Genómica
Licenciatura em Ciências Biomédicas
Departamento de Ciências da Saúde,
UCP
Fevereiro 2013
Sumário
3. Montagem de genomas
• Montagem hierárquica
• Montagem de genomas completos
• Montagem de genomas com base em
modelos
• Problemas associados à montagem dos
genomas
– Controlo de qualidade
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Montagem de genomas
• Após a sequenciação temos fragmentos (de
tamanhos que vão de 1000 a 40 pbs) que é
preciso reordenar na sequência original.
Sobreposições em média de duas
centenas de pares de bases. Equivale a
ter um puzzle de 30 milhões de peças
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Aumenta o número de peças para 2-3
triliões.
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Algumas das peças…
• Faltam
– Problemas na construção das bibliotecas
– Problemas com a amplificação por PCR
• Têm erros
– Zonas repetitivas
– Erros no PCR
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Aumentamos o nº de
vezes que cada peça é
sequenciada!
Entre 8 e 100 vezes
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A sequência (read) ideal
• É longa
• Não tem erros
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Podemos considerar 2 tipos
• Única (single read)
– Resulta da sequenciação do
fragmento em si.
• Emparelhada (paired read)
– Nestas leituras eu sei a
sequência das pontas e a
que distância estão uma da
outra.
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MONTAGEM HIERÁRQUICA OU DE
CLONES
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Abordagem usada para alinhar
grandes inserções clonadas
– Primeiro é
feito o
mapeamento
dos clones
por padrões
de digestão,
marcadores
de linkage ou
mutações
induzidas.
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Desse mapeamento….
• Escolhem-se os fragmentos a vermelho pois
implicam a menor sobreposição.
• É feita a sequenciação desses fragmentos:
– Cada sequenciação (read) é avaliada quanto à sua
qualidade.
– É reconstruida a sequencia inicial usando as
sobreposições.
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MONTAGEM DE GENOMAS
COMPLETOS
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Método mais aplicado atualmente
• Uma vez que a maioria da sequenciação já não
implica clonagem.
• Dispensa o passo do mapeamento.
• São sequenciadas as extremidades dos vários
fragmentos que são depois alinhadas.
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Desse alinhamento surge o “contig”
• Inclui 3 fases:
– Sobreposição
– Alinhamento
– Consenso
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Desse alinhamento surge o “contig”
A localização vai ser
determinada pela
homologia
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Vários contigs dão um scaffold
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ALGUNS ALGORITMOS DE
MONTAGEM DE GENOMAS
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Greedy
• Como a homologia é a única condição este
tipo de algoritmos é muito influenciado pelas
sequências repetitivas ou homologias.
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Overlap-Layout-Consensus
• Todas as sobreposições são mapeadas (Overlap)
• É eliminada a informação redundante (Layout)
• Usando a teoria de grafos é desenhado o mapa mais
simples e que corresponderá à organização inicial.
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Overlap-Layout-Consensus
• Pode ser substituído pelo: Align-Layout-Consensus
pois já há vários genomas de referência
sequenciados.
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CONTROLO DE QUALIDADE
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Em genomas de novo
• Não se sabe quase nada
– Nº de scaffolds e contigs que representam o
genoma.
– A proporção de reads que consegue ser
– O comprimento dos contigs e scaffolds
relativamente ao comprimento do genoma.
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N50
• Tamanho do contig mais curto acima do qual
se inclui 50% do genoma.
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Os vários algoritmos devem ser comparados
• Foi feita uma comparação no artigo GAGE:
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O algoritmo deve ter em conta
• Dependendo do organismo
– Tamanho diferente dos genomas
– Heterozigotia diferente
• Humanos (1 par de bases pair/1000)
• Lesmas do mar 1/50–100
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Independentemente do algoritmo…
• Entra lixo
• Sai lixo
– Muitos sequenciadores têm controlos de
qualidade para contaminações, quimeras e erros
de leitura.
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MONTAGEM COMPARATIVA
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Genomas de referência
Genomas de mesma espécie ou espécies
semelhantes que servem de modelo.
Os algoritmos tentam alinhar as sequências
obtidas ao que já está sequenciado
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PROBLEMAS NA MONTAGEM DE
GENOMAS
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Dificuldades
• Contaminação
– Sequências que não pertencem ao genoma que se quer sequenciar.
• Erros de montagem
– As sequências repetidas podem induzir os algoritmos de montagem
em erro. As secções podem ser montadas como mais curtas ou
sobrepostas pelo que desaparecem do genoma final.
• Homologia em grande escala.
– Nos genomas dos mamíferos há zonas com uma grande percentagem
de homologia (>90%) mas que são zonas diferentes do genoma. Como
a homologia éusada para fazer os alinhamentos as montagens
ficammal feitas.
• Polimorfismo genómico
– Dado que muitos genomas são poliploides a montagem de genomas
muitas vezes não consegue distinguir estes polimorfismos como
possibilidades alternativas do mesmo locus.
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Efeito das zonas repetidas
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Bibliografia
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genom
e/assembly/assembly.shtml
• http://www.cbcb.umd.edu/research/assembly
_primer.shtml
• Artigo: de novo genome assembly; GAGE
ambos na pasta
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