UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MARIA LIDUÍNA MAIA DE OLIVEIRA MODULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE-INFLAMATÓRIA E CICATRICIAL EM MODELOS EXPERIMENTAIS PROMOVIDA PELO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia sidoides Cham., RICO EM TIMOL, E PELO ÓLEO FIXO DE Cucurbita pepo L. RICO EM ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS -6 E -9 FORTALEZA – CEARÁ 2013 MARIA LIDUÍNA MAIA DE OLIVEIRA MODULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE-INFLAMATÓRIA E CICATRICIAL EM MODELOS EXPERIMENTAIS PROMOVIDA PELO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia sidoides Cham., RICO EM TIMOL, E PELO ÓLEO FIXO DE Cucurbita pepo L. RICO EM ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS -6 E -9 Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias do Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro. FORTALEZA – CEARÁ 2013 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho Bibliotecária Responsável –Thelma Marylanda Silva de Melo- CRB-3 / 623 O48m Oliveira, Maria Liduína Maia de Modulação da resposta imune-inflamatória e cicatricial em modelos experimentais promovida pelo óleo essencial de Lippia sidoides Cham., rico em timol, e pelo óleo fixo de Cucurbita pepo L., rico em ácidos graxos insaturados -6 e -9 / Maria Liduína Maia de Oliveira. -- 2013. CD-ROM. 142 f. : il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol. “CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm)”. Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Doutorado em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2013. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof.ª Dr.ª Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro. 1. Óleos vegetais. 2. Ácidos graxos insaturados. 3. Inflamação. 4. Cicatrização. 5. Biomarcadores imunológicos. I. Título. CDD: 574.192 À Deus-Pai Misericordioso; Aos meus pais, Francisco Gutemberg de Oliveira e Hélia Maria Maia de Oliveira. Dedico. AGRADECIMENTOS À Deus, pai supremo e fidedigno, por sua infinita misericórdia e bondade, por ter me dado forças diante das adversidades, permitindo eu concluir mais esta etapa da minha vida. A todos os animais, especialmente àqueles utilizados em estudos científicos. À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo apoio financeiro concedido durante o Doutorado. À Profa. Dra. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro, pelo seu entusiasmo com a pesquisa científica, por sua inestimável orientação, colaboração, compreensão, incentivo, ensinamentos e acima de tudo pela amizade e apoio nos momentos mais difíceis e ao longo de toda minha vida acadêmica, meus eternos agradecimentos. À Profa. Dra. Virgínia Cláudia Carneiro Girão pela colaboração junto ao Núcleo de Estudos em Microscopia e Processamento de Imagens (NEMPI) do Departamento de Morfologia da UFC, permitindo a realização de etapas fundamentais na execução deste trabalho; e pela valiosa contribuição na correção dos artigos científicos. À Profa. Dra. Adriana Rocha Tomé por estar sempre disposta a ajudar e pela importante colaboração na etapa de finalização deste trabalho. À Profa. Dra. Dirce Fernandes de Melo pela longa parceria e colaboração junto ao Laboratório de Bioenergética da UFC. À Profa. Dra. Érika Freitas Mota e à Profa Dra. Selene Maia de Morais por sempre estarem disponíveis em ajudar por meio de sugestões, discussões e apoio técnico em seus laboratórios de pesquisa. À Neuza Félix Gomes Rochette pela ajuda, presteza e atenção e, sobretudo, pela amizade compartilhada ao longo do período da pós-graduação. A todos os colegas do Laboratório de Imunologia e Bioquímica de Animais (LIBA), em especial à Belise Maria Oliveira Bezerra e Luana Oliveira Leite, pelo convívio harmonioso, amizade e imensa colaboração na execução deste trabalho. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) da UECE, pelos conhecimentos e experiências compartilhados, em especial em especial ao Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha e ao Prof. Dr. Davide Rondina, que coordenaram o Programa durante o período do Doutorado. Aos funcionários do PPGCV e da Faculdade de Veterinária (FAVET), em especial à Adriana Maria Sales, Joélia Carlota Amorim, Maria Eudócia Albano e Zirlene Nascimento Machado, por estarem sempre dispostas a ajudar e fornecer palavras amigas durante todos esses anos de convívio. Aos meus pais, Francisco Gutemberg de Oliveira e Hélia Maria Maia de Oliveira, que são meus pilares de sustentação e maiores incentivadores, por todo amor e dedicação, e por estarem sempre ao meu lado, me apoiando em qualquer situação. Aos meus irmãos, Arquimedes Maia de Oliveira, pela amizade e companheirismo, e Catarina Áurea Maia de Oliveira (in memorian), que com certeza intercedeu por mim junto ao Pai nos momentos de angústia e aflição. Ao Carlos Alberto Carneiro, por todo amor, carinho, compreensão e atenção dedicados a mim, sempre me incentivando em meu crescimento profissional. Às minhas avós, Francisca Barreto de Oliveira e Salete Maria Maia, pelos exemplos de vida e dedicação, que me dão forças para nunca desistir diante das dificuldades. A vocês, todo meu amor e gratidão. À minha amiga Walciany Barbosa Eleutério Andrade, por todos os momentos de descontração e pelos laços de amizade e fraternidade indescritíveis. Aos colegas da Agência de Defesa Agropecuária do Estado Ceará (ADAGRI), pela amizade, apoio e incentivo necessários à conclusão deste trabalho. Às demais pessoas que não foram aqui mencionadas, mas que contribuíram direta ou indiretamente em mais uma etapa da minha realização profissional. RESUMO Diversas plantas medicinais são fontes de óleos essenciais, constituídos principalmente por componentes voláteis, e óleos fixos, ricos em ácidos graxos insaturados (AGI). Estes óleos e seus constituintes são relatados por atuar como importantes agentes moduladores da resposta imunológica. Lippia sidoides apresenta propriedades antimicrobianas e anti-inflamatórias, enquanto não foram descritas atividades biológicas sobre a resposta imune-inflamatória para Cucurbita pepo. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do óleo essencial de L. sidoides e óleo fixo de C. pepo sobre a inflamação tópica e a cicatrização cutânea em modelos experimentais in vivo. Os óleos vegetais foram submetidos a análises químicas e utilizados para elaboração de curvas dose-resposta. Testes de irritação à pele foram conduzidos para verificar a segurança da aplicação tópica dos óleos vegetais sobre a pele em diferentes condições fisiológicas. Os efeitos sobre a inflamação tópica foram avaliados em modelos de inflamação aguda e crônica induzida por diferentes agentes flogísticos em camundongos, através de análises morfométricas e histológicas, utilizando dexametasona e indometacina como drogas de referência. Para avaliar os efeitos sobre a cicatrização, utilizou-se o modelo de feridas por excisão cutânea em ratos e camundongos, as quais foram avaliadas através de análises morfométricas, histológicas e imunohistoquímicas. O óleo essencial de L. sidoides, rico em timol (71,0%), apresentou efeito irritativo sobre a pele, promovendo uma resposta inflamatória cutânea. Entretanto, quando usado em concentrações adequadas, esse efeito pró-inflamatório favoreceu o processo de cicatrização de feridas. Por outro lado, o óleo fixo de C. pepo foi capaz de inibir a inflamação tópica induzida por xileno (69,6%), TPA (78,7%) e oxazolona (60,8%) de maneira dose-dependente (p<0,05), e essa inibição foi similar a, no mínimo, uma droga de referência (p>0,05). Esse óleo diminuiu os parâmetros inflamatórios, como o número de mastócitos (p<0,05) no tecido inflamado. Além disso, o óleo fixo de C. pepo reduziu a expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2) e aumentou relativamente a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) durante a cicatrização de feridas cutâneas. Esses efeitos podem estar associados a proporção promissora de AGI presentes nesse óleo, especialmente 6 (55,8%) e -9 (23,5%). Em conjunto, esses resultados permitem indicar o uso do óleo essencial de L. sidoides e do óleo fixo de C. pepo como agentes terapêuticos alternativos para tratamento tópico de lesões cutâneas em diferentes condições fisio-patológicas. Palavras-chave: Óleos vegetais; Ácidos graxos insaturados; Inflamação; Cicatrização; Biomarcadores imunológicos. ABSTRACT Several medicinal plants are sources of essential oils, which are constituted mainly of volatile components; and fixed oils, which are rich in unsaturated fatty acids (UFAs). These oils and their constituents are reported to act as important agents that modulate the immuneinflammatory response. Lippia sidoides presented antimicrobial and anti-inflammatory activities, while biological activities on the immune-inflammatory response were not described for Cucurbita pepo. The aim of this study was to evaluate the effects of the essential oil of L. sidoides and fixed oil of C. pepo on topical inflammation and skin wound healing in experimental models in vivo. Vegetable oils were submitted to chemical analysis and used for the preparation of dose-response curves. Skin irritation tests were conducted to verify the topical safe use of vegetable oils on skin in different physiological conditions. The effects on topical inflammation were assessed by morphometric and histological analyses in acute and chronic inflammation models induced by different phlogistic agents in mice. Dexamethasone and indomethacin were used as reference drugs. To evaluate the effects on wound healing, we used the excision wound model in rats and mice skin, which were evaluated by morphometric, histological and immunohistochemical analyses. The essential oil of L. sidoides, rich in thymol (71.0%), presented an irritant response to skin by the mounting of local inflammatory response. However, when this oil was used in adequate concentrations, the pro-inflammatory effect was favorable to the wound healing. On the other hand, C. pepo fixed oil was able to inhibit topical inflammation induced by xylene (69.6%) TPA (78.7%) and oxazolone (60.8%) in a dose- dependent manner (p<0.05), and this inhibition was similar to, at least, one reference drug (p>0.05). This oil reduced the inflammatory parameters of inflamed tissue, as well as reduced the number of mastocytes in the inflammatory infiltration (p<0.05). In addition, C. pepo fixed oil reduced the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and relatively increased the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) during cutaneous wound healing. These effects may be associated to promising proportion of UFAs present in this oil, especially -6 (55.8%) and -9 (23.5%). Taken together, these results indicated the use of essential oil of L. sidoides and fixed oil of C. pepo as alternative therapeutic agents for the topical treatment of cutaneous lesions in different physiological and pathological conditions. Keywords: Vegetable oils; Unsaturated fatty acids; Inflammation; Wound healing; Immunological biomarkers. LISTA DE TABELAS REVISÃO DE LITERATURA Tabela 1. Principais tipos celulares e mediadores envolvidos na cicatrização.................... 22 ARTIGO I Table 1. Percentage composition of EOLS obtained by gas chromatography/mass spectrometry.........................................................................................................57 Table 2. Effects of essential oil of L. sidoides (EOLS) on wound contraction by excision wound model......................................................................................... 58 ARTIGO II Table 1. Fatty acids composition of PSO obtained by gas chromatography/mass spectrometry.........................................................................................................76 Table 2. Topical anti-inflammatory effect of pumpkin seed oil (PSO) and reference drugs in acute and chronic models of inflammation at the end of the experimental period............................................................................................. 77 Table 3. Topical effect of pumpkin seed oil (PSO) and reference drug on absolute number of mastocytes in acute and chronic models of inflammation................. 78 ARTIGO III Table 1. Fatty acids composition of pumpkin seed oil (PSO) and reference oil obtained by gas chromatography/mass spectrometry......................................................... 98 Table 2. Effect of pumpkin seed oil (PSO) on wound healing by excision wound model 99 Table 3. Histological evaluation of wound healing process in different groups of treatment per biopsy day...................................................................................... 100 LISTA DE FIGURAS REVISÃO DE LITERATURA Estrutura molecular dos principais ácidos graxos encontrados em óleos Figura 1. vegetais........................................................................................................... 32 39 Figura 2. Lippia sidoides Cham.............................................................................. Figura 3. Curcubita pepo L. Aspecto geral da planta com ramas e do fruto.................... 40 ARTIGO I Fig. 1. Effect of topical treatment with essential oil of L. sidoides (EOLS) at different concentrations in skin irritation models: (A) one-dosage irritation to healthy skin; (B) multiple-dosage irritation to healthy skin; (C) irritation to damaged skin......................................................................................................................... 59 Fig. 2. Evaluation scores on the skin irritation response of Swiss mice to the application of essential oil of L. sidoides (EOLS) at different concentrations in three models: (I) one-dosage irritation to healthy skin; (II) multiple-dosage irritation to healthy skin; (III) irritation to damaged skin. (A) edema and (B) erythema scores were obtained on day 3 time course............................................ 60 Fig. 3. Skin sections in the group treated with EOLS 100% (A, B and C) and EOLS 50% (D) on day 7 in different skin irritation models: (A) one-dosage irritation to healthy skin; (B) multiple-dosage irritation to healthy skin; (C) and (D) irritation to damaged skin. (a) epidermal discontinuity; (b) inflammatory cells infiltration; (c) ulcer; (d) fibroblast proliferation; (e) epidermal thickening with keratinocytes proliferation. Haematoxylin and eosin staining. Original magnification: 200x. Scale bar: 100 μm................................................................ 51 Fig. 4. Wound severity scores for lesions treated with essential oil of L. sidoides (EOLS) ointments in excision wound model. (A) edema and (B) exudation scores were assessed on days 1-3 and days 1-5, respectively................................ 62 ARTIGO II Figure 1. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO), indomethacin (Indo) and dexamethasone (Dexa) on xylene (Xyl)-induced ear edema in mice. Ear edema was measured at 1 h after induction of inflammation in both ear thickness (A) and tissue weight (B). The positive control only received acetone topically after the challenge with xylene............................................. 79 Figure 2. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO), indomethacin (Indo) and dexamethasone (Dexa) on TPA-induced ear edema in mice. Ear edema was measured at 4 h after induction of inflammation in both ear thickness (A) and tissue weight (B). The positive control only received acetone topically after the challenge with TPA............................................................................. 80 Figure 3. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone (Dexa) on oxazolone (Oxa)-induced chronic dermatitis in mice. The responsiveness of treatments was measured in ear thickness (A) at 24, 48, 72, 96 and 102 h after challenge and just before drug application as well as in tissue weight (B) at 102 h post-challenge. The positive control only received acetone 81 topically after the challenge with oxazolone............................................. Figure 4. Histological analysis of topical anti-inflammatory effect of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone on acute ear edema induced by xylene (A, B, C) and TPA (D, E, F) and chronic dermatitis induced by oxazolone multiple applications (G, H, I). Photomicrograph of transverse sections from ears collected in the last day of experiments. Generally, inflamed ears (A, D, G) showed dermal edema, congestion, inflammatory cell infiltration with the presence of mononuclear and polymorphonuclear cells. Treatment with in nature PSO (B, E, H) or dexamethasone (C, F, I) reduced these inflammatory parameters. A minimum of two section from five animals for each treatment were analyzed. HE staining. Original magnification: 100x. Scale bar: 200 μm.............................................................................................. 82 Figure 5. Topical effect of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone on mastocytes infiltration in acute ear edema induced by xylene (A, B, C) and TPA (D, E, F) and chronic dermatitis induced by oxazolone multiple applications (G, H, I). Photomicrograph of transverse sections from ears collected in the last day of experiments. In chronic model, the treatment with in nature PSO (B, E, H) and dexamethasone (C, F, I) reduced the number of mastocytes in inflammatory cell infiltration when compared to respective positive control (A, D, G). A minimum of two section from five animals for each treatment were analyzed. Toluidine-blue staining. Original magnification: 100x. Scale bar: 200 μm....................................................................................................... 83 ARTIGO III Figure 1. Macroscopic wound closure on days 0, 3, 7 and 10 post-surgery. The in natura PSO treated group shown an enhanced wound closure when compared to other treatment groups, except to reference group on day 7........ 