
Nos diferentes experimentos onde foram utilizados parasitos vivos, a
viabilidade celular foi monitorada antes e após as incubações, através de
55
microscopia óptica, por visualização da motilidade. Nenhuma das condições
utilizadas neste trabalho interferiu com a viabilidade dos parasitos.
Regularmente, os parasitos recolhidos do meio de cultura foram lavados por
três vezes em PBS (pH 7,2) a 4oC. A centrifugação dos parasitos foi feita a
1,500 × g por 5 min.
4) Microscopia óptica a fresco
Em todos os experimentos que se fez necessária, a microscopia óptica
(MO) a fresco foi feita observando-se a amostra em lâmina/lamínula ao
microscópio Axioplan 2 (Zeiss, Germany).
5) Microscopia óptica de amostras coradas com solução de Giemsa
Para a coloração de Giemsa as amostras foram fixadas por 5 min, em
lâmina de vidro, com metanol absoluto, e coradas, por 1 h, em solução de
Giemsa diluída 1:50 em PBS.
A observação das lâminas coradas foi feita ao microscópio Axioplan 2
(Zeiss, Germany) e as imagens capturadas pela câmera digital ColorView SX e
processadas pelo programa AnalySIS (Soft Image System).
6) Microscopia eletrônica de varredura
Para a análise por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), as
amostras foram fixadas em solução contendo 2,5% de glutaraldeído, 4,0% de
formaldeído, 3,7% de sacarose e 5 mM de CaCl2 em tampão cacodilato de sódio
0,1 M (pH 7,2) por 2 h, a 26oC.
Após a fixação, as amostras foram lavadas três vezes em tampão cacodilato
de sódio 0,1 M (pH 7,2), desidratadas em concentrações crescentes de etanol
56
(50, 70, 90 e 100%) e secas pelo método do ponto crítico com CO2 no aparelho
Balzers CDP-20 (Balzers Union, Fürstentun Liechstenstein).
Após a secagem, as amostras foram fixadas com fita dupla-face em cubos
de alumínio e pulverizadas com ouro no aparelho Balzers modelo FC- 9646. As
observações e micrografias foram realizadas em microscópio eletrônico Jeol
JSM-5310.
7) SDS-PAGE
Para os diferentes experimentos, os extratos protéicos tiveram as
concentrações de proteínas dosadas, através do método descrito por Lowry e
colaboradores (1951), utilizando a soroalbumina bovina (BSA) como proteína
padrão.
Para a análise de proteínas, alíquotas dos extratos foram adicionadas de
tampão Tris-HCl 62 mM (pH 6,8), SDS 2%, glicerol 25%, azul de bromofenol
0,01% e 2-β-mercaptoetanol 1 mM, aquecidas a 95oC por 5 min, e submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS)
(SDS-PAGE), de acordo com Laemmli (1970). As concentrações de acrilamida
nos SDS-PAGE variaram de acordo com cada experimento.
A eletroforese foi processada em cuba miniVE (GE Healthcare Life
Science) a 150V/60mA, a 4oC, e as proteínas reveladas através de coloração
com 0,2% de Coomassie Btrilliant Blue R-250 em metanol:ácido acético:água
(50:10:40) e descoradas em metanol:ácido acético:água (40:10:50).
A massa molecular aparente das diferentes proteínas separadas no gel foi
calculada, tendo-se como base as posições dos padrões de proteínas (Fermentas
Life Science), aplicadas no mesmo gel.
57
8) Transferência de proteínas para membranas de nitrocelulose
Em todos os experimentos que se fez necessária, a transferência de
proteínas dos géis para membranas de nitrocelulose foi conduzida a
100V/300mA, por 2 h, a 4oC, em tampão tris-base 25 mM, contendo ácido
aminoacético 200 mM e 20% de metanol.
9)
Estabelecimento
de
colônia
de
Oncopeltus
fasciatus
livre
de
tripanossomatideos
9.1) A partir de ovos recolhidos da colônia parental
Quatrocentos e cinqüenta ovos no mesmo estágio de maturação foram
recolhidos da colônia parental, divididos em três grupos de cento e cinqüenta
ovos e incubados até a eclosão em potes previamente tratados em hipoclorito de
sódio a 2%.
Após a eclosão dos ovos, os insetos foram alimentados com sementes de
girassol autoclavadas e água mineral estéril.
Todo o material utilizado para a manutenção desta colônia foi esterilizado
por autoclavação.
Nos dias 12 (ninfas de terceiro estágio), 17 (ninfas de quarto estágio), 22
(ninfas de quinto estágio) e 35 (insetos adultos), posteriores à eclosão dos ovos,
trinta insetos foram recolhidos de cada um dos três grupos e dissecados para a
extração do tubo digestivo. Após a extração, os tubos digestivos foram
homogeneizados separadamente em tubos Eppendorf contendo PBS (pH 7,2) e o
conteúdo de cada intestino foi analisado a fresco por MO, para a pesquisa de
flagelados da espécie L. wallacei, conforme item 4. A visualização de pelo
menos um parasito com mobilidade caracterizava a ninfa como infectada pela L.
wallacei.
58
As fezes e ovos de insetos infectados foram analisados por MEV da forma
descrita no item 6.
9.2) A partir de ovos recolhidos da colônia parental e tratados com
hipoclorito de sódio
Quatrocentos e cinqüenta ovos no mesmo estágio de maturação foram
recolhidos da colônia parental, tratados em solução de hipoclorito de sódio a 2%
durante 5 min, lavados em PBS estéril e secos em papel de filtro estéril.
Após o tratamento, os ovos foram divididos em três grupos de cento e
cinqüenta ovos e incubados até a eclosão em potes previamente tratados em
hipoclorito de sódio a 2%.
Após a eclosão dos ovos, os insetos foram alimentados com sementes de
girassol autoclavadas e água mineral estéril.
Todo o material utilizado para a manutenção desta colônia foi esterilizado
por autoclavação.
Nos dias 12 (ninfas de terceiro estágio), 17 (ninfas de quarto estágio), 22
(ninfas de quinto estágio) e 35 (insetos adultos), posteriores à eclosão dos ovos,
trinta insetos foram recolhidos de cada um dos três grupos e dissecadas para a
extração do tubo digestivo. Após a extração, os tubos digestivos foram
homogeneizados separadamente em tubos Eppendorf contendo PBS (pH 7,2) e o
conteúdo de cada intestino foi analisado a fresco por MO, para a pesquisa de
flagelados da espécie L. wallacei, conforme item 4. A visualização de pelo
menos um parasito com mobilidade caracterizava a ninfa como infectada pela L.
wallacei.
Os tubos digestivos dos insetos infectados e livres de tripanossomatídeos
foram analisados por MEV da forma descrita no item 6.
59
10) Infecção experimental de tomates para cultivo de Phytomonas serpens
Tomates da espécie L. esculentum variedades cerasiforme (tomate cereja),
pyriforme (tomate italiano) e esculentum (tomate salada) foram inoculados em
três diferentes pontos com 10 µl de suspensão contendo 1 x 105 parasitos e
incubados a 22oC. Nos dias 7, 14, 21 e 28 posteriores a inoculação, três tomates
de cada variedade foram dissecados e tiveram suas sementes removidas. O
volume de sementes de cada tomate foi calculado e as sementes foram, então,
lavadas em igual volume de solução de NaCl a 0,9% (solução salina). Após a
lavagem, o número de parasitos foi contado em câmara de Neubauer.
Paralelamente, alíquotas do lavado foram coradas com solução de Giemsa para a
visualização dos parasitos por MO, conforme item 5.
Tomates controle, ou seja, que não receberam o inóculo contendo parasitos,
foram processados da mesma forma. Em nenhum dos tomates controle foram
encontrados parasitos.
11) Infecção experimental de Oncopeltus fasciatus com parasitos da espécie
Phytomonas serpens
Para a infecção experimental dos insetos, os parasitos foram crescidos em
tomates da variedade esculentum. No vigésimo primeiro dia após a inoculação
dos parasitos, os tomates foram dissecados e suas sementes extraídas e lavadas
em solução salina, como descrito no item anterior. O lavado das sementes foi,
então, filtrado em papel Whatman e a concentração de parasitos acertada para 1
x 107 parasitos/mL de solução salina.
Cinqüenta insetos adultos, recolhidos da colônia de insetos livres de
tripanossomatídeos, foram mantidos na ausência de comida e água por 18 h e
transferidos para potes plásticos contendo a suspensão de parasitos. Todos os
insetos foram observados se alimentando da suspensão de parasitos.
60
Nos dias 2, 5, 10 e 25, posteriores à infecção dos insetos com os parasitos,
grupos de cinco insetos foram dissecados para a pesquisa de parasitos no
intestinos médio e posterior, nas fezes, na hemolinfa e nas glândulas salivares,
por meio de MO, conforme itens 4 e 5. A hemolinfa dos insetos infectados foi
colhida após o extravasamento causado por amputação parcial de uma das patas.
12) Interação in vitro de Phytomonas serpens com glândulas salivares de
Oncopeltus fasciatus inseto, em condições ex vivo
As glândulas salivares foram incubadas em 1 mL de PBS (pH 7,2),
contendo 1% de BSA e 1 x 107 parasitos crescidos em meio de cultura. As
incubações foram feitas em lâmina escavada e em câmara úmida, por 2 h, a
26ºC.
Após a incubação, os parasitos não associados (aderidos ou internalizados)
às glândulas foram eliminados durante três lavagens consecutivas das glândulas
em placas de Petri com 15 mL de PBS, por 1 min .
Após a lavagem, as glândulas foram processadas e a interação observada
por MEV, como descrito no item 6.
13) Determinação do perfil de proteínas totais de Phytomonas serpens e das
glândulas salivares de Oncopeltus fasciatus
As glândulas salivares e os parasitos foram adicionados de tampão TrisHCl 20 mM (pH 8,0), contendo ácido etileno-diamino tetracético (EDTA) 1
mM, fluoreto de fenilmetanosufonil (PMSF) 1 mM, leupeptina 100 µM, E-64 1
µM, bestatina 10 µM, 1,10-fenantrolina e SDS 1% e submetidos a três ciclos de
congelamento/descongelamento. Em seguida, as glândulas, ao contrário dos
parasitos, foram maceradas em tubo Eppendorf. O conteúdo dos tubos foi
61
agitado por três vezes em aparelho vórtex, por 1 min, sendo cada agitação
intercalada por banho de gelo, durante 2 min.
O homogenato foi centrifugado a 5000 × g, por 10 min, a 4oC, e o
sobrenadante, contendo o extrato protéico, foi recolhido.
Alíquotas do extrato protéico contendo 80 µg de proteína foram separadas
em SDS-PAGE a 10%, como descrito no item 7.
14) Biotinilação de proteínas de superfície de Phytomonas serpens
A biotinilação dos parasitos foi realizada de acordo com o método descrito
por Altin & Pagler (1995). Uma suspensão de parasitos, contendo 108 céls/mL,
foi tratada em PBS (pH 8,0) com 1 mg/mL de hexanoato de sulfo-succinimidil6-(biotinamida) (Sulfo-NHS-Lc-Biotina - Pierce Biotechnology), a 4oC, por 20
min. Em seguida, as células foram lavadas, como descrito no item 3.
15) Observação do perfil de proteínas de superfície de Phytomonas serpens
Proteínas totais de parasitos biotinilados foram separadas em SDS-PAGE
10% e transferidas para membrana de nitrocelulose. Seguindo a transferência, a
membrana foi bloqueada em tampão tris 10 mM, NaCl 190 mM (TBS), pH 7,2,
contendo 0,05% de tween 20 (TBS-tween) e 2% de BSA, por 16 horas, a 4oC. A
membrana foi, então, lavada três vezes, por 10 min, com TBS-tween e incubada
com
estreptoavidina
conjugada
à
peroxidase
(0,1
µg/mL
de
TBS-tween), por 1 hora, sob leve agitação. Após mais três lavagens em TBStween, por 10 min, as proteínas de membrana de P. serpens foram reveladas
após a utilização do kit SuperSignal West Pico (Pierce Biotechnology) para
desenvolvimento de quimioluminescência, seguida de exposição a filmes de
raios-X T-MAT G/RA (Kodak).
62
16) Interação de proteínas de superfície do parasito com proteínas das
glândulas salivares do inseto por “ligand blotting”
16.1) Transferência de proteínas da glândula salivar para membrana de
nitrocelulose
Alíquotas do extrato protéico total das glândulas salivares, equivalentes a
80 µg, foram separadas em SDS-PAGE a 10%, como descrito no item 7, e
transferidas para membrana de nitrocelulose, como descrito no item 8.
16.2) “Ligand blotting”
A membrana contendo proteínas da glândula foi bloqueada e lavada em
TBS-tween, como no descrito no item 15. Em seguida, a membrana foi incubada
em TBS-tween (pH 7,2), contendo 500 µg de proteínas totais de parasitos
previamente biotinilados, por 1 h, a 26oC, sob leve agitação e, posteriormente,
lavada três vezes em TBS-tween, por 10 min. Após esta etapa, a membrana foi
incubada com estreptoavidina conjugada à peroxidase (0,1 µg/mL de TBStween), por 1 hora, sob leve agitação. Após mais três lavagens em TBS-tween,
por 10 min, as proteínas de membrana de P. serpens, que reconheceram bandas
de proteínas da glândula salivar, foram reveladas como descrito no item 15.
17) Interação de parasitos vivos com proteínas das glândulas salivares
Este experimento foi realizado de acordo com o protocolo descrito por Dias
e colaboradores (2007) (ANEXO 1). Resumidamente, membranas contendo
proteínas das glândulas salivares separadas em SDS-PAGE ou em gel
bidimensional (2D) foram bloqueadas e lavadas, como descrito no item 15. Em
seguida, as membranas foram incubadas em TBS-tween (pH 7,2) contendo 1%
63
de BSA e parasitos previamente biotinilados, na concentração de 1x107
parasitos/mL, por 1 h, a 26oC, em câmara úmida, sob leve agitação. Após a
incubação, as membranas foram lavadas três vezes (10 min cada) em TBS-tween
(pH 7,2). Após esta etapa, as membranas foram incubadas com estreptoavidina
conjugada à peroxidase (0,1 µg/mL de TBS-tween), por 1 hora, sob leve
agitação. Após mais três lavagens em TBS-tween, por 10 min, a presença de
parasitos aderidos às bandas de proteínas separadas em SDS-PAGE ou em
“spots” de proteínas separadas em gel bidimensional (gel 2D) de proteínas foi
revelada, como descrito no item 15.
18) Eletroforese bidimensional do extrato protéico das glândulas salivares
Para a separação das proteínas em géis 2D, as glândulas foram extraídas,
conforme item 2, e maceradas em tampão tris 50 mM (pH 7, 0), uréia 8 M,
tiouréia 2 M, DTT 50 mM, pharmalyte 0,5 %, amidosulfobetaina-14 1% e triton
X-100 2%. O extrato foi centrifugado a 5000 × g, por 15 min, e o sedimento
desprezado. A concentração de proteína no extrato da glândula foi realizada com
o kit 2D Quant (GE Healthcare Life Sciences).
Para os diferentes experimentos, 125 µl do extrato protéico contendo 150
µg de proteínas totais da glândula, foram adicionados de azul de bromofenol
(concentração final de 1%) e utilizados para reidratar tiras de 7 cm.
