Isolamento e Identificação de Legionella spp.
Milton Costa
Departamento de Ciências da Vida, Universidade de Coimbra
e
Biocant – Associação de Transferência de Tecnologia, Cantanhede
Primeiros passos
Prof. Luis de Oliveira, Director Clínico das Termas do Luso, pretende saber se existem legionelas
nastermas. Fui fazer um curto estágio no PHLS, Porton Down, UK com Julian Dennis.
Primeiros isolamentos de Legionella spp. em tabuleiros de água morna na unidade de
prematuros no Hospital Pediátrico de Coimbra.
Veríssimo, A., G. Vesey, M. G. Rocha, G. Marrão, J. Colbourne, P. J. Dennis & M. S. da Costa. (1990) A hot water
supply as the source of Legionella pneumophila in incubators of a neonatology unit. Journal of Hospital Infections, 15:
255-263.
O António Verissimo e eu relacionámos as temperaturas de isolamento de Legionella com
temperatura de nascentes termais e decidimos saber se colonizavam nascentes termais.
Veríssimo, A., G. Marrão, F. Gomes da Silva & M. S. da Costa. (1991) Distribution of Legionella spp. in hydrothermal
areas in Continental Portugal and on the Island of S. Miguel, Azores. Applied and Environmental Microbiology, 57:
2921-2927.
As espécies do género Legionella
•L. adelaidensis
•L. anisa
•L. belardiensis
•L. birminghamensis
•L. bozemanii
•L. brunensis
•L. busanensis
•L. cherrii
•L. cincinnatiensis
•L. drancurtii
•L. dresdenensis
•L. drozanskii
•L. dumoffii
•L. erythra
•L. fairfieldensis
•L. fallonii
•L. feeleii
•L. geestiana
•L. gormanii
•L. gratiana
•L. gresilensis
L. hackeliae
L. impletisoli
L. israelensis
L. jamestowniensis
L. jordanis
L. lansingensis
L. londiniensis
L. longbeachae
L. lytica
L. maceachernii
L. massiliensis
L. micdadei
L. moravica
L. nagasakiensis
L. nautarum
L. oakridgensis
L. parisiensis
L. pneumophila
L. quateirensis
L. quinlivanii
L. rowbathamii
L. rubrilucens
L. sainthelensi
L. santicrucis
L. shakespearei
L. spiritensis
L. steigerwaltii
L. tauriensis
L. tucsonensis
L. tunisiensis
L. wadsworthii
L. waltersii
L. worsleiensis
L. yabuuchiae
Cerca de 22 espécies associadas a doença
Imunofluorescência indirecta
Anticorpos Policlonais
Anticorpos Monoclonais para L. pneumophila
L. pneumophila sg 1
L. pneumophila sg 2
L. pneumophila sg 3
L. pneumophila sg 4
L. pneumophila sg 5
L. pneumophila sg 6
L. pneumophila sg 7
L. pneumophila sg 8
L. pneumophila sg 9
L. pneumophila sg 10
L. pneumophila sg 11
L. pneumophila sg 12
L. pneumophila sg 13
L. pneumophila sg 14
L. pneumophila sg 15
MAB 1
MAB 2
MAB 3
W32
33G2
32A12
144C2
L. bozemanii sg1
L. bozemanii sg2
L. erythra
L. feelei sg1
L. feelei sg2
L. israelensis
L. jamestowniensis
L. jordanis
L. longbeachae sg1
L. longbeachae sg2
L. rubrilucensis
L. micdadei
L. santicrucis
L. spiritensis
L. steigerwaltii
L. wadsworthi
L. dumofii
L. gormanii
L. oakridgensis
L. londiniensis
L. moravica
L. nautorum
W29
P4C3
P9C3
P 13-15
W36
W32
4032
W39
JR5
K1 G6
Um flagelante
Processar amostras
Amostra de água
Norma ISO 11731
Filtração
Concentrado
Directo
Tratamento
calor
Tratamento
ácido
Espalhamento em GVPC ou BCYE
Incubação a 37ºC, 3 a 10 dias
ou
a temperaturas mais baixas
Identificação presumptiva
Norma ISO 11731
Visualização das colónias suspeitas
Identificação presumptiva de Legionella spp.