101 Figure 2. Histological progression of the wound healing in PSO (in nature) treated group, reference and saline 0.9% control groups (top to bottom, respectively) on days 3 (left column) and 7 (right column). On day 3, a single cells layer in re-epithelized epidermis could be observed in group treated with in natura PSO, while ulcer areas could still be verified in the other groups. Wound healing was characterized by a complete re-epithelization and higher proliferation of fibroblasts and neovascularization in PSO (in nature) treated group on day 7. Haematoxylin and eosin staining. Original magnification: 100x. Scale bar: 200 μm.................................................................................... 102 Figure 3. Immunohistochemical staining for COX-2 and VEGF on days 3 and 7, respectively. In natura PSO treated lesions decreased COX-2 expression on day 3 and increased relatively VEGF expression as compared to saline 0.9% control group on day 7. Similar results was found in reference group. Sections were scored as +, slight positive staining, up to 15% positive cells; ++, moderate positive staining, from 15% to 30% positive cells; +++, strong positive staining with more than 30% positive cells. Original magnification: 400x. Scale bar: 50 μm...................................................................................... 103 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AA Ácido araquidônico AGI Ácidos graxos insaturados AG Ácidos graxos ALA Ácido α-linolênico ANOVA Análise de variância AOCS American Oil Chemists’ Society ºC Graus Celsius CD Grupamento de diferenciação (cluster of differentiation) CEUA Comitê de Ética para Uso de Animais COX Ciclooxigenases COX-1 Ciclooxigenase-1 COX-2 Ciclooxigenase-2 DAB Diaminobenzidine Dexa Dexamethasone DHA Ácido docosahexaenóico EGF Fator de crescimento epidérmico Ed Edema EOLS Essential oil of Lippia sidoides EPA Ácido eicosapentaenóico FP Fibroblast proliferation eV Elétron-volt FGF Fator de crescimento de fibroblastos FUNCAP Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico h/min Hora/Minuto He/HE Gás hélio/Hematoxilin-eosin HGF Fator de crescimento dos hepatócitos HLE Human leukocyte elastase HRP Horseradish peroxidase ICAM Molécula de adesão intercelular IFN-γ Interferon gama IL-1 Interleucina-1 IL-2 Interleucina-2 IL-6 Interleucina-6 IL-8 Interleucina-8 Indo Indomethacin Ka/Wa Known area/ Wound area Kg/g/mg/ µg Quilograma/Grama/Miligrama/Micrograma L/mL/µL Litro/Mililitro/Microlitro LA Ácido linoléico LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais LIBA Laboratório de Imunologia e Bioquímica de Animais LOX Lipoxigenase LT Leucotrienos LTB4 Leucotrieno B4 LTC4 Leucotrieno C4 LTD4 Leucotrieno D4 LTE4 Leucotrieno E4 m/cm/mm Metro/Centímetro/Milímetro Mac-1 Receptor para integrinas CD11a/CD18 e CD11bCD18 MCP Proteína quimioatraente de macrófagos MEC Matriz extracelular MIP Proteína inflamatória para macrófagos MNC Mononuclear cells MMP Metaloproteinases da matriz Nk Number of pixels inside know area Nw Number of pixels inside wound area NF-κB Fator de transcrição nuclear kappa-B NO Óxido nítrico NV Neovascularization NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs OA Ácido oléico Oxa Oxazolone PADETEC Parque de Desenvolvimento Tecnológico PAF Fator de agregação plaquetária PBS Phosphate-buffered saline PDGF Fator de crescimento derivado das plaquetas PG Prostaglandinas PGE2 Prostaglandina E2 PGE3 Prostaglandina E3 PGF2 Prostaglandina F2 PGI2 Prostaglandina I2 pH Potencial hidrogeniônico PK Proteína quinase PMN Polymorphonuclear cells PPAR Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias PSO Pumpkin seed oil PT Pre-treatment RANTES Ligante de quimiocina tipo 5 RE Re-epithelialization ROS Espécies reativas de oxigênio SD Standard deviation SNK Student-Newman-Keuls TB Toluidine blue TIMP Inibidores teciduais das metaloproteinases TGF Fator de crescimento transformante Th Célula T auxiliar (T helper) TNF-α Fator de necrose tumoral alfa TPA 13-acetato de 12-O-tetradecanoil-forbol TX Tromboxanos TXA2 Tromboxano A2 UECE Universidade Estadual do Ceará UFA Unsaturated fatty acids UFC Universidade Federal do Ceará VCAM Molécula de adesão à célula vascular VEGF Fator de crescimento endotelial vascular VR1 Receptor vanilóide tipo 1 Xyl Xylene -3 Ômega-3 -6 Ômega-6 -9 Ômega-9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 18 2 REVISÃO DE LITERATURA..............................................................................20 2.1 Resposta inflamatória............................................................................................ 20 2.2 Resposta cicatricial................................................................................................. 21 2.2.1 Fase inflamatória.................................................................................................... 22 2.2.2 Fase proliferativa.................................................................................................... 23 2.2.2 Fase de remodelagem............................................................................................. 25 2.3 Óleos de origem vegetal......................................................................................... 26 2.3.1 Óleos essenciais........................................................................................................26 2.3.2 Óleos fixos............................................................................................................... 27 2.4 Óleos de origem vegetal e suas atividades em processos inflamatórios e cicatriciais............................................................................................................... 28 2.4.1 Óleos essenciais........................................................................................................29 2.4.2 Óleos fixos................................................................................................................ 31 2.4.2.1 Ácidos graxos........................................................................................................... 32 2.4.2.2 Influência dos AGI na resposta inflamatória........................................................... 33 2.4.2.3 Influência dos AGI na resposta cicatricial...............................................................36 2.5 Plantas medicinais fornecedoras de óleos vegetais objetos do estudo............... 39 2.5.1 Lippia sidoides Cham.............................................................................................. 39 2.5.2 Curcubita pepo L..................................................................................................... 40 3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 42 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA.....................................................................................43 5 OBJETIVOS.......................................................................................................... 44 5.1 Geral....................................................................................................................... 44 5.2 Específicos.............................................................................................................. 44 6 ARTIGO I – O USO TÓPICO CONTÍNUO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia sidoides Cham. INDUZ RESPOSTA INFLAMATÓRIA CUTÂNEA, MAS NÃO RETARDA O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO..................... 45 7 ARTIGO II – POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO TÓPICO DO ÓLEO DE SEMENTE DE ABÓBORA (Cucurbita pepo L.) SOBRE A INFLAMAÇÃO CUTÂNEA AGUDA E CRÔNICA EM CAMUNDONGOS. 63 8 ARTIGO III – ÓLEO DE SEMENTE DE ABÓBORA REDUZ A EXPRESSÃO DE CICLOOXIGENASE-2 (COX-2) E MELHORA A EXPRESSÃO DO FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) NA CICATRIZAÇÃO CUTÂNEA................................. 84 9 CONCLUSÕES.................................................................................................... 104 10 PERSPECTIVAS............................................................................................... 105 REFERÊNCIAS..................................................................................................... 106 APÊNDICES..................................................................................................... 121 Apêndice A – Artigo publicado na Acta Veterinaria Brasilica, v. 7, n. 2, 2013.......................................................................................................................... 122 Apêndice B – Artigo publicado na Acta Scientiae Veterinariae, v. 41, n. 1168, 2013................................................................................................................ 134 18 1 INTRODUÇÃO A inflamação é uma resposta inata desencadeada por estímulos e condições nocivas, tais como infecções e lesões nos tecidos (MEDZHITOV, 2008). A cicatrização, por sua vez, compreende uma série de mecanismos complexos ativados após injúria tecidual, que inclui a resposta inflamatória e visa manter a homeostase tecidual (VELNAR et al., 2009). Estes processos envolvem a interação entre muitos tipos celulares e mediadores solúveis bioativos, os quais tem um importante papel na defesa do hospedeiro. Os mediadores químicos podem incluir moléculas de natureza lipídica, peptídica, aminas vasoativas, enzimas, moléculas de adesão, espécies reativas de oxigênio, dentre outras, dependendo da população celular envolvida e da natureza do agente injuriante. Em geral, a reposta inflamatória, quando controlada, é benéfica e culmina com a eliminação do agente agressor e reparo do dano tecidual. Entretanto, se essa reação for desregulada pode haver dano aos tecidos do hospedeiro, levando ao desenvolvimento de doenças inflamatórias (CALDER, 2013). Na busca por novas substâncias com potencial anti-inflamatório e cicatrizante, as plantas medicinais têm sido utilizadas como fontes de matérias-primas para aliviar, prevenir, curar ou alterar estes processos fisiológicos e patológicos tanto no homem quanto nos animais (RATES, 2001). Dentre essas plantas, algumas são fontes de óleos vegetais, os quais podem ser classificados como óleos essenciais constituídos por componentes voláteis de baixo peso molecular (MATOS, 2007), e óleos fixos, ricos em ácidos graxos, constituintes de alto peso molecular (REDA; CARNEIRO, 2007). Com o avanço da ciência, óleos vegetais têm sido cada vez mais utilizados como recursos promissores no desenvolvimento de formulações cosméticas, e na farmacologia como agentes terapêuticos alternativos para o tratamento de processos inflamatórios associados ou não a cicatrização de feridas. Óleos essenciais e seus constituintes, quando utilizados em concentrações apropriadas, apresentam propriedades anti-inflamatórias e cicatrizantes comprovadas (MONTEIRO et al., 2007; RIELLA et al., 2012; VERAS et al., 2013). Entretanto, o uso inadequado desses óleos pode ser irritante aos tecidos do hospedeiro e interferir com o processo de cicatrização (KERR, 2002; VIGAN, 2010). Em contrapartida, AGI presentes em óleos vegetais são relatados como importantes agentes moduladores das respostas imune-inflamatórias (PEREIRA et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2010; CARDOSO et al., 2011) com indicação terapêutica no reparo de feridas cutâneas (DECLAIR, 1997; PIEPER; CALIRI, 2003; FERREIRA et al., 2012). Entretanto, diversos óleos vegetais ricos 19 em AGI ainda necessitam de investigação científica para validação destas propriedades farmacológicas. Tendo em vista o uso popular associado ao importante papel que os óleos vegetais e seus constituintes exercem sobre o sistema imune, torna-se cada vez mais necessário o entendimento dos eventos celulares e moleculares envolvidos nas respostas inflamatória e cicatricial moduladas por esses produtos naturais. Neste cenário, o óleo essencial de Lippia sidoides (alecrim-pimenta) e o óleo fixo de Cucurbita pepo (abóbora) destacam-se como objetos de estudo. 20 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Resposta inflamatória A inflamação consiste de um mecanismo de defesa inato, sendo definida como uma resposta biológica complexa dos tecidos vascularizados a diferentes estímulos, que auxilia na eliminação de agentes estranhos e dá início ao processo de reparo tecidual (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; GRIVENNIKOV et al., 2010). Os tecidos podem responder a estímulos nocivos, tais como patógenos, células lesionadas e injúrias químicas, térmicas ou mecânicas, através da interação com receptores que desencadeiam a produção de diferentes mediadores bioativos, os quais amplificam os eventos celulares e moleculares envolvidos no processo inflamatório (SETHI et al., 2012; CALDER, 2013). A resposta inflamatória quando controlada é benéfica, pois auxilia na eliminação do agente agressor, protegendo contra infecções, mas pode tornar-se prejudicial se desregulada, levando ao desenvolvimento de doenças. Assim, o estado patológico inflamatório é assumido como uma contrapartida fisiológica (MEDZHITOV, 2008). Fisiologicamente, a inflamação caracteriza-se por eventos vasculares e celulares, e pode ser classificada em aguda ou crônica, dependendo da persistência da lesão e severidade dos sinais clínicos (MEDZHITOV, 2008). A reação inflamatória aguda é caracterizada pela curta duração, aumento da permeabilidade vascular, exsudação de fluidos e proteínas plasmáticas e migração de leucócitos, principalmente neutrófilos (BAUHMANN; GAUDIE, 1994; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013). Em geral, essa reação é autolimitante e sofre resolução, envolvendo remoção de células mortas, depuração das células de resposta aguda e regeneração da matriz extracelular. A resposta inflamatória crônica depende ou não da resolução do processo de fase aguda e, geralmente, possui longa duração. Caracteriza-se pela persistência de macrófagos e linfócitos, além de angiogênese, proliferação de tecido conjuntivo e dano tissular frequentemente resultando em reparo excessivo (GRIVENNIKOV et al., 2010; WIDGEROW, 2011; FREIRE; VAN-DYKE, 2013). Os eventos vasculares da resposta inflamatória ocorrem na microcirculação (BAUHMANN; GAUDIE, 1994). As alterações vasculares consistem em vasoconstrição arteriolar inicial, seguida por vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular, principalmente venular, as quais são induzidas por diversos mediadores, tais como histamina, serotonina, bradicinina e prostaglandinas (PG) (MEDZHITOV, 2008; FREIRE; VAN-DYKE, 21 2013). Com o aumento do fluxo sanguíneo local, são observados os sinais clínicos calor e eritema. Paralelamente, ocorre a saída de íons e moléculas, como água e proteínas para o meio extravascular, resultando no aumento da pressão hidrostática local e formação de edema. O exsudato contém uma variedade de substâncias e mediadores, o qual é drenado pelos vasos linfáticos até os linfonodos regionais, onde os produtos dos micro-organismos invasores podem iniciar uma resposta imune (BAUHMANN; GAUDIE, 1994; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; ROCK et al., 2010). Os eventos celulares, por sua vez, caracterizam-se pelo acúmulo de leucócitos, particularmente polimorfo e mononucleares, nos tecidos afetados (ROCK et al., 2010). Essas células são recrutadas do sangue para os locais de infecção por intermédio de citocinas e quimiocinas, as quais favorecem a ligação destas células ao endotélio mediada por moléculas de adesão, favorecendo a migração transendotelial e seu deslocamento até o local da infecção (FUHLBRIGGE; WEISHAUPT, 2007; SCHMIDT et al., 2013). Os neutrófilos e macrófagos fagocitam agentes nocivos, destroem bactérias e outros patógenos, degradam o tecido necrótico, antígenos estranhos e células apoptóticas, levando à liberação de enzimas, mediadores químicos e espécies reativas de oxigênio (ROS), que contribuem para o dano tecidual e, posteriormente, para o retorno à homeostase através do processo de cicatrização (MURRAY; WYNN, 2010; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013). 2.2 Resposta cicatricial A cicatrização cutânea é um processo complexo, que envolve uma série de eventos celulares e moleculares desencadeados a partir de uma lesão na pele. Esses eventos são inter-relacionados entre si e englobam diferentes tipos celulares, proteínas da matriz extracelular, fatores de crescimento, citocinas e outros mediadores, que regulam e modulam a resposta reparativa para restabelecer a homeostase do tecido lesionado (VELNAR et al., 2009; GANTWERKER; HOM, 2012). Os principais tipos celulares e mediadores envolvidos no processo cicatricial estão indicados na Tabela 1. Classicamente, este processo pode ser dividido em três fases que se sobrepõem de forma contínua e temporal: inflamatória, proliferativa e de remodelagem (TELLER; WHITE, 2011). 