Espectrofotometria
Fernanda de Oliveira
Espectrofotometria
• Método de análise baseado em medidas de
absorção de radiação eletromagnética.
• Espectrofotometria Óptica
– Comprimento de onda corresponde a luz visível
ou ultra-violeta:
Fontes Luminosas
• Luz UV faixa de 200 a 400 nm
• Lâmpada de gás hidrogênio
• Mercúrio
Luz Visível : 400 e 800 nm
Tungstênio
Luz UV e Visível
• A absorção na região da luz depende da estrutura
eletrônica da molécula.
• Produz modificações da energia eletrônica da
molécula em consequência de transições dos
elétrons de valência.
• Estas transições fazem com que o elétrons excitado
passe do orbital molecular ocupado para o primeiro
orbital de energia superior.
Interação da radiação com a amostra
Requerimentos que devem ser observados para que uma
determinada radiação possa ser absorvida por uma
molécula:
A radiação incidente deve ser de frequência equivalente
aquela rotacional ou vibracional, eletrônica ou nuclear da
molécula,
Absorção de Radiação
• Os comprimentos de onda que uma certa
substância absorverão são característicos da
sua estrutura, diferindo de substância para
substância.
– DNA e RNA = 260nm
– Proteínas = 280nm
– Células bacterianas= 600nm
Absorção de Radiação
• Fenômenos que podem ocorrer com a
radiação luminosa: reflexão, refração,
espalhamento ou ser absorvida pelo material.
Transmitância
• Transmitância é a fração da luz incidente em
um comprimento de onda específico, que
passa por uma amostra de matéria.
T = I / I0
Absorbância
• É a capacidade do material em absorver
radiações em frequência específica.
A = - log10 T
Espectroscopia de Absorção
• É preciso determinar a quantidade de luz que a amostra irá
absorver, sendo descrito pela Lei de Beer-Lambert que é a
relação entre a intensidade da luz incidida na solução (I0) e a
intensidade da luz saindo da solução (I).
-log (I/Io) = A = cl
A = absorbância
 = absorvidade molecular ou coeficiente de extinção
c = concentração do material absorvedor
l = espessura da amostra através da qual a luz passa
Leis de absorção
Io
I1
I1 = 50
Io = 100
Io = 100
I1 = 50
Transmitânica = It/ Io
I2 = 25
T% = It/Io x 100
Lei de Lambert-Beer
• Intensidades da radiação incidente e
emergente podem ser relacionadas com as
concentrações do material presente na
solução.
– Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não
são considerados nessa lei.
– A radiação incidente deve ser monocromática
Lei de Lambert-Beer
• I0 = intensidade da radiação incidente
• I = intensidade transmitida pela amostra
I = I0 10-Ɛlc
= absorvidade molecular
coeficiente de extinção
ou
l = espessura da amostra através
da qual a luz passa
c = concentração do material
absorvedor
Fenômenos envolvidos quando um feixe (monocromático) de radiação incide
sobre uma cubeta contendo uma solução.
Io = Ir + Ie + Ia + It
Io = Ia + It
Io = Intensidade do feixe incidente,
Ir = Intensidade do feixe refletido, resultado das diferenças do índice de refração
entre o absorvedor e o ambiente,
Ie = Intensidade do feixe espalhado, resultado de um meio não homogêneo
(suspensão) e/ou de flutuações térmicas,
Ia = Intensidade do feixe absorvido pelo meio
It = Intensidade do feixe transmitido.
Lei de Lambert-Beer
• Transmitância:
T = I / I0
• Na lei de Lambert-Beer
T = 10-Ɛlc
Lei de Lambert-Beer
• Absorbância
A = - log10 T
• Na lei de Lambert-Beer
A = - log10 T = log10(1/T ) = log10(10-Ɛlc)
Representação gráfica da Lei de Beer, para soluções de KMnO4 em l = 545 nm e
um caminho óptico de 1 cm.
a) Em %Transmitância %T versus c
b) Em Absorbância A versus c
a/ε = absortividade/absortividade molar
b= caminho óptico
c= concentração
Espectro de absorção do permanganato de potássio
A amostra (1) tem 66mg/L de concentração.
