Microbiologia
Teórica 32
2º Ano
2011/2012
Sumário

Capítulo XXX. A microbiologia como pilar das ciências biomédicas

Expectativas dos alunos. Análise de resposta à pergunta para que serve a
microbiologia em Ciências Biomédicas?
 Exemplos das análises clínicas
 Exemplos da Indústria Farmacêutica




Exemplos da Indústria Agroalimentar
Investigação em Ciências Biomédicas



2
Controlo de Qualidade
Produção de medicamentos por microrganismos
Microbiologia e diagnóstico
Microbiologia e desenvolvimento de novas formas de terapêutica
Microbiologia e conhecimento de novas vias etiológicas e terapêuticas
T32-34 MJC
3-01-2012
Microbiologia e análises clínicas
Microbiologia e Parasitologia Médicas



São função exclusiva dos biomédicos nalguns países com UK.
O Cientista Biomédico tem de ser capaz de:



3
Fazer diagnóstico microbiológico de amostras médicas.
 Por cultura
 Por coloração
 Por testes bioquímicos
 Por testes moleculares
Fazer o diagnóstico da imunidade serológica
Análise de anticorpos ou antigénios presentes no soro dos pacientes
T32-34 MJC
3-01-2012
Microbiologia e Indústria Agroalimentar
Controlo de qualidade microbiológicas:




Matérias primas
Processos
Produtos finais
Monitorização de fermentadores ou bioreactores onde
existe a produção de alimentos ou aditivos por bactérias:



4
Produção de proteínas recombinantes ou nativas
Isolamento e purificação desses produtos
T32-34 MJC
3-01-2012
Microbiologia Investigação em Ciências
Biomédicas
Microbiologia e diagnóstico


Desenvolvimento e aprefeiçoamento de novas formas de
diagnóstico
Microbiologia e desenvolvimento de novas formas de
terapêutica


Utilização dos microrganismos em novas formas de terapêutica
ou produção de conhecimento que leve ao desenvolvimento
de novas formas terapêuticas
Microbiologia e conhecimento de novas vias etiológicas


5
Associação de agentes microbianos a patologias e/ou
caracterização de novoas agentes etiológicos de patologias
infecciosas.
T32-34 MJC
3-01-2012
Microbiologia Investigação em Ciências
Biomédicas
Técnicas que é necessário o cientista biomédico dominar:




Cultura de células microbianas
Observação ao microscópio de lâminas preparadas e
preparação de lâminas para observação ao microscópio.
Identificação de microrganismos pelas várias técnicas


6
Bioquímicas
Moleculares
T32-34 MJC
3-01-2012
Bibliografia
7
T32-34 MJC
3-01-2012
Microbiologia
Teórica 33
2º Ano
2011/2012
Sumário


Capítulo XXX.

Exemplos das análises clinicas

Análise de um artigo que faz o teste de um método de diagnóstico microbiológico
da doença periodontal

A pergunta

Os métodos utilizados

Os resultados

As conclusões.
Em que passos deverá intervir o Biomédico?
9
T32-34 MJC
3-01-2012
Diagnóstico Microbiológico da Doença
Periodontal



É possível?
É útil?
Está disponível?


10
Que métodos de investigação?
Que testes?
T32-34 MJC
3-01-2012
Artigo
”Comparison between polymerase chain reaction-based
and checkerboard DNA hybridization techniques for microbial assessment
of subgingival plaque samples.”
Que técnicas existem para detectar/quantificar MO
periodontopatogénicos?



12
Cultura
Teste BANA
Benzoyl-DL-arginine-naphthylamide (BANA) test
(Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, e Bacteroides
forsythus)
Observação directa
T32-34 MJC
3-01-2012
Que técnicas existem para detectar/quantificar MO
periodontopatogénicos?

Métodos moleculares



13
PCR
RT-PCR
DNA-DNA hibridization
T32-34 MJC
3-01-2012
Qual o objectivo da investigação
presente?

Compara os resultados obtidos por dois métodos moleculares.
 PCR e aplicação dos testes Micro-Ident


14
Hibridação DNA-DNA (sem PCR)
Para as mesmas amostras de pacientes saudáveis e de pacientes com
periodontite.
T32-34 MJC
3-01-2012
Caracterização da população estudada.




Todos com mais de 20 anos
Saudáveis sem ser a periodontite
Sem tratamento periodontal ou antibiótico sistémicos há pelo
menos 3 meses
25 pessoas

Grupo com patologia periodontal



Grupo saudáveis


15
Pelo menos 24 dentes
Sem locais com PD acima de 4 mm
Com pelo menos 20 dentes
Mais de 5% de dentes com PD acima de 4mm
T32-34 MJC
3-01-2012
Como foi feita a avaliação
microbiológica?