22 Tabela 1. Principais tipos celulares e mediadores envolvidos na cicatrização Tipos celulares presentes no ferimento Principais mediadores liberados Principais efeitos desencadeados Plaquetas TGF-β, PDGF (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD), PAF, fibrinogênio, fibronectina, tromboplastina Formação de trombo plaquetário que tampona a lesão e recrutamento de neutrófilos/monócitos Neutrófilos IL-6, IL-8, IL-1, TNF-α, TGF-β, HGF, MIP, HLE Monócitos/ Macrófagos TGF-α, TGF-β, VEGF-A, IL-6, IL-8, IL-1, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP1, HB-EGF, HGF, MIP Células residentes (a) FGF1, FGF2, FGF4, FGF7, FGF-10, (a) Fibroblastos IP-10, IL-8, eotaxina, TGF-β (b) MCP-1, (b) Queratinócitos FGF1, FGF2, TGF-β, MIP-2; (c) MCP-1 (c) Células endoteliais Fontes: Werner e Grose (2003), Hatanaka e Curi (2007) e Behm et al. (2012). Recrutamento de monócitos/macrófagos Quimiotaxia de monócitos e fibroblastos, proliferação de fibroblastos, angiogênese e síntese de colágeno Maturação e remodelamento da matriz extracelular e angiogênese 2.2.1 Fase inflamatória Na fase inflamatória, predominam eventos relacionados com a hemostasia e a inflamação (BAUM; ARPEY, 2005). A hemostasia se caracteriza pela vasoconstrição, agregação plaquetária e ativação dos sistemas de coagulação sanguínea. Estes eventos geram um tampão, rico em fibrina, que forma uma barreira contra a invasão de micro-organismos e organiza uma matriz provisória necessária para a migração celular. As plaquetas, além de sua função hemostática, são importantes por atuarem como moduladoras do reparo tecidual, sendo as primeiras células a produzirem e liberarem citocinas e fatores de crescimento, que estimulam a proliferação celular e a produção de proteínas específicas que irão atuar durante as fases seguintes do processo cicatricial (EMING et al., 2007; VELNAR et al., 2009). Dentre esses mediadores, o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) apresenta propriedades quimiotáticas sobre neutrófilos, macrófagos e fibroblastos, assim como as moléculas da superfamília do fator de crescimento transformante- β (TGF-β) (WERNER; GROSE, 2003; BEHM et al., 2012). Durante a ruptura da barreira epidérmica, ocorre ativação de fatores de transcrição nas células sentinelas, como o fator de transcrição nuclear kappa-B (NF-κB), o qual está envolvido na ativação de genes específicos (SIGAL, 2006). Isso resulta no aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias como fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1 (IL-1), as quais exercem papéis importantes na ativação de células endoteliais e 23 aumento da expressão de moléculas de adesão, favorecendo à migração do neutrófilo (BARRIENTOS et al., 2008; BEHM et al., 2012). Após atingirem o sítio lesionado, os neutrófilos predominam na região entre o primeiro e segundo dia (HATANAKA; CURI, 2007). Os macrófagos, por sua vez, são as próximas células a chegarem na área da lesão, por volta do segundo ao quinto dia, e ao contrário do papel desempenhado pelos neutrófilos, são considerados os elementos mais críticos na indução do processo de reparo (PARK; BARBUL, 2004). Além de auxiliar os neutrófilos na eliminação de micro-organismos pela fagocitose, essas células atuam na limpeza da ferida, degradando e eliminando componentes do tecido conjuntivo necrosado, e modulando a cicatrização através da secreção de proteases, citocinas, fatores de crescimento e substâncias vasoativas. Estes mediadores são fundamentais para a formação do tecido de granulação na fase subsequente do processo cicatricial (MURRAY; WYNN, 2010; NOVAK; KOH, 2013). Por outro lado, embora a participação dos linfócitos também tenha sido demonstrada, os mecanismos através dos quais estas células contribuem para a cicatrização tecidual ainda necessitam de maiores esclarecimentos (OLIVEIRA; POPI et al., 2010). A fase inflamatória tem duração de 48 a 72 horas (HATANAKA; CURI, 2007). 2.2.2 Fase proliferativa A fase proliferativa caracteriza-se pelos processos de angiogênese, formação do tecido de granulação, deposição de matriz extracelular (MEC) e re-epitelização (SCHREML et al., 2010). Nesta fase, a sinalização celular é feita por um número maior de mediadores, que envolvem ativação, migração e proliferação celular, principalmente de fibroblastos e queratinócitos (PARK; BARBUL, 2004). Inicialmente, a migração e ativação de fibroblastos são intensificadas em decorrência da liberação de mediadores produzidos principalmente por macrófagos, destacando-se os fatores de crescimento como PDGF, TGF-β e fator de crescimento endotelial vascular-VEGF (WERNER; GROSE, 2003; BARRIENTOS et al., 2008). Os fibroblastos são os principais componentes celulares do tecido de granulação, os quais são ativados por fatores de crescimento derivados dos macrófagos, migrando das bordas para o centro da ferida. Isto ocorre através da matriz provisória formada e de um gradiente químico de substâncias quimioatraentes (VELNAR et al., 2009; TELLER; WHITE, 2011). Os fibroblastos ativados iniciam a produção de colágeno no local e a nova matriz extracelular começa a ser substituída 24 por um tecido conjuntivo mais denso e elástico, embora desorganizado. Esse processo denominado de fibroplasia é dependente da formação paralela de novos vasos sanguíneos na região (GREAVES et al., 2013). A angiogênese ocorre pela ação direta de fatores de crescimento sobre as células endoteliais e, em parte, pela baixa tensão de oxigênio no centro da ferida, elevados níveis de ácido láctico e aminas vasoativas. Esse evento é essencial porque permite a troca de gases e a nutrição de células metabolicamente ativas no tecido neoformado (BROWN et al., 2002; VELNAR et al., 2009; GREAVES et al., 2013). Dentre os fatores de crescimento, VEGF é descrito como principal regulador da angiogênese durante o desenvolvimento do tecido cicatricial (HOWDIESHELL et al., 2001; BAO et al., 2009). Com a fibroplasia e a angiogênese, inicia-se a formação do tecido de granulação por volta do quarto dia. Esse tecido é constituído por macrófagos, fibroblastos, células inflamatórias e componentes neovasculares, os quais são sustentados por uma matriz frouxa de fibronectina, ácido hialurônico, glicosaminoglicanos e colágenos. O tecido neoformado é edematoso e caracteriza-se pela presença de muitos espaços vazios, devido à imaturidade dos vasos, os quais são exsudativos e sangram com facilidade (BAUM; ARPEY, 2005; HATANAKA; CURI, 2007; KLINGBERG et al., 2013). Durante a maturação fenotípico dos fibroblastos em células produtoras de colágeno, o processo de contração da ferida alcança sua eficiência máxima. Isto ocorre devido à diferenciação de alguns fibroblastos das margens das feridas para miofibroblastos, células contráteis especializadas, as quais promovem o fechamento da ferida (KLINGBERG et al., 2013; VELNAR et al., 2009). Em resposta aos diversos estímulos recebidos, os queratinócitos hiperproliferam e migram a partir das bordas da ferida, produzindo e secretando componentes da MEC e polipeptídeos sinalizadores, ao mesmo tempo em que seu citoesqueleto é alterado para a produção de queratina (FREEDBERG et al., 2001; SANTORO; GAUDINO, 2005; SCHREML et al., 2010). A re-epitelização inicia-se imediatamente após a lesão, porém nas etapas iniciais esse processo é ineficiente devido à inexistência de substrato adequado na área da ferida, o qual somente é fornecido quando o tecido de granulação alcança o nível da epiderme. Além disso, a superfície úmida e oxigenada da ferida também acelera o processo de migração dos queratinócitos (BALBINO et al., 2005; VELNAR et al., 2009). Ao final desta etapa, o leito da ferida está totalmente preenchido pelo tecido de granulação, a circulação é restabelecida pela neovascularização e a rede linfática passa por regeneração. Lentamente, o tecido de granulação é enriquecido com mais fibras colágenas, 25 que começam a ser reorganizadas, dando à região lesada a aparência de cicatriz devido ao acúmulo de massa fibrosa. A fase proliferativa tem duração de 12 a 14 dias (HATANAKA; CURI, 2007; GANTWERKER; HOM, 2012). 2.2.2 Fase de remodelagem A fase de remodelagem é marcada por maturação dos elementos e alterações na matriz extracelular, ocorrendo aumento na deposição e reorganização do colágeno e aumento da força de tensão da cicatriz (VELNAR et al., 2009). A resistência do tecido cicatricial é dada pela quantidade de colágeno depositada e pela forma com que as fibras estão organizadas. Esse remodelamento envolve etapas sucessivas de produção, digestão e orientação das fibrilas de colágeno até o restabelecimento basal do tecido (BALBINO et al., 2005; TELLER; WHITE, 2011). A degradação do colágeno e de outras proteínas da MEC é efetuada por uma família de metaloproteinases da matriz (MMP) que dependem de íons zinco para sua atividade (GILL; PARKS, 2008). MMP consiste em colagenases intersticiais, gelatinases e metaloproteinases da matriz ligadas à membrana. Essas enzimas são produzidas por vários tipos celulares, como macrófagos, neutrófilos, fibroblastos e queratinócitos, e sua secreção é induzida por determinados estímulos, incluindo fatores de crescimento, como PDGF e fator de crescimento fibroblástico (FGF), e citocinas, como IL-1 e TNF-α. Por outro lado, a produção de MMP é inibida pelo TGF-β (GILL; PARKS, 2008; TELLER; WHITE, 2011; KHOKHA et al., 2013). Uma vez expressas e ativadas, MMP induz a liberação de fatores de crescimento ligados à MEC, permitindo um estímulo constante à proliferação e migração dos queratinócitos, acelerando o processo de re-epitelização (BAUM; ARPEY, 2005; GILL; PARKS, 2008; SCHREML et al., 2010). Por outro lado, MMP ativadas são rapidamente inibidas por uma família de inibidores teciduais específicos das metaloproteinases (TIMP) que são produzidos pela maioria das células mesenquimatosas, impedindo, assim, a ação descontrolada dessas proteinases (GILL; PARKS, 2008; KHOKHA et al., 2013). Ao final desta etapa, os anexos da pele, como folículos pilosos e glândulas sofrem regeneração limitada e a coloração da cicatriz permanece pálida, pois a regeneração dos melanócitos é deficiente e as cicatrizes são hipovascularizadas devido ao desaparecimento dos neocapilares. Esta fase ocorre lentamente, podendo durar de meses a anos e, mesmo assim, uma cicatriz cutânea completamente madura possui apenas 70% da resistência da pele normal (BALBINO et al., 2005; HATANAKA; CURI, 2007; VELNAR et al., 2009). 26 2.3 Óleos de origem vegetal O uso de produtos naturais como matéria-prima para a síntese de compostos químicos com atividade biológica tem sido amplamente relatado ao longo dos anos. A grande biodiversidade vegetal presente no Brasil é considerada uma fonte potencial de substâncias biologicamente ativas. Assim, sua preservação e estudo são fundamentais para descoberta de novas substâncias com ação farmacológica (ALBUQUERQUE et al., 2007). A maioria dos fármacos em uso clínico ou são de origem natural ou foram desenvolvidos por síntese química planejada a partir de produtos naturais (BARREIRO; BOLZANI, 2009). Nas plantas medicinais, podem ser encontradas várias substâncias importantes com diferentes aplicações farmacológicas, sintetizadas a partir do metabolismo celular vegetal (RATES, 2001). Dentre esses produtos naturais, destacam-se dois tipos de óleos vegetais: óleos essenciais constituídos por componentes voláteis de baixo peso molecular (MATOS, 2007) e óleos fixos, ricos em ácidos graxos, constituintes de alto peso molecular (REDA; CARNEIRO, 2007). 2.3.1 Óleos essenciais Os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas e, na maioria das vezes, extraídos de plantas aromáticas como metabólitos secundários por meio de destilação por arraste com vapor d’água ou hidrodestilação (BAKALLI et al., 2008). Eles podem ser obtidos a partir de todas as partes da planta, incluindo folhas, flores, frutos, raízes etc. (SIMÕES et al., 2010). Entretanto, o produto extraído pode sofrer variações na qualidade, quantidade e composição química devido ao material genético, idade e estágio vegetativo da planta, das condições ambientais, como clima e tipo de solo, assim como da colheita e o processamento pós-colheita, tais como a parte da planta utilizada para extração, horário e época do ano (TAYLOR et al., 2001; ANGIONI et al., 2006). Esses óleos essenciais também são chamados de óleos etéreos ou essências devido a algumas de suas características físico-químicas, como a de serem geralmente líquidos com aspecto oleoso à temperatura ambiente (GIORDANI et al., 2008). Os óleos essenciais têm sido largamente utilizados em virtude de apresentar importantes atividades biológicas na natureza, tais como efeitos antibacteriano (ROSATO et al., 2007), antifúngico (SEGVIC-KLARIC et al., 2007) e inseticidas (PAVELA, 2005). Estes 27 produtos naturais são comercialmente importantes para as indústrias farmacêutica, agronômica, alimentícia, e principalmente para fabricação de cosméticos e perfumes (BAKALLI et al., 2008). Compostos vegetais bioativos ricos em óleos essenciais são empregados in natura para a preparação de infusões ou sob a forma de outras preparações simples. Tais óleos podem ser utilizados na indústria farmacêutica para síntese de vitaminas, hormônios, antibióticos e antissépticos (BRUNETON, 1995). Além disso, alguns óleos essenciais apresentam diferentes propriedades medicinais, sendo indicados como agentes terapêuticos para tratar diversas enfermidades (PERRY et al., 2003; SILVA et al., 2003; CAVALCANTI et al., 2012). Quimicamente, os óleos essenciais podem conter cerca de 20 a 60 constituintes em diferentes concentrações, sendo caracterizados por um ou dois constituintes majoritários, existindo outros em menores concentrações e alguns em baixíssimas quantidades (BAKALLI et al., 2008; SIMÕES et al., 2010). Os constituintes químicos dos óleos essenciais variam desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com enxofre, todos caracterizados por apresentar baixo peso molecular (SIMÕES et al., 2010). Geralmente, o constituinte majoritário determina as propriedades biológicas do óleo essencial (PICHERSKY et al., 2006), incluindo atividades anti-inflamatórias (MONTEIRO et al., 2007; VERAS et al., 2013) e cicatriciais (CAVALCANTI et al., 2012). 2.3.2 Óleos fixos Óleos fixos, conhecidos genericamente por óleos vegetais, são gorduras obtidas das plantas, quase exclusivamente de grãos e sementes conhecidas como oleaginosas, apesar de outras partes da planta poderem ser utilizadas na extração destas substâncias, como casca do caule e polpa de frutos (SIMÕES et al., 2010; PAULA et al., 2012). Segundo definição da Agência Nacional de Vigilância Sanitária-ANVISA (2005), são produtos obtidos de espécies vegetais compostos principalmente por glicerídeos de ácidos graxos, podendo conter baixas quantidades de fosfolipídios, constituintes insaponificáveis e ácidos graxos livres. São substâncias hidrofóbicas e lipofílicas, formadas predominantemente por triglicerídeos ou triacilgliceróis (moléculas que provêm do metabolismo primário, formadas por três ácidos graxos esterificados com glicerol e que pelo menos um deles seja insaturado), que se apresentam em estado líquido e viscoso nas condições normais de temperatura e pressão, devido ao baixo ponto de fusão (MORETTO; FETT, 1998). 28 É importante destacar que os óleos fixos são quimicamente diferentes dos óleos essenciais. Além dos triacilgliceróis, os óleos fixos podem apresentar outros constituintes químicos em menor quantidade. Dentre estes, os carotenoides (β-caroteno) dão a coloração amarelada ou avermelhada característica dos óleos. Os tocoferóis agem como antioxidantes, impedindo a rancidez oxidativa. As lactonas e metilcetonas conferem odor ao óleo. Já os esteróis, os cerídeos e os hidrocarbonetos incolores não influenciam as propriedades organolépticas dos óleos fixos (MORETTO; FETT, 1998). Os óleos fixos são fontes de energia de grande importância para a indústria alimentícia, na produção de ácidos graxos, glicerina, lubrificantes, biodiesel, além de inúmeras outras aplicações (REDA; CARNEIRO, 2007). A obtenção do óleo vegetal bruto é feita por meio de métodos físicos e químicos sobre as sementes oleaginosas, utilizando solventes como extrator e prensagem (MORETTO et al., 2002; REDA; CARNEIRO, 2007). Os óleos fixos destinados ao consumo humano ou à formulação de rações animais são submetidos a um processo de refinamento para remoção de alguns componentes como ácidos graxos livres, proteínas, corantes naturais, umidade e compostos voláteis e inorgânicos (MORETTO et al., 2002). A utilização de fontes de ácidos graxos proveniente de óleos vegetais, principalmente ácidos graxos insaturados, na dieta humana e animal ou em formulações concentradas, como cápsulas, emulsões e azeites vegetais, tem sido cada vez mais recomendada por especialistas da área de saúde para prevenção de várias doenças. Essas macromoléculas são bem relatados por apresentarem diversas propriedades biológicas no organismo, incluindo importantes atividades anti-inflamatórias (CALDER et al., 2013) e cicatrizantes (CARDOSO et al., 2004; CARDOSO et al., 2011). 2.4 Óleos de origem vegetal e suas atividades em processos inflamatórios e cicatriciais Os avanços científicos para o entendimento dos aspectos celulares e moleculares envolvidos na inflamação e cicatrização de feridas permitiram o estabelecimento de novas metodologias/sistemas para identificação de substâncias de origem vegetal efetoras, como os óleos vegetais e seus constituintes (CARVALHO, 2004). A investigação desses produtos com propriedades anti-inflamatórias e cicatrizantes tem sido possível graças ao uso de técnicas in vitro, tais como cultura de células, dosagem e identificação de biomarcadores, inibição de enzimas e outros mediadores; além de técnicas in vivo, como indução de inflamação tópica 29 por agentes flogísticos, e indução de feridas cutâneas para avaliar atividade cicatrizante em diferentes modelos animais, os quais são amplamente utilizados na pesquisa pré-clínica. Neste contexto, óleos vegetais (essenciais e fixos) tradicionalmente utilizados no tratamento da inflamação e/ou cicatrização são indicadores da presença de compostos ativos que possuem atividades biológicas sobre estes processos, e por isso devem ser investigados para comprovação de sua eficácia. 