As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para (0.8), (0.6), (0.4) e (0.2) da
concentração da primeira amostra, respectivamente.
Figura 1 - a. conjunto dos comprimentos de onda correspondentes ao
espectro de emissão de uma lâmpada de tungstênio-halogênio (luz branca);
b. região espectral transmitida por uma solução de azul de bromotimol e o
respectivo espectro de absorção; c. região espectral transmitida por uma
solução de solução amarela de fluoresceína e o respectivo espectro de
absorção.
a- Espectro de uma
lâmpada de luz
branca
b- Espectro de uma
solução aquosa de
azul de bromotimol 105 mol L-1 (laranja)
c - Espectro de uma
solução etanólica de
fluoresceína 10-5 mol L-1
(amarela)
Desvios da Lei de Beer-Lambert
• Desvios Químicos:
•  Deslocamento do equilíbrio: quando uma amostra
se dissocia, associa ou reage com um solvente para
formar um produto que tem espectro de absorção
diferente da amostra.
•  Dissociação de complexos: excesso ou
insuficiência de agente complexante.
Desvios da Lei de Beer-Lambert
• Desvios Instrumentais: em soluções muito
concentradas, as moléculas do soluto
influenciam umas às outras devido às suas
proximidades, pois quando ficam muito perto
umas das outras, a absortividade pode mudar
um pouco.
Espectrofotômetro
• É um instrumento que serve para medir a
intensidade da luz em função de um
comprimento de onda específico .
Esquema dos principais componentes de um
espectrofotômetro
• A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de quartzo
quando a radiação for na região espectral do ultravioleta.
• Quando for na região da luz visível usa-se os de vidro por ter
uma melhor dispersão.
• Os detectores devem ser altamente sensíveis.
• Os dados obtidos pelo detector são enviados para um
dispositivo de processamento de dados.
Cubetas
• Espectrofotometria de Luz Visível
– Cubeta de Vidro ou Plástico
• Espectrofotometria de Luz Ultra- Violeta
– Cubeta de Quartzo
• Etapas:
1º) Coloca-se o solvente (branco) no caminho
ótico e mede-se a intensidade da energia
radiante,que atinge o detector;
2º) Substitui-se o recipiente com o solvente
(branco) pelo recipiente com a amostra e fazse a determinação propriamente dita da
absorbância.
(a) lâmpada de deutério/tungstênio; (b) lente da fonte; (c) obturador; (d) amostra;
(e) lente espectrográfica; (f) fenda; (g) rede de difração; (h) arranjo de detectores
Diagrama de um espectrofotômetro
Esquema óptico de um espectrofotômetro com detector de arranjo de diodos
Há duas fontes de radiação, as lâmpadas de deutério e de tungstênio, cujas emissões são focalizadas através de
uma lente sobre a amostra.
A radiação incidente será, em parte, absorvida. Esta radiação que atravessou a amostra (transmitida ou
emergente) irá incidir sobre uma lente que focaliza o feixe sobre uma fenda, e desta sobre uma grade de
difração.
Esta grade irá difratar a radiação, separando os seus diferentes comprimentos de onda, sendo que cada um
deles irá incidir sobre um diodo do arranjo. Este diodo, ao ser irradiado, produz uma corrente elétrica cuja
magnitude depende da intensidade da emissão (novamente aqui se aplica o efeito fotoelétrico).
Através de um circuito de calibração adequado, esta corrente será transformada em absorbância nos diferentes
comprimentos de onda, resultando no que se convenciona chamar de espectro de absorção.
Exemplos de Fontes de Exemplos de
Fontes de Radiação
• Lâmpada de filamento de tungstênio;
• Lâmpada de quartzo-iodo;
• Lâmpada de descarga de hidrogênio ou de
deutério;
• Lâmpada de cátodo oco
• Laser
* Normalmente usa-se a lâmpada de deutério para
comprimentos de onda entre 180 a 370nm.
Monocromadores
• Função: seleção do comprimento de onda em que se tem interesse para a
análise.
• Constituição:
 fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação
 fenda de saída
• Tipos:
 prismático
 reticuladores
Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma:
(a) esquema e (b) fotografia.