A isoeletrofocalização das proteínas nas tiras, ou seja, a separação por
ponto isoelétrico (pI) foi feita em aparelho Ettan IPG phor III (GE Healthcare
Life Sciences), através dos seguintes ciclos: 30 volts por 12 h; 200 volts por 1 h;
500 volts por 1 h; 1000 volts por 1 h; 1500 volts por 3 h.
Após a focalização das proteínas, as tiras foram equilibradas em tampão tris
50 mM (pH 8,8), uréia 6 M, glicerol 30%, SDS 30%, azul de bromofenol 2%,
DTT 65 mM, por 15 min, a 26oC, e, em seguida, em tampão tris 50 mM (pH
64
8,8), uréia 6 M, glicerol 30%, SDS 30%, azul de bromofenol 2%, iodoacetamida
217 mM, por 15 min, a 26oC.
A segunda dimensão, isto é, o SDS-PAGE das proteínas contidas no strip
foi feita, conforme o item 7.
19) Espectrometria de massa
O “spot” cortado do gel 2D foi descorado em solução contendo bicarbonato
de amônio 25 mM e acetonitrila (ACN) 50%, por 12 h. A solução anterior foi
trocada por solução de bicarbonato de amônio 25 mM, contendo ditiotreitol
(DTT) 10 mM e o gel incubado, por 1 h, a 56ºC. Após esta etapa, a solução
anterior foi substituída por solução de bicarbonato de amônio 25 mM, contendo
iodoacetamida 55 mM e o gel incubado, por 45 min (reação no escuro), a 56oC.
Toda esta solução foi retirada, o gel lavado com bicarbonato de amônio 25 mM,
contendo ACN 50 % e desidratado em ACN 100 %. O gel seco foi reidratado
com solução de bicarbonato de amônio 25 mM contendo 100 ng de tripsina
(Promega, WI, USA) e incubado, por 20 h, a 37ºC, para a digestão tríptica.
Após a digestão, os peptídeos foram extraídos com solução de ACN 50% e
ácido trifluoracético (TFA) 5% e o volume reduzido para 10 µl em “speed vac”
(GE Healthcare Biosciences). Deste concentrado, 1µl foi adicionado de 1µl de
matriz formada por solução saturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico em
ACN 50%, TFA 1% e aplicado em placa de amostra para MALDI-TOF
(Voyager-DE, Applied Biosystem, CA, USA) e secas a 26oC.
Para a calibração do espectrômetro, como padrões internos, foram usados
os peptídeos gerados pela autólise da tripsina e, como padrões externos,
peptideos padrões comerciais (Sequazyme Peptide Mass Standard kit,
PerSeptive Biosystems, CA, USA).
Os peptídeos gerados foram analisados usando um programa de interface
(Protein Prospector MS-Fit interface) (http://prospector.ucsf.edu), que faz busca,
65
em banco de dados, por sequências de proteínas onde os peptídeos gerados se
encaixam. O banco de dados utilizados no presente trabalho foi o do NCBI
(National Center for Biotechnologiacl Information).
Os critérios utilizados para a identificação de proteínas com sequências
homólogas foram: (i) “MOWSE score” acima de 104, (ii) diferença maior que
100 vezes entre o “MOWSE score” da primeira proteína candidata para a
segunda, (iii) 20% de cobertura dos peptídeos gerados sobre a sequência da
proteína homóloga e (iv) pelo menos 4 peptídeos encaixados na sequência da
proteína homóloga.
20) “Imunoblotting” da proteína de 130 kDa, utilizando o anticorpo
produzido contra a cadeia beta-3 da laminina-5 humana
Para este experimento, 80 µg de proteínas totais das glândulas salivares
extraídas, conforme item 13, foram separadas em SDS-PAGE a 12% e
transferidas para membrana de nitrocelulose, conforme item 8. Em seguida, a
membrana foi bloqueada em tampão TBS-tween, contendo 2% de BSA, por 16
horas, a 4oC. A membrana foi, então, lavada três vezes, por 10 min, com TBStween e incubada com anticorpo policlonal de cabra, produzido contra a cadeia
beta-3 da laminina-5 humana (sc-7651, Santa Cruz Biotechnology) na diluição
de 1:500 em TBS-tween, por 1 hora, a 26oC, sob leve agitação. Após mais três
lavagens em TBS-tween, por 10 min, a membrana foi incubada com anticorpo
secundário (conjugado à peroxidase), produzido em coelhos, contra IgG de
cabra (A 4174, Sigma-Aldrich), por 1 hora, a 26oC, sob leve agitação. Este
anticorpo secundário foi utilizado na diluição de 1:10000 em TBS-tween.
Em um sistema controle, a membrana de nitrocelulose, contendo as
proteínas das glândulas salivares, foi incubada somente com o anticorpo
secundário, conforme descrito anteriormente.
66
Após a incubação com o anticorpo secundário, as membranas foram
submetidas a mais três lavagens em TBS-tween, por 10 min, e reveladas
conforme item 15.
21) Busca do gene da cadeia beta-3 da laminina-5 em Oncopeltus fasciatus
Glândulas salivares extraídas conforme item 2 e ninfas de terceiro estágio
previamente tratadas em hipoclorito de sódio, conforme item 9.2, foram
utilizadas para a extração de DNA total.
21.1) Extração do DNA total
Quarenta glândulas e três ninfas foram maceradas separadamente em dois
tubos Eppendorf, contendo 1 ml de tampão tris 10 mM, EDTA 1 mM (TE), pH
7,8, e SDS 1%. As preparações foram agitadas no vortex por 30 segundos,
incubadas a 65ºC por 1 h. Após esta incubação, as amostras foram adicionadas
de 2 µl de RNase A (10 mg/ml) e incubadas, a 37ºC, por 10 min. Em seguida, 22
µl de pronase (10 mg/ml) foram adicionados e o material foi incubado a 37ºC
por 2 h. O preparado foi centrifugado a 5000 × g, por 10 min, e o sobrenadante
recolhido.
Em cada um dos dois tubos Eppendorf, contendo 25 µl de acetato de sódio
3 M (pH 7,0) e 480 µl de etanol absoluto gelado, foram adicionados 800 µl do
sobrenadante, contendo o DNA extraído da amostra. Em seguida, cada tubo foi
agitado por inversão (50 vezes), incubado a -20ºC, por 1 h, e centrifugado a
5000 × g, por 10 min, a 4ºC. O precipitado foi, então, ressuspenso em 200 µl de
TE, incubado a 4ºC, por 20 h, e adicionado de 100 µl de fenol. Em seguida, a
amostra foi agitada em vórtex, por 1 min, e centrifugada a 5000 × g, por 10 min,
a 26oC. A fase aquosa (fase superior) de cada tubo foi transferida para um novo
67
tubo Eppendorf, adicionada de volume equivalente de clorofórmio-álcool
isoamílico (24:1), agitada no vórtex, por 1 min, e centrifugada novamente a
5000 × g, por 10 min a 26oC. Esta etapa de purificação com clorofórmio-álcool
isoamílico foi repetida e, então, a fase aquosa superior de cada tubo foi
transferida novamente para outro tubo Eppendorf e acrescida de acetato de sódio
3 M (pH 7,0), em volume correspondente a 1/10 do volume total da amostra. Em
seguida, etanol absoluto a -20ºC foi acrescentado em quantidade equivalente a
duas vezes o volume total de amostra. O preparado foi deixado a -20ºC, por 20
h, e centrifugado a 5000 × g, por 15 min, 4ºC. O precipitado de cada tubo foi
lavado uma vez com 100 µl de etanol 70%, centrifugado a 5000 × g, por 5 min e
ressuspenso em 200 µl de TE.
Como controle para os experimentos, utilizamos DNA de sangue humano,
extraído da mesma forma descrita acima.
21.2) Reação de polimerização em cadeia
Para a reação de polimerização em cadeia (PCR) foi realizada uma reação
de “nested-PCR”, com os dois pares de iniciadores comerciais desenhados
especificamente para o gene da cadeia beta-3 da laminina-5 humana (sc-43151PR, Santa Cruz Biotechnology).
A primeira reação de PCR foi realizada com o Par A de iniciadores e a
segunda reação com o Par B. Cada tubo de reação continha Tris-HCl 10 mM
(pH 9,0), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, dNTPs 200 µM, 2 µM do par de
iniciadores e 2,5 U da enzima Taq polimerase (Invitrogen). Na primeira reação,
foram usados 10 ng do DNA de cada amostra (DNA controle, DNA das ninfas
ou DNA das glândulas) e na segunda reação foram usados 2 µl do produto da
primeira reação como DNA molde. O ciclo aplicado nas duas reações foi o
68
mesmo: 1x (94°C por 3 min), 35x (94°C por 1 min e 30 seg; 48°C por 30 seg;
72°C por 2 min e 30 seg,); 1x (72°C por 6 min).
21.3) Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de PCR obtidos foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose a 1,4%, preparado em tampão tris 890 mM, EDTA 25 mM, ácido bórico
890 mM (TEB), pH 7,8. As amostras de DNA foram misturadas com solução de
glicerol, 50%, EDTA 20 mM, azul de bromofenol 0,05% e xilenocianol 0,05%,
na proporção de 1/3 do volume total da mistura aplicada no gel.
A eletroforese dos produtos de PCR foi realizada a 80 V, por 2 h, em
tampão TEB. Após a eletroforese, os géis foram tratados por 20 min com
brometo de etídio, na concentração de 2 µl/ml de água destilada. Os fragmentos
de DNA foram observados em transiluminador com luz ultra-violeta de
comprimento de onda de 300 nm.
22) Inibição da interação dos parasitos com as glândulas salivares do inseto
Nestes experimentos, grupos de cinco glândulas salivares foram incubados
em 1 mL de PBS (pH 7,2), contendo 1% de BSA e 1 x 107 parasitos crescidos
em meio de cultura. As incubações foram feitas em lâmina escavada e em
câmara úmida, por 2 h, a 26ºC. Para cada sistema (teste e controle), foram
incubados, separadamente, dez grupos de cinco glândulas.
Após a incubação, os parasitos não-associados (aderidos ou internalizados)
às glândulas foram eliminados, durante três lavagens consecutivas das glândulas
em placas de Petri contendo 15 mL de PBS.
Após a remoção dos parasitos não-associados, os grupos de cinco glândulas
foram levemente macerados, separadamente, em tubos Eppendorf contendo 50
µL de PBS. As contagens de parasitos associados às glândulas foram feitas em
69
câmara de Neubauer, de acordo com Pimenta e colaboradores (1994). Somente
os parasitos apresentando motilidade foram consideradas nas contagens.
A análise de variância do número de parasitos associados entre os grupos
de glândulas de um mesmo sistema foi feita através do programa EPI-INFO
6.04 (Database and Statistics Program for Public Health). Os resultados obtidos
para os diferentes sistemas foram considerados significantes, mostrando valores
de P menores do que 0,05.
22.1) Inibição promovida pela p130 purificada
Neste experimento, foi adicionada ao meio de interação a proteína de 130
kDa nas concentrações de 2 ou 20 µg/mL de meio de incubação. No sistema
controle, a proteína de 130 kDa não foi adicionada.
a) Purificação da proteína de 130 kDa
Para purificar a proteína de 130 kDa, uma alíquota do extrato protéico total
da glândula, equivalente a 1 mg de proteína, foi aplicada em SDS-PAGE a 8%.
Após a eletroforese (condições no item 7), o gel foi incubado em solução de KCl
1 M, o que permitiu a visualização das bandas. A banda de 130 kDa foi, então,
cortada e macerada em tubo Eppendorf, contendo solução de bicarbonato de
amônio 50 mM e SDS 0,1% (pH 7,8). O macerado foi incubado a 37o C, por 1 h,
e centrifugado a 5000 × g, por 10 min. O sobrenadante foi, então, adicionado de
4 volumes de acetona, resfriado até -20oC e centrifugado a 5000 × g, por 10 min,
a 4oC. A proteína precipitada foi ressuspensa em PBS (pH 7,2) e a pureza
avaliada em SDS-PAGE, corado com nitrato de prata, de acordo com
Gonçalves, Nehme & Morel (1984).
A concentração do produto da purificação foi medida como descrito no
item 7.
70
22.2) Inibição promovida pela laminina-5 humana
Neste experimento, foi adicionado ao meio de incubação a laminina-5
humana (Alpco Diagnostics), nas concentrações de 2 ou 20 µg/mL de meio de
incubação. No sistema controle esta proteína não foi adicionada.
22.3) Inibição promovida pelo anticorpo anti-cadeia beta-3 da laminina-5
humana
Neste experimento, as glândulas salivares foram tratadas com o anticorpo
anti-cadeia beta-3 da lamina-5 humana (sc-7651, Santa Cruz Biotechnology) nas
diluições de 1:100 (equivalente a 20 ng/mL) e 1:500 (equivalente a 4 ng/mL),
em PBS, por 10 min, a 26oC, antes de serem adicionadas ao meio de interação.
No sistema controle, as glândulas foram pré-incubadas apenas em PBS.
23) Enzimas proteolíticas extracelulares envolvidas na interação do parasito
com as glândulas salivares do inseto
Para pesquisar o envolvimento de proteases extracelulares no processo de
interação foram montados três sistemas:
(i) Sistema interação - incubamos 100 glândulas salivares em 200 µl de
suspensão de parasitos, na concentração de 1 x 108 parasitos/mL de PBS.
(ii) Sistema controle_glândulas - incubamos 100 glândulas salivares em
200 µl de PBS.
(iii) Sistema controle_parasitos - incubamos 200 µl de suspensão de
parasitos, na concentração de 1 x 108 parasitos/mL de PBS.
71
Alternativamente, para determinar a origem das proteases presentes no
sobrenadante da interação, fizemos outro experimento, onde foram montados
outros três sistemas:
(i) Sistema parasito vivo x glândula viva - incubamos 100 glândulas
salivares em 200 µl de suspensão de parasitos, na concentração de 1 x 108
parasitos/mL de PBS.
(ii) Sistema parasito vivo x glândula fixada - incubamos 100 glândulas
salivares, previamente fixadas em formaldeído a 4%, em 200 µl de suspensão de
parasitos vivos, na concentração de 1 x 108 parasitos/mL de PBS.
(iii) Sistema parasito fixado x glândula viva - incubamos 100 glândulas
salivares vivas em 200 µl de suspensão de parasitos, previamente fixados em
formaldeído a 4%, na concentração de 1 x 108 parasitos/mL de PBS.
Os parasitos e as glândulas foram fixados em PBS (pH 7,2), contendo
formaldeído a 4%, durante 10 min, a 4oC.
Após a incubação, por 2 h, a 26oC, o sobrenadante dos sistemas foi
recolhido e centrifugado a 1500 × g, por 10 min, a 4oC. Alíquotas de 40 µl do
sobrenadante de cada sistema foram adicionadas de 10 µl de tampão de amostra
(TA) contendo tris-HCl 62 mM (pH 6,8), SDS 2%, glicerol 25%, azul de
bromofenol 0,01% e aplicadas, em triplicata de gel de poliacrilamida a 10%,
contendo 0,1% de gelatina co-polimerizada.
Após a eletroforese, os três géis foram lavados em solução de triton X-100
a 2,5% durante 1 h e, posteriormente, incubados em tampão glicina 50 mM (pH
10,0), tampão PBS (pH 7,2) ou tampão fosfato 50 mM (ph 5,5) suplementado
com DTT 2 mM, por 48 h, a 37oC. Em seguida, os géis foram corados e
72
descorados, nas condições descritas no item 7, para a visualização de bandas de
degradação.