2.4.1 Óleos essenciais Diversas plantas fornecedoras de óleos essenciais utilizadas na medicina popular têm demonstrado amplo potencial anti-inflamatório tópico e cicatrizante in vivo. Dentre essas plantas, destacam-se aquelas pertencentes ao gênero Lippia (Verbenaceae) tradicionalmente usadas em países da América Central, América do Sul e África Tropical. Muitas espécies de Lippia contém monoterpenos como constituintes majoritários dos óleos essenciais, sendo o timol, carvacrol, citral e p-cimeno os compostos mais frequentemente encontrados e responsáveis pelas atividades biológicas observadas (PASCUAL et al., 2001). Do ponto de vista farmacológico, o óleo essencial de Lippia alba é provavelmente o mais estudado, o qual tem sido relatado por apresentar atividades analgésicas e antiinflamatórias (HENNEBELLE et al., 2008). Por outro lado, embora o óleo essencial de Lippia multiflora tenha demonstrado propriedades analgésicas e antipiréticas, esta mistura não foi efetiva em inibir o processo inflamatório através da formação de granuloma induzido in vivo (ABENA et al., 2003). Estes efeitos foram atribuídos a mono e sesquiterpenos presentes nestes óleos essenciais (ABENA et al., 2003; HENNEBELLE et al., 2008). A avaliação do potencial anti-inflamatório, bem como o mecanismo de ação do óleo essencial de Lippia gracilis tem sido mais recentemente investigados. Esta mistura de terpenos, cujos constituintes majoritários foram timol e p-cimeno, reduziu a formação do edema de pata e a migração de leucócitos na cavidade peritoneal em modelos murinos (MENDES et al., 2010), através da inibição de mediadores inflamatórios como óxido nítrico (NO), PGE2, TNF-α e interferon-γ (IFN-γ), sugerindo que este óleo essencial afeta seletivamente as células inflamatórias (GUILHON et al., 2011). Adicionalmente, o timol presente no óleo essencial de L. gracilis apresentou potencial anti-inflamatório e cicatrizante ao reduzir o edema e o infiltrado inflamatório na área da lesão, com redução da atividade enzimática da mieloperoxidase. Além disso, feridas tratadas com esse monoterpeno, demonstraram maiores taxas de contração da 30 ferida, com maior densidade e organização das fibras de colágeno no tecido de granulação durante o processo cicatricial (RIELLA et al., 2012). Ainda relativo ao gênero Lippia, o óleo essencial de Lippia sidoides também mostrou potentes atividades anti-inflamatórias tópicas quando usado em diferentes concentrações em modelos de inflamação aguda (MONTEIRO et al., 2007; VERAS et al., 2013). Tal efeito provavelmente foi devido às suas propriedades antioxidantes (MONTEIRO et al., 2007) e à redução da produção de mediadores pró-inflamatório, sobretudo aqueles envolvidos com a via de sinalização mediada pela ciclooxigenase-COX (VERAS et al., 2013). Entretanto, o tratamento tópico repetido com o óleo essencial de L. sidoides ou timol promoveu um aumento da resposta inflamatória, limitando seu uso em tratamentos crônicos (VERAS et al., 2013). Este efeito pode ser devido a uma atividade aumentada da enzima lipoxigenase (LOX), a qual gera mediadores com propriedades quimioatraentes para células inflamatórias, induzindo a formação excessiva de ROS, responsável pelo dano tecidual (VERAS et al., 2013). Entretanto, os efeitos do óleo essencial de L. sidoides sobre a cicatrização de feridas não foi encontrado na literatura. Acredita-se que o monoterpeno timol seja o responsável pelas atividades antiinflamatórias tópicas atribuídas a L. sidoides (MONTEIRO et al., 2007; VERAS et al., 2013) e cicatrizantes verificadas para L. gracilis (RIELLA et al., 2012). Entretanto, em um estudo realizado com o óleo essencial de Thymus vulgaris foi demonstrado que o efeito antiinflamatório observado para este óleo essencial foi antagônico àquele verificado para timol, seu constituinte majoritário. Nesse mesmo estudo, timol exerceu um potente efeito quimioatraente, mas não reduziu a formação de edema e, mais que isso, apresentou uma resposta irritante, provavelmente dependente da liberação de histamina, eicosanóides e outros mediadores inflamatórios, a qual foi similar ao efeito observado com óleo de cróton, um potente agente flogístico (FACHINI-QUEIROZ et al., 2012). Além disso, deve-se considerar que constituintes presentes em menores quantidades nos óleos essenciais possam contribuir para seus efeitos biológicos. Isto foi observado para o óleo essencial de Cordia verbenaceae, cuja atividade anti-inflamatória é devido ao α-humuleno, presente na mistura volátil em torno de 4,64% (FERNANDES et al., 2007), o qual parece interferir com a produção de TNF-α (PASSOS et al., 2007). Outros gêneros de plantas aromáticas utilizadas na medicina tradicional também têm sido amplamente estudadas como fonte de substâncias voláteis com atividades antiinflamatória e cicatrizante. Os efeitos anti-inflamatórios de óleos essenciais de Eucalyptus 31 foram demonstrados através da inibição de parâmetros como edema, migração neutrofílica e permeabilidade vascular (SILVA et al., 2003). Esses mesmos parâmetros também estavam reduzidos em processos inflamatórios agudos tratados com óleo essencial de Peperomia serpens, o qual inibiu a produção de mediadores inflamatórios e a expressão de moléculas de adesão (PINHEIRO et al., 2011). Adicionalmente, atividades anti-inflamatórias associadas à propriedades cicatrizantes têm sido relatadas para óleos essenciais de plantas da família Pinaceae (TUMEN et al., 2011), sobretudo do gênero Pinus (SUNTAR et al., 2012), as quais podem estar associadas aos seus potentes efeitos antimicrobianos. Dentre as espécies nativas do Nordeste do Brasil, o óleo essencial de Croton zehntneri e seu constituinte majoritário, trans-anetol, têm sido relatados por apresentar potencial terapêutico significativo sobre a cicatrização de feridas cutâneas. Ambos tratamentos aceleraram o fechamento das feridas com aumento da atividade de fibroblastos e deposição de fibras colágenas no tecido neoformado, embora não tenham sido observadas alterações no infiltrado inflamatório e angiogênese. Além disso, o óleo essencial reduziu o edema e exsudato na área das lesões semelhante à droga de referência padrão (CAVALCANTI et al., 2012). Óleos essenciais também têm sido efetivos no tratamento de lesões, em que há retardo do processo de cicatrização. O óleo essencial de Rosmarinus officinalis tem sido efetivo na cicatrização de feridas em modelos experimentais de diabetes, o qual reduziu a resposta inflamatória e melhorou a contração das feridas e outros parâmetros como reepitelização, formação do tecido de granulação, angiogênese e deposição de colágeno (ABUAL-BASAL, 2010). Os resultados promissores encontrados nesses estudos demonstram possibilidades da utilização de óleos essenciais como agentes anti-inflamatórios tópicos e cicatrizantes. 2.4.2 Óleos fixos Existe grande diversidade de espécies vegetais oleaginosas das quais se podem extrair óleos fixos. Estes produtos apresentam variações nas proporções dos diferentes ácidos graxos (AG), os quais podem apresentar respostas fisiológicas distintas quando fornecidos em dietas nutracêuticas (SALMERON, 2008; PAULA et al., 2012) ou quando utilizados como agentes terapêuticos alternativos para tratamento tópico de processos inflamatórios e lesões 32 cutâneas (OLIVEIRA; NUNES-PINHEIRO et al., 2010; VALACCHI et al., 2011; FRANCO et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2013). 2.4.2.1 Ácidos graxos Os óleos vegetais contêm alta proporção de ácidos graxos insaturados (AGI) em relação aos saturados (PAULA et al., 2012). Dentre estes constituintes, os mais comuns entre os saturados são os ácidos palmítico (C16:0) e o esteárico (C18:0), e entre os insaturados, destacam-se os ácidos oléico (C18:1, -9, OA), linoléico (C18:2, -6, LA) e α-linolênico (C18:3, -3, ALA) (Figura 1). Dentre os AGI, ALA (-3) e LA (-6) são considerados os únicos AG essenciais, uma vez que outros AG podem ser sintetizados a partir desses dois precursores. ALA (-3) e LA (-6) são nutrientes essenciais para o funcionamento do organismo e devem ser adquiridos através de fontes alimentares, uma vez que os mamíferos não podem sintetizá-los. Dentre os AGI produzidos a partir desses AG essenciais, os ácidos araquidônico (-6, AA), docosahexaenoico (-3, DHA) e eicosapentaenoico (-3, EPA) são os mais relevantes fisiologicamente (LE et al., 2009). Figura 1. Estrutura molecular dos principais ácidos graxos encontrados em óleos vegetais ALA (-3) e LA (-6) estão presentes tanto em espécies vegetais como animais empregados na alimentação. As principais fontes de AGI -3, incluindo ALA, DHA e EPA 33 são os pescados, moluscos, algas e crustáceos. Dentre os peixes, aqueles de origem marinha, como sardinha, salmão e cavala, geralmente apresentam maiores quantidades de EPA e DHA que os peixes oriundos de águas continentais. Outras fontes de AGI -3 e -6 são alguns cereais, leguminosas, sementes e frutos oleaginosos (VIANI; BRAZ-FILHO, 1996; MARTIN et al., 2006). AA (-6) pode ser obtido diretamente dessas fontes vegetais ou indiretamente formado a partir do LA (-6), que é um componentes encontrados em óleos vegetais, como os de milho, girassol, açafrão e soja. Nos óleos vegetais, a maior concentração do ALA (-3) ocorre no óleo de linhaça, sendo que os óleos de canola e soja também apresentam concentrações significativas desse AGI (DUBOIS et al., 2007; MARTINS et al., 2008). Ao contrário dos AG essenciais, OA (-9), um AG monoinsaturado não-essencial pode ser sintetizado pelos mamíferos a partir de precursores carbônicos simples (VIANI; BRAZ-FILHO, 1996; YAQOOB, 2002), sendo considerado o principal constituinte de muitos óleos vegetais, incluindo azeite de oliva, óleos da noz de macadâmia e abacate (DUBOIS et al., 2007). As propriedades biológicas dos AGI oriundos de óleos vegetais no organismo são amplas e têm sido bem descritas na literatura (RICHARD et al., 2009; RISERUS et al., 2009; HURST et al., 2010; KELLER et al., 2013; KRÁLOVÁ-LESNÁ et al., 2013; LAVIANO et al., 2013). Dentre seus inúmeros efeitos benéficos, destaca-se o importante papel dessas moléculas bioativas como agentes moduladores da resposta imunológica, participando nas interações célula-célula e sinalização intracelular nos processos inflamatórios e cicatriciais (OLIVEIRA; NUNES-PINHEIRO, 2013). 2.4.2.2 Influência dos AGI na resposta inflamatória A relação entre resposta inflamatória e AGI tem sido bastante investigada nos últimos anos. O interesse das pesquisas nesta área deve-se ao fato de que AGI com 20 átomos de carbono, especialmente AA (-6) e EPA (-3), são precursores dos eicosanóides, metabólitos biologicamente ativos que modulam inúmeros processos fisiológicos e bioquímicos e possuem importantes propriedades imunorregulatórias (LE et al., 2009; KENDALL; NICOLAOU, 2013). AGI -9 produzidos endogenamente parecem não possuir papel expressivo na resposta inflamatória (CLIFTON, 2009), embora apresentem efeitos moduladores sobre outras funções imune-fisiológicas (SALES-CAMPOS et al., 2013). 34 Em resposta a uma variedade de estímulos de ativação inespecíficos, AA é mobilizado a partir da bicamada de fosfolipídios de membrana das células inflamatórias pela ação da fosfolipase A2. AA é o principal substrato para as enzimas COX e LOX, originando mediadores que contribuem para o processo inflamatório: prostaglandinas (PG) e tromboxanos (TX) da série 2 (PGE2, PGF2, PGI2, TXA2) ou leucotrienos (LT) da série 4 (LTB4, LTC4, LTD4, LTE4), respectivamente. Esses mediadores têm papéis bem conhecidos na imunidade e inflamação (ROCCA; FITZGERALD, 2002; CALDER, 2009; CALDER, 2013; KENDALL; NICOLAOU, 2013). PGE2 induz febre, aumenta a permeabilidade vascular e está envolvida com a sensação de dor associada a processos inflamatórios (CALDER, 2010). Já LTB4 aumenta a permeabilidade vascular, é um potente quimioatraente para leucócitos, induz liberação de enzimas lisossômicas e ROS pelos neutrófilos, bem como a produção de TNF-α, IL-1β e IL-6 (CALDER, 2010). LTB4 juntamente com TXA2 promovem vasoconstrição. Em reações inflamatórias nas quais ocorre produção de LTC4, LTD4 e LTE4 por mastócitos, basófilos e eosinófilos, esses mediadores têm atividades biológicas similares àquelas da histamina, promovendo vasodilatação. Ademais, atuam como potentes estimuladores da permeabilidade vascular nas reações de hipersensibilidade imediata (PETERS-GOLDEN et al., 2005, CALDER, 2006; VOEHRINGER, 2013). PGE2 atua suprimindo a imunidade celular através da inibição da proliferação de linfócitos T (CALDER et al., 1992) e da produção de citocinas Th1: IL-2 e IFN-γ (BETZ; FOX, 1991). Assim, é possível que um suprimento excessivo de AG -6 poderia agir para promover ou exacerbar estados de inflamação e imunossupressão (CALDER, 2010). Apesar da contínua ênfase dada aos efeitos pró-inflamatórios dos eicosanóides derivados do AA, propriedades anti-inflamatórias desses mediadores também tem sido relatadas (CALDER, 2009). PGE2 é uma potente inibidora da produção de duas citocinas próinflamatórias clássicas, IL-1 e TNF-α, por monócitos e macrófagos (MILES et al., 2002). Além disso, esse mediador inibe a 5-LOX, diminuindo a produção de LT da série 4, e induz a 15-LOX promovendo a formação de lipoxinas (LEVY et al., 2001), as quais tem sido relatadas por seus efeitos anti-inflamatórios, atuando na resolução da resposta inflamatória (SERHAN et al., 2008). EPA (-3) e DHA (-3) inibem o metabolismo do AA (-6), e a produção dos eicosanóides derivados do AA é diminuída por esses AG -3 de maneira dose-dependente (CALDER, 2009). EPA também atua como substrato para as enzimas COX e LOX, sendo 35 convertido em PG e TX da série 3 e LT da série 5, respectivamente. Esses eicosanóides, por sua vez, apresentam ação anti-inflamatória no organismo (WANTEN; CALDER, 2007). Outros mediadores derivados do EPA e DHA são as resolvinas, enquanto DHA também produz protectinas (WEYLANDT et al., 2012). Estas moléculas são produzidas através de uma série de reações envolvendo as enzimas COX-2 e LOX e exercem potentes efeitos antiinflamatórios sobre neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células T (SERHAN et al., 2008; WEYLANDT et al., 2012). Apesar dos eicosanóides gerados a partir de EPA e DHA serem descritos por apresentar menor potência biológica do que aqueles formados a partir do AA, tem sido relatado que nem sempre isso é verdadeiro (CALDER, 2009). PGE2 e PGE3 mostraram ter efeitos inibitórios equivalentes sobre a produção de TNF-α e IL-1β por células mononucleares humanas estimuladas com lipopolissacarídeo (MILES et al., 2002). AGI -3 podem, ainda, originar AG eletrofílicos através de um mecanismo catalisado por COX-2, especificamente em macrófagos ativados. Essas moléculas podem modular a inflamação, funcionando como mediadores anti-inflamatórios por inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias e NO. Dessa forma, os AG eletrofílicos podem estar envolvidos nos efeitos anti-inflamatórios sistêmicos associados a dietas ricas em AGI -3 (GROEGER et al. 2010). AGI também podem regular a expressão de moléculas de adesão, tais como integrinas e selectinas, nos leucócitos e células endoteliais. Esse tipo de regulação é importante para migração transendotelial dos leucócitos (CALDER, 2013). AGI -3 reduz a expressão de ICAM-1, VCAM-1 e selectina-E nas células endoteliais, enquanto AGI -6 aumenta a expressão de ICAM-1 e VCAM-1. AGI -9, por sua vez, é capaz de aumentar o estado de afinidade da molécula de adesão Mac-1, permitindo maior adesão dos leucócitos às células endoteliais (POMPÉIA et al., 2000; CALDER, 2006). Um dos principais fatores de transcrição envolvido na produção de mediadores inflamatórios é o NF-κB, cuja expressão pode ser modulada por AGI (CALDER, 2013). Estudos utilizando cultura de células endoteliais têm sugerido que o LA (-6) pode desempenhar um importante papel na inflamação através da ativação do NF-κB com aumento na produção de TNF-α, IL-6 e outros mediadores inflamatórios (HENNIG et al., 1996), bem como da molécula de adesão VCAM-1 (DICHTL et al., 2002). Existem evidências que o AA (-6) também pode ativar o NF-κB (CAMANDOLA et al., 1996) e induzir a produção de TNF-α, IL-1α e IL-1β (PRIANTE et al., 2002). A expressão de COX-2 também tem sido 36 regulada pelo NF-κB em resposta a diferentes estímulos pró-inflamatórios, como lipopolissacarídeo, TNF- α e IL-1, em diferentes tipos celulares (TAK; FIRESTEIN, 2001). EPA (-3), por sua vez, é relatado por diminuir ativação do NF-κB em cultura de monócitos, sugerindo um efeito direto dos AGI -3 sobre a inibição da expressão de genes que codificam citocinas pró-inflamatórias (NOVAK et al., 2003). Entretanto, recentemente um estudo demonstrou que os AGI, independente da família a que pertencem, podem suprimir a atividade do NF-κB e dos mediadores envolvidos nessa via de sinalização, indicando, assim, um novo mecanismo através dos qual os AGI exercem seus efeitos anti-inflamatórios (SCHUMANN; FUHRMANN, 2010). Estudos recentes utilizando modelos experimentais têm explorado importantes efeitos anti-inflamatórios tópicos para os AGI presentes em óleos vegetais. O óleo da semente de pequi, rico em OA (AGI -9), foi capaz de inibir a inflamação tópica induzida por xileno de maneira dose-dependente (OLIVEIRA; NUNES-PINHEIRO et al., 2010). Esse óleo também apresentou efeito anti-edematogênico em modelos de inflamação tópica induzida por óleo de cróton, AA e fenol, sem antagonizar o edema causado pela histamina e capsaicina, sugerindo uma atividade anti-inflamatória tópica similar àquela de drogas clássicas que modulam a produção de metabólitos do AA (SARAIVA et al., 2011). Ensaios preliminares também mostram que os óleos de abóbora (OLIVEIRA et al., 2011), sucupira e andiroba, os quais apresentam diferentes proporções de AGI -6 e -9, mostraram resultados similares na inibição do processo inflamatório tópico, enquanto o óleo de linhaça (AGI -3) apresentou a menor resposta no modelo utilizado (OLIVEIRA; BEZERRA et al., 2010). Dessa forma, AGI de diferentes classes podem atuar como agentes pró ou antiinflamatórios quando administrados por via tópica ou oral. Isso pode ser verificado através de modificações nos biomarcadores celulares e moleculares, sobretudo no perfil de mediadores lipídicos e peptídicos gerados. Assim, alterações na composição lipídica da dieta ou de formulações tópicas, sobretudo na proporção de AGI -3, -6 e -9 podem estar associadas à regulação de diferentes processos inflamatórios. 