Tiradas amostras de 6 locais nos doentes com periodontite:






Nas amostras para o Microident (Fotos slide 2):



Extração de DNA  PCR  hibridização com membrana com 13 sondas
específicas.
Verificação do sinal e classificação por comparação com escala em 0,5 ate 3 de
abundância
Nas amostras de DNA-DNA hibridization (Fotos slide 6)

16
2 em bolsas com menos de 4mm
2 em bolsas com 4-6 mm
2 em bolsas com mais de 6 mm
Paper points for the Micro ID test
Cureta para DNA-DNA
Extração de DNA  hibridização com os chips de DNA
T32-34 MJC
3-01-2012
Teste MicroIDent
Este é o resultado que o médico
dentista recebe como relatório não
o resultado laboratórial.
No laboratório o resultado é lido
por hibridização com uma
membrana de nitrocelulose.
17
T32-34 MJC
3-01-2012
DNA-DNA Checker Board
18
T32-34 MJC
3-01-2012
Quais os resultados da investigação?
19
T32-34 MJC
3-01-2012
Quais os resultados da investigação?



20
Ambos os métodos têm “perfis” diferentes para indivíduos com
doença periodontal e sem.
Num há 11 espécies com diferenças significativas estatisticamente
entre saúde e doença.
Noutro há 10 espécies estatisticamente diferentes entre saúde e
doença.
T32-34 MJC
3-01-2012
Quais os resultados da investigação?
21
T32-34 MJC
3-01-2012
Quais os resultados da investigação?

22
Há alguma concordância na especificidade e na sensibilidade dos
testes
T32-34 MJC
3-01-2012
Quais os resultados da investigação?
23
T32-34 MJC
3-01-2012
Quais os resultados da investigação?

24
Para a maioria das espécies é indiferente usar um ou outro teste
que os resultados estatisticamente não diferem mesmo quando se
consideram as quantificações.
T32-34 MJC
3-01-2012
Conclusões gerais



25
Para algumas das espécies os resultados são muito semelhantes.
Para outras há maiores diferenças
O facto de para os agentes mais associados à periodontite os
resultados serem muito semelhantes leva a supor que os dois
tipos de teste podem ser usados alternativamente.
T32-34 MJC
3-01-2012
Microbiologia
Teórica 34
2º Ano
2011/2012
Sumário

Capítulo XXX.


27
Exemplos das análises clinicas.
Procedimentos normais num consultório de Análises
clínicas

Análise de uma amostra de urina
 Análise preliminar
 Cultivo
 Antibiograma

Análise serológica de marcadores da hepatite
 Testes serológicos
T32-34 MJC
3-01-2012
Num laboratório de análises clínicas...






Cultivo de bactérias e fungos em placas
Exame directo de amostas de esfregações, urina ou fezes.
Preparação, fixação, coloração e exame de lâminas de sputum,
esfregações, fezes, fluído encefalo raquidiano e organismos de
cultura. As colorações incluem coloração de gram mas
também outras colorações específicas para algumas amostras.
Inoculação e leitura de testes bioquímicos para identificação
de Microrganismos
Determinação de sensibilidade a antibióticos por
antibiogramas.
Testes serológios para fetecção de antigénios ou anticorpos.
28
T32-34 MJC
3-01-2012
Análise microbiológica de uma amostra de urina

Análise preliminar:

Tiras de detecção de:




Leucócitos
Proteínas
Glicémia
Permitem a despistagem rápida de infecção urinária.
http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/pro
dutos/equipamentos-dediagnostico/products/near-patienttesting/combur/
29
T32-34 MJC
3-01-2012
Análise microbiológica de uma amostra de urina

Análise cultural:

Análise de crescimento, quantificação.



Esta é feita pois a inoculação é feita usando um volume determinado
de urina 0.01 ou 0.001ml.
A cultura é feita em agar de sangue, MacConkey ou Colistin-nalidixic
ácid Agar (CNA).
Antibiograma

Em meio Mueller-Hinton é feita a cultura dos isolados onde são
testados alguns antibióticos passíveis de ser utilizados.
http://www.youtube.com/watch?v=FOimwWEV6vU&feature=player_e
mbedded
30
T32-34 MJC
3-01-2012
Análise serológica de marcadores de HBV

Marcadores:




31
HBSag (Antigénio de superfícies de vírus da hepatite B)
HB anti-core (anticoprpo para o antigénio core do vírus da
hepatite B).
HBeAg (Antigénio e do vírus da hepatite B)
Anti-HBe (anticorpo contra o antigénio e do vírus).
T32-34 MJC
3-01-2012
Procedimento para detecção de antigénios
32
T32-34 MJC
3-01-2012
Em todos os testes de ELISA há:




Replicados da amostra
Um contolo positivo em que há uma concentração
conhecida do antigénio a detectar.
Um contolo negativo em que não há o antigénio a
detectar.
A leitura é feita por espectofotometria que mede a
intensidade da cor gerada da reação da enzima com o
substratos presentes.
33
T32-34 MJC
3-01-2012
Sumário

Capítulo XXX.