As massas moleculares das proteases foram estimadas através da
comparação da migração destas enzimas com a dos padrões de proteínas
(Fermentas Life Science).
23.1) Determinação da classe da enzima proteolítica liberada pelo parasito
no meio de interação
Para determinar a classe proteolítica da enzima liberada pelos parasitos,
durante a interação com as glândulas salivares do inseto, incubamos 300
glândulas salivares em 600 µl de suspensão de parasitos, na concentração de 1 x
108 parasitos/mL de PBS.
Após a incubação, por 2 h, a 26oC, o sobrenadante da interação foi
recolhido e centrifugado a 1500 × g, por 10 min, a 4oC. Alíquotas de 40 µl do
sobrenadante foram adicionadas de 10 µl de TA e aplicadas em gel de
poliacrilamida a 10%, contendo 0,1% de gelatina co-polimerizada.
Após a eletroforese, o gel foi lavado em solução de triton X-100 a 2,5%
durante 1 h e, posteriromente, incubado em tampão glicina 50 mM (pH 10,0),
por 48 h, a 37oC, na ausência (controle) ou na presença dos íons Zn2+ (ZnCl2 2
mM) e Ca2+ (CaCl2 5 mM), do quelante de íons EDTA (5 mM) e dos inibidores
proteolíticos 1,10-Fenantrolina (10 mM), E-64 (10 µM) e PMSF (1 mM).
Em seguida, o gel foi corado e descorado, nas condições descritas no item
7, para a visualização de bandas de degradação.
73
23.2) Caracterização da atividade proteolítica liberada pela glândula
salivar no meio de interação
a) Modulação da expressão da protease da glândula salivar exercida pelos
parasitos
Para determinar se a presença dos parasitos influencia a expressão de
proteases pelas glândulas salivares, incubamos 100 glândulas em 200 µl de PBS,
na ausência ou na presença de 1 x 108 parasitos/mL.
Após a incubação, por 2 h, a 26oC, o sobrenadante da interação foi
recolhido e centrifugado a 1500 × g, por 10 min, a 4oC. Alíquotas de 40 µl do
sobrenadante foram analisadas por zimografia, conforme item 24, e por SDSPAGE a 10%, conforme item 7.
b) Determinação do sítio de atividade da protease de 14-18 kDa da glândula
salivar
Sabendo que as glândulas salivares liberam a protease de 14-18 kDa, na
presença ou na ausência de parasitos, incubamos 100 glândulas salivares em 200
µl de PBS a 26oC, por 10 min ou 2 h.
No final de cada período de incubação, recolhemos o sobrenadante e
fizemos o extrato protéico total das glândulas salivares incubadas.
Os sobrenadantes (40 µl) e os extratos protéicos (40 µl), equivalentes a 80
µg de proteína, foram adicionadas de 10 µl de TA e aplicados em gel de
poliacrilamida a 10%, contendo 0,1% de gelatina co-polimerizada.
Após a eletroforese, os géis foram lavados em solução de triton X-100 a
2,5% durante 1 h e, posteriormente, incubados em tampão glicina 50 mM (pH
10,0), por 48 h, a 37oC. Em seguida, os géis foram corados e descorados nas
condições descritas no item 7, para a visualização de bandas de degradação.
74
c) Determinação da classe da enzima proteolítica liberada pela glândula
salivar no meio de interação
Sabendo que as glândulas salivares liberam a protease de 14-18 kDa, na
presença ou na ausência de parasitos, para determinar a classe proteolítica da
enzima liberada pelas glândulas salivares, durante a interação com os parasitos,
incubamos 300 glândulas salivares em 600 µl de PBS, por 2 h, a 26oC.
Após a incubação, o sobrenadante da interação foi recolhido e centrifugado
a 1500 × g, por 10 min, a 4oC. Alíquotas de 40 µl do sobrenadante foram
adicionadas de 10 µl de TA e aplicadas em gel de poliacrilamida a 10%
contendo 0,1% de gelatina co-polimerizada.
Após a eletroforese, o gel foi lavado em solução de triton X-100 a 2,5%
durante 1 h e, posteriromente, incubado em tampão glicina 50 mM (pH 10,0),
por 48 h, a 37oC, na ausência (controle) ou na presença dos íons Zn2+ (ZnCl2 2
mM) e Ca2+ (CaCl2 5 mM), do quelante de íons EDTA (5 mM) e dos inibidores
proteolíticos 1,10-Fenantrolina (10 mM), E-64 (10 µM) e PMSF (1 mM).
Em seguida, o gel foi corado e descorado, nas condições descritas no item
7, para a visualização de bandas de degradação.
75
RESULTADOS
76
1) Obtenção de colônia de insetos livres de tripanossomatídeos
1.1) A partir de ovos recolhidos na colônia parental
Na tentativa de obter uma colônia com insetos curados da infecção pela L.
wallacei, quatrocentos e cinquenta ovos no mesmo estágio de maturação foram
recolhidos da colônia parental, isto é, da colônia de insetos naturalmente
infectados com tripanossomatídeos da espécie L. wallacei. Estes ovos foram
separados em três grupos de cento e cinqüenta ovos e incubados até a eclosão
em potes previamente tratados com hipoclorito de sódio. Após a eclosão dos
ovos, foram adicionadas sementes de girassol autoclavadas e água mineral
estéril. No entanto, nos dois primeiros dias após a eclosão, as ninfas foram
observadas se alimentando exclusivamente nos ovos eclodidos.
No décimo segundo dia após a eclosão dos ovos, quando as ninfas já se
encontravam no terceiro estágio, trinta insetos de cada um dos três grupos foram
recolhidos e dissecados, para a extração do tubo digestivo. Após a
homogeneização dos tubos digestivos em PBS, o conteúdo intestinal foi
analisado a fresco por MO, para a pesquisa de flagelados da espécie L. wallacei.
O percentual de ninfas de terceiro estágio infectadas variou entre 26,7 e 56,7%
nos três grupos analisados (Tabela 1).
Tabela 1- Percentual de infecção por L. wallacei em ninfas de terceiro estágio.
Ninfas analisadas
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
30
30
30
Número de ninfas
infectadas não-infectadas
17
8
13
13
22
17
Percentual de ninfas infectadas
56,7%
26,7%
43,3%
No décimo sétimo dia após a eclosão dos ovos, quando os insetos já
estavam no quarto estágio de ninfa, outros trinta insetos de cada um dos três
grupos foram recolhidos, dissecados e analisados como descrito anteriormente.
O percentual de ninfas de quarto estágio infectadas variou entre 30 e 50%, nos
77
três grupos analisados (Tabela 2). O mesmo procedimento foi realizado no
vigésimo segundo dia, quando os insetos já se encontravam no quinto estágio de
ninfa. Neste estágio, o percentual de ninfas infectadas variou entre 36,7% e 43,3%
(Tabela 3). Dessa forma, o percentual médio de ninfas infectadas variou entre
31,13% ± 5,09 e 47,8% ± 10,18 nos três grupos analisados (Tabela 4).
Tabela 2- Percentual de infecção por L. wallacei em ninfas de quarto estágio.
Ninfas analisadas
30
30
30
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Número de ninfas
infectadas não-infectadas
15
9
12
15
21
18
Percentual de ninfas infectadas
50,0%
30,0%
40,0%
Tabela 3- Percentual de infecção por L. wallacei em ninfas de quinto estágio.
Ninfas analisadas
30
30
30
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Número de ninfas
infectadas não-infectadas
11
11
13
19
19
17
Percentual de ninfas infectadas
36,7%
36,7%
43,3%
Tabela 4- Percentual médio de ninfas inefctadas por L. wallacei.
Percentual de ninfas infectadas
3 estágio
4o estágio
5o estágio
o
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
56,7%
26,7%
43,3%
50,0%
30,0%
40,0%
36,7%
36,7%
43,3%
Percentual médio de ninfas infectadas
47,8% ± 10,18
31,13% ± 5,09
42,20% ± 1,90
No trigésimo quinto dia após a eclosão dos ovos, quando os insetos já
estavam na fase adulta, outros trinta insetos de cada um dos três grupos foram
recolhidos e dissecados para a extração do tubo digestivo. Após a
homogeneização dos tubos digestivos em PBS, o conteúdo intestinal foi
analisado a fresco por MO para a pesquisa de L. wallacei. O percentual de
infecção nos insetos analisados foi de 100% nos três grupos analisados (Tabela
5). Ninfas e adultos nascidos e crescidos na colônia parental mostram índice de
infecção de 100% (Romeiro et al., 2000).
78
Tabela 5- Percentual de infecção por L. wallacei em insetos adultos.
Insetos analisados
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
30
30
30
Número de insetos adultos
infectados não-infectados
30
30
30
Percentual de insetos infectados
0
0
0
100%
100%
100%
Diante destes resultados e sabendo que a espécie L. wallacei é capaz de
produzir formas císticas, decidimos investigar a possibilidade dos ovos
recolhidos na colônia parental conterem cistos de L. wallacei.
Por meio de MEV, observamos que fezes frescas de O. fasciatus, colhidas
na colônia parental, contêm formas promastigotas viáveis e cistos de L. wallacei
(figura 1). Formas císticas, com textura e relevo normais de uma célula viável,
foram observadas ainda ligadas à célula parental, a qual apresentou inúmeros
poros em sua membrana celular.
Analisando a superfície externa de ovos colhidos na colônia de O. fasciatus
(Figura 2), observamos a presença de cistos característicos de L. wallacei
(Romeiro et al, 2000; Romeiro, 2001), isto é, formas ovóides com cerca de 3 µm
de comprimento ao longo do seu eixo longitudinal e invaginação característica
de bolsa flagelar. No presente estudo não foi possível observar nos cistos
visualizados o flagelo residual, observado por Romeiro e colaboradores (2000).
79
A
B
C
Figura 1 - Microscopia eletrônica de varredura mostrando a presença de formas promastigotas e císticas de L.
wallacei em fezes frescas do inseto O. fasciatus fixadas sobre lamínula de vidro. (A) Formas promastigotas
aparentemente viáveis. Barra - 5 µm. (B) Forma cística aderida ao flagelo da célula parental aparentemente
viável Barra - 1 µm. (C) Formas císticas aderidas ao flagelo da célula parental. Notar os poros presentes na
membrana plasmática da célula parental. Barra - 1 µm.
80
A
*
* *
*
*
B
Figura 2 - Microscopia eletrônica de varredura da face externa de ovos de O. fasciatus recolhidos em colônia
naturalmente infectada com L. wallacei. (A) Micrografia de ovos de O. fasciatus analisados em pequeno
aumento. Barra - 500 µm. (B) Micrografia da parede externa dos ovos mostrando a presença de cistos (∗)
característicos de L. wallacei, com cerca de 3 µm de comprimento ao longo do eixo longitudinal, e presença de
invaginação característica da bolsa flagelar, indicada pela seta. Barra - 1 µm
81
1.2) A partir de ovos recolhidos da colônia parental e tratados com
hipoclorito de sódio
Percebendo a possibilidade de que as ninfas de O. fasciatus poderiam estar
contraindo a infecção por L. wallacei a partir da ingestão de cistos, contidos na
face externa dos ovos, decidimos promover a assepsia dos ovos, através do
tratamento com hipoclorito de sódio. Após este tratamento, quatrocentos e
cinqüenta ovos recolhidos na colônia infectada foram incubados até a eclosão,
da mesma forma descrita no item anterior.
Ninfas de terceiro, quarto e quinto estágios, assim como insetos adultos,
foram dissecadas e o conteúdo dos seus tubos digestivos analisados para a
pesquisa de L. wallacei, da mesma forma descrita anteriormente. Ao contrário
do acontecido no experimento anterior, onde aproximadamente 50% das ninfas e
100% dos insetos adultos apresentaram-se infectados, quando os ovos foram
tratados com hipoclorito de sódio, em nenhum dos tubos digestivos analisados a
fresco por MO foi detectada a presença de flagelados (figura 3).
A
B
Figura 3 - Microscopia óptica do conteúdo de tubos digestivos extraídos de ninfas de O. fasciatus no quinto
estágio de desenvolvimento. Os conteúdos dos tubos digestivos foram corados através da coloração de Giemsa.
Fotos em aumento de 100x. (A) Conteúdo de tubo digestivo de ninfa nascida de ovo coletado em colônia de
insetos infectados com L. wallacei. A seta e a ponta de seta indicam, respectivamente, o cinetoplasto e o núcleo
de um dos parasitos presentes na lâmina. (B) Ausência de parasitos no conteúdo de tubo digestivo de ninfa
nascida de ovo tratado com hipoclorito de sódio.
82
No intuito de confirmar a ausência de parasitos nos tubos digestivos de
insetos nascidos de ovos tratados com hipoclorito, decidimos analisar, por meio
de MEV, os tubos digestivos destes insetos e comparar com os tubos digestivos
de insetos recolhidos na colônia contaminada com L. wallacei. Ao analisar as
micrografias do ventrículo 4 do intestino médio de insetos colhidos na colônia
infectada, observamos a presença de grande número de parasitos aderidos na
parede interna deste segmento (figura 4 A). O mesmo foi evidenciado nas
micrografias do reto de insetos infectados, onde observamos uma quantidade
maciça de parasitos aderidos às almofadas retais (figura 4 B). Em contrapartida,
as micrografias de insetos nascidos de ovos tratados mostraram o lúmen do
ventrículo 4 com intenso brotamento de membranas perimicrovilares e ausência
de parasitos (figura 5 A). Da mesma forma, na micrografia do reto foi
observado um acúmulo de membranas perimicrovilares e ausência de flagelados
(figura 5 B).
Os insetos nascidos dos ovos tratados com hipoclorito de sódio formaram
uma nova colônia, constituída de insetos livres de tripanossomatídeos.
83
A
AR
B
Figura 4 - Microscopia eletrônica de varredura mostrando a presença de parasitos da espécie L. wallacei no
lúmen do ventrículo 4 e no reto de O. fasciatus. (A) A seta indica a presença de grande número de parasitos
interagindo com a parede interna do ventrículo 4 do intestino médio do inseto. Barra - 10 µm. (B) As setas
indicam a adesão de quantidade maciça de parasitos nas almofadas retais (AR) do inseto. Barra - 10 µm.
84
A
B
Figura 5 - Microscopia eletrônica de varredura mostrando o lúmen do ventrículo 4 e do reto de insetos da
espécie O. fasciatus, nascidos de ovos tratados com hipoclorito de sódio. (A) Micrografia da parede interna do
ventrículo 4, mostrando o brotamento de membranas perimicrovilares (seta) e ausência de parasitos flagelados.
Barra - 10 µm. (B) Micrografia mostrando a ausência de parasitos e o acúmulo de membranas perimicrovilares
na parede retal (setas). Barra - 10 µm.