2.4.2.3 Influência dos AGI na resposta cicatricial A presença de AGI na pele é fundamental para manutenção da homeostase, hidratação e barreira cutâneas. Quando há rompimento dessa barreira mecânica, os AGI são mobilizados para restabelecer a continuidade da epiderme através do processo de cicatrização 37 cutânea (McCUSKER; GRANT-KELS, 2010; KENDALL; NICOLAOU, 2013). No entanto, essas funções tornam-se reduzidas quando há deficiências nutricionais dos AG essenciais (BROWN; PHILLIPS, 2010). Os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) são fatores de transcrição pertencentes à família de receptores nucleares que regulam a homeostase da glicose e do metabolismo dos lipídios (DESVERGNE; WAHLI, 1999). Estes receptores são expressos em diferentes tecidos, incluindo a pele, já tendo sido identificados em queratinócitos, células de Langerhans e melanócitos da epiderme (MICHALIK; WAHLI, 2007). AGI -3 são ligantes agonistas dos PPAR, ativando-os. A ativação dos PPAR-β promove a sobrevivência das células por reduzir a apoptose. Isso é importante para o processo de reparo cutâneo, uma vez que PPAR-β é expresso nos queratinócitos das bordas da ferida durante todo o processo de cicatrização (McCUSKER; GRANT-KELS, 2010). Além disso, AGI -3 parece aumentar a atividade dos PPAR-γ, resultando em efeitos anti-inflamatórios por interferir na ativação do NF-κB durante a fase inflamatória do processo cicatricial (VANDEN-BERGHE et al., 2003; CALDER, 2013). Os benefícios do tratamento de feridas cutâneas com formulações contendo AG essenciais têm sido verificados na literatura (DE NARDI et al., 2004; MANHEZI et al., 2008; OLIVEIRA; NUNES-PINHEIRO et al., 2010; FERREIRA et al., 2012). Em modelos experimentais, a suplementação dietética com óleos de linhaça (AGI -3) e girassol (AGI -6 e -9) retardou o fechamento de feridas cutâneas, bem como afetou o infiltrado inflamatório e a deposição de colágeno nas lesões (OTRANTO et al., 2010). Por outro lado, a aplicação tópica do óleo de pequi (-9) acelerou o processo de reparo cutâneo (OLIVEIRA; NUNESPINHEIRO et al., 2010), assim como o óleo de gergelim (AGI -6 e -9), o qual também promoveu aumento da expressão do VEGF e maior nível de angiogênese (VALACCHI et al., 2011). Entretanto, o efeito da associação do AG essencial LA (-6) com triglicerídeos de cadeia média (ácidos caprílico, cáprico, capróico e láurico), lecitina de soja e vitaminas A e E, aplicado por via tópica em úlceras cutâneas induzidas experimentalmente, não acelerou o processo de reparo tecidual por segunda intenção (MAGALHÃES et al., 2008). Um papel relevante da administração tópica isolada de AGI -3, -6 e -9 sobre a cicatrização de feridas cutâneas também foi descrito. Esses AGI alteraram a deposição de fibras do tecido conjuntivo no sítio da ferida, sendo que o tratamento com AGI -9 induziu uma menor resposta inflamatória local e fechamento mais rápido da ferida quando comparado a AGI -3 e -6. Além disso, AGI -9 foi capaz de inibir a produção de NO nas primeiras 38 horas, enquanto AGI -3 retardou o fechamento da lesão, induziu pico de NO e intensa deposição de matriz extracelular (CARDOSO et al., 2004). AGI -3 é capaz de aumentar a produção de citocinas pró-inflamatórias no sítio de feridas, as quais são responsáveis pela ativação de macrófagos, estimulando as fases seguintes do processo cicatricial (McDANIEL et al., 2008). AGI -6 e -9 estimularam uma elevação dose-dependente dos níveis de IL-1β e VEGF, enquanto AGI n-9 também estimulou a produção de uma citocina quimioatraente para neutrófilos. Além disso, AGI -6 e -9 aumentaram a massa do tecido cicatrizado e não afetaram a permeabilidade vascular durante a fase inflamatória do reparo cutâneo. Juntos, esses efeitos pró-inflamatórios podem acelerar o processo de cicatrização (PEREIRA et al., 2008). Ensaios in vitro mostram que os AGI -6 e -9 agem sobre neutrófilos aumentando a liberação de ROS. Essas moléculas são importantes sinalizadores durante o processo de reparo tecidual, e estão envolvidas na sinalização para migração e diferenciação celular e liberação de citocinas (HATANAKA; CURI, 2007). No processo cicatricial, a produção excessiva de citocinas por neutrófilos pode levar à injúria tecidual e a morte celular. Por outro lado, a não produção de citocinas por neutrófilos pode afetar a migração de outros tipos celulares para o local da lesão. Sendo assim, a hiper ou hipo-responsividade encontrada em células tratadas com AGI pode desencadear efeitos inapropriados, aumentando a susceptibilidade do organismo à infecção por patógenos invasores (HATANAKA; CURI, 2007). AGI também podem modificar o reparo tecidual por alterar o equilíbrio das MMP e seus inibidores (TIMP), moléculas chaves na fase de remodelagem do processo cicatricial (ARMSTRONG; JUDE, 2002). Feridas cutâneas induzidas experimentalmente e tratadas com AGI -9 apresentaram maior expressão de MMP e TIMP, sugerindo uma elevada remodelagem tecidual (CARDOSO et al., 2011). Nesse mesmo estudo, AGI -9 diminuiu a expressão de COX-2 e aumentou a expressão de colágeno III quando comparado a AGI -3, e reduziu o infiltrado inflamatório nas lesões cutâneas sem induzir morte celular (CARDOSO et al., 2011). Esses resultados sugerem novos mecanismos para a modulação da resposta imunológica pelo AGI -9 na cicatrização (CARDOSO et al., 2011; SALES-CAMPOS et al., 2013). As diferentes fases do processo cicatricial podem ser moduladas por AGI. Essas moléculas regulam positiva ou negativamente a ativação de diferentes tipos celulares e a secreção de seus produtos, bem como a expressão de biomarcadores moleculares envolvidos no restabelecimento da homeostase tecidual. 39 2.5 Plantas medicinais fornecedoras de óleos vegetais objetos do estudo 2.5.1 Lippia sidoides Cham. Lippia sidoides Cham. é um arbusto aromático, caducifólio, ereto, muito ramificado, próprio da vegetação do semiárido nordestino, comum na caatinga entre MossoróRN e Tabuleiro do Norte-CE. Esta planta pertence à família Verbenaceae, sendo conhecida popularmente como alecrim-pimenta e estrepa-cavalo (Figura 2) (LORENZI; MATOS, 2002; MATOS, 2002). Figura 2. Lippia sidoides Cham. Fonte: http://cerradoinvitro.net/files/lippia_sidoides.pdf O óleo essencial obtido de suas folhas apresenta alto teor de timol, além de outros constituintes minoritários como α-felandreno, β-cariofileno, p-cimeno, mirceno e carvacrol, dentre outros (MATOS et al., 2004). As múltiplas propriedades biológicas verificadas para o óleo essencial de L. sidoides, e que apoiam seu uso popular, tem sido atribuídas ao seu constituinte majoritário, timol. Dentre estas, destacam-se as atividades antimicrobiana (BERTINI et al., 2005; FONTENELLE et al., 2007; VERAS et al., 2012), anti-helmíntica (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2008), antiprotozoária (MEDEIROS et al., 2011), antioxidante, gastroprotetora e anti-inflamatória tópica (MONTEIRO et al., 2007; VERAS et al., 2013) e antisséptica oral (GIRÃO et al., 2003; BOTELHO et al., 2009). Recentemente, um efeito inflamatório crônico para este óleo essencial também foi relatado (VERAS et al., 2013). 40 L. sidoides é uma das plantas selecionadas pelo projeto de Fitoterapia Social da Universidade Federal do Ceará denominado “Farmácias Vivas”, utilizada para tratar feridas e infecções superficiais cutâneas em pessoas carentes (MATOS, 2002). Isto torna a pele um alvo comum para as ações farmacológicas desta planta. A despeito de sua propriedade antiinflamatória tópica e de seu amplo uso popular, não foram verificados na literatura relatos sobre a segurança do uso do óleo essencial de L. sidoides sobre a pele, bem como seus efeitos sobre a cicatrização de feridas cutâneas. 2.5.2 Curcubita pepo L. Cucurbita pepo L. é uma planta herbácea pertencente à família Cucurbitaceae, a qual produz ramas rasteiras que podem chegar a 6 m de comprimento. Por ser uma espécie de polinização cruzada, há grande variedade de formas, cores e textura dos frutos, os quais são conhecidos popularmente como abóbora, moranga ou jerimum (Figura 3) (HEIDEN et al., 2007). A abóbora tem sido cultivada em todas as regiões brasileiras, incluindo o Nordeste (RAMOS et al., 2010). Esse fruto é amplamente utilizado na alimentação humana, sobretudo no preparo de vários pratos da culinária, e na ornamentação de ambientes (HEIDEN et al., 2007). Suas sementes são consideradas uma fonte valiosa de proteína e gordura vegetal, a qual fornece cerca de 400 a 540 g/Kg de óleo fixo (PROCIDA et al., 2013). Figura 3. Curcubita pepo L. Aspecto geral da planta com ramas e do fruto Fontes: Heiden et al. (2007) e Ramos et al. (2010). 41 O óleo das sementes de abóbora é extraordinariamente rico em AGI, os quais representam cerca de 84% do total de ácidos graxos, incluindo LA (-6) e OA (-9), e os saturados palmítico e esteárico (PROCIDA et al., 2013). Além disso, também é rico em minerais, vitaminas lipossolúveis, particularmente α- e γ-tocoferol, carotenoides, e outros componentes como fitoesterois (NAWIRSKA-OLSZANSKA et al., 2013; PROCIDA et al., 2013). Este óleo é utilizado pelas indústrias alimentícia e farmacêuticas, bem como na medicina tradicional de muitos países (CAILI et al., 2006). Por muitos anos, as sementes de abóbora foram utilizadas na medicina complementar principalmente como vermífugo (NAWIRSKA-OLSZANSKA et al., 2013). Com o avanço das pesquisas, evidências demonstraram que o óleo destas sementes foi efetivo contra o desenvolvimento de patologias prostáticas (HONG et al., 2009), incluindo o câncer de próstata (ANDERSON, 2005), por reduzir a inflamação deste tecido; e doenças cardiovasculares como a hipertensão (EL-MOSALLAMY et al., 2012). Além disso, também foram verificados efeitos benéficos em mulheres na menopausa devido à sua rica composição em fitoestrógenos (GOSSELL-WILLIAMS et al., 2011). Entretanto, a despeito da sua composição rica em AGI, não foram encontrados na literatura relatos de seus efeitos terapêuticos sobre a inflamação e a cicatrização cutâneas. 42 3 JUSTIFICATIVA Muitas plantas medicinais são fontes de óleos vegetais, os quais atuam como importantes agentes terapêuticos na modulação da resposta imunológica. Estudos prévios apontam para atividades anti-inflamatória e/ou cicatrizante de óleos essenciais e AGI presentes em óleos fixos. L. sidoides apresenta diversas propriedades biológicas, destacando-se seu potencial antimicrobiano e anti-inflamatório tópico, enquanto as atividades biológicas de C. pepo sobre as respostas imune-inflamatórias ainda não foram descritas. Assim, os efeitos do óleo essencial de L. sidoides e do óleo fixo de C. pepo sobre o processo inflamatório e cicatricial cutâneo, incluindo seu uso seguro sobre a pele em diferentes condições fisiológicas, o envolvimento de componentes celulares e moleculares, bem como os mecanismos através dos quais estes eventos se estabelecem, necessitam de esclarecimentos para comprovação de suas atividades. Portanto, torna-se necessário aprofundar os estudos pré-clínicos através de avaliações morfológica e detecção de biomarcadores no tecido afetado. A descoberta de novas atividades biológicas para esses óleos vegetais poderá favorecer o desenvolvimento de fitoterápicos que agreguem múltiplas potencialidades biológicas em um único produto, como é o caso do óleo essencial de L. sidoides. Somado a isso, haverá, ainda, benefícios para pessoas carentes por reduzir custos com diferentes tratamentos convencionais, bem como a viabilização de opções terapêuticas alternativas na prática clínica veterinária, sobretudo para animais que sofrem de afecções múltiplas de pele. 43 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA O óleo essencial de L. sidoides Cham. e o óleo fixo de C. pepo L. modulam as respostas imune-inflamatória e cicatricial cutânea. 44 5 OBJETIVOS 5.1 Geral Avaliar os efeitos do óleo essencial de L. sidoides e do óleo fixo de C. pepo sobre a inflamação tópica e cicatrização cutânea em modelos experimentais in vivo. 5.2 Específicos a) Verificar, in vivo, os efeitos do óleo essencial de L. sidoides sobre a pele em modelos de irritação tópica e cicatrização por excisão cutânea, através da avaliação de parâmetros morfométricos e histológicos; b) Avaliar, in vivo, os efeitos do óleo fixo de C. pepo em modelos de inflamação aguda e crônica induzida por diferentes agentes flogísticos, através de análises morfométricas e histológicas; c) Avaliar, in vivo, os efeitos do óleo fixo de C. pepo em modelo de cicatrização por excisão cutânea, através de análises morfométricas, histológicas e imunohistoquímica para COX-2 e VEGF. 45 6 ARTIGO I – O USO TÓPICO CONTÍNUO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia sidoides Cham. INDUZ RESPOSTA INFLAMATÓRIA CUTÂNEA, MAS NÃO RETARDA O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO Topical continuous use of Lippia sidoides Cham. essential oil induces cutaneous inflammatory response, but does not delay wound healing process (O uso tópico contínuo do óleo essencial de Lippia sidoides Cham. induz resposta inflamatória cutânea, mas não retarda o processo de cicatrização) Artigo submetido ao periódico Journal of Ethnopharmacology Maria Liduína Maia de Oliveiraa, Belise Maria Oliveira Bezerraa, Luana Oliveira Leitea, Virgínia Cláudia Carneiro Girãob, Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiroa,* a Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil b Departamento de Morfologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil *Corresponding author: Tel: +55 85 32270804; Fax: + 55 85 31019840. E-mail address: [email protected] (D.C.S. Nunes-Pinheiro) 46 Topical continuous use of Lippia sidoides Cham. essential oil induces cutaneous inflammatory response, but does not delay wound healing process Graphical abstract Abstract Ethnopharmacological relevance: The essential oil of Lippia sidoides (EOLS) has been used in Brazilian folk medicine as a topical antiseptic agent in skin for treatment of wounds and superficial infections of the body. The aim of this study was to investigate the effects of EOLS on intact and damaged skin, including its action on healing full-thickness cutaneous lesions in vivo. Material and methods: EOLS was analyzed chemically and used at different concentrations to dose-response experiments in skin mice. Skin irritation tests by one-dosage and multiple- 47 dosages and irritation to damaged skin were assessed by macroscopy, morphometry and histological analysis. To evaluate the effects of EOLS on wound healing, excision wounds were surgically created on the dorsum of rats, and the ointments at 6% and 12% were applied daily to the wound area. Cutaneous lesions were assessed by planimetric (wound contraction) and macroscopic parameters. Results: Skin irritation tests showed that topical application of EOLS promoted cutaneous inflammation in a concentration-dependent manner, which was demonstrated by increase of skin thickness and formation of cutaneous edema and erythema. Topical administration of EOLS in high concentrations presented an irritant response to skin, but this irritation is lighter when low concentrations this oil were used. Histological evaluation supported the outcome of these models, which revealed accentuated presence of inflammatory cells infiltration. In wound healing process, the lesions treated with EOLS showed intense edema and exsudation up to day 5, but there were not significant differences in the wound contraction on days 14 and 21. Conclusion: The continuous application of EOLS in adequate concentrations on cutaneous wounds increases inflammatory response without delay the lesions closure. The association of these results with antimicrobial action previously related to EOLS allows its indication as an alternative therapeutic modality for topical treatment of infected cutaneous wound. Keywords: Lippia sidoides; Verbenaceae; essential oil; inflammation; wound healing; skin 1 Introduction As the primary interface between the body and the environment, the skin provides a first line of defense against infection, trauma, or injury. Upon skin injury, a series of events take place aiming at the reconstruction of the wounded and cutaneous homeostasis maintenance (Bangert et al., 2011). Wound repair is a natural process of regenerating tissue with multiple pathways, which are immediately activated after an injurious stimulus and can be divided into three overlapping phases: inflammation, proliferation or granulation tissue formation, and tissue remodeling (Velnar et al., 2009). During the inflammatory phase, leukocyte cells play a key role in protecting the tissue against infections through phagocytosis, the antibacterial effects of oxygen radicals, and the activation of complement (Rock et al., 2010). In general, this response is a beneficial event that leads to removal of the 48 offending factor, repair the damage, and then the recruited cells need to be removed themselves with resolution of inflammation (Widgerow, 2011). In inflammatory and wound healing processes, several medicinal plants and their diverse biological compounds such as terpenes, phenols, lignols and essential oils have been traditionally used to inhibit or accelerate these events, respectively (Monteiro et al., 2007; Cavalcanti et al., 2012; Riella et al., 2012; Veras et al., 2013). Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) is a native aromatic bush from semiarid areas of the northeast Brazil, popularly known as “alecrim-pimenta” (Matos, 2007). Essential oil obtained from its leaves presented high concentration of thymol and exhibits multiple biological activities, including antimicrobial (Bertini et al., 2005; Fontenelle et al., 2007; Veras et al., 2012), antioxidant, gastroprotective and topical anti-inflammatory (Monteiro et al., 2007; Veras et al., 2013), and oral antiseptic (Girão et al., 2003; Botelho et al., 2009). In northeastern Brazil, pharmaceutical formulations from the essential oil of L. sidoides (EOLS) have been available by programs of herbal medicine in primary health care to treat cutaneous wounds and superficial infections in people served at regional hospitals (Matos, 2002), which make the skin a common target to pharmacologic actions of this plant. Despite topical acute anti-inflammatory (Monteiro et al., 2007; Veras et al., 2013) and chronic inflammatory effects recently attributed to OELS (Veras et al., 2013), its safe and continuous use on skin in different physiologic conditions, including the use in open cutaneous wound was not reported. Thus, the aim of this work was to evaluate the effects of topical application of EOLS on intact and damaged skin, including its action on wound healing process in experimental models. 2 Material and methods 2.1 Plant material and chemical analysis EOLS was purchased commercially from Technological Development Center (PADETEC) of the Federal University of Ceará. The chemical composition of EOLS was determined by gas chromatography coupled to mass spectrometry, using a Shimadzu 5050 GCMS-QP instrument under the following conditions-column: W Scientific DB-5MS fused silica capillary column (50 m x 0.25 mm); carrier gas: He (1 mL/min); injector temperature: 250 °C; detector temperature: 200 °C; column temperature: 35-180 °C at 4 °C/min and then 250 49 °C/15 min; mass spectrum: electronic impact 70 eV. The identification of the constituents was performed by a computer-based library search, retention indices and visual interpretation of the mass spectra (Alencar et al., 1984; Adam, 1989). 2.2 Experimental animals Male Swiss albino mice (25-30 g) and male Wistar rats (150-180 g) were used in the study. Animals were individually housed in polypropylene cages under standard experimental conditions of humidity (40-45%), temperature (23-25 °C), 12 h light/dark cycle and fed on normal pellet diet and water ad libitum. All experimental protocols were approved by Ethics Committee for Use of Animals of the State University of Ceará (protocol n° 10340180-6/2010). 2.3 Skin irritation tests Skin irritation tests were performed as previously described procedure (Jia et al., 2008) with some modifications. Swiss mice were shaved on the dorsal surface of the body, and then were left under close observation for 24 h in order to ascertain no abnormal skin responses. The shaved animals were randomly allocated into fifteen groups (n=6/group), that received EOLS (10 L) at 100% (in nature EOLS), 50%, 25% and 12% (v/v) in mineral oil (control group), applied topically in skin nude area of about 1 cm2, as following: 2.3.1. One-dosage irritation to healthy skin. Mice were treated with EOLS at different concentrations in a single dose. 2.3.2. Multiple-dosages irritation to healthy skin. Mice were repeatedly treated with EOLS at different concentrations, once per day, for consecutive 7 days. 2.3.3. Irritation to damaged skin. Mice skin abrasion was made using a scalpel blade until the presence of the noticeable tissue fluid, but not blood. The animals were treated with EOLS in a dose (10 L) fractionated three times a day for one day. Dermal reactions to the skin challenge, including edema and erythema, were evaluated by macroscopic examination daily for 7 consecutive days. Scoring method for skin irritation was performed as follows: 1-absent; 2-light; 3-moderate; 4-intense. Skin thicknesses were measured before and after application of treatments, every 24 h, using a micrometer (MMD IP54). On day 7, the animals were euthanized and skin samples were removed for histological evaluation. 50 2.4 Histological analysis Skin sample were fixed in 10% neutral buffered formalin and were embedded in paraffin wax by usual histological processing. Five-micrometer sections were cut and stained with hematoxylin-eosin. A representative area was selected for descriptive light microscopic analysis (Nikon, Tokyo, Japan) at 400x magnification. 2.5 Wound healing evaluation Excision wound model was used to evaluate the effects of EOLS on wound healing. Wistar rats were anesthetized with an intraperitoneal injection of xylazine (5 mg/kg) and ketamine (80 mg/kg) (Sadigh-Eteghad et al., 2013). The dorsal surface of each animal was shaved and area was disinfected with povidone-iodine. Then, an area approximately 4 cm2 was delimited on the dorsal medial line, and one full-thickness wound was created with sterile surgical blade and scissors as previously described (Magalhães et al., 2008). The animals were randomly divided into five groups (n=6/group). Test group was treated with EOLS ointment 6% and 12% (v/w). Control groups received ointment vehicle (vaseline and lanolin-1:2) or 0.9% saline. Reference group was treated with 5% clostebol acetate and neomycin sulphate cream. The treatments were applied topically once a day, starting from the wound induction until complete healing in enough quantity to cover all wounds. The wounds were left undressed to the open environment and observed daily (Oliveira et al., 2010). Inflammatory parameters, edema and exudation, were monitored by macroscopic examination and graded on a four-point scale: 1-absent; 2-light; 3-moderate; 4-intense. Planimetrical analysis was performed on days 0, 3, 7, 14 and 21 on anesthetized animals. The contraction rate was assessed by tracing the raw wound on each evaluation day using transparency paper and a permanent marker. The wound area and one piece of millimeter paper with known area (1 cm2) were digitalized using a scanner (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA). The measuring wound area was obtained with images analyses as previously described (Oliveira et al., 2010). Thus, the unhealed wound area and the percentage of wound contraction were calculated as reduction of initial wound size and used for statistical analysis. 51 2.6 Statistical analysis Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5.0 software (San Diego, CA, USA). The comparison between groups was carried out by ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test. The analysis of the inflammatory parameters was performed by Kruskal-Wallis test, followed by Dunn test. Results were expressed as mean±standard deviation (SD) and values of p<0.05 were considered as statistically significant 3 Results The chemical analysis of EOLS is displayed in Table 1. The main constituent was thymol, but other minor constituents were also identified. The results of skin irritation tests showed that topical application of EOLS promoted cutaneous inflammation in a concentration-dependent manner (Fig. 1). In one-dosage irritation to healthy skin model, EOLS 100% increased skin thickness (p<0.05) throughout the study (Fig. 1A). Cutaneous edema and erythema were more intense in mice treated with EOLS 100% in comparison to the control group on day 3 (Fig. 2). On day 7, it was observed epidermal discontinuity and moderate polymorphonuclear cells infiltration (Fig. 3A). In multiple-dosages irritation to healthy skin model, EOLS 100% treated group revealed intense inflammatory parameters in cutaneous tissue on day 3 (Fig. 2). From day 5, this group showed diminished skin thickness when compared to EOLS 50% treated group (p<0.05), which induced higher skin thickness on day 7 (p<0.05) (Fig. 1B). In histological evaluation, it was verified the presence of ulcer and moderate inflammatory cells infiltration in EOLS 100% treated group (Fig. 3B). In irritation to damaged skin model, the cutaneous thickness was higher in EOLS 25% and 12% treated groups in relation to the other groups up to day 4 (p<0.05) (Fig. 1C). On day 3, skin erythema and edema were more intense in EOLS 50% and 25% treated groups, respectively, as compared to control group (Fig. 2). On the other hand, the skin peeling was more intense from day 3 post-treatment with EOLS 100%, which increased progressively during the study. On day 7, it was verified intense inflammatory cells infiltration and fibroblast proliferation in EOLS 100% treated group (Fig. 3C), while the group that received EOLS 50% presented intense epidermal thickening with keratinocytes proliferation (Fig. 3D), 52 which can have contributed to higher skin thickness observed in this group at the end of experiment (Fig. 1C). When the wounds were induced experimentally, the lesions appeared clean and free of exudate throughout the study in all groups, except in groups treated with EOLS. In these groups, it was observed intense edema and exudation on wounds up to day 5. Despite the presence of edema in all groups on day 3, except in saline 0.9% control group, this inflammatory parameter was more intense and noticeable in animals treated with EOLS (Fig. 4); however, EOLS ointments promoted healing. Table 2 shows the reduction in wound area in the different groups over the 21-day study period. The wound areas decreased in all groups compared with the initial wound size, but no significant differences were verified in the wound contraction on days 14 and 21 (p>0.05). 4 Discussion In folk medicine of northeast Brazil, EOLS has been used as antiseptic agent for local use in skin (Matos, 2002). This oil presents thymol and others phenolic compounds, which are effective biological molecules when used in appropriate manner. Although the bioactive constituents of EOLS substantiate their use as the wound healing agent (Cavalcanti et al., 2012; Riella et al., 2012), they are nonselective in their action and can cause damage to host cells. Consequently, inadequate use might cause skin damage and interfere with or prevent healing (Chang et al., 2000). In the present study, we investigated the effects of continuous topical administration of EOLS on intact and damaged skin, in order to evaluate safety of EOLS on cutaneous tissues. Data present here indicate that OELS in high concentrations, mainly when it was used in nature, showed irritant effects on mice skin, which were demonstrated by increase cutaneous thickness, edema and erythema formation, loss of skin hydration and elasticity. On the other hand, in low concentrations (12%), irritant effects of EOLS on the mice skin, after seven days of treatment, were limited to discrete erythema and edema, and the skin response was estimated as light irritation. Although not indicated using pure essential oils on the skin, it must be considered that there may be improper use (Vigan, 2010). However, essential oils are used in a 12% concentration to treat skin wounds, excoriations and infections (Kerr, 2002). The skin is an immune-competent organ capable of rapid response to chemical and physical injuries by mounting an inflammatory response that prevents damage and restore tissue function (Bangert 53 et al., 2011). In this context, the results of the current study show that an increased cellular infiltration was observed on histological analysis in EOLS treated skin, which may be due to increased induction of chemotactic molecules, which might have attracted inflammatory cells towards the wound site and intensified the inflammatory response. Considering that relative skin irritancy in response to the topical treatment may play a role to delay or impair the wound healing (Jia et al., 2008), an issue addressed in this study was determining the effect of EOLS ointments on excision wound healing and evaluating their therapeutic action for topical application. Wound repair is a dynamic and complex process that requires inflammatory reaction and formation of new tissue to heal the lesion. In inflammatory phase, soluble mediators increase vascular permeability, leading to fluid extravasations that result in edema, and attract inflammatory cells, facilitating the adhesion to the endothelium and transmigration, which result in tissue exudation (Velnar et al., 2009). A successful inflammatory response is characterized by clearance of injurious stimuli and restoration of tissue normal physiology with resolution of process. However, when this event is not controlled, the exaggerated inflammation is a common factor that contributes to matrix destruction, cellular senescence, and tissue nonhealing (Rajakariar et al., 2006; Widgerow, 2011). In our study, we found that EOLS at 6% and 12% accentuated the inflammatory response by edema and exudation formation, but does not delay wound closure and promoted healing in rat skin. Despite topical anti-inflammatory activity of EOLS in acute edema model, the repeated use of both EOLS and its major constituent, thymol, induced pro-inflammatory effect and cutaneous damage, suggesting that the use this oil must be limited mainly in chronic treatment (Veras et al., 2013). On the other hand, thymol has been related as a promising compound to be used in treatment of inflammatory processes as well as wound healing, once it reduced the edema and diminished the influx of leukocytes to the injured area (Riella et al., 2012). We and other researchers believed that the anti-inflammation is the first step in the wound healing and this effect can play a direct role in facilitating the fast healing (Jia et al., 2008; Oliveira et al., 2010; Riella et al., 2012). However, a prolonged inflammatory response can be beneficial when it does not cause tissues damage and there is the need to eliminate excessive potential pathogens (Rock et al., 2010; Widgerow, 2011). In other words, the remarkable inflammatory response and normal wound closure promoted by OELS in this study associated with its previous potential antimicrobial activity (Bertini et al., 2005; Fontenelle et al., 2007; Veras et al., 2012) can be responsible for the inhibition of superficial 54 infections of the damaged skin. Moreover, considering that wound infection is likely the most common cause for deficient wound healing, the efficiency of EOLS in eradiation of the potential pathogenic microorganisms after injury can played an essential role in controlling the morbidity in patients suffering from skin wounds, such as diabetic foot ulcers in humans and traumatic ulcers in domestic animals. 5 Conclusion In summary, we provided evidence that adequate use of EOLS has positive effects on dermal irritation response and wound healing. EOLS revealed an irritant response to skin when applied topically in high concentrations; however this irritation was light when OELS was used in low concentrations, suggesting that the dose of EOLS should be controlled for external use. In relation to wound repair process, continuous use of EOLS in adjusted concentrations amplifies the inflammatory response, but does not delay the cutaneous lesions closure. Take together, the antimicrobial action previously related and exacerbation of inflammatory response during wound healing verified in our study, we suggest that the EOLS in adequate concentrations can be used topically as an alternative therapeutic modality for treatment of infected cutaneous wound. However, further cellular and molecular studies of tissue response to OELS should be carried out before to obtain conclusions more accurate regarding these heath benefits. References Adams, R.P. (Ed.), 1989. 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Unhealed wound area (mm2) and wound contraction (%) Day EOLS 6% EOLS 12% Vehicle Reference Saline 0.9% 0 432.95±39.53a 488.38±52.91a 422.08±76.47a 464.08±53.10a 449.15±67.23a 3 503.90±58.39a 539.90±52.26a 456.08±68.45ab 511.93±42.48a 406.20±69.05b 308.52±44.40ab 386.90±41.55a 237.70±46.84b 310.63±65.86ab 269.48±60.62b (28.50±9.75)AB (20.36±8.83)A (43.12±10.53)B (33.02±13.75)AB (39.44±13.61)AB 72.47±8.73ab 89.14±26.24a 58.38±16.03b 86.02±19.30ab 58.52±12.30b (82.99±3.81)A (81.42±6.12)A (85.62±5.04)A (81.45±3.65)A (86.95±2.09)A 24.67±5.75a 30.26±19.69a 9.84±13.95a 28.33±16.15a 17.10±8.50a (94.18±1.97)A (93.88±3.89)A (97.29±4.11)A (93.84±3.48)A (96.17±1.82)A 7 14 21 Results are expressed as means±S.D. (n=6). Different small letters within the same line indicate significant difference of unhealed wound area among groups (p<0.05). Different capital letters within the same line indicate significant difference of wound contraction among groups (p<0.05). 