Exemplo de difração de luz produzida
na natureza.
Monocromador Prismático
• A radiação policromática vinda da fonte de radiação
passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de
um prisma, sofrendo um desvio.
• Os vários comprimentos de onda terão diferentes
direções após a incidência no prisma. Se for realizado
um ajuste rigorosamente controlado da fenda de
saída, pode-se selecionar o comprimento de onda
desejado.
Monocromador Prismático
• Espectrofotômetros mono-feixe
- Não são cômodos pois a amostra e o branco tem que ser
colocados alternadamente no único feixe de radiação;
- Não é adequado para medir absorbâncias em função do
tempo.
Monocromador Reticular
• O principal elemento dispersante é a rede de difração. Essa
rede consiste em uma placa transparente ou refletora com
muitas ranhuras paralelas e equidistantes.
• Dispersão resultante desta rede é linear. Os vários
comprimentos de onda dispersos são igualmente espaçados,
por isso a fenda de saída isolará uma banda de radiação de
largura constante.
• A resolução é muito mais elevado que os prismas.
Monocromador Reticular
Espectrofotômetro mono-feixe
• Espectrofotômetros mono-feixe:
- Não são cômodos pois a amostra e o branco
tem que ser colocados alternadamente no
único feixe de radiação;
- Não é adequado para medir absorbâncias
em função do tempo;
Espectrofotômetro duplo-feixe
•
Dois feixes de radiação são formados no espaço por um espelho.
• Um feixe passa através da solução referencia (branco) até o transdutor e outro,
ao mesmo tempo, passa através da amostra até o segundo transdutor.
• As duas correntes serão determinadas, calcula-se a diferença de transmitância
entre os dois feixes.
Espectrofotômetro duplo-feixe
Espectrofotômetro duplo-feixe
Detectores
Fotografias de arranjos de
diodo com 1024
elementos (detectores de
diodo):
a. vista de topo;
b. vista de perfil.
Esquema (a) e fotografia (b) do tubo
fotomultiplicador HAMAMATSU - R928
Procedimentos Analíticos em
Espectrofotometria Visível em
Ultravioleta
• Análise Qualitativa: dependendo de quanto de
luz que a amostra absorver vai determinar
qual é a espécie, pois o espectro é
característico daquela determinada espécie
química.
Procedimentos Analíticos em
Espectrofotometria Visível em Ultravioleta
• Análise Quantitativa: dependendo da absorbância irá
determinar a concentração da amostra.
• A condição especial para qualquer determinação
quantitativa é a observação à Lei de Beer-Lambert,
mas o controle do pH, as técnicas de extração por
solventes, o ajuste do estado de oxidação, entre
outras também são muito importantes.
Espectro de Proteínas
• Espectro é bastante
característico.
• São influenciados pelo meio
local: dependem de
fenômenos elétricos.
• Mostra a quantidade de
hélice- e folha-
• Caso a proteína seja
desnaturada, a
espectroscopia será
diferente.
Infravermelho
• IV – maior que 780 nm
• Utilizada em grande escala para identificação de compostos,
sendo um método sensível e rápido.
• Fornece informação sobre grupos funcionais de moléculas.
• É o registro da energia envolvida no processo de vibração
molecular.
• Ocorre um estiramento das ligações, que se esticam e
relaxam, devido as vibrações provocadas aos átomos.
Fluorescência e Fosforescência
• Fluorescência é a emissão de luz associada com elétrons que
se movem de um estado excitado para o estado fundamental.
• Fosforescência é a capacidade que uma espécie química tem
de emitir luz.
• Importante porque algumas substâncias quando sujeitas às
radiações ultravioleta emitem luz visível.
• As duas são frequentemente muito mais úteis para se estudar
processos biológicos do que a absorbância, por serem
consideravelmente mais sensíveis, podendo, então, detectar
concentrações bastante baixas.
Espectro de Massas
• Fornece informações a respeito do peso
molecular da substância, baseado na
fragmentação da molécula após um
bombardeio de feixe de elétrons.
• Desvantagem de não diferenciar moléculas
isômeras.