85
2) Infecção experimental de tomates para cultivo de Phytromonas serpens
Tomates da espécie L. esculentum variedades cerasiforme (tomate cereja),
pyriforme (tomate italiano) e esculentum (tomate salada) foram infectados,
através da inoculação de 10 µl de suspensão contendo 1x105 parasitos em três
diferentes pontos. Os tomates foram incubados a 22oC e, semanalmente (dias 7,
14, 21 e 28, após a inoculação), três tomates de cada variedade foram dissecados
e tiveram suas sementes removidas e lavadas. Os parasitos presentes no lavado
das sementes foram contados e corados em solução de Giemsa, para observação
por MO. As fotos presentes na figura 6 mostram que os flagelados crescidos nas
três variedades de L. esculentum apresentam morfologia típica das formas
promastigotas de P. serpens. Em todas as contagens, os tomates controle, ou
seja, que não receberam o inóculo contendo parasitos, foram processados da
forma descrita anteriormente. Em nenhum dos tomates controle foram
encontrados parasitos flagelados (dados não mostrados).
Os resultados das contagens mostram que no vigésimo primeiro dia de
infecção a concentração de parasitos/mL chegou a 2,1 x 108/mL na variedade
esculentum, enquanto nas variedades cerasiforme e pyriforme o número de
parasitos foi significativamente menor, chegando a 1,1 x 108/mL e 1,1 x 107/mL,
respectivamente (figura 7).
Diante destes resultados, decidimos utilizar tomates da variedade
esculentum para cultivar P. serpens, com o objetivo de infectar os insetos da
espécie O. fasciatus.
86
A
B
C
Figura 6 - Microscopia óptica de parasitos da espécie Phytomonas serpens crescidos em
tomates da espécie Lycopersicon esculentum variedades esculentum (A), cerasiforme (B) e
pyriforme (C), corados em lâmina de vidro através da coloração de Giemsa. Os parasitos
crescidos nas três variedades apresentam morfologia típica das formas promastigotas de P.
serpens. Fotos em aumento de 100x.
350
número de parasitas x 106
300
250
200
variedade pyriforme
variedade cerasiforme
variedade esculentum
150
100
50
0
0
5
10
15
20
25
30
dias após a infecção
Figura 7 - Curva de crescimento de P. serpens em tomates da espécie Lycopersicon
esculentum variedades pyriforme, cerasiforme e esculentum. Para a contagem de parasitos o
volume total de sementes de cada tomate foi recolhido e o número de parasitos/ml do lavado
contado em câmara de Neubauer.
87
3) Infecção experimental de Oncopeltus fasciatus com parasitos da espécie
Phytomonas serpens
Cinqüenta insetos adultos recolhidos da colônia de insetos livres de
tripanossomatídeos foram mantidos na ausência de comida e água por 18 h e,
posteriormente, transferidos para potes plásticos contendo suspensão de
parasitos da espécie P. serpens, crescidos em tomates da variedade esculentum
(1 x 107 parasitos/mL de solução salina). Todos os insetos foram observados se
alimentando da suspensão de parasitos.
Em seguida, nos dias 2, 5, 10 e 25 após a infecção com os parasitos, grupos
de cinco insetos foram dissecados, para a pesquisa de parasitos nos intestinos
médio e posterior, nas fezes, na hemolinfa e nas glândulas salivares. Por meio de
MO, foi observada a presença de parasitos no ventrículo 4 do intestino médio de
todos os insetos dissecados nos dias 2 e 5, fato confirmado por MEV (dados não
mostrados). No entanto, nos dias posteriores não foram observados parasitos em
nenhum dos outros sítios analisados (dados não mostrados). Este experimento
foi repetido outras duas vezes, resultando nas mesmas observações.
Percebendo que as condições utilizadas para a infecção experimental dos
insetos não iriam permitir, em tempo hábil, o estudo da interação in vivo com os
parasitos da espécie P. serpens, decidimos promover a interação in vitro dos
parasitos com as glândulas salivares do inseto, em condições ex vivo.
4) Interação in vitro de Phytomonas serpens com glândulas salivares de
Oncopeltus fasciatus inseto, em condições ex vivo
A MEV de glândulas salivares de O. fasciatus incubadas em suspensão
contendo 1 x 107 parasitos/mL de PBS, a 26oC, por 2 h, mostrou que os
parasitos foram capazes de aderir à face externa das glândulas salivares e que
esta adesão ocorreu tanto pelo corpo celular, quanto pelo flagelo do parasito
88
(figura 8 A). Além disso, foi observado que os parasitos foram capazes de
atravessar, via corpo celular, a membrana basal que reveste externamente as
glândulas salivares de O. fasciatus (figura 8 B-D), e que isto ocorreu por meio
de orifícios, que são formados nesta membrana. Estes orifícios, ausentes em
regiões livres de tripanossomatídeos, foram observados em grande número nos
locais onde os parasitos estavam aderidos (figura 8 B-D).
CC
CC
∗
F
F
B
A
∗ ∗
F
CC
F
F
C
F
D
Figura 8 - Microscopia eletrônica de varredura de glândulas salivares de O. fasciatus incubadas em condições ex
vivo na presença de parasitos da espécie P. serpens, in vitro. (A) Adesão do parasito via corpo celular (CC) e
flagelo (F) à membrana basal que reveste a glândula salivar do inseto. Barra - 5 µm. (B) Parasito penetrando na
membrana basal via corpo celular. Barra - 5 µm. (C) Micrografia mostrando os flagelos de um grupo de
parasitos flagrados durante a invasão das glândulas salivares. Barra - 5 µm. (D) Parasito presente entre a
membrana basal e o epitélio da glândula salivar. Barra - 1 µm. Notar nas figuras B, C e D que a penetração dos
parasitos ocorre em regiões da glândula salivar onde a membrana basal apresenta orifícios (setas). Estes orifícios
não foram observados em regiões livres de parasitos (∗).
89
Levando-se em consideração que a interação de P. serpens com a face
externa das glândulas salivares de O. fasciatus parecia ocorrer de forma
específica, decidimos identificar quais moléculas participavam deste evento.
5) Pesquisa por molécula(s)-alvo para a ligação de Phytomonas serpens às
glândulas salivares de Oncopeltus fasciatus
Sabendo que a interação de parasitos com células e tecidos hospedeiros
pode ser mediada por proteínas de superfície, sejam elas do parasito ou do
hospedeiro, decidimos promover a interação de proteínas de superfície de P.
serpens com proteína presentes nas glândulas salivares de O. fasciatus.
5.1) Perfil de proteínas totais da glândula salivar de Oncopeltus fasciatus
Nas condições utilizadas neste experimento, a eletroforese do extrato
protéico total das glândulas salivares em SDS-PAGE a 10% revelou, após a
coloração com Coomassie brilliant blue, um perfil de aproximadamente 20
bandas de proteínas, com massas moleculares entre 15 e 160 kDa (figura 9).
Figura 9 - SDS-PAGE a 10% do extrato protéico total
de glândulas salivares de O. fasciatus corado com
Coomassie brilliant blue. Os números à esquerda
referem-se às massas moleculares dos padrões de
proteínas expressas em quilodaltons.
90
5.2) Perfil de proteínas totais de Phytomonas serpens
A eletroforese do extrato protéico total de P. serpens em SDS-PAGE a
10%, após coloração com Coomassie brilliant blue, revelou um perfil com cerca
de 30 bandas de proteínas com massas moleculares variando entre 15 e 250 kDa
(figura 10 A).
5.3) Perfil de proteínas de superfície de Phytomonas serpens
Para a observação do perfil de proteínas de superfície de P. serpens,
incubamos os parasitos com biotina, antes da extração de proteínas totais. Após
a transferência das proteínas totais para membrana de nitrocelulose, esta
membrana foi tratada com estreptoavidina conjugada à peroxidase e as proteínas
de superfície foram reveladas com a utilização de kit comercial.
A análise do filme exposto à membrana revelou a biotinilação de pelo
menos 8 polipeptídeos, com massas moleculares variando entre 25 e 100 kDa,
com predomínio de aproximadamente 5 polipeptídeos, com massas moleculares
entre 30 e 55 kDa (figura 10 B). .
5.4) Interação de proteínas de superfície de Phytomonas serpens com
proteínas das glândulas salivares de Oncopeltus fasciatus
No intuito de pesquisar a presença, nas glândulas salivares, de possíveis
ligantes para proteínas de superfície de P. serpens, incubamos membranas de
nitrocelulose, contendo proteínas totais das glândulas salivares, na presença de
proteínas extraídas de parasitos previamente marcados com biotina. Em seguida,
a membrana de nitrocelulose foi incubada com estreptoavidina conjugada à
peroxidase e a presença de ligantes revelada como descrito no item anterior. A
marcação de bandas na membrana revelou a presença de proteínas de superfície
91
do parasito, ligadas à banda de proteína da glândula. Desta forma, foi possível
determinar que no extrato total de glândulas salivares existem pelo menos cinco
polipeptídeos, que são reconhecidos por proteínas de superfície do parasito.
Estes polipeptídeos apresentam massas moleculares aproximadas de 31, 32, 34,
36 e 130 kDa (figura 11 B).
250
160
105
75
50
35
30
15
A
B
Figura 10 - (A) SDS-PAGE 10% do extrato protéico total de P.
serpens corado com Coomassie brilliant blue. (B) Perfil de proteínas de
superfície de P. serpens. Os números à esquerda referem-se às massas
moleculares dos padrões de proteínas expressas em quilodaltons.
5.5) Interação de parasitos vivos com proteínas das glândulas salivares
Numa tentativa de aproximar as condições experimentais das condições
biológicas, decidimos utilizar parasitos vivos marcados em sua superfície com
biotina, para a busca de ligantes presentes nas glândulas salivares. Para isso,
membranas de nitrocelulose, contendo proteínas totais das glândulas salivares,
foram incubadas com os parasitos biotinilados. Com isso, ao contrário do
experimento anterior, foi possível perceber a marcação de uma única banda de
proteína da glândula salivar, com massa molecular aproximada de 130 kDa
92
(p130) (figura 11 A). Este polipeptídeo, reconhecido pelos parasitos vivos,
também foi reconhecido por proteínas de superfície do parasito (figura 11 B).
a
b
c
d
Figura 11 - “Ligand blotting” mostrando a interação de proteínas de superfície de P.serpens e
deste parasito vivo com proteínas das glândulas salivares de O. fasciatus. (A) Proteínas totais
das glândulas salivares de O. fasciatus separadas em SDS-PAGE a 10% e coradas com
Coomassie brilliant blue. Os números à esquerda referem-se às massas moleculares dos
padrões de proteínas, expressas em quilodaltons. (B) Bandas de proteínas das glândulas
salivares reconhecidas por proteínas de superfície de P. serpens. As setas à direita indicam as
bandas de proteína que reagiram mais fortemente com proteínas de superfície de P. serpens.
Os números à direita referem-se as massas moleculares aproximadas das proteínas reativas da
glândula salivar. (C) Banda de proteína das glândulas salivares reconhecida por parsitas vivos
biotinilados. A seta à direita indica a banda de proteína de aproximadamente 130 kDa
reconhecida pelos parasitos. (D) Sistema controle - membrana de nitrocelulose incubada na
ausência de proteínas de superfície de P. serpens e de parasitos biotinilados.
93
Sabendo que as bandas de proteínas separadas através de SDS-PAGE
podem ser compostas por mais de uma proteína, decidimos promover a interação
de parasitos vivos biotinilados com proteínas das glândulas salivares separadas
em gel 2D.
Em um primeiro momento, separamos o extrato protéico total das glândulas
salivares focalizando as proteínas em tiras com pI entre 3-10 (primeira
dimensão). Em seguida, as proteínas foram separadas através de SDS-PAGE a
10% (segunda dimensão). Com isso, observamos que o extrato protéico das
glândulas salivares possui pelo menos quatro polipeptídeos, com pI variando
entre 3-10, na faixa de peso molecular próximo de 130 kDa (figura 12).
1
220
170
2
3
4
116
76
53
pI 3
pI 10
Figura 12 - SDS-PAGE 10% de proteínas totais de glândulas salivares de O. fasciatus,
previamente separadas pelo ponto isoelétrico. Após a coloração das proteínas com Coomassie
brilliant blue, observou-se a presença de “spots” de pelo menos quatro polipeptídeos
(indicados pelos números), na faixa de massa molecular próxima de 130 kDa. Os números à
esquerda referem-se às massas moleculares dos padrões de proteínas expressas em
quilodaltons.
94
Em um segundo momento, na tentativa de separar em diferentes géis os
polipeptídeos com massa molecular próxima de 130 kDa, voltamos a separar o
extrato protéico das glândulas, mas desta vez focalizando as proteínas em tiras
com pI entre 3-6, 6-8 e 8-10. Seguindo a focalização nestas três diferentes tiras,
as proteínas foram separadas por massa molecular em três diferentes géis (SDSPAGE) a 12% (dados não mostrados).
Em um terceiro momento, as proteínas separadas nos três diferentes géis
(SDS-PAGE) foram transferidas para membrana de nitrocelulose e estas
membranas incubadas em suspensão de parasitos vivos biotinilados. Revelando
as três diferentes membranas (dados não mostrados), observamos que os
parasitos reconheceram apenas o polipeptídeo com pI entre 6-8 (figura 13).
6) Identificação do ligante presente na glândula salivar
Após identificar o “spot” do ligante presente na glândula salivar, repetimos
o gel 2D nas mesmas condições utilizadas no experimento onde os parasitos
reconheceram a p130 (figura 13). O “spot” da proteína foi, então, cortado e
digerido in gel com tripsina e submetido à análise por MALDI-TOF
“fingerprint”. Fazendo a busca no banco de dados do NCBI, através do
programa MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu), a proteína da glândula salivar de
O. fasciatus, apresentando pI de 7,1 e massa molecular de 129,5 kDa, foi
identificada como uma proteína semelhante ao precursor da cadeia beta-3 da
laminina-5 humana. Os peptídeos gerados pela tripsinização e analisados por
“fingerprint” cobriram 23% da seqüência de aminoácidos do precursor da cadeia
beta-3 da laminina-5 humana (figura 14).
95
170
116
76
53
A
pI 6
pI 8
170
116
76
53
B
pI 6
pI 8
Figura 13 - Interação de parasitos da espécie P. serpens com o “spot” de uma proteína de 130
kDa e pI entre 6-8 presente nas glândulas salivares de O. fasciatus. (A) SDS-PAGE 12% de
proteínas das glândulas salivares de O. fasciatus, previamente separadas pelo ponto
isoelétrico. Após a coloração das proteínas com Coomassie brilliant blue, observou-se a
presença de um único “spot” (indicado pela seta) na faixa de massa molecular próxima de 130
kDa. (B) “Ligand blot” mostrando a interação de parasitos vivos biotinilados com o “spot” da
proteína de 130 kDa da glândula salivar do inseto. Os números à esquerda referem-se às
massas moleculares dos padrões de proteínas expressas em quilodaltons.
96
MRPFFLLCFALPGLLHAQQACSRGACYPPVGDLLVGRTRFLRASSTCGLTKPETYCTQYGEWQMK
CCKCDSRQPHNYYSHRVENVASSSGPMRWWQSQNDVNPVSLQLDLDRRFQLQEVMMEFQGPMP
AGMLIERSSDFGKTWRVYQYLAADCTSTFPRVRQGRPQSWQDVRCQSLPQRPNARLNGGKVQLNL
MDLVSGIPATQSQKIQEVGEITNLRVNFTRLAPVPQRGYHPPSAYYAVSQLRLQGSCFCHGHADRCA
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EAEELFGETMEMMDRMKDMELELLRGSQAIMLRSADLTGLEKRVEQIRDHINGRVLYYATCK.
Figura 14. Enquadramento dos peptídeos gerados pela digestão tríptica da proteína de 130
kDa sobre a sequência de aminoácidos do precursor da cadeia beta-3 da laminina-5 humana.
As letras em vermelho mostram a sequência de aminoácidos dos peptídeos da proteína da
glândula salivar que foram enquadrados pelo programa MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu),
sobre a sequência de aminoácidos do precursor da cadeia beta-3 da laminina-5 humana.
7) Similaridade antigênica da p130 com a cadeia beta-3 da laminina-5
humana
No intuito de pesquisar uma possível similaridade antigênica entre a p130 e
a cadeia beta-3 da laminina-5 humana, foi realizado um “imunoblotting” das
proteínas da glândula salivar de O. fasciatus, utilizando anticorpo policlonal
produzido contra a cadeia beta-3 da laminina-5 humana (Ac anti-beta-3).
Após a separação do extrato protéico total das glândulas salivares em SDSPAGE a 12%, as proteínas das glândulas foram transferidas para membrana de
nitrocelulose. Esta membrana foi, então, bloqueada e incubada na presença do
Ac anti-beta-3. A revelação da membrana mostrou que o anticorpo monoclonal
utilizado reconheceu especificamente a p130, enquanto o anticorpo secundário
reconheceu uma banda de aproximadamente 75 kDa (figura 15).
97
160
p130
105
75
50
35
30
A
B
C
Figura 15 - “Inumoblotting” mostrando a marcação da proteína de 130 kDa da glândula
salivar de O. fasciatus pelo anticorpo policlonal produzido contra a cadeia beta-3 da laminina5 humana. (A) SDS-PAGE 12% do extrato total das glândulas salivares corado com
Coomassie brilliant blue. Os números à esquerda referem-se às massas moleculares dos
padrões de proteínas, expressas em quilodaltons. (B) “Inumoblotting” mostrando a marcação
de duas bandas de proteínas da glândula salivar pelo anticorpo anti-cadeia beta-3 da laminina5 humana. (C) Controle do experimento onde apenas o anticorpo secundário foi utilizado no
“Inumoblotting”. A seta vermelha indica a marcação da p130. A seta azul indica a marcação
de outra banda apenas pelo anticorpo secundário.
8) Busca do gene da cadeia beta-3 da laminina-5 em Oncopeltus fasciatus
No intuito de caracterizar a presença de regiões homólogas ao gene da
cadeia beta-3 da laminina-5 humana no genoma do O. fasciatus, utilizamos
iniciadores comercias desenhados especificamente para amplificar o gene da
cadeia beta-3 em reações de PCR.
Os resultados deste experimento mostram que os iniciadores foram capazes
de amplificar fragmentos de DNA com aproximadamente 506 pb nos sistemas
contendo (i) DNA extraído de glândulas salivares do O. fasciatus, (ii) DNA total
de ninfas de terceiro estágio e (iii) DNA humano (controle positivo) (figura 16).
98
Fragmentos de 506 pb são indicados pelo fabricante como produtos da
amplificação em reações iniciadas pelo “primer” utilizado.
1500
1000
750
~ 506 pb
500
250
1
2
3
4
5
Figura 16 - Eletroforese em gel de agarose a 1,4% dos produtos de PCR obtidos após
amplificação, utilizando iniciadores específicos para o gene da cadeia beta-3 da laminina-5
humana. O gel foi tratado durante 20 min em brometo de etídio e visualizado em
transiluminador de luz ultra-violeta a 300 nm. 1- Padrão de peso molecular. Os números à
esquerda referem-se aos tamanhos dos fragmentos padrões, expressas em pares de bases. 2DNA extraído de glândulas salivares de O. fasciatus. 3- DNA total extraído de ninfas de O.
fasciatus no terceiro estágio de desenvolvimento. 4- DNA extraído de sangue humano. 5Controle negativo - Todos os componentes do meio de reação ensaiados na ausência de DNA.
99
9) Inibição da interação de Phytomonas serpens com glândulas salivares de
Oncopeltus fasciatus
9.1) Inibição promovida pela p130 purificada
Com o objetivo de avaliar o efeito da proteína p130 na interação dos
parasitos com glândulas salivares do inseto, esta proteína foi purificada (figura
17) e adicionada ao meio de interação entre os parasitos e as glândulas salivares.
Após a incubação, as glândulas foram maceradas em tubos Eppendorf e o
número de parasitos associados (aderidos ou internalizados) às glândulas foi
calculado, após a contagem de células móveis em câmara de Neubauer.
160
p130
105
75
50
35
30
A
B
Figura 17 - SDS-PAGE 8% mostrando o resultado da purificação da proteína de 130
kDa (seta vermelha) presente no extrato protéico total da glândula salivar de O. fasciatus. (A)
Extrato protéico total das glândulas salivares. (B) Produto da purificação da p130. Os
números à esquerda referem-se às massas moleculares dos padrões de proteínas, expressas em
quilodaltons. As proteínas foram coradas com nitrato de prata.
100
Como mostra a figura 18 A, a p130 foi capaz de inibir de forma dosedependente a interação dos parasitos com as glândulas salivares do inseto.
Enquanto na concentração de 2 µg/mL de meio de interação a p130 promoveu
uma inibição de aproximadamente 26% na média de parasitos interagindo com a
glândula, na concentração de 20 µg/mL a inibição chegou a 55%.
9.2) Inibição promovida pela laminina-5 humana
Da mesma forma que a p130, a laminina-5 humana, presente no meio de
incubação, foi capaz de inibir a interação entre os parasitos e as glândulas
salivares de forma dose-dependente. Presente na concentração de 2 µg/mL de
meio de incubação, a laminina-5 foi capaz de inibir a interação diminuindo em
27% a média de parasitos associados por glândula. Na concentração de 20
µg/mL a inibição foi de 48% (figura 18 B).
9.3) Inibição promovida pelo anticorpo anti-cadeia beta-3 da laminina-5
humana
No intuito de avaliar o efeito do Ac anti-beta-3 na interação entre os
parasitos e as glândulas salivares, as glândulas foram previamente tratadas com
este anticorpo nas diluições de 1:100 e 1:500 e, então, adicionadas ao meio de
incubação contendo os paraitos.
Em relação ao sistema controle, no sistema contendo glândulas previamente
tratadas com a diluição de 1:100, foi observada uma redução de 86% na média
de parasitos associados às glândulas. Quando o tratamento prévio das glândulas
foi feito com o Ac anti-beta-3 na diluição de 1:500, a inibição foi menos
acentuada e induziu uma redução de 66% no número de parasitos que
interagiram com as glândulas (figura 18 C).
101
20 µg
55%
2 µg
26%
Controle
20 µg
48%
2 µg
27%
Controle
IgG controle
1:100
1:500
86%
66%
Controle
média do no de parasitas x 103
Figura 18 - Inibição da interação entre parasitos da espécie P. serpens e glândulas salivares
8
do inseto O. faciatus. As glândulas salivares foram incubadas com 10 parasitos, em PBS
contendo 1% de BSA, na presença (A) da p130 purificada nas concentrações de 2 µg e 20 µg
e (B) da laminina-5 humana nas concentrações de 2 µg e 20 µg. (C) Glândulas salivares
previamente tratadas com o Ac anti-beta-3 nas diluições de 1:100 e 1:500 foram incubadas
8
com 10 parasitos, em PBS. As contagens representam a média ± devio padrão do número de
parasitos associados às glândulas.
102
10) Envolvimento de enzimas proteolíticas na interação de Phytomonas
serpens com glândulas salivares de Oncopeltus fasciatus
Ao analisar as micrografias da interação entre os parasitos e a face externa
das glândulas salivares do inseto, percebemos a formação de orifícios na
superfície da glândula, justamente no local onde ocorreu a adesão e penetração
dos parasitos (figura 8). Estes orifícios não foram observados em regiões da
glândula livres de parasitos. Com base nesta observação e sabendo que a
glândula salivar do O. fasciatus é revestida externamente por uma membrana
basal e que a membrana basal de diferentes tecidos é formada majoritariamente
por proteínas, decidimos pesquisar o envolvimento de proteases no processo de
interação de P. serpens com as glândulas salivares de O. fasciatus.
Para pesquisar o envolvimento de proteases extracelulares no processo de
interação, incubamos as glândulas salivares em PBS, na presença dos parasitos.
Após a incubação, o sobrenadante do meio de interação foi recolhido,
centrifugado e a presença de atividade proteolítica avaliada por zimografia.
Neste experimento, os sistemas controle continham (i) parasitos incubados na
ausência das glândulas salivares e (ii) glândulas incubadas na ausência de
parasitos. A análise dos géis nos permitiu observar que o sobrenadante da
interação entre as glândulas e os parasitos apresentou duas bandas com atividade
proteolítica. Estas bandas, com massas moleculares próximas de 63 kDa e
atividade ótima em pH 10,0, não foram observadas nos sistemas controle, como
mostra a figura 19.
No intuito de determinar se estas enzimas proteolíticas estavam sendo
secretadas pelos parasitos ou pelas glândulas salivares, repetimos o experimento
anterior incubando (1) parasitos vivos com glândulas salivares vivas, (2)
parasitos vivos com glândulas salivares previamente fixadas em formaldeido e
(3) glândulas salivares vivas com parasitos previamente fixados em formaldeído.
O resultado da zimografia, mostrado na figura 20, indica que as enzimas
103
proteolíticas com massas moleculares próximas de 63 kDa foram secretadas
pelos parasitos, já que estas atividades foram observadas no sobrenadantes dos
sistema (1) e (2) e não foram detectadas no sobrenadante do sistema (3).
pH 10,0
pH 7,2
pH 5,5
66,2
45
35
18,4
14,4
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Figura 19. Zimograma mostrando as atividades proteolíticas presentes no sobrenadante da
interação de P. serpens com glândulas salivares do inseto O. fasciatus. Após a incubação das
glândulas na presença dos parasitos (1), glândulas na ausência de parasitos (2) e parasitos na
ausência das glândulas (3), o sobrenadante do meio de incubação foi recolhido e aplicado em
SDS-PAGE-gelatina. Os géis foram incubados em tampão glicina pH 10,0, tampão PBS pH
7,2 e tampão fosfato pH 5,5 suplementado com 2 mM de DTT, por 48 h a 37ºC. Os números à
esquerda indicam a massa molecular dos padrões de proteínas. As setas vermelhas indicam as
enzimas detectadas apenas no sobrenadante da interação. As setas azuis indicam as enzimas
secretadas pelas glândulas salivares na presença ou na ausência dos parasitos.
104
66,2
45
35
18,4
14,4
1
2
3
Figura 20. Zimograma mostrando as atividades proteolíticas presentes no sobrenadante da
interação de P. serpens com glândulas salivares do inseto O. fasciatus. (1) Parasitos vivos
incubados na presença das glândulas salivares vivas. (2) Glândulas salivares, previamente
fixadas em formaldeído a 4%, incubadas na presença de parasitos vivos. (3) Parasitos,
previamente fixados em formaldeido a 4%, incubados na presença de glândulas salivares
vivas. O sobrenadante do meio de incubação foi recolhido e aplicado em SDS-PAGEgelatina. Os géis foram incubados em tampão glicina pH 10,0, por 48 h a 37ºC. Os números à
esquerda indicam a massa molecular dos padrões de proteínas. As setas vermelhas indicam as
enzimas detectadas apenas no sobrenadante da interação. As setas azuis indicam as enzimas
secretadas pelas glândulas salivares na presença de parasitos vivos ou previamente fixados.
10.1) Determinação da classe da enzima proteolítica liberada pelo parasito
no meio de interação
Para determinar a classe proteolítica da enzima liberada pelos parasitos
durante a interação com as glândulas salivares do inseto, o sobrenadante do
meio de interação foi aplicado em SDS-PAGE-gelatina e, posteriormente,
incubado na presença dos íons Zn2+ e Ca2+, do quelante de íons EDTA e de
inibidores proteolíticos 1,10-Fenantrolina, E-64 e PMSF (figura 21). A análise
do resultado deste experimento nos permitiu constatar que as enzimas
proteolíticas liberadas pelo parasito para o meio de interação são da classe das
metalo-proteases, já que foram moduladas negativamente por um inibidor
105
específico desta classe (1,10-Fenantrolina) e por um quelante de íons metálicos
(EDTA) e moduladas positivamente pelos íons Ca2+ e Zn2+. Além disso, a
atividade proteolítica não foi influenciada pelos inibidores de cisteína- (E-64) e
serina-proteases (PMSF). Como mostrado na figura 19, entre os valores de pH
testados, o que permitiu uma atividade mais acentuada foi o pH 10,0.
66,2
SF
PM
E64
TA
Fe
na
nt
ro
lin
a
ED
Ca
Cl
2
2
Zn
Cl
co
nt
ro
le
45
Figura 21. Perfil de atividade da enzima proteolítica liberada por P. serpens durante a
interação com as glândulas salivares de O. fasciatsu. O sobrenadante da interação foi aplicado
em SDS-PAGE-gelatina e incubado em tampão glicina pH 10,0, por 48 h a 37ºC, na ausência
(controle) e na presença dos íons Zn2+ (ZnCl2 2 mM) e Ca2+ (CaCl2 5 mM), do quelante de
íons EDTA (5 mM) e dos inibidores proteolíticos 1,10-Fenantrolina (10 mM), E-64 (10 µM) e
PMSF (1 mM). Os números à esquerda indicam a massa molecular dos padrões de proteínas.
106
10.2) Possível envolvimento da cisteína-protease do parasito na interação
com as glândulas salivares do inseto
Em um dos experimentos, onde procurávamos estabelecer as condições
ideais para determinar a procedência da metalo-protease liberada para o meio de
interação, um fato curioso nos chamou atenção. Quando utilizamos parasitos
inativados pelo congelamento num sistema de interação com glândulas vivas,
percebemos que duas enzimas proteolíticas, que são secretadas pelas glândulas
no meio de incubação, tiveram sua atividade completamente inibida em tampão
glicina (pH 10,0). A duplicata do gel, que foi incubada em tampão fosfato (pH
5,5), revelou a atividade de uma cisteína-protease de P. serpens de
aproximadamente 40 kDa, no mesmo sistema onde a atividade da protease da
glândula havia sido inibida (figura 22). Neste experimento, foi possível
observar, descorando o SDS-PAGE, que a cisteína-protease de P. serpens foi
capaz de degradar as proteases secretadas pela glândula salivar (figura 22 C).
Recentemente, foi sugerida a importância desta cisteína-protease de P.
serpens no processo de interação com glândulas salivares de O. fasciatus
(Santos et al., 2006 - ANEXO 5).
107
A
B
C
66,2
45
35
14,4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Figura 22. Inibição de proteases da glândula salivar liberadas no meio de incubação
promovida pela cisteína-protease de P. serpens. 1- Glândulas salivares incubadas na ausência
de parasitos. 2- Glândulas salivares incubadas na presença de parasitos inativados pelo
congelamento. 3- Glândulas salivares incubadas na presença de parasitos inativados a 60oC.
4- Glândulas salivares incubadas na presença de parasitos fixados com formaldeído a 4oC. (A)
SDS-PAGE-gelatina incubado em tampão glicina pH 10,0, por 48 h a 37ºC. (B) SDS-PAGEgelatina incubado em tampão fosfato pH 5,5, por 48 h a 37ºC. (C) Mesmo gel do quadro B
descorado para a visualização das bandas de proteínas. Notar, no sistema 2 do quadro C, a
ausência das bandas referentes às proteases da glândula (setas azuis), que foram
provavelmente degradadas pela cisteína-protease de P. serpens (seta vermelha). Os números à
esquerda indicam a massa molecular dos padrões de proteínas.
10.3) Caracterização da atividade proteolítica liberada pela glândula
salivar no meio de interação
Como pode ser observado na figura 19, as glândulas salivares de O.
fasciatus secretam para o meio de incubação, na presença ou na ausência de
parasitos, pelo menos cinco proteases com atividade em pH 10,0.
Durante os nossos experimentos, observamos que das cinco proteases
observadas no zimograma da figura 19, duas com massas moleculares entre 14
e 18 kDa, podem ser a mesma enzima, com modificações que alteram a sua
massa molecular como, por exemplo, a perda de um grupamento glicídico. Esta
enzima de massa entre 14 e 18 kDa, dentre as cinco proteases detectadas no
sobrenadante da glândula, foi a única detectada em todos os experimentos
realizados por nós.
Como já foi demonstrado, a liberação da protease de 14-18 kDa da glândula
salivar para o meio de incubação ocorre na presença ou na ausência dos
108
parasitos. No entanto, observamos, que na presença dos parasitos, a liberação
desta protease parece ser mais acentuada, como mostra a figura 23.
45
35
18,4
14,4
1
2
A
1
2
B
Figura 23. Modulação da secreção da protease de 14-18 kDa da glândula salivar mediada por
P. serpens. (A) SDS-PAGE a 10% do sobrenadante de glândulas salivares incubadas na
ausência (1) e na presença de P. serpens (2) por 2 h em PBS. Glândulas salivares incubadas
na ausência de parasitos. Notar a expressão mais acentuada de um polipeptídeo entre 14 e 18
kDa (seta azul) quando na presença dos parasitos. (B) Zimograma do sobrenadante de
glândulas salivares incubadas na ausência (1) e na presença de P. serpens (2) por 2 h em PBS.
Notar a atividade mais acentuada de um polipeptídeo entre 14 e 18 kDa (seta azul) quando na
presença dos parasitos. O SDS-PAGE-gelatina a 10% foi incubado em tampão glicina pH
10,0, por 48 h a 37ºC. Os números à esquerda indicam a massa molecular dos padrões de
proteínas.
a) Determinação do sítio de atividade da protease de 14-18 kDa da glândula
salivar
Sabendo que as glândulas salivares liberam a protease de 14-18 kDa na
presença ou na ausência de parasitos, no intuito de determinar o sitio de
atividade e o curso temporal da expressão desta protease, incubamos glândulas
salivares em PBS, a 26oC, por 10 min ou 2 h. No final de cada período de
109
incubação, recolhemos o sobrenadante e fizemos o extrato protéico total das
glândulas salivares incubadas. Os sobrenadantes e os extratos protéicos das
glândulas incubadas nos dois diferentes períodos de tempo foram analisados por
zimografia. A revelação do zimograma (figura 24) nos permitiu observar que a
atividade da protease da glândula foi detectada exclusivamente no sobrenadante
da incubação, não sendo observada no extrato protéico total das glândulas, que
contém proteínas celulares e da saliva. Com isso, podemos observar que esta
protease é secretada pelas células da glândula exclusivamente para o meio de
incubação e não para a saliva.
Neste experimento, observamos também que a expressão e liberação da
protease para o meio de incubação ocorreram de forma tempo-dependente, já
que sua atividade, ausente no sobrenadante de glândulas incubadas por 10 min,
foi detectada no sobrenadante da incubação quando as glândulas foram
incubadas por 2 h (figura 24).
110
45
35
18,4
14,4
1
2
3
4
Figura 24. Zimograma determinando o sítio de atividade e o curso temporal de expressão da
protease de 14-18 kDa da glândula salivar de O. fasciatus. (1) Extrato protéico total de
glândulas salivares incubadas em PBS, a 26oC, por 10 min. (2) Extrato protéico total de
glândulas salivares incubadas em PBS, a 26oC, por 2 h. (3) Sobrenadante de glândulas
salivares incubadas em PBS, a 26oC, por 10 min. (4) Sobrenadante de glândulas salivares
incubadas em PBS, a 26oC, por por 2 h. Notar a atividade da protease de 14 e 18 kDa (seta
azul) somente no sitema 4. O SDS-PAGE-gelatina a 10% foi incubado em tampão glicina pH
10,0, por 48 h a 37ºC. Os números à esquerda indicam a massa molecular dos padrões de
proteínas.
b) Determinação da classe da enzima proteolítica liberada pela glândula
salivar no meio de interação
Sabendo que as glândulas salivares liberam a protease de 14-18 kDa na
presença ou na ausência de parasitos e que esta enzima é secretada de forma
tempo-dependente, incubamos glândulas salivares em PBS, a 26oC, por 2 h na
ausência de parasitos. Para determinar a classe da enzima proteolítica liberada
pelas glândulas salivares do inseto, o sobrenadante do meio de interação foi
aplicado em SDS-PAGE-gelatina e, posteriormente, incubado na presença dos
íons Zn2+ e Ca2+, do quelante de íons EDTA e de inibidores proteolíticos 1,10Fenantrolina, E-64 e PMSF (figura 25). A análise do resultado deste
experimento nos permitiu constatar que a protease de 14-18 kDa, liberada pela
glândula salivar para o meio de interação, é da classe das metalo-proteases, já
111
que foi modulada negativamente por um inibidor específico desta classe (1,10Fenantrolina) e por um quelante de íons metálicos (EDTA), além de modulada
positivamente pelos íons Ca2+ e Zn2+. Além disso, a atividade proteolítica não
foi influenciada pelos inibidores de cisteína- (E-64) e serina-proteases (PMSF).
Como mostrado na figura 19, entre os valores de pH testados, o que permitiu
uma atividade mais acentuada foi o pH 10,0.
O aumento acentuado da atividade da protease da glândula na presença de
íons Zn2+, em conjunto com a inibição exercida pelo quelante de íons e pela
1,10-Fenantrolina (inibidor de metalo-proteases), sugerem que esta enzima é
uma metalo proteinase de membrana basal (MMP).
18,4
SF
PM
E64
tro
lin
a
an
TA
ED
Fe
n
Z
Ca
Cl nCl
2
2 +
Zn
Cl
2
Ca
Cl
2
co
nt
ro
le
14,4
Figura 25. Perfil de atividade da enzima proteolítica liberada pelas glândulas salivares de O.
fasciatus durante a interação com P. serpens. O sobrenadante das glândulas salivares foi
aplicado em SDS-PAGE-gelatina e incubado em tampão glicina pH 10,0, por 48 h a 37ºC, na
ausência (controle) e na presença dos íons Ca2+ (CaCl2 5 mM) e Zn2+ (ZnCl2 2 mM), do
quelante de íons EDTA (5 mM) e dos inibidores proteolíticos 1,10-Fenantrolina (10 mM), E64 (10 µM) e PMSF (1 mM). Os números à esquerda indicam a massa molecular dos padrões
de proteínas.
112
DISCUSSÃO
113
Passados quase cem anos da descoberta de que tripanossomatídeos
infectam plantas (Lafont, 1909), analisando a literatura científica, é notável
observar que, enquanto a quantidade de estudos descrevendo o isolamento de
espécies de Phytomonas e os danos causados às plantas é de certa forma
abundante, os mecanismos envolvidos na interação destes parasitos com estes
insetos ainda permanecem pouco estudados e, portanto, pouco entendidos.
Dois dos raros exemplos de estudos bem descritivos acerca do ciclo
biológico de tripanossomatídeos parasitas de plantas são aqueles publicados por
McGhee e Hanson (1964) e Jankevicius e colaboradores (1989). Em 1964,
McGhee e Hanson descreveram o ciclo de Phytomonas elmassiani em seu inseto
vetor, o hemíptero fitófago Oncopeltus fasciatus, enquanto, em 1989,
Jankevicius e colaboradores caracterizaram todo o ciclo biológico da
Phytomonas serpens, um parasita de tomate transmitido pelos hemípteros Phthia
picta e Nezara viridula.
A invasão das glândulas salivares dos insetos vetores é, certamente, uma
etapa importante dentro do ciclo biológico das espécies de Phytomonas. Assim,
o aumento do conhecimento a respeito deste processo pode permitir o
desenvolvimento de estratégias para o controle de parasitoses causadas por estes
tripanossomatídeos.
No início do nosso trabalho, tínhamos como meta estabelecer, de forma
experimental, a infecção de insetos da espécie O. fasciatus com parasitos da
espécie P. serpens, com o objetivo de estudar mais pontualmente a interação
deste parasito com as glândulas salivares do inseto hospedeiro. A escolha do
inseto O. fasciatus como hospedeiro experimental foi baseada (i) no fato de que
este hemíptero é hospedeiro natural de diferentes espécies de tripanossomatídeos
(Hanson & McGhee, 1961; Mcghee & Hanson, 1962; Romeiro et al., 2000),
dentre elas P. elmassiani (Holmes, 1925; McGhee & Hanson, 1964) e (ii) na
reconhecida capacidade deste hemíptero em contrair infecção experimental por
tripanossomatídeos isolados de outros insetos (Hanson & Mcghee, 1963)
114
A partir de exemplares cedidos pelo Dr. Alexandre Romeiro (Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ), estabelecemos uma nova colônia de
insetos da espécie O. fasciatus em nosso laboratório (colônia parental). Sabendo
que esta colônia era composta por insetos, em sua totalidade, infectados com
tripanossomatídeos monoxênicos da espécie L. wallacei (Romeiro et al., 2000),
procuramos
obter
uma
colônia
formada
por
insetos
livres
destes
tripanossomatídeos. Com este intuito, colhemos ovos na colônia parental, que
foram separados em três grupos e incubados até a eclosão em diferentes potes
tratados em hipoclorito de sódio. Após a eclosão, nos primeiros dias de vida, as
ninfas se alimentaram dos restos dos ovos eclodidos, mesmo na presença de
sementes de girassol. Ao analisar o conteúdo intestinal das ninfas por meio de
MO (figura 3) percebemos que, independentemente do grupo analisado, parte
das ninfas encontravam-se infectadas por L. wallacei.
Nos três grupos, a média de ninfas infectadas com L. wallacei variou entre
31,1 e 47,8% (Tabela 4). Curiosamente, a análise do conteúdo intestinal de
insetos adultos mostrou que a totalidade dos insetos estava infectada com os
parasitos (Tabela 4). Como observado por McGhee e Hanson (1962), ninfas de
O. fasciatus no terceiro estágio já apresentam grande quantidade de parasitos da
espécie L. oncopelti em seu trato intestinal, mas não os liberam através das
fezes, ao contrário do que acontece nos insetos adultos. Sabendo que hemípteros
fitófagos apresentam o hábito da coprofagia e que as fezes contendo formas
promastigotas e císticas do parasito são certamente uma via de transmissão deste
parasito entre os insetos, o comportamento diferenciado entre ninfas e adultos,
observado por McGhee e Hanson (1962), pode ser uma explicação para o fato de
que, nos três grupos, nem todas as ninfas encontravam-se infectadas (Tabela 4),
enquanto que na fase adulta, todos os insetos pesquisados mostraram-se
infectados (Tabela 5).
O fato de encontrarmos parasitos da espécie L. wallacei em uma
porcentagem das ninfas nascidas em potes plásticos, livres de microrganismos,
115
pelo tratamento com hipoclorito de sódio, nos surpreendeu. No entanto, a
transmissão hereditária ou vertical de tripanossomatídeos do gênero Leptomonas
em insetos hospedeiros, embora não muito aceita, foi postulada por Rodhain
(1962). Diante destes resultados e sabendo que a espécie L. wallacei é capaz de
produzir formas císticas, decidimos investigar a possibilidade dos ovos
recolhidos na colônia parental conterem cistos de L. wallacei.
Ao analisar, por meio de MEV, a superfície externa de ovos colhidos na
colônia parental (Figura 2), observamos a presença de cistos característicos de
L. wallacei mostrando forma ovóide, com cerca de 3 µm de comprimento ao
longo do seu eixo longitudinal e invaginação característica de bolsa flagelar
(Romeiro et al, 2000; Romeiro, 2001). Ao contrário do observado por Romeiro
e colaboradores (2000), em nenhuma de nossas micrografias foi possível
visualizar a presença de flagelo residual, apresentado por parte das formas
císticas de L. wallacei.
Na mesma amostra de fezes frescas de O. fasciatus colhidas na colônia
parental foi possível observar por MEV a presença de formas promastigotas
viáveis, formas promastigotas apresentando poros na membrana citoplasmática e
formas císticas de L. wallacei (figura 1). Em uma das micrografias, foi possível
observar a presença de formas císticas, com textura e relevo normais de uma
célula viável, ainda ligadas à célula parental, a qual apresentou inúmeros poros
em sua membrana celular (figura 1 C). Este fato sugere a importância dos cistos
como forma de resistência contra a dessecação e nos levou a propor a hipótese
de que, durante ou após a oviposição, ocorre a contaminação dos ovos com as
formas císticas presentes nas fezes dos insetos, sendo os cistos, portanto, as
fontes de infecção para ninfas recém eclodidas.
Para comprovar a nossa hipótese, decidimos promover a assepsia dos ovos
recolhidos na colônia parental, através do tratamento com hipoclorito de sódio.
Seguindo este tratamento, os ovos incubados em potes plásticos, também
submetidos ao tratamento com hipoclorito de sódio, deram origem a ninfas
116
livres de flagelados. Em nenhum dos insetos analisados (ninfas ou adultos) por
MO foram observados flagelados parasitando os tubos digestivos (figura 3).
Sabendo que os intestinos médio e posterior de O. fasciatus são os sítios de
maior concentração de parasitos da espécie L. wallacei (Romeiro et al, 2003) e
com o objetivo de confirmar a ausência de parasitos em insetos nascidos de ovos
tratados com hipoclorito de sódio, decidimos analisar, por meio de MEV, os
tubos digestivos destes insetos, comparando com os tubos digestivos de insetos
recolhidos na colônia contaminada com L. wallacei. As micrografias dos
intestinos médio e posterior dos insetos colhidos na colônia infectada mostraram
a presença de grande número de parasitos aderidos na parede interna do V4
(figura 4 A) e nas almofadas retais (figura 4 B). Em contrapartida, as
micrografias de insetos nascidos de ovos tratados mostraram ausência de
parasitos, seja no intestino médio (figura 5 A), seja no intestino posterior
(figura 5 B).
Assim, demonstramos que a transmissão de L. wallacei pode ocorrer de
forma vertical, através das formas císticas presentes nas fezes de insetos adultos,
que contaminam a parede externa dos ovos. Nos primeiros dias de vida, quando
as ninfas apresentam o hábito de se alimentar dos restos dos ovos eclodidos,
ingerem os cistos, contraindo a infecção por este parasito.
Os insetos nascidos dos ovos tratados com hipoclorito de sódio formaram
uma nova colônia, que vem sendo mantida pelo nosso grupo. Periodicamente,
alguns insetos são colhidos nesta colônia e analisados para a pesquisa de
flagelados em seu conteúdo intestinal. Estando, atualmente, na vigésima quinta
geração, em nenhum momento foi observada a presença de insetos parasitados
nesta colônia.
No
intuito
de
infectar
experimentalmente
os
insetos
livres
de
tripanossomatídeos com parasitos da espécie P. serpens, alimentamos os insetos
com suspensões de parasitos, por diversas vezes e de diversas formas, não
obtendo êxito em nenhuma delas (dados não mostrados).
117
Com o objetivo de aproximar as condições utilizadas no nosso estudo
daquelas descritas por Jankevicius e colaboradores (1989), quando observaram o
ciclo biológico da P. serpens, decidimos cultivar os parasitos em tomates da
espécie Lycopersicon esculentum, em uma tentativa de obter parasitos com
capacidade de estabelecer a infecção em O. fasciatus.
Em um primeiro momento, infectamos diferentes variedades de tomates da
espécie L. esculentum, com a finalidade de analisar a curva de crescimento
destes parasitos nos frutos e de determinar em qual das variedades obteríamos o
maior número de parasitos, para a infecção dos insetos. Das variedades testadas
(cerasiforme, pyriforme e esculentum), a que apresentou maior título de infecção
foi a variedade esculentum, da qual conseguimos extrair, no vigésimo dia de
infecção dos tomates, cerca de 2,1 x 108 parasitos/mL de sementes (figura 7).
Este resultado sugere que P. serpens, caso tenha a capacidade de causar
prejuízos a produtores de tomates, este prejuízo pode se apresentar em diferentes
níveis, dependendo da espécie e da variedade de tomate cultivada.
Diante dos resultados obtidos com a infecção dos tomates, decidimos
utilizar tomates da variedade esculentum para cultivar P. serpens, com o
objetivo de infectar os insetos da espécie O. fasciatus.
Verificando que os insetos, mesmo em períodos prolongados de jejum, não
se alimentavam em tomates infectados, na tentativa de infectar os insetos com P.
serpens, extraímos estes parasitos de tomates da variedade esculentum no
vigésimo dia de incubação. Em seguida, uma suspensão destes parasitos, na
concentração de 1 x 107 células/mL de solução salina, foi oferecida a insetos
mantidos na ausência de água e comida por 18 h. Todos os insetos foram
observados se alimentando da suspensão de parasitos.
Nos dias 2 e 5 após a alimentação dos insetos na suspensão de parasitos,
alguns insetos foram dissecados, para pesquisar a presença de parasitos nos
intestinos médio e posterior, nas fezes, hemolinfa e nas glândulas salivares.
Nestes insetos, foi possível observar, por MO e MEV, a presença de flagelados
118
no V4 do intestino médio. No entanto, em todos os insetos dissecados nos dias
posteriores não foi observada a presença de parasitos, seja nos intestinos médio
ou posterior, nas fezes, hemolinfa ou nas glândulas salivares (dados não
mostrados).
A presença de P. serpens colonizando o V4 do intestino médio de O.
fasciatus nos dias 2 e 5 posteriores à infecção nos deixou esperançosos, visto
que este local foi descrito por McGhee e Hanson (1964) como único sítio
intestinal onde ocorre a colonização por P. elmassiani no hospedeiro O.
fasciatus.
Nas condições utilizadas no presente estudo não obtivemos êxito na
tentativa de estabelecer a infecção de O. faciatus com P. serpens. No entento,
acreditamos ainda que este inseto possa ser um bom modelo para reproduzir o
ciclo biológico de diferentes espécies de Phytomonas, em especial a P. serpens,
já que os dados preliminares do nosso grupo indicam que este parasito, ao
contrário da L. wallacei, não promove a ativação da resposta imunológica de O.
fasciatus in vitro e quando injetado na hemocele deste inseto é capaz estabelecer
a infecção (dados não mostrados).
Percebendo que as condições utilizadas para a infecção experimental dos
insetos não iriam permitir o estudo da interação in vivo com os parasitos da
espécie P. serpens, decidimos promover a interação in vitro dos parasitos com as
glândulas salivares do inseto O. fasciatus, em condições ex vivo. Para isso,
glândulas salivares extraídas dos insetos foram incubadas na presença de
suspensão de parasitos a 26oC, por 2 h.
A MEV das glândulas incubadas na presença de P. serpens sugere que este
parasito é capaz de aderir à membrana basal que reveste este órgão, tanto pelo
corpo celular, quanto pelo flagelo (figura 8 A). Na interação de
tripanossomatídeos com seus hospedeiros, quase sempre são observados
mecanismos de adesão do flagelo com os tecidos do hospedeiros (Brooker,
1971; Schaub & Schnitker, 1988; Tieszen, Molyneux & Abdel-Hafez, 1989;
119
Jensen, Schaub & Molineux, 1990; Moraes et al., 1994). Em contrapartida, a
adesão via corpo celular é raramente observada (Romeiro, 1997; Romerio et al.,
2000).
O perfil de interação de P. serpens com glândulas salivares de O. fasciatus
mostrou-se muito semelhante ao observado por Meirelles e colaboradores
(2005), para a interação entre Trypanosoma rangeli e glândulas salivares do
hemíptero hematófago Rhodnius domesticus. No entanto, enquanto para T.
rangeli foi descrito que a invasão da membrana basal ocorre via flagelo, no
presente estudo foi observado que a invasão de P. serpens ocorre via corpo
celular (figura 8 B). Na figura 8 (C e D) podemos observar que alguns
parasitos foram detectados com o corpo celular já inserido no espaço entre a
lâmina basal e o epitélio da glândula, embora ainda mantendo os flagelos livres
no meio de incubação.
Diversos estudos têm revelado a afinidade de moléculas presentes na
superfície de tripanossomatideos por diferentes componentes de matriz
extracelular de tecidos hospedeiros (Okolo et al., 1990; Love, Esko & Mosser,
1993; Lira, Rosales-Encina & Arguelo, 1997; Bandyopadhyay et al., 2003; Nde
et al., 2006). A presença de receptores de superfície de P. serpens para
moléculas da membrana basal de glândulas salivares pode conferir um tropismo
específico para estes órgãos, o que teria grande importância para o
estabelecimento da infecção das glândulas e a continuidade do ciclo biológico
do parasito, uma vez que ao ultrapassar a parede intestinal de insetos, esse
microrganismo usa como veículo de transporte a hemolinfa (McGhee & Hanson,
1964; Jankevicius, 1992), que banha as glândulas, mas, também, todos os outros
órgãos do inseto.
Na tentativa de identificar proteínas-alvo para a ligação de P. serpens nas
glândulas salivares de O. fasciatus desenvolvemos e publicamos uma nova
técnica na qual parasitos vivos, apresentando proteínas de superfície
biotiniladas, são incubados na presença de membranas de nitrocelulose,
120
contendo proteínas do tecido hospedeiro, no intuito de se detectar entre estas
proteínas quais são os possíveis ligantes para os parasitos (Dias et al., 2007 ANEXO 1).
Seguindo o protocolo sugerido por Altin & Pagler (1995), observamos a
biotinilação de cerca de oito proteínas de superfície de P. serpens, com massas
moleculares variando entre 25 e 100 kDa (figura 10 A). Estas proteínas
biotiniladas foram capazes de reconhecer, através de “ligand blotting”, cerca de
cinco polipeptídeos apresentando massas moleculares aproximadas de 31, 32,
34, 36 e 130 kDa (figura 11 B).
Seguindo a técnica por nós descrita (Dias et al., 2007 - ANEXO 1),
observamos que os parasitos biotinilados reconheceram, entre as cinco bandas
reconhecidas pelas proteínas de superfície (figura 11 B), apenas uma, com
massa molecular aproximada de 130 kDa (figura 11 A).
Para determinar se esta banda de 130 kDa era composta por uma ou mais
proteínas da glândula salivar, separamos as proteínas totais das glândulas
salivares em gel 2D. Desta forma, pudemos notar que a banda de 130 kDa,
reconhecida pelos parasitos vivos, era composta por pelo menos quatro
polipeptídeos distintos, com pIs variando entre 3-10 (figura 12). Restava, então,
determinar qual dos quatro polipeptídeos era reconhecido pelos parasitos.
Repetimos, então, o gel 2D e, após transferir os “spots” de proteína para
membranas de nitrocelulose, incubamos estas membranas com parasitos
biotinilados. Estes parasitos reconheceram o “spot” que apresentava pI entre 6 e
8, que foi recortado do gel 2D e utilizado para a espectrometria de massa,
através de MALDI-TOF “fingerprint”, no intuito de identificar este possível
ligante.
Utilizando o programa MS-Fit, fizemos uma busca por proteínas
semellhantes no banco de dados do NCBI e, desta forma, identificamos a p130
da glândula salivar como uma proteína semelhante à cadeia beta-3 da laminina-5
humana, já que o “MOWSE score” desta proteína candidata foi superior a 104 e
121
100 vezes maior que o “MOWSE score” da segunda proteína candidata. Além
disso, os peptídeos gerados pela digestão tríptica da p130 e analisados por
“fingerprint” cobriram 23% da seqüência de aminoácidos desta proteína (figura
14). Através de “imunobloting”, onde foram utilizados anticorpos epecíficos
para a cadeia beta-3, foi demonstrado que a p130 apresentou similaridade
antigênica com a cadeia beta-3 da laminina-5 humana (figura 15).
Para pesquisar, em insetos da espécie O. fasciatus, a presença de seqüências
de nucleotídeos análogas à seqüência do gene beta-3 da laminina-5 humana,
extraímos DNA total de glândulas salivares e de ninfas de terceiro estágio e
utilizamos este DNA como molde para reação de PCR, onde foram utilizados
oligonucleotídeos iniciadores desenhados especificamente para o gene da cadeia
beta-3 de humanos. Após a reação, os produtos foram separados em gel de
agarose, que mostrou a presença de fragmentos de DNA, com aproximadamente
506 pb, tanto nos sistemas contendo DNA de O. fasciatus, quanto no sistema
controle, onde foi utilizado DNA humano como molde para a reação de PCR
(figura 16). Fragmentos de DNA com 506 pb são indicados pelo fabricante dos
oligonucleotideos utilizados como do tamanho dos produtos amplificados por
PCR.
A cadeia beta-3 da laminina, que já recebeu a denominação de cadeia beta1k (Gerecke et al., 1994) e kalinina beta-1 (Utani et al., 1995), já foi identificada
em humanos e em camundongos. Enquanto em humanos esta proteína mostra-se
presente na junção entre a derme e a epiderme, mediando a adesão do epitélio à
membrana basal (Rousselle et al., 1991), em camundongos, além de se mostrar
presente neste mesmo sítio, também já é encontrada na membrana basal da
mucosa oral, da orofaringe e dos brônquios (Utani et al., 1995). Tanto em
humanos, quanto em camundongos, esta proteína, após ser secretada pelas
células produtoras, reage com as proteínas que formam as cadeias alfa-3 e gama2, para formar a proteína trimérica, a laminina-5 (Rousselle et al., 1991; Utani et
al., 1995; revisto por Colognato & Yurchenco, 2000).
122
Análogos da cadeia beta-3 ainda não foram descritos em insetos. No
entanto, análogos de outras cadeias foram descritos em Drosophila
melanogaster, onde fazem parte de membranas basais de diversos tecidos
(revisto por Colognato & Yurchenco, 2000). Neste inseto, foi visto que uma
proteína análoga da cadeia alfa-5 da laminina tem importante função na
formação do sistema nervoso do embrião (Garcia-Alonso, Fetter & Goodman,
1996). Ainda neste díptero, proteínas análogas das cadeias alfa-1 e alfa-2 foram
detectadas, respectivamente, nas membranas basais do epitélio intestinal e do
tecido muscular (Martin et al., 1999).
Uma série de estudos demonstraram a importância de uma proteína análoga
à cadeia gama-1 da laminina na interação de protozoários parasitas do gênero
Plasmodium com o intestino de insetos vetores do gênero Anopheles. Esta
proteína, que compõe a membrana basal que reveste a face do intestino voltada
para a hemocele, é reconhecida por diferentes proteínas presentes na superfície
dos parasitos (Vlachou et al., 2001; Arrighi & Hurd, 2002; Dessens et al., 2003).
O silenciamento do gene da cadeia gama-1 em Anopheles gambiae provocou
uma drástica redução da invasão do intestino pelos protozoários da espécie
Plasmodium berghei (Arrighi et al., 2005).
Sabidamente, os tripanossomatídeos da espécie Trypanosoma cruzi
(Giordano et al., 1994; 1999) e L. donovani (Ghosh et al., 1996;
Bandyopadhyay et al., 2003) utilizam receptores específicos para laminina,
presentes em sua membrana citoplasmática, para se ligar em células ou na
matriz extracelular de tecidos hospedeiros. Em 1994, Giordano e colaboradores
demonstraram que anticorpos anti-laminina podem inibir a invasão in vitro de T.
cruzi em células de mamíferos, mostrando que a laminina é uma proteína com
provável importância na interação deste parasito com o hospedeiro vertebrado.
No presente estudo, já sabendo que a proteína da glândula salivar de O.
fasciatus reconhecida por P. serpens possuía seqüência peptídica e antígenos
semelhantes aos da cadeia beta-3 da laminina-5 humana (figura 14 e 15),
123
decidimos testar o efeito do tratamento prévio das glândulas salivares com
anticorpos produzidos contra a cadeia beta-3 da laminina sobre o índice de
associação de P. serpens com este órgão. Este tratamento das glândulas foi
capaz de reduzir acentuadamente a média de parasitos associados às glândulas.
Além disso, foi demonstrado que o perfil de inibição da interação deste parasito
com as glândulas salivares, promovida pelas proteínas laminina-5 e p130, em
concentrações equivalentes, é bastante semelhante e dose-dependente (figura
18). Desta forma, com base nas evidências descritas, podemos sugerir que a
molécula-alvo para a ligação dos parasitos da espécie P. serpens às glândulas
salivares do inseto O. fasciatus é a p130, uma proteína homóloga à cadeia beta-3
da laminina.
Através da MEV das glândulas salivares de O. fasciatus, incubadas na
presença de P. serpens, observamos que, seguindo a adesão do parasito na face
externa deste órgão, ocorre a invasão da membrana basal que reveste o epitélio
(figura 8). Ao analisar as micrografias da interação, percebemos a presença de
orifícios na membrana basal, justamente no local onde ocorreu a adesão e
penetração dos parasitos. Estes orifícios não foram observados em regiões da
glândula livres de parasitos (figura 8 B e C). De forma semelhante, Meirelles e
colaboradores (2005), estudando a interação de T. rangeli com glândulas
salivares do hemíptero hematófago R. domesticus, observaram parasitos
interagindo individualmente ou em grupos em regiões da membrana basal das
glândulas salivares, que mostravam indícios de degradação, apresentando
orifícios que não foram observados em regiões da membrana basal livres de
tripanossomatídeos. Naquele estudo, Meirelles e colaboradores associaram a
formação dos orifícios na membrana basal da glândula de R. domesticus com a
liberação para o meio de interação de uma proteína formadora de poro ou
perforina do T. rangeli, denominada de rangelisina.
Sabendo que a membrana basal de diferentes tecidos é formada
majoritariamente por proteínas (Yurchenco & O’Rear, 1994) e que muitos
124
parasitas, entre eles protozoários, utilizam-se de enzimas proteolíticas
(secretadas e associadas à superfície celular) para a invasão de tecidos
hospedeiros (McKerrow et al., 1993; Roose & Van Noorden, 1995), no presente
estudo, pesquisamos se havia a presença de proteases, liberadas por P. serpens
durante a interação com as glândulas salivares de O. fasciatus, no intuito de se
avaliar a importância destas enzimas para a formação dos orifícios na membrana
basal deste órgão.
Em 2003, Vermelho e colaboradores mostraram, através de zimografia, que
P. serpens é capaz de secretar para o meio de crescimento três proteases, com
massas moleculares entre 70 e 94 kDa, que foram caracterizadas como
pertencentes à classe das metalo-proteases, de acordo com o perfil de inibição,
apresentado por inibidores específicos, utilizados pelos autores. Como discutido
por Greig e Ashall (1990) e por Branquinha e colaboradores (1996), as proteases
expressas em baixas concentrações podem não ser detectadas facilmente por
zimografia. Isto deixa clara a possibilidade de existirem outras proteases
secretadas por P. serpens que não foram detectadas por Vermelho e
colaboradores (2003).
No presente trabalho, detectamos através de zimografia, a presença de duas
atividades proteolíticas no sobrenadante da interação entre P. serpens e as
glândulas salivares de O. fasciatus, com massas moleculares muito próximas de
63 kDa (figura 19). De acordo com os resultados demonstrados, através da
figura 20, nós sugerimos que essas enzimas são secretadas pelos parasitos,
durante a interação com as glândulas salivares. No intuito de se determinar a
classe proteolítica dessas enzimas, o sobrenadante do meio de interação foi
aplicado em SDS-PAGE-gelatina e, posteriormente, incubado na presença de
diferentes moduladores (figura 21). A análise do resultado deste experimento
nos permitiu constatar que as enzimas proteolíticas, liberadas pelo parasito para
o meio de interação, pertencem à classe das metalo-proteases, já que foram e
moduladas positivamente pelos íons Ca2+ e Zn2+ e, negativamente, por um
125
inibidor específico desta classe (1,10-Fenantrolina) e por um quelante de íons
metálicos (EDTA). Além disso, os inibidores específicos de cisteína- (E-64) e
serina-proteases (PMSF) não foram capazes de modular negativamente a
atividade proteolítica destas enzimas. Como mostrado na figura 19, entre os
valores de pH testados, o que permitiu uma atividade mais acentuada foi o pH
10,0.
Recentemente (d’Ávila-Levy et al., 2006b - ANEXO 3), utilizando
diversas abordagens, em P. serpens, foi caracterizada uma proteína com massa
molecular próxima de 63 kDa, semelhante à gp63, principal glicoproteína
presente na superfície de espécies de Leishmania. Esta gp63, em adição,
apresenta atividade de metalo-protease (revisto por Yao, Donelson & Wilson,
2003). A proteína semelhante à gp63, embora abundantemente expressa na
membrana celular de P. serpens, também foi detectada no sobrenadante da
cultura deste parasito. Além de ter sido reconhecida por anticorpos produzidos
contra a gp63 de Leishmania amazonensis, assim como a proteína de
Leishmania, a proteína semelhantre a gp63 de P. serpens parece ser ancorada à
membrana celular deste parasito, via âncora de GPI. Os resultados apresentados
por d’Ávila-Levy e colaboradores sugerem uma possível função da proteína
semelhante à gp63 de P. serpens na interação com as glândulas salivares de O.
fasciatus, uma vez que o tratamento prévio dos parasitos com anticorpo anti-
gp63 inibiu significativamente a associação deste flagelado com as glândulas
salivares. Ainda naquele trabalho, não foi possível detectar a atividade
proteolítica catalisada pela proteína semelhante à gp63. No entanto, os autores
não descartam a possibilidade deste fato ser reflexo da baixa acurácia das
técnicas utilizadas. Analisando todos estes dados publicados por d’Ávila-Levy e
colaboradores, nós sugerimos que as metalo-proteases extracelulares de P.
serpens, detectadas no presente estudo, as quais apresentam massas moleculares
próximas de 63 kDa (figura 19), são proteases semelhantes à gp63. Esta
hipótese é reforçada pelos resultados obtidos através do uso dos moduladores de
126
atividade proteásica, que mostraram perfis de atividade sobre as proteases de P.
serpens (figura 21) extremamente semelhantes aos descritos para a gp63 das
espécies de Leishmania (revisto por Yao, Donelson & Wilson, 2003), com
inibição total induzida pela 1,10-fenantrolina, parcial induzida pelo EDTA e
modulação positiva exercida pelo íon Zn2+.
Proteínas semelhantes à gp63 já foram descritas em outras espécies de
tripanossomatídeos (revisto por Santos, Branquinha & d’Ávila-Levy, 2006). Da
mesma forma observada nos estudos referentes às espécies de Leishmania
(revisto por Yao, Donelson & Wilson, 2003), diferentes estudos sugerem uma
possível função destes homólogos na interação entre tripanossomatídeos
monoxênicos e seus insetos hospedeiros (d’Ávila-Levy, 2006a - ANEXO 4;
Nogueira de Melo et al., 2006 - ANEXO 6; revisto por Santos, Branquinha &
d’Ávila-Levy, 2006).
No presente estudo, nós sugerimos que a metalo-protease semelhante à
gp63 detectada no sobrenadante da interação de P. serpens com as glândulas
salivares de O. fasciatus, pode ser a responsável pela formação dos orifícios na
membrana basal, que servem como porta de entrada para a invasão das
glândulas salivares pelo parasito. Logicamente, mais estudos serão necessários
para comprovar essa suspeita. No entanto, nossa hipótese é reforçada pelos
resultados apresentados em dois recentes estudos (McGwire et al. 2002;
McGwire, Chang & Engeman, 2003), que mostram que a gp63 secretada por
espécies de Leishmania está envolvida com a patogênese no hospedeiro
vertebrado, pois participa da degradação de componentes da matriz extracelular
de tecidos.
O papel da gp63 das espécies do gênero Leishmania na interação com o
hospedeiro invertebrado ainda não está bem estabelecido. No entanto, sabe-se
que, além de ter uma possível função relacionada à nutrição (Schlein, 1993),
127
pode ser importante no estabelecimento e no desenvolvimento inicial da
infecção em Lutzomia longipalpis (Hajmová et al. 2004).
Nas espécies de Leishmania, a gp63 liberada para o meio extracelular
pode se apresentar sob duas isoformas. Traduzida no retículo endoplasmático,
esta proteína passa pelo complexo de Golgi e é levada, por meio de vesículas,
até a bolsa flagelar. Estas vesículas, que contêm tanto a forma solúvel, quanto
aquela que será ancorada à membrana celular, se fundem com a membrana da
bolsa, liberando a forma solúvel para o meio extracelular e adicionando a forma
ancorada na membrana plasmática. A forma ancorada pode ser liberada para o
meio extracelular, fazendo parte de fragmentos da membrana plasmática e, por
este motivo, no meio extracelular podem ser encontradas isoformas da gp63 com
diferentes massas moleculares (McGwire et al. 2002; Yao, Donelson & Wilson,
2003). Esta pode ser uma explicação para o fato de termos observado, no
presente estudo, a atividade de duas metalo-proteases, com massas moleculares
distintas e muito próximas (figura 19), que responderam de forma idêntica à
modulação exercida por diferentes substâncias (figura 21). Da mesma forma,
d’Ávila-Levy e colaboradores (2006b - ANEXO 3) detectaram em P. serpens,
por “imunoblotting”, proteínas semelhantes à gp63, com massas moleculares
variando de acordo com a localização na célula e do tratamento prévio das
proteínas.
No presente estudo, além das metalo-proteases secretadas por P. serpens,
detectamos no sobrenadante da interação, enzimas proteolíticas secretadas pelas
glândulas salivares (figura 19). Das cinco enzimas secretadas pelas glândulas,
somente duas, com massas moleculares entre 14 e 18 kDa, foram observadas na
maioria dos experimento (figura 19, 20 e figuras 22-25). Estas duas proteases,
provavelmente representam a mesma proteína e a diferença de massa pode ser
reflexo de pequenas modificações, como a perda de algum domínio glicídico ou
autólise, que não induzem a perda da atividade catalítica.
128
A protease secretada pelas glândulas salivares, da mesma forma que as
secretadas pela P. serpens, foram caracterizadas, através do uso de moduladores
de atividade proteásica, como pertencente à classe das metalo-proteases (figura
25). Esta protease, que é secretada de forma tempo-dependente, não foi
encontrada na saliva das glândulas ou no extrato protéico deste tecido, indicando
que a expressão ou a ativação desta protease é induzida por algum fator, ainda
indeterminado (figura 24). Curiosamente, percebemos que a secreção desta
protease ocorre na ausência ou na presença de P. serpens. No entanto, na
presença deste parasito, parece ocorrer uma liberação mais acentuada e,
consequentemente, uma atividade mais pronunciada no sobrenadante da
interação (figura 23).
Em 1999, Feder e colaboradores, estudando a interação de T. rangeli com
R. prolixus, observaram na hemolinfa do inseto a expressão de uma metalo-
protease de aproximadamente 39 kDa, induzida pelo parasito. Naquele estudo,
não foi possível determinar a origem da produção desta metalo-protease. No
entanto, foi descartada a possibilidade desta protease ter sido secretada pelo
parasito. Da mesma forma que ocorre para as espécies de Phytomonas, no ciclo
de vida de T. rangeli, a interação com a face externa das glândulas salivares do
vetor é uma etapa crucial. Sabendo que P. serpens é capaz de modular a
secreção de uma metalo-protease da glândula salivar de O. fasciatus, não
surpreenderia o fato de que a metalo-protease detectada por Feder e
colaboradores (1999) tivesse origem na glândula salivar de R. prolixus. Esta
possibilidade não foi pesquisada pelos autores.
É sabido que serina-proteases participam da ativação da cadeia da
profenoloxidase (Ashida & Yamazaki, 1990), responsável em artrópodes pela
resposta humoral contra microrganismos que parasitam a hemocele. Esta cadeia
leva à melanização e encapsulamento dos parasitas (Raticliffe, 1991).
Curiosamente, no estudo de Feder e colaboradores (1999), enquanto inibidores
de serina-proteases reduziram em até 70% a melanização dos parasitas,
129
inibidores de metalo-protease bloquearam completamente a ativação da cadeia
da profenoloxidase, mostrando que em R. prolixus a metalo-protease liberada na
hemolinfa pode ter papel fundamental na ativação da resposta imune contra o T.
rangeli.
Curiosamente, no presente estudo, em um dos experimentos onde
incubamos glândulas salivares de O. fasciatus na presença de um lisado de
parasitos, observamos a degradação da metalo-protease, que é secretada pela
glândula para o meio de interação (figura 22 A), catalisada por uma cisteínaprotease de P. serpens (figura 22 B e C), descrita por Branquinha e
colaboradores (1996).
Recentemente, foi mostrado que esta cisteína-protease de P. serpens
apresenta similaridades bioquímicas e antigênicas com a principal cisteínaprotease expressa por T. cruzi (Santos et al., 2006 - ANEXO 5). Embora
presente majoritariamente em sítios intracelulares, foi possível detectar a
presença da proteína semelhante à cruzipaína na superfície P. serpens, fato que
nos levou a testar a importância desta cisteína-protease de P. serpens no
processo de interação com glândulas salivares de O. fasciatus. De fato, parasitos
tratados previamente com diferentes inibidores de cisteína-protease, ou com
anticorpos produzidos contra a cruzipaína, mostraram um índice de ligação à
glândula salivar muito menos do que o observado em condições controle,
sugerindo a participação da proteína semelhante à cruzipaína de P. serpens na
interação com as glândulas salivares de O. fasciatus.
A importância da cruzipaína na interação de T. cruzi com células e tecidos
hospedeiros foi mostrada em uma série de estudos (Piras, Henríquez & Piras,
1985; Meirelles et al., 1992; Franke de Cazzulo et al., 1994). Sabendo que a
proteína semelhante à cruzipaína de P. serpens está presente em sua superfície
(Santos et al., 2006 - ANEXO 5) e pode degradar a metalo-protease secretada
da glândula salivar de O. fasciatus (figura 22), e supondo que in vivo esta
metalo-protease da glândula pode ter papel importante na ativação da resposta
130
imune do inseto (Feder et al., 1999) sugerimos, no presente estudo, uma
provável participação da proteína semelhante à cruzipaína de P. serpens não só
na interação com as glândulas salivares de O. fasciatus, mas também no escape
dos sistema imune deste inseto. Esta última hipótese está sendo testada em outro
trabalho do nosso grupo.
A participação direta da proteína semelhante à cruzipaína de P. serpens na
invasão das glândulas salivares de O. fasciatus não pode ser descartada,
primeiro porque a cruzipaína de T. cruzi tem conhecido envolvimento no
processo de invasão de células hospedeiras (Piras, Henríquez & Piras, 1985;
Meirelles et al., 1992; Franke de Cazzulo et al., 1994) e segundo porque o
tratamento prévio de P. serpens com anticorpos anti-cruzipaína ou com o E-64,
um inibidor específico de cisteína-proteases, incapaz de atravessar a membrana
plasmática, foi capaz de inibir acentuadamente a associação de P. serpens com
glândulas salivares de O. fasciatus (Santos et al., 2006 - ANEXO 5).
131
CONCLUSÕES
132
- A transmissão de L. wallacei entre insetos da espécie O. fasciatus pode
ocorrer de forma vertical, através das formas císticas presentes nas fezes de
insetos adultos, que contaminam a parede externa dos ovos;
- O crescimento de P. serpens em tomates pode apresentar diferentes perfis,
dependendo da variedade da espécie de tomate L. esculentum infectada;
- Nas condições utilizadas no presente trabalho não foi possível estabelecer
a infecção in vivo de P. serpens em insetos da espécie O. fasciatus;
- Em condições in vitro, P. serpens é capaz de aderir à membrana basal, que
reveste externamente as glândulas salivares de O. fasciatus, via flagelo ou corpo
celular, e atravessar esta barreira via corpo celular;
- P. serpens é capaz de reconhecer uma proteína de 130 kDa, presente nas
glândulas salivares de O. fasciatus, a qual possui seqüência peptídica e
antígenos similares a cadeia beta-3 da lamina;
- No DNA de O. fasciatus parece existir seqüência homóloga ao gene da
cadeia beta-3 da lamina;
- O tratamento prévio de glândulas salivares de O. fasciatus com anticorpo
anti-cadeia beta-3 da laminina, assim como o tratamento prévio de P. serpens
com a laminina-5 ou com a p130, foi capaz de inibir, de forma dose-dependente,
a interação deste parasito com as glândulas salivares do inseto;
- A p130 parece ser a molécula-alvo para a ligação de P. serpens às
glândulas salivares de O. fasciatus;
133
- Durante a interação com as glândulas salivares de O. fasciatus, P. serpens
é capaz de liberar para o meio de interação uma metalo-protease, com massa
molecular próxima de 63 kDa, que apresenta semelhanças bioquímicas com a
metalo-protease gp63 expressa por diferentes espécies de Leishmania;
- A proteína semelhante à gp63, secretada por P. serpens, pode ter
importante papel na invasão das glândulas salivares de O. fasciatus;
- Na presença ou na ausência de P. serpens, as glândulas salivares de O.
fasciatus liberam para o meio de incubação uma metalo-protease, com massa
molecular entre 14 e18 kDa;
- A proteína semelhante à cruzipaína de P. serpens é capaz de degradar a
metalo-protease secretada pelas glândulas salivares de O. fasciatus, podendo
desempenhar importante papel na interação com este órgão.
134
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