Risco associado ao trabalho em laboratórios de análises
clínicas.





34
Risco biológico
Risco quimico
Risco físico
Risco eléctrico
Risco ambiental
T32-34 MJC
3-01-2012
Risco Biológico

Todas as amostras são potencialmente perigosas!

Usar o equipamento de segurança pessoal adequado:




Luvas
Batas
Óculos quando necessário
Respeitar as normas de segurança dos níveis de risco
biológico:
Nível 1
 Nível 2
 Nível 3
 Nível 4


35
Todos os níveis pressupõem a adopção das medidas do
nível anterior.
T32-34 MJC
3-01-2012
Nível 1



Nível 1: Bactérias e vírus Bacillus
subtilis, canine hepatitis, Escherichia coli, varicella (chicken
pox),e algumas culturas celulares não infecciosas.
Na manipulação deste material pode apenas usar-se luvas.
A descontaminação deste nível é feita por lavagem das
mãos e descontaminação por autoclavagem de todo o
material contaminado.
36
T32-34 MJC
3-01-2012
Nível 2






Bactérias e vírus que causam doenças pouco graves em
humanos ou que dificilmente podem ser contraídos por
aerossois.
Hepatitis A, B, e C, influenza A, Lyme
disease, salmonella, papeira, rubeola, febre de Dengue
e HIV.
Têm de ser usadas câmaras de segurança biológica nível
2.
Acesso limitado ao laboratório
Avisos de perigo biológico
Descontaminação de todo o material antes de ser
deitado no lixo.
37
T32-34 MJC
3-01-2012
Nível 3






Bactérias e vírus que podem causar patologias fatais em
humanos mas para as quais há vacinas e outros
tratamentos.
anthrax,West Nile virus,encefalite equina Venezuelana
, SARS, variola , tuberculose, tifo, Febre Rift Valley
fever, Febre Rocky Mountain spotted fever, Febre amarela
e malaria.
Trabalho obrigatório em câmaras de segurança biológica
3
Acesso controlado ao laboratório
Descontaminação da roupa antes de lavar.
Descontaminação de todo o equipamento
38
T32-34 MJC
3-01-2012
Nível 4




Víruses e bactérias que causam patologias severas e fatais
em humanos para as quais não há tratamentos nem
vacinas disponíveis.
Febres hemorrágicas
Trabalho não autorizado na maior parte dos laboratórios.
Controlo de entrada e saída de todas as pessoas e
materiais.
39
T32-34 MJC
3-01-2012
Risco Químico






Algumas das substâncias usadas para preparar as
amostras têm vários riscos associados.
É preciso saber a sinalética e respeitar as normas de
segurança de cada substância
Não cheirar
Não pipetar com a boca
Ter cuidados especiais com a chama
Cuidados com o contacto com a pela de substâncias
carcinogénicas
40
T32-34 MJC
3-01-2012
Risco Eléctrico


Além das precauções normais de senso comum ...
Necessário asseurar que os equipamentos são mantidos
em condições ao longo dos anos.
41
T32-34 MJC
3-01-2012
Risco Físico




Cuidado esqpecial com a arrumação do laboratório
Evitar gavetas e portas dos armários abertas
Evitar caixas ou obstáculos no chão que possam
promover quedas.
Cuidado com a abertura brusca de portas especialmente
as que abrem para os dois lados!
42
T32-34 MJC
3-01-2012
Risco Ambiental



Cuidados na separação dos lixos
Eliminação responsável de substâncias como mercúrio,
chu,bo ou outras susbtâncias químicas nocivas para o
ambiente
Manutenção do ar do laboratório com qualidade


43
Monitorização da qualidade do ar
Manutenção dos filtros e condutas de ar condicionado.
T32-34 MJC
3-01-2012
Recursos

http://www.cdc.gov/niosh/topics/healthcare/#c
44

Capítulo 5. Secção 5.4

Capítulo 6. Secção 6.5
T32-34 MJC
3-01-2012