Ciclo de Krebs
Bioquímica para Enfermagem
Prof. Dr. Didier Salmon
MSc. Daniel Lima
Vias Lineares
• Glicólise e Gliconeogênese
GLICOSE
PIRUVATO
Via Circular
• Ciclo do Ácido Cítrico ou Ciclo de Krebs
– Representa o estágio final da
oxidação de fontes de energia
metabólica (carboidratos, ácidos
graxos e aminoácidos)
– Rota central de recuperação de
energia a partir de vários
combustiveis metabólicos
Respirômetro de Warburg
Coloca o
substrato
-
Era usado para medir
a produção de CO2.
-
Permitia determinar a
estequiometria das
reações.
Pressão
CO2
• Células Produzem CO2
Tecido
Meio de cultura
• Formação de
Bicarbonato
Fluido
com cor
• ↓ Pressão no frasco
Papel de filtro
com KOH
KOH + CO2
KHCO3
• ↑ Líquido na coluna
Destino do Piruvato na Presença de O2
• A: Piruvato (C3) + 3O2
3CO2 + 3H2O
• Szent – Györg (1930) testa ácidos C4
• B: Piruvato (C3) + ácidos dicarboxílicos (C4) + nO2
50
piruvato +
CO2
40
30
piruvato
20
10
0
0
5
10
tempo
15
20
nCO2 + nH2O
oxaloacetato
succinato
malato
fumarato
Hans Krebs
•
Krebs então testa outros ácidos dicarboxílicos. Em 1935 descobre que um deles, o
α-cetoglutarato, com 5 carbonos, assim como nos experimentos de Szent-Györgyi,
aceleravam a produção de CO2 e não eram consumidos na reação
•
Em 1937 Krebs testa ácidos tricarboxílicos como citrato, isocitrato e aconitato,
agora com 6 carbonos, e observa que a produção de CO2 também era estimulada e
esses intermediários não eram consumidos.
50
piruvato
CO2
40
30
piruvato
20
10
0
0
5
10
tempo
15
20
+
citrato
isocitrato
aconitato
Hans Krebs
•
Segundo Krebs, outra contribuição significativa para suas descobertas veio dos
estudos de Martius e Knoop, em 1937, que elucidaram a transformação oxidativa
de citrato até α-cetoglutarato
Em 1936, Carl Martius e Franz
Knoop demonstraram que o
citrato pode ser formado de
modo não-enzimático a partir
do oxaloacetato e do piruvato
Hans Krebs
•
Krebs também observou que a formação de citrato (C6) ocorria rapidamente após
a adição de oxaloacetato (C4) em diversos tecidos.
Oxaloacetato (C4) + ???(C2)
•
Citrato(C6)
Composto vindo provavelmente da degradação da glicose
Juntando as seguintes informações:
•
1- ácidos di- e tri- carboxílicos aceleravam a formação de CO2 em diversos tecidos
mas não eram consumidos na reação.
•
2- algum composto de 2 carbonos vindo provavelmente da glicólise se combinava
com oxaloacetato e formava um composto de 6 carbonos (citrato) que iniciava
uma via de interconversão, Krebs conclui e postula um modelo que ele chamou de
“Ciclo do Ácido Cítrico” ou dos “Ácidos Tricarboxílicos”.
Krebs então postula que:
“O piruvato, ou um derivado vindo da glicólise (acetato), se condensa
com o oxaloacetato e forma citrato. Por uma sequência de reações que
envolvem cis-aconitato, isocitrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato,
malato e oxaloacetato como intermediários, um ácido acético é oxidado
e o oxaloacetato necessário para a reação inicial de condensação é
regenerado. Isso explica a ação catalítica dos ácidos di e tricarboxílicos
(de 4, 5 e 6 carbonos), bem como a capacidade que esses ácidos
possuem de se oxidar nos tecidos que oxidam carboidratos.”
Ciclo do Ácido Cítrico
• Mitocôndria
– Membranas interna e externa
– Matriz Mitocondrial
???(C2)
• Os experimentos de Fritz Lipmann
– Lipmann demonstra que o consumo de O2 é aumentado na presença
de ácido pantotênico quando se fornece glicose-fosfato para leveduras
???(C2)
• Os experimentos de Fritz Lipmann
– Naquela época já se sabia que a Coenzima A estava envolvida em
reações de transferência de carbono e que ela era derivado do ácido
pantotênico, uma vitamina pertencente ao complexo B (vit. B5).
Coenzima A
• Ubíqua nos tecidos
• Síntese de citrato aumenta na presença de CoA
O Complexo Piruvato Desidrogenase
•
Complexo multienzimático: grupos de enzimas associadas de modo não-covalente
que catalisam duas ou mais reações seqüencias em uma rota metabólica
– Aumento a velocidade das reações, canalização dos intermediários
minimizando as reações secundárias, controle coordenado das reações
catalisadas
O Complexo Piruvato Desidrogenase
• Três tipos de enzimas em cópias múltiplas: E1, E2, E3
• Ex: piruvato desidrogenase de E. coli contém 60 subunidades proteicas
– 24 E1, 24 E2, 13 E3
– Grande o suficiente para ser visto em microscopia eletrônica
O Complexo Piruvato Desidrogenase
Descarboxilação Oxidativa
Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
• Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação
– TPP (tiamina)
– FAD (riboflavina)
– NAD (niacina)
– CoA-SH (pantotenato)
– Lipoato
Tiamina (Vitamina B1)
Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
• Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação
– TPP (tiamina)
– FAD (riboflavina)
– NAD (niacina)
– CoA-SH (pantotenato)
– Lipoato
Riboflavina (Vitamina B2)
Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
• Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação
– TPP (tiamina)
– FAD (riboflavina)
– NAD (niacina)
– CoA-SH (pantotenato)
– Lipoato
Niacina (Vitamina B3)
Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
• Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação
– TPP (tiamina)
– FAD (riboflavina)
– NAD (niacina)
– CoA-SH (pantotenato)
– Lipoato
Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
• Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação
– TPP (tiamina)
– FAD (riboflavina)
– NAD (niacina)
– CoA-SH (pantotenato)
– Lipoato
Beriberi – Deficiência de B1
Ciclo de Reações
da PD
Piruvato Desidrogenase (E1)
Diidrolipoil Transacetilase (E2)
Hidroxietil-TPP
Diidrolipoil Desidrogenase (E3)
Lipoamido = ácido lipóico
ligado a um resíduo lisina
Piruvato Desidrogenase (E1)
Diidrolipoil Transacetilase (E2)
Diidrolipoil Desidrogenase (E3)
Hidroxietil-TPP
Acetil- diidrolipoamido
Transesterificação e produção
da AcetilCoA
Piruvato Desidrogenase (E1)
Oxidação da hidroxietil a acetila na
redução do dissulfeto do lipoamida
Diidrolipoil Transacetilase (E2)
Diidrolipoil Desidrogenase (E3)
Hidroxietil-TPP
diiidrolipoamido
Piruvato Desidrogenase (E1)
Diidrolipoil Transacetilase (E2)
Diidrolipoil Desidrogenase (E3)
Hidroxietil-TPP
Regeneração do lipoamido
Piruvato Desidrogenase (E1)
Diidrolipoil Transacetilase (E2)
Diidrolipoil Desidrogenase (E3)
Arsênico
O complexo piruvato desidrogenase pode ser inibido pela reação do grupo
lipoamido com compostos que contêm arsênico
E1= piruvato desidrogenase
Piruvato + TPP
Hidroxietil-TPP + CO2
E2= dihidrolipoil transacetilase
Hidroxietil-TPP + lipoil-lisina oxidada
TPP + Acetil tioester da lipoil-lisina reduzida
Acetil tioester da lipoil-lisina reduzida + CoA
E2= dihidrolipoil transacetilase
Acetil-CoA + lipoil lisina reduzida
E3= dihidrolipoil desidrogenase: restauração do complexo PDH
ao seu estado inicial (regeneração da lipoamida oxidada e
produção de FADH2 e redução do FADH2 pelo NAD produzindo
NADH )
Regulação do Complexo Piruvato
Desidrogenase
• Inibida quando [ATP/ADP], [NADH/NAD+] e [acetilCoA/CoA]
– Balanço energético positivo
• Inibida por ácido graxos de cadeia longa (modificação
alostérica)
• Por modificação covalente de E1 (mamíferos):
– piruvato desidrogenase cinase fosforila E1 inativa o PDC
(ATP é um ativador alostérico desta cinase)
– piruvato desidrogenase fosfatase: reativa o PDC
Insulina
A insulina reverte essa inativação ativando a PD fosfatase promovendo
a síntese de acetil-CoA
As Reações do Ciclo de Krebs
Matriz Mitocondrial
1) Citrato Sintase
• Sintase: reação de condensação sem nucleosídeo trifosfato (ATP, GTP...) ou
outra origem de energia
1) Citrato Sintase
• Oxaloacetato (em amarelo) é o primeiro substrato a se ligar, e
promove uma mudança conformacional, criando um sítio de ligação
para o segundo substrato, o Acetil-CoA (em vermelho um análogo
da Acetil-CoA) = reação cinética seqüencial ordenada
1) Citrato Sintase
• Importância da ligação tioéster
2) Aconitase
• Isomerização de citrato a isocitrato via cis-aconitato
• Aconitase contêm um grupo ferro-enxofre 4Fe-4S
3) Isocitrato Desidrogenase
• Ocorre a primeira descarboxilação oxidativa com liberação com
conservação de energia na forma de NADH
• O CO2 eliminado vem do OAA não do acetil-CoA
4) a-Cetoglutarato Desidrogenase
• Perda do grupo carboxila na forma de CO2 e Energia de oxidação
conservada na ligação tioéster
5) Succinil-CoA Sintetase
• Energia livre de hidrólise da ligação tioéster do succinil-CoA forte e
negativa (-36 kJ/mol)
• Sintetase: reação de condensação com uso de nucleosídeos trifosfato
5) Succinil-CoA Sintetase
• Fosforilação a nível do substrato, como na
glicólise.
6) Succinato Desidrogenase
• Catalisa a desidrogenação estereoespecífica do succinato em fumarato
• Única enzima do ciclo que não se encontra solúvel na matriz
Malonato = inibidor competitivo
7) Fumarase
8) Malato Desidrogenase
• Regeneração do Oxaloacetato
Saldo Final
• 3 NADH
• 1 FADH2
• 1 GTP ou ATP
Componentes do TCA são importantes
intermediários anabólicos
Reações anapleróticas repõem os intermediários
O catabolismo de proteínas gera
diversos intermediários do TCA
Regulação do Ciclo de Krebs
No músculo cardiáco o flúxo de metabólitos no TCA é proporcional a taxa de
consumo de oxigênio :
3 níveis de regulação:
Piruvato carboxilase
-Disponibilidade de Substrao
-Inibição por acumulo de Produto
-Inibição competitiva retroativa
pelos intermediários
Velocidades da glicólise e do CK
são reguladas de maneira
integrada (NADH, ATP, Citrato)
Diabetes e formação dos corpos cetónicos...