59 (A) a a b a a b a a b b b b ab ab c b b b b b b c c b b b c c c b a a a b b (B) a b b a a ab a a treatment with essential oil of L. sidoides (EOLS) at b b a b skin irritation models: (A) b b different concentrations in a c b bc c Fig. 1. Effect of topical b a bc ab ab a a a b ab a a c d c c one-dosage irritation to healthy skin; (B) multipledosage irritation to healthy (C) skin; b b (C) irritation to damaged skin. Different b small letters on the same b b b ab c ab a a a a a a ab a a day b differences a a a a c b indicate significant a ab a a ab ab a ab of skin thickness among groups (p<0.05). Results are expressed as means±S.D. c c (n=6). 60 (A) (B) a a ab ab ab ab a a a ab a ab ab ab ab ab ab b ab ab ab ab ab ab ab b b b b b Fig. 2. Evaluation scores on the skin irritation response of Swiss mice to the application of essential oil of L. sidoides (EOLS) at different concentrations in three models: (I) one-dosage irritation to healthy skin; (II) multiple-dosage irritation to healthy skin; (III) irritation to damaged skin. (A) edema and (B) erythema scores were obtained on day 3 time course. Different small letters indicate significant difference of inflammatory parameters among groups per skin irritation model (p<0.05). Results are expressed as means±S.D. (n=6). 61 Fig. 3. Skin sections in the group treated with EOLS 100% (A, B and C) and EOLS 50% (D) on day 7 in different skin irritation models: (A) one-dosage irritation to healthy skin; (B) multiple-dosage irritation to healthy skin; (C) and (D) irritation to damaged skin. (a) epidermal discontinuity; (b) inflammatory cells infiltration; (c) ulcer; (d) fibroblast proliferation; (e) epidermal thickening with keratinocytes proliferation. Haematoxylin and eosin staining. Original magnification: 200x. Scale bar: 100 μm. 62 (B) (A) a a a a ab a a ab a ab b b b b b b b b b b Fig. 4. Wound severity scores for lesions treated with essential oil of L. sidoides (EOLS) ointments in excision wound model. (A) edema and (B) exudation scores were assessed on days 1-3 and days 1-5, respectively. Different small letters indicate significant difference of inflammatory parameters among groups per evaluation day (p<0.05). Results are expressed as means±S.D. (n=6). 63 7 ARTIGO II – POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO TÓPICO DO ÓLEO DE SEMENTE DE ABÓBORA (Cucurbita pepo L.) SOBRE A INFLAMAÇÃO CUTÂNEA AGUDA E CRÔNICA EM CAMUNDONGOS Topical anti-inflammatory potential of pumpkin (Cucurbita pepo L.) seed oil on acute and chronic skin inflammation in mice (Potencial anti-inflamatório tópico do óleo de semente de abóbora (Cucurbita pepo L.) sobre a inflamação cutânea aguda e crônica em camundongos) Artigo publicado no periódico Acta Scientiae Veterinariae (v. 41, pub. 1168, 2013) Maria Liduína Maia de Oliveira1; Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro1, Belise Maria Oliveira Bezerra1, Luana Oliveira Leite1, Adriana Rocha Tomé2, Virginia Cláudia Carneiro Girão3 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brazil 2 Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brazil 3 Departamento de Morfologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE, Brazil *Corresponding author: M.L.M. Oliveira [[email protected] - Tel.: +55 (85) 3101-9860]. PPGCV, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE). Avenida Paranjana nº 1700, Campus do Itaperi, CEP 60740-903, Fortaleza, CE, Brazil. 64 Topical anti-inflammatory potential of pumpkin (Cucurbita pepo L.) seed oil on acute and chronic skin inflammation in mice GRAPHICAL ABSTRACT ABSTRACT Background: Inflammation is an adaptive response that is triggered by noxious stimuli and conditions, which involves interactions amongst many cell types and mediators, and underlies many pathological process. Unsaturated fatty acids (UFAs) can influence inflammation through a variety of mechanisms, and have been indicated as alternative anti-inflammatory agents to treat several inflammatory skin disorders. Pumpkin seed oil (PSO) is rich in UFAs, but its topical anti-inflammatory properties have not been investigated. Therefore, the aim of this paper was to evaluate the effects of PSO on acute and chronic cutaneous inflammation experimental models. 65 Materials, Methods & Results: PSO was purchased commercially and analyzed phytochemically. The topical anti-inflammatory activity of PSO at different concentrations was evaluated on acute models (xylene- and 12-O-tetradecanoylphorbol acetate (TPA)induced ear edema) and chronic model (multiple applications of oxazolone-induced dermatitis) in mice. Indomethacin and dexamethasone were used as reference drugs. The ear swelling was measured in both ear thickness (µm) and weight tissue (mg) at 1 and 4 h after xylene and TPA application, respectively. In the chronic model, the effectiveness of treatments was measured each 24 h post-challenge with oxazolone for 4 days. At the end of experiments, ear biopsies were assessed by histological analysis on hematoxylin-eosin- and toluidine blue-stained slides. Data were submitted to ANOVA followed Student Newman Keuls test (P < 0.05). PSO was characterized by a high content of unsaturated fatty acids (UFAs) (79.80%), including linoleic acid (ω-6, 55.83%) and oleic acid (ω-9, 23.47%). PSO caused a dose-dependent inhibition of xylene and TPA-induced ear edema in both skin thickness and weight when compared to respective positive controls (P < 0.05). This antiinflammatory effects was maximum when PSO was applied in nature (inhibition of 69.9±2.8% and 78.1±7.7% for inflammation induced by xylene and TPA, respectively; P < 0.05), and was similar to, at least, one drug reference (P < 0.05). In addition, the topical treatment with PSO caused the inhibition of inflammation-induced by oxazolone in 60.9±9.8% when compared to control positive (P < 0.05), which was similar to dexamethasone (68.7±8.1%, P < 0.05). In histological analysis, PSO reduced the inflammatory parameters (edema, congestion, epidermal hyperplasia and cellular infiltration) in inflammation models studied. However, the number of mastocytes in cell infiltration was reduced (17.6±4.0) when compared to positive control (39.4±5.8 cells) in chronic model (P < 0.05), but no differences were observed in acute models. Discussion: Topical anti-inflammatory activity of plant-originated substances can be evaluated in several experimental models. In this study, we used as phlogistic agents: xylene, a promoter of neurogenic inflammation; TPA, a phorbol ester that activate protein kinase C, leading to production of lipid-derived mediators; and oxazolone, an inductor of contact delayed-type hypersensitivity. Our results suggest that PSO alter inflammatory response via modulation of cellular and molecular mediators involved in inflammatory pathways activated by theses phlogistic agents. In addition, this oil was able to resolve a persistent inflammatory lesion similar to dexamethasone, but we did not observe any cutaneous alterations caused by its topical use as related for corticosteroids. This is the first report on topical anti- 66 inflammatory potential of PSO in acute and chronic skin inflammation. This activity may be attributed the proper balance of -6 and -9 UFAs present in PSO, suggesting this oil as alternative therapy for the treatment of inflammatory skin diseases. Further investigations are needed to support its application in clinical practice. Keywords: Vegetable oils, unsaturated fatty acids, pumpkin, topical inflammation, skin disorders. INTRODUCTION Inflammation is a normal defense mechanism that protects the host from infection and other insults. It involves interactions amongst many cell types and chemical mediators for restoring homeostasis [13]. These mediators include lipid-derived mediators, peptide mediators, enzymes, and adhesion molecules, depending upon the cell type involved and the nature of the injurious stimulus [3,10,15]. However, when produced in an unregulated fashion, they can cause damage to host tissues, leading to disease [3]. Inflammatory skin disorders can be treated with some success by pharmaceutical agents, such as corticosteroids and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). However, they can frequently cause a set of undesirable side effects [31]. Because of these risks, alternative bioactive molecules are being intensively investigated. In this scenario, fatty acids are highlighted as important effectors and regulators molecules in the immuneinflammatory response [18]. Unsaturated fatty acids (UFAs) are found in significant quantities in vegetable oils. Pumpkin (Cucurbita pepo L.; Cucurbitaceae) seed oil (PSO) is extraordinarily rich in UFAs, which represent about 84% of the total fatty acids. It is also rich in minerals and antioxidants as tocopherols and carotenoids [20]. Despite several vegetable oils rich in UFAs have been related as promising alternative anti-inflammatory agents on skin disorders [17,19,22], information is not available about the anti-inflammatory properties of PSO. The aim of the present study was to investigate the effects of PSO on acute and chronic cutaneous inflammation models in mice, in order to verify its topical antiinflammatory potential. 67 MATERIALS AND METHODS Phytochemical analysis The oil from the seeds of pumpkin (PSO1) was purchased commercially and used for transesterification reactions [5]. The recovered fatty acid methyl esters were analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry, using a CGC AGILENT 68650 series GC system under the following conditions-column: Methylpolysiloxane DB-23 AGILENT capillary column (60 m x 0.25 mm); carrier gas: He (1 mL/min); injector temperature: 250°C; detector temperature: 280°C; column temperature: 110°C/5 min, 110-215°C at 5°C/min and then 215°C/24 min; mass spectrum: electronic impact 70 eV. The identification of the constituents was performed by a computer-based library search, retention indices and visual interpretation of the mass spectra [1,2]. Animals Female Swiss mice weighing 25-30 g, obtained from Central Animal House of the Federal University of Ceará were used for this study. Mice were housed in standard polypropylene cages under controlled conditions of temperature (23-25°C), relative humidity (40-45%) and 12 h light/dark cycle, with free access to commercial pellet diet and water. Xylene and 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA)-induced acute ear edema Ear edema was induced in mice (n=7/group) by topical application on the inner and outer surfaces of the right ear of the following phlogistic agents: xylene2 (20 µL/ear) and 12O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA3) 2.5 µg/ear in acetone2. Immediately after the application of each phlogistic agent, the right ears were topically treated with PSO at 100% (in nature), 50% and 25% (v/v) in acetone (20 µL/ear), vehicle (acetone, 20 µL/ear, positive control), indomethacin4 (0.5 mg/ear) and dexamethasone5 (0.05 mg/ear). The left ear was considered as contralateral control and received only vehicle or saline solution (negative control, 20 µL/ear). The ear edema was evaluated 1 h after xylene and 4 h after TPA application [8,14,19]. Ear edema measurement Ear thickness was measured before and after induction of the inflammatory response using a digital micrometer. The micrometer was applied near the tip of the ear just distal to 68 the cartilaginous ridges and the thickness was recorded in µm [22]. To evaluate the ear weight, animals were euthanized, and then both ears biopsies were removed and individually weighed [19]. Edema was expressed as right ear thickness variation and as the weight difference between the right and left ears. The inhibition edema percentage was calculated as weight reduction in comparison to positive control. Oxazolone-induced chronic dermatitis Contact dermatitis induction was performed according to Ginner et al. [8]. Briefly, mice (n=7/group) were sensitized by topical application of 2% solution (w/v) oxazolone3 in acetone (50 µL) on the shaved abdomen skin for two consecutive days (days 1 and 2). On day 6, the challenge was performed by application of 2% oxazolone (30 µL) on both sides of the mouse right ear (20 µL/ear). PSO at 100% (in nature), 50% and 25% (v/v) in acetone (20 µL/ear), vehicle (acetone, 20 µL/ear, positive control) and dexamethasone (0.05 mg/ear) were topically applied (20 µL) to right ear 6, 24, 48, 72 and 96 h after challenge. The left ear was considered as contralateral control (negative control). Ear thickness was measured before treatment application each 24 h for 4 days using a digital micrometer as described above. The final measurement (102 h after challenge) was performed immediately before the animals were euthanized. The weight of ears were measured as described for xylene and TPA tests, and activity was expressed as inhibition percentage referred to the positive control. Histological analysis Ear samples were fixed in 10% neutral buffered formalin (pH 7.0) for 48 h and then processed by standard histological methods. Each sample was embedded in paraffin, cut into 5 µm sections and stained with hematoxylin-eosin (HE) and toluidine blue (TB). On the cross-sections stained with HE, a representative area was selected for qualitative light microscopic analysis at 200× magnification [22]. Mastocytes were evaluated with a semiquantitative method on TB-stained slides in five areas randomly selected at magnification of 400× [8]. Statistical analysis Data were initially submitted to Kolmogorov-Smirnov and Bartlett tests to confirm normal distribution and homogeneity of variance, respectively. Thereafter, multiple comparisons were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by 69 Student Newman Keuls test. All analyses were made using GraphPad Prism 5.0 software. Differences were considered significant at P < 0.05 and the results were expressed as means ± SD. RESULTS Chemical analysis of PSO is displayed in Table 1. This oil was characterized by a high content of UFAs (79.80%). The main fatty acids found were linoleic, oleic and palmitic acids. In the acute models of inflammation, exposure to xylene and TPA on the ear of the mouse resulted in marked increases in both ear thickness (Figures 1A and 2A) and tissue weight (Figures 1B and 2B). Topical application of the vehicles (acetone or saline solution) or PSO alone on the ear did not alter the skin thickness significantly (data not shown). However, PSO inhibited the xylene and TPA-induced ear edema in both skin thickness and weight when compared to respective positive controls (P < 0.05) at times 1 and 4 h, respectively. This inhibition occurred in a dose-dependent fashion within the range of evaluated concentrations and was similar to indomethacin and/or dexamethasone results (Figures 1 and 2). The maximal anti-inflammatory effects of PSO were verified at concentration 100% (in nature) on the TPA-induced ear edema model. In this model, in nature PSO reduced the ear edema in 78.71%, which was significantly higher as compared to inflammation inhibition promoted by others phlogistic agents (Table 2). In the chronic model of inflammation, the topical application of oxazolone to ear of sensitized mice caused a marked inflammatory response as verified by presence of erythema, edema and sometimes induration. Ear thickness significantly increased from 24 h and persisted until 102 h after the challenge (Figure 3A). At the end of experimental period, it was also observed a significant increase of ear weight (Figure 3B). The topical treatment with PSO significantly reduced the oxazolone-induced increase in both ear thickness (Figure 3A) and tissue weight (Figure 3B) during the period of study. In addition, this inhibition was dosedependent and reached its maximum 102 h after the challenge at concentration 100% (P < 0.05), showing a reduction of inflammatory response of 60.86% (Table 2). Histological analysis of the ear tissue clearly supported the results described above. Ears exposed to xylene and TPA applications revealed an intense dermal edema and congestion, epidermal hyperplasia and a large number of infiltrating inflammatory cells (Figures 4A and 4D). These findings were reduced in ear tissues of animals treated topically 70 with in nature PSO (Figures 4B and 4E) and dexamethasone (Figures 4C and 4F). Repeated applications of oxazolone induced a slight dermal edema, intense congestion, epidermal hyperproliferation and infiltration of leukocytes and mastocytes into the dermis (Figure 4G). The PSO treatment as well as dexamethasone prominently reduced the keratinocyte hyperproliferation as well as other inflammatory parameters, such as edema, congestion and cells infiltration (Figures 4H and 4I). Additionally, in the oxazolone-induced dermatitis model, the ears treated with in nature PSO showed a significant reduction in number of mastocytes when compared to positive control, but this reduction was inferior (P < 0.05) to dexamethasone (Table 3 and Figures 5G, 5H and 5I). On the other hand, no differences were observed in the number of mastocytes among treatment groups in xylene (Figures 5A, 5B and 5C) or TPA-induced ear edema models (Figures 5D, 5E and 5F), except inflamed ears with TPA and treated with dexamethasone (Table 3). DISCUSSION Models of topical inflammation induced by different phlogistic agents has been extensively used as pharmacological tools for the investigation of several substances with anti-inflammatory potential in alternative medicine. These compounds include products of plant origin as vegetable oils, which can be useful in the treatment of inflammatory skin disorders [7]. In the present study, we have examined the pharmacological properties of PSO in acute and chronic skin inflammation in order to demonstrate its topical anti-inflammatory potential. Firstly, we studied the anti-inflammatory activity of PSO in two models of topical acute edema. The