UNIVERSIDADE ESTADUAL
DO CEARÁ-UECE
LABORATÓRIO DE
BIOQUÍMICA HUMANA
Maria Izabel Florindo Guedes
Grupo de Pesquisa: Grupo de Inovação
Biotecnológica em Saúde
Maria Izabel Florindo Guedes
Desenvolvimento
de
vacina
contra a Dengue em Tecnologia
Vegetal
Por que a Dengue?
• Estima-se que 50 a 100 milhões de casos
• Brasil é líder absoluto de casos de dengue da
América Latina (~60% do total)
• Ceará –54.000 casos em 2013.
Vacinas contra Dengue
O As
primeiras iniciativas de produzir
vacinas contra o dengue surgiram há
mais de 50 anos.
O Desde a década de 70, a OMS tem
incentivado o desenvolvimento de
estudos na produção de vacinas contra o
dengue.
Obstáculos que desafiam os
pesquisadores
O Necessidade de uma vacina tetravalente com
O
O
O
O
proteção duradoura.
Resposta imune e patogenia.
Possibilidade de mutações dos vírus
selvagens.
Riscos de mutações de vírus vacinais e
infecção dos vetores por vírus vacinais.
Falta de um modelo animal para testar a
efetividade da vacina.
Estratégias para superar os
obstáculos?
Produção em plantas
O Plantas transgênicas
O Cultura de célula vegetal
O Cloroplastos
O Produção transiente
Vantagens
O Ausência de risco de contaminação
com patógenos que infectam o homem
e outros animais.
O Baixo custo de produção.
O Possível produção em grande escala.
O Célula eucariótica (modificações póstradução corretas).
•
Arbovírus (Arthropode Borne Virus)
•
Família: Flaviviridae
•
Gênero: Flavivirus
•
Genoma: + SS com RNA (11 kb)
•
Virion envelopado
•
Icosaédrico (40 a 50 nm)
•
Virus complexo (1-4 sorotipos)
v
C
E
M
RNAss
ETAPAS: NA PRODUÇÃO DE VACINAS
1-Alinhamento dos quatro sorotipos do Vírus do
Dengue
2-Escolha da região da proteína E mais
imunogênica
3-Confecção dos oligonucleotídeos
4-PCR
5-purificação dos fragmentos multiplicados
6-Inserção dos fragmentos no cDNA do Vírus de
planta (vetor)
7-Sequenciamento
8-Inoculação em plantas
9-Purificação das proteínas do vírus do dengue
10-Imunizaçaõ de camundongos
Alinhamento do EDIII do vírus dengue (em destaque os resíduos de cisteína)
Vetor baseado no Vírus do Mosaico do caupi (CPMV)
PNC-1
+
PNC-2
INFECÇÃO
Poli-proteína viral
Peptídeo de clivagem
(liberação de proteína exógena)
Vírus de planta
Gene X
Terminador
Gene Y
 2.000 bp
Gene Z
ApaI
StuI
Domínio III
(EDIII)
Proteína E
Vírus Dengue
Proteína E
Plasmídeo binário baseado
em vírus vegetal
Alinhamento do EDIII do vírus dengue (em destaque os resíduos de cisteína)
*
EDIII-1
EDIII-2
EDIII-3 Quim 1-2-3
P
P
P
S
S
S
P
S
41 kDa
Expressão de proteína
quimérica em modelo
procarionte
15 kDa
Westernblot com anticorpo
monoclonal anti-His
Foto mostrando a inoculação de plantas de Vigna unguiculata, com o
plasmídeo CPMV contendo o inserto 2/9 da proteína E do (DEN-2).
Planta de Vigna unguiculata L. (feijão-de-corda) infectada com
o inserto (DEN-2 ),
10 dias após a inoculação. A planta
apresenta os sintomas característicos do vírus CPMV.
Planta de Vigna unguiculata L. (feijão-de-corda) mecanicamente inoculadas com extrato
de plantas infectadas com o inserto Isaac (DEN-1 inserido no Pbin-3), 20 dias após a
inoculução do plasmídeo.
Sistema de produção de antígeno quimérico contendo o Domínio
III da proteína E dos diferentes sorotipos de vírus dengue.
Domínio III
(EDIII)
Proteína E
Vírus Dengue
Proteína E
EDIII
Den-1
Plasmídeo receptor
(adição de His-Tag)
EDIII
Den-2
EDIII
Den-3
EDIII
Den-4
Proteína quimérica
Primers de transporte
F
Expressão procarionte
R
Expressão em plantas
Vacina de DNA
Alinhamento do EDIII do vírus dengue (em destaque os resíduos de cisteína)
*
EDIII-1
EDIII-2
EDIII-3 Quim 1-2-3
P
P
P
S
S
S
P
S
41 kDa
Expressão de proteína
quimérica em modelo
procarionte
15 kDa
Westernblot com anticorpo
monoclonal anti-His
Purificação das Proteínas Recombinantes
Eletroforese SDS-PAGE com proteína E do vírus dengue produzidas em
Planta de Vigna unguiculata L. (feijão-de-corda):1-marcador de PM, 2-DENcérebro de camundongo, 3-Planta sadia e 4 a 10 proteína E recombinante
produzida em feijão-de-corda.
M 1
2
3
97
66
45
30
20.1
FIGURA-4:Eletroforese SDS PAGE em gel 12%. M- Marcador de peso
molecular, 1- extrato da planta infectada com PNC 3+ inserto Dengue, 2Planta sadia e 3- Extrato de planta infectada com PNC- RNA-2 contendo o
inserto Dengue.
Western blotting, com anticorpos anti-dengue comercial: 1 e 3- Extrato de
plantas infectadas com PNC- RNA-2 contendo o inserto dengue, 2-Extrato
Planta sadia.
A
B
Western blotting- A: com anticorpo monoclonal anti-histidina
comercial e B: anticorpos policlonais anti-dengue contra proteína E
do vírus dengue produzidas em Planta de Vigna unguiculata L. (feijãode-corda)
Resposta imunológica induzida pelas
proteínas purificadas das plantas
-Os anticorpos produzidos pelas vias
subcutânea
e
Oral
reconheceram
especificamente os quatro sorotipos (vírus
purificado).
FIGURA-6: Teste Enzyme linked immunossorbent assay (ELISA) com anticorpos
policlonais anti-Dengue, mostrando reações específicas contra diferentes peptídeos
produzidos em plantas de Vígna unguiculata L. : A-Fragmento da Proteína E DEN-2, BFragmento da Proteína E DEN-1; C- Vírus dengue purificado do cérebro de camundongo
(controle +); D- Extrato planta infectada com vetor baseado no vírus CPMV sem o inserto;
E-Extrato de planta de V. unguiculata Sadia (não infectada). As letras (a-d) significam
diferença significativa (P< 0,05 de acordo com teste de Tukey).
Vantagens para a população
1-Representa o controle de uma doença
que mata milhares de pessoas por ano.
2-Utiliza método que não agride o meio
ambiente.
3-Via de imunização não invasiva.
4-Baixo custo.
Abre perspectiva para a produção de vacinas
comestíveis
!!!
Empresa de produtos biotecnológicos,
desenvolvidos em plataformas vegetais.
A Greenbean produz proteínas recombinantes
para o desenvolvimento de kits de diagnósticos,
fármacos, vacinas, bem como desenvolve
alimentos funcionais para atender os mercados
humano e animal.
[email protected]
Fundada por um grupo de pesquisadores
multidisciplinares da Universidade Estadual do
Ceará (Uece), a Greenbean encontra-se
registrada e incubada na incubadora de
empresas da universidade, atuando nas áreas
de biotecnologia, imunologia, microbiologia,
bioquímica e biologia molecular.
[email protected]
 Proteína E (quatro sorotipos do vírus do
dengue)
 Proteína NS1 ( quatro sorotipos do vírus do
dengue)
 Proteína do vírus da Hepatite C
 Proteína P28 do CAEV (Encefalite caprina)
 Interferon alfa
 Proteínas sob encomenda
[email protected]
CNPq e CAPES
OBRIGADA!!!