BCYE
BCYE sem cisteína
Purificação
Preservação
Identificação
Latex Ser1, Ser2-14, Ser2-15
Ácidos gordos ou 16s rRNA
Identificação de Legionella a partir dos perfís proteicos
Veríssimo, A., P. V. Morais, A. Diogo, C. Gomes & M. S. da Costa. (1996) Characterization of Legionella species by
numerical analysis of whole-cell protein electrophoresis International Journal of Systematic Bacteriology, 46: 41-49.
Identificação de Legionella pelos ácidos gordos
6790 amostras examinadas entre 1997 e 2013 para
legionelas.
Cerca de 1600 estirpes de Legionella identificadas pela
análise dos ácidos gordos.
Este banco de dados, foi adoptado pela MIDI e estamos
agora acreditadso o método dentro da Norma ISO 11731 e
prNP4422.
Em casos de dúvida podemos pesquisar o gene dotA for
PCR para confirmar L. pneumophila. De 375 estirpes de
Legionella, só
Temos conservadas todas as estirpes de espécies de
Legionella isoladas desde. As não-pneumophila, mais
isoladas pertencem a L. oakridgensis, L. londiniensis, L.
parisiensis, L. steigerwaltii
Diogo, A., A. Veríssimo, M. F. Nobre & M. S. da Costa. (1999).
Usefulness of fatty acid composition for the differentiation of Legionella
species. Journal of Clinical Microbiology, 37: 2248-2254.
Aquicella lusitana e Aquicella siphonis
“Algumas coisas não são aquilo que parecem”
Santos, P., I. Pinhal, F. A. Rainey, N. Empadinhas, J. Costa, B. Fields, R. Benson, A. Veríssimo & M. S. da Costa
(2003). The Gamma-Proteobacteria, Aquicella lusitana gen. nov., sp. nov. and Aquicella siphonis, sp. nov., infect protozoa
and require activated charcoal for growth in laboratory media. Applied and Environmental Microbiology, 69:6533-6540.
Aquicella lusitana e Aquicella siphonis
“Algumas coisas não são aquilo que parecem”
Parentes mais próximos são Rickettsiella (doença em insectos).
Rickettsiella spp., parasitas intracelulares, nunca foram cultivadas.
Legionella spp. e Aquicella spp. são cultiváveis.
Aquicella spp.
Crescem só em meios com carvão, extracto de levedura e a-cetoglutarato ou piruvato.
Crescimento aeróbio ou microaeróbio.
Não cresce em anaerobiose.
Aquicella lusitana e Aquicella siphonis
“Algumas coisas não são aquilo que parecem”
Este processo permitiu-nos examinar várias
condições de crescimento de Legionella e Aquicella
que não seria possível com meios sólidos contendo
carvão.
Gama de temperatura de crescimento,
Gama de pH de crescimento,
Substratos assimilados,
Meio de cutura
líquido
Espaçamento de
agar
Carvão Activado
Aquicella lusitana e Aquicella siphonis
“Algumas coisas não são aquilo que parecem”
Thermomonas
hydrothermalis
pH 9.0
Meiothermus cerbereus
pH 10.0
Albidovulum inexpectatum
Legionella oakridgensis
Legionella anisa
Aquicella lusitana
Aquicella siphonis
5.0
6.0
7.0
pH
8.0
Aquicella lusitana e Aquicella siphonis
“Algumas coisas não são aquilo que parecem”
Hartmannella vermiformis
Aquicella spp. infectam Hartmanella vermiformis
Infecção crónica (103/cell),
não é aguda (105-106/cell) como Legionella spp.
Aquicella lusitana
Aquicella siphonis
Células humans infectadas
com Legionella
Aquicella spp. não infectam macrófagos humanos
Aquicella lusitana e Aquicella siphonis
“Algumas coisas não são aquilo que parecem”
1
2
3
4
5
1
mip gene
2
3
4
5
6
7
dotA gene
2642 bp
500 bp
697 bp
1- Marker
2- Sgt 39 (Aquicella)
3- Sgt 108 (Aquicella)
4- L. pneumophila
5- L. anisa
1- Marker
2- L. pneumophila
3- L. anisa
4- Sgt 39 (Aquicella)
5- Sgt 50 (L. pneumophila)
6- Sgt 59 (L.pneumophila)
7- Sgt 108 (Aquicella)
AS PESSOAS E AS ORGANIZAÇÔES FINANCIADORAS
António Verissímo
Fernanda Nobre
Joana Costa
Graça Rocha
Gina Marrão
Alexandra Diogo
Paula Morais
Richard Bowker
Barry Fields
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Sociedade das Águas de Luso, SA
Cinágua