Treinamento Colunas
Cromatográficas
Objetivo
Padronizar a correta utilização, cuidados e
acompanhamento da performance das colunas
cromatográficas
Definição
Compreende como a fase estacionária na
cromatografia líquida. A fase estacionária é
constituída ou por um sólido finamente
dividido ou por um líquido impregnando um
suporte sólido ou por um sólido modificado
quimicamente por introdução de grupos
orgânicos. A fase estacionária é responsável
por reter o soluto devido sua adsorção,
partição, troca iônica ou pela permeação em
gel. Sendo os mais usados a separação por
adsorção e por partição
.
Recebimento das Colunas
Verificação
de acordo com a solicitação
 Codificação. Ex : DMA001
 Arquivar o certificado de análise
Cuidados e manuseio das Colunas
Evitar mudanças drásticas de fluxo e tipos de
solventes;
 Utilizar sempre pré-coluna quando tiver;
 Filtrar e degaseificar a fase móvel;
 Não expor as colunas a temperaturas
maiores que 60°C;
 Evitar colisões e quedas das colunas

Cuidados e manuseio das Colunas
Não submeta a coluna a pH’s extremos se
não for estritamente necessário;
 Nunca armazene ou estoque a coluna em
soluções tamponadas;


Utilize somente solventes grau HPLC;
Limpeza
Sequência de Limpeza para Colunas: C18/C8 e
Fenil:
TEMPO
COMPOSIÇÃO DO
FLUXO
SOLVENTE
0 a 15 minutos
ÁGUA: METANOL
(90:10)
1mL/min
16 a 30
100% METANOL
1 mL/min
31 a 45
100% ACETONITRILA
1 mL/min
46 a 60 minutos
ÁGUA: ACN (20:80)
1 mL/min
Limpeza
Sequência de Limpeza para Coluna Si/CN:
TEMPO
COMPOSIÇÃO DO
FLUXO
SOLVENTE
0 a 15 minutos
HEXANO 100%
1mL/min
16 a 30
ISOPROPANOL 100%
1 mL/min
31 a 45
ETER 100%
1 mL/min
46 a 60 minutos
HEXANO 100%
1 mL/min
Limpeza
Qual a forma correta de lavar uma coluna RP
após a utilização de uma fase móvel composta
por tampão?
 Água, Metanol ou Acetonitrila????
 Qual proporção???
 Validade fase móvel???

Limpeza Ácida
É feita com os mesmos parâmetros utilizados
na limpeza de rotina, alterando somente os
tipos de reagentes:

Água
– Metanol – Clorofórmio – Metanol –
H2SO4 0,05M – ACN
Limpeza Ácida
Quando
é realizada?
Quais os cuidados em relação aos reagentes
utilizados?
Regeneração Colunas
 Antes
de proceder à regeneração de uma
coluna, certificar-se que somente com a
limpeza não alcance o resultado esperado.
Caso haja problema de pressão alta passar
primeiramente água a 50°C, com vazão baixa
pelo tempo que se julgar necessário. Se esses
procedimentos não apresentarem bons
resultados, proceder primeiramente com a
sequência ácida, se não houver o resultado
desejado, proceder com a regeneração
específica para a coluna.
Regeneração Colunas
Para a coluna de Si, não realizar a limpeza
ácida, se for necessário proceder diretamente a
regeneração específica;
 Toda regeneração deverá ser registrada no
formulário de registro e acompanhamento da
vida útil da coluna cromatográfica,conforme
anexo I do procedimento.

Regeneração de Colunas
Condições Gerais:
Para regenerar uma coluna danificada (baixa
seletividade, eficiência e simetria) proceder da
seguinte forma:
 Colunas de 100, 125 e 150 x 4,0 e 4,6 mm:
 Condição de regeneração: 20 minutos por
componente com vazão de
1 mL/min;
 Colunas de 250, 300 x 4,0 e 4,6 mm:
 Condição de regeneração: 40 minutos por
componente com vazão de 1 mL/min.


Regeneração Colunas
FASE REVERSA C8/C18 e Fenil:
 Água quente (50°C) – Metanol – ACN – THF – Etanol –
Água –ACN
FASE NORMAL CN:
 Heptano – Clorofórmio – Acetato de Etila – Acetona –
Etanol – Água – ACN
FASE NORMAL Si:
 Hexano – Cloreto de Metileno – Clorofórmio –
Cloreto de Metileno – Hexano
Qualificação de Performance
Processo empregado para verificação da
eficiência da coluna cromatográfica, onde são
analisados alguns parâmetros como assimetria,
resolução, número de pratos teóricos,
verificando dessa forma se a coluna atende aos
requisitos farmacopéicos para análise.

Avaliação da Performance Colunas
Seguir o procedimento de análise e as
seguintes especificações:

 Assimetria: 0,8
a 1,8
 Pratos teóricos: não menos que 2000.
 Desvio padrão relativo: não mais que 2,0%
Qualificação de Performance
Quando
os resultados obtidos em análise não
estiverem dentro dos parâmetros
estabelecidos para análise realizar uma
investigação de todos os procedimentos
analíticos para confirmação de problemas
específicos da coluna.
Qualificação de Performance
Caso haja necessidade de regeneração,
proceder conforme procedimento de
regeneração e logo após, realizar uma nova
qualificação de performance para essa coluna
e anexar os resultados na pasta de verificação
de performance de colunas cromatográficas.

Qualificação de Performance
Preencher o formulário de qualificação
conforme o modelo juntamente com os
cromatogramas de qualificação.
 Após a realização da qualificação deve ser
preenchida uma etiqueta fixada na caixa da
coluna cromatográfica.

Considerações Importantes
Coluna é o coração do sistema,
 As três principais razões para falha em
coluna reversa são:
 perda de fase ligada;
Vazios na coluna;
Contaminação coluna

Considerações Importantes
Quando uma coluna está ligada pela primeira
vez, ou após ter sido armazenado por um
longo tempo, ele precisa ser ativada. Nesta fase,
recomenda-se que não deve ser conectada
para o detector ainda, mas para deixar o
solvente eluir fora livremente por 5 minutos
para liberar partículas que pode ser liberado
devido a problemas de embalagem, ou mesmo
do ar.

Considerações Importantes
Perda de fase ligada:
 A medida que fase ligada é removida do
suporte de sílica, tempos de retenção e
resolução mudarão e picos dão mais cauda.
Causa: Hidrólise siloxane da fase ligada ou
reagentes.
Prevenção: Opere com fase móvel de pH
acima de 2 e temperatura menor que 60°C

Considerações Importantes
Vazios
na Coluna:
 Picos decrescem,alargam, eluem com cauda
ou dividem.
 Causas: Colunas mal empacotadas, que se
assentam durante o uso,dissolução de sílica por
operação de pH elevado,aumento brusco da
pressão, “colisões”.
Considerações Importantes
Prevenção:
 Mantenha a pressão abaixo de 4000 psi e
elimine grandes aumentos de pressão;
 Compre colunas de qualidade;

Considerações Importantes
Contaminação na Coluna:
 Incrustações na coluna resulta material
retido, isto pode conduzir a deslocamento da
retenção do pico.
Como por exemplo: materiais particulados
ou amostras precipitadas e tampões.
 Causas: Impurezas na fase móvel, que
adsorve na fase estacionária, é comum quando
uma íon-par e outros aditivos;

Considerações importantes
Prevenção:
 Limpe as amostras, antes da injeção, isto
pode incluir filtração das amostras;
 Rotineiramente passe solvente forte através
da coluna;
 Troque sempre frit
Considerações Importantes
Eventualmente todas as colunas perdem o
desempenho e devem ser substituídas. O
tempo depende das condições cromatográficas
usadas, bem como da própria coluna.
 Monitorando o desempenho da coluna
pode-se saber se ela iniciou a se deteriorar e
prever quando deve ser substituída.

Mensagem Final
“Somos
anjos de uma asa só e só
podemos voar se abraçarmos uns aos
outros”
Questões????????
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