xylene is a phlogistic agent that act on target cells in the periphery such as mast cells, immune cells, and vascular smooth muscle via VR1 receptors, and promote neurogenic inflammation, which is characterized by redness and warmth, swelling, and hypersensitivity. This inflammatory response result from the release of neuropeptides from primary sensory nerve terminals [15,21]. Another phlogistic agent, TPA is a phorbol ester able to activate protein kinase C, which activates other enzymatic cascades in turn, such as phospholipase A2, leading to release of arachidonic acid (AA). This signaling pathway stimulates local inflammation with vascular permeability, edema formation and polymorphonuclear leukocytes infiltration as consequence of the production of inflammatory 71 eicosanoids by cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) enzymes [6,7]. Many drug classes, such as corticosteroids and NSAIDs, can modulate the acute ear edema response in varying degrees, depending on the nature of edematogen and involved mediators [7,21]. In the present work, we observed that the topical application of PSO was able of reducing inflammation in xylene and TPA-induced acute ear edema in a dose-dependent fashion, and this effect was similar to, at least, one drug reference (Figures 1 and 2). Moreover, PSO reduced the inflammatory lesion and cellular infiltration in both acute ear edema models (Figures 4B and 4E). Taken together, these results suggest that this oil alter inflammatory response via modulation of cellular and molecular mediators involved in inflammatory pathways activated by theses phlogistic agents. A third model used in this study was the chronic skin inflammation induced by repeated exposure to oxazolone. Skin inflammation is persistent in this model, which induces a contact delayed-type hypersensitivity resembling human contact dermatitis. This response is characterized by a sustained ear swelling, marked polymorphonuclear, macrophage, mastocytes and T lymphocytes infiltration, and abundant pro-inflammatory mediators [16]. Increased skin thickening is often the first hallmark of events that occur during cutaneous inflammation, including dermal edema, inflammatory cells infiltration and proliferation of epidermal keratinocytes [12]. Here we verified that the topical application of PSO were active both in the early stage and throughout the inflammatory process and decreased the ear thickness in model of oxazolone-induced chronic dermatitis. This reduction was dosedependent and similar to dexamethasone results. Corticosteroids are well known to have potent anti-inflammatory effects, however its topical use can cause intense skin atrophy, one of the serious side effects limiting their uses for chronic skin diseases [23]. Thus, our findings support the ability of PSO to resolve a persistent inflammatory lesion, with an efficacy comparable to dexamethasone. In addition, we did not observe any cutaneous alterations when PSO alone was applied to mice skin. With an extent of activity comparable to reference drug, PSO reduced two important events related to the skin inflammatory response induced by oxazolone: the migration of neutrophils and the number of mastocytes, as determined by HE and TB staining, respectively. Indeed, the accumulation of polymorphonuclear cells and mastocytes plays a critical role in cutaneous inflammatory diseases such as contact dermatitis, and is related to the pathological mechanism of disease [16]. Neutrophils recruitment is an essential factor in the acute inflammatory process, acting as first-line defense cells in the initiation and 72 resolution phases of this process [11]. Another immune cell, the mastocytes act as important sentinels in the skin, helping to limit or even prevent the damage that results from injurious agent due to release of various biochemical mediators [25]. Under condition in which uncontrolled infiltration of these cells occurs, they can become the main aggressor factor and have pathological role [11,25]. Thus, our results directly illustrate the inhibitory effects of PSO on neutrophils and mastocytes within the target tissue, providing further evidence that PSO ameliorates oxazolone-induced contact dermatitis and indicating the therapeutic effect of this oil for chronic skin disorders. With respect to this study, for the first time, we demonstrate the topical antiinflammatory potential of PSO in acute and chronic skin inflammation. Altogether, we believed that the results evidenced here may be attributed the promising ratio of -6 and -9 UFAs (2:1) present in PSO, namely linoleic and oleic acids (Table 1). Fatty acids are a diverse set of molecules that act as cell membranes constituents, gene expression regulators, signal transduction modifiers and cell proliferation, generating products that modulate a variety of biological mechanisms, including those linked to homeostasis, immune responsiveness, and inflammation [9]. These bioactive molecules have shown to be potential anti-inflammatory agents due, at least in part, to their ability to inhibit enzymes that modulate the production of AA metabolites, or produce anti-inflammatory eicosanoids [4]. In this context, linoleic and oleic acids have been reported to modulate the skin immuneinflammatory responses [4,10,18]. These previous findings are consistent with our results, which we suggest that the proper balance of these UFAs present in PSO can have a great importance in modulation of different inflammatory signaling according to injurious stimulus. In recent years, plant-derived natural products have become known for its beneficial effects on inflammatory response [12,14,24]. Amongst the natural products as rich source of UFAs, the vegetable oils have been indicated as alternative therapy for treat skin inflammatory process [17,18]. Previously, we reported that Caryocar coriaceum oil (-6:-9 / 1:24), inhibited the xylene-induced ear edema, but this inhibition was twice less effective compared to the current study [19]. In other study, this same oil demonstrated significant topical antiedematous effect against croton oil, but did not present significant reduction on capsaicininduced ear neurogenic inflammation [22]. Here we verified that PSO showed topical antiinflammatory activity similar to reference drugs that inhibit the production of eicosanoids via modulation of phospholipase A2, COX and LOX enzymes [7,23], suggesting that this finding may be focused for future studies aiming to unravel mechanism of action of PSO. 73 In conclusion, this study represents the first report that PSO acts as a topical antiinflammatory agent, and it is effective against acute and chronic skin inflammatory processes. The anti-inflammatory activity of PSO may be attributed to promising proportions of ω-6 and ω-9 UFAs present in it, due to either their individual activity or the synergistic effect of these bioactive molecules. Together, these finding suggest that PSO may be an important alternative therapy for the treatment of inflammatory skin diseases, such as psoriasis, contact dermatitis and atopic dermatitis. Nevertheless, further investigations need to be performed to determine the precise mechanism of action and support its application in clinical practice. SOURCES AND MANUFACTURERS 1 Vital Âtman, Uchoa, SP, Brazil. 2 Dinâmica Química, Diadema, SP, Brazil. 3 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. 4 Merck Sharp & Dohme, Cramlington, Northumberland, UK. 5 EMS, Hortolândia, SP, Brazil. Acknowledgements. The authors would like to thank the Vital Âtman for providing the pumpkin seed oil and phytochemical analysis, and Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA/UECE) for support with histological photomicrographs. Ethical approval. Experimental protocols were approved by the Ethics Committee for Use of Animals of the State University of Ceará, under number 103401806-49. Declaration of interest. The authors declare no conflicts of interest. REFERENCES 1 Adams, R.P. 1989. Identification of essential oils by ion trap mass spectroscopy. 1st edn. San Diego: Academic Press, 456p. 2 Alencar W.J., Craveiro A.A. & Matos F.J.A. 1984. Kovats indices as preselection routine in mass spectra library search of volatiles. Journal of Natural Products. 47(5): 890-892. 3 Calder P.C. 2013. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and inflammatory processes: nutrition or pharmacology? 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Fatty acids Saturated fatty acids Yield (% m/m) 20.20% Palmitic acid (C16:0) 12.87 Stearic acid (C18:0) 6.24 Others 1.09 Unsaturated fatty acids 79.80% Oleic acid (C18:1; -9) 23.47 Linoleic acid (C18:2; -6) 55.83 Linolenic acid C18:3; -3) 0.21 Others 0.29 77 Table 2. Topical anti-inflammatory effect of pumpkin seed oil (PSO) and reference drugs in acute and chronic models of inflammation at the end of the experimental period. Inflammation inhibition (%) Treatment groups Phlogistic agent Xylene TPA a 78.71±7.70 Oxazolone b 60.86±9.81c PSO 100% (in nature) 69.61±2.79 PSO 50% 56.54±4.81a 70.89±5.79b 32.81±7.32c PSO 25% 49.57±7.52a 69.02±6.12b 28.90±6.90c Indomethacin 51.00±12.08a 84.11±5.86b - Dexamethasone 65.07±8.98a 88.44±6.60b 68.69±8.10a Results are expressed as means ± SD (n = 7) of ears weight reduction in relation to the positive control of each model. Different superscripts letters within the same line indicate statistically significant difference among different inflammation models (P < 0.05). 78 Table 3. Topical effect of pumpkin seed oil (PSO) and reference drug on absolute number of mastocytes in acute and chronic models of inflammation. Number of mastocytes Treatment groups Phlogistic agent Xylene TPA a 18.80±3.56 Oxazolone a 39.40±5.81a Positive control 14.40±3.05 PSO (in nature) 12.80±2.68a 16.20±2.95a 17.60±4.04b Dexamethasone 12.00±3.16a 11.80±2.59b 11.40±2.97c Negative control 8.00±1.58b 8.00±1.58c 8.00±1.58c Results are expressed as means ± SD (n = 5) of mastocytes counting in five fields on toluidine blue-stained slides. Different superscripts letters within the same column indicate statistically significant differences among groups (P < 0.05). 79 (A) a c c bc bc b (B) a c cd c bd b Figure 1. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO), indomethacin (Indo) and dexamethasone (Dexa) on xylene (Xyl)-induced ear edema in mice. Ear edema was measured at 1 h after induction of inflammation in both ear thickness (A) and tissue weight (B). The positive control only received acetone topically after the challenge with xylene. The bars represent the mean ± SD for seven animals. Different small letters indicate statistically significant differences among groups (P < 0.05). 80 (A) a bc c b b d (B) a b c c bd d Figure 2. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO), indomethacin (Indo) and dexamethasone (Dexa) on TPA-induced ear edema in mice. Ear edema was measured at 4 h after induction of inflammation in both ear thickness (A) and tissue weight (B). The positive control only received acetone topically after the challenge with TPA. The bars represent the mean ± SD for seven animals. Different small letters indicate statistically significant differences among groups (P < 0.05). 81 (A) a a a a c a bc c b bc bd d c c c c b c b c b b b b d (B) a c c b b Figure 3. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone (Dexa) on oxazolone (Oxa)-induced chronic dermatitis in mice. The responsiveness of treatments was measured in ear thickness (A) at 24, 48, 72, 96 and 102 h after challenge and just before drug application as well as in tissue weight (B) at 102 h post-challenge. The positive control only received acetone topically after the challenge with oxazolone. The bars represent the mean ± SD for seven animals. Different small letters indicate statistically significant differences among groups at different time points (P < 0.05). 82 Figure 4. Histological analysis of topical anti-inflammatory effect of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone on acute ear edema induced by xylene (A, B, C) and TPA (D, E, F) and chronic dermatitis induced by oxazolone multiple applications (G, H, I). Photomicrograph of transverse sections from ears collected in the last day of experiments. Generally, inflamed ears (A, D, G) showed dermal edema, congestion, inflammatory cell infiltration with the presence of mononuclear and polymorphonuclear cells. Treatment with in nature PSO (B, E, H) or dexamethasone (C, F, I) reduced these inflammatory parameters. A minimum of two section from five animals for each treatment were analyzed. HE staining. Original magnification: 100x. Scale bar: 200 μm. 83 Figure 5. Topical effect of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone on mastocytes infiltration in acute ear edema induced by xylene (A, B, C) and TPA (D, E, F) and chronic dermatitis induced by oxazolone multiple applications (G, H, I). Photomicrograph of transverse sections from ears collected in the last day of experiments. In chronic model, the treatment with in nature PSO (B, E, H) and dexamethasone (C, F, I) reduced the number of mastocytes in inflammatory cell infiltration when compared to respective positive control (A, D, G). A minimum of two section from five animals for each treatment were analyzed. Toluidine-blue staining. Original magnification: 100x. Scale bar: 200 μm. 84 8 ARTIGO III – ÓLEO DE SEMENTE DE ABÓBORA REDUZ A EXPRESSÃO DE CICLOOXIGENASE-2 (COX-2) E MELHORA A EXPRESSÃO DO FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) NA CICATRIZAÇÃO CUTÂNEA Pumpkin seed oil reduces the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and ameliorates the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in cutaneous wound healing (Óleo de semente de abóbora reduz a expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2) e melhora a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) na cicatrização cutânea) Artigo submetido ao periódico Wound Repair and Regeneration Maria Liduína M. Oliveira, MSc1; Belise M. O. Bezerra, MSc1; Luana O. Leite, MSc1; Neuza F. G. Rochette, PhD2; Virginia C. C. Girão, PhD3, Diana C. S. Nunes-Pinheiro, PhD1 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil 2 Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil 3 Departamento de Morfologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil *Corresponding author: Tel: +55 85 32270804; Fax: + 55 85 31019840. E-mail address: [email protected] (D.C.S. Nunes-Pinheiro) 85 Pumpkin seed oil reduces the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and ameliorates the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in cutaneous wound healing GRAPHICAL ABSTRACT ABSTRACT Pumpkin seed oil is rich in unsaturated fatty acids (-6, -9), which are bioactive molecules that act on generating lipid mediators involved in inflammatory responses and tissue repair. This paper evaluated the effects of pumpkin seed oil on wound healing and the expression of mediators, cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor, involved at different phases of this process. Full-thickness wounds were induced on the dorsum of mice, and pumpkin seed oil at different concentrations was administrated topically on lesion area for 10 days. Skin lesions were assessed by planimetrical, histological and immunohistochemical analyses. Treatment with pumpkin seed oil (in nature) promoted wound healing. The rate of wound closure was higher in this group during the first seven days, although all the wounds were completely re-epithelized irrespective of treatments on 86 day 10. Furthermore, under the same treatment, polymorphonuclear cells and cyclooxygenase-2 expression were reduced on day 3, while an enhanced neovascularization and vascular endothelial growth factor expression were observed on day 7. The results were similar to reference oil treated group. Our findings have important implications for topical use of pumpkin seed oil as a promising alternative for wound healing therapy in reparative medicine. This is the first report of this oil as a healing agent. Keywords: Vegetable oils, fatty acids, wound healing, COX-2, VEGF. INTRODUCTION Skin provides the first line of defense against microbial pathogens and traumatic injury. After skin injury, a complex series of events must proceed for the epidermal and dermal wound recovery and cutaneous homeostasis maintenance.1 Wound repair can be broken down into several overlapping phases. Generally, it starts with blood clot formation, and then progresses through the inflammation, formation of new granulation tissue, angiogenesis and matrix remodelling. This process involves multiple cell population, extracellular matrix components and many bioactive soluble mediators such cell adhesion molecules, cytokines, growth factors and eicosanoids.2,3 Eicosanoids such as prostaglandins (PGs) has been reported to be involved in the inflammatory phase of wound repair.4 PGs are formed by the combined actions of phospholipase, which releases arachidonic acid (AA) and other fatty acid precursors from cell membrane phospholipids, and cyclooxygenase (COX), which converts AA to PGs.5 There are 2 main enzymes in the COX pathway: COX-1 and COX-2. In general, COX-1 is constitutively expressed in most tissues as skin and it is related with the vascular homeostasis, while COX-2 is inducible under inflammatory stress.6,7 The expression of COX-2 in the inflammatory phase of cutaneous wound healing has been reported in murines,8,9 dogs10 and humans,11 thus suggesting that it plays important role during skin repair. Angiogenesis is a crucial event for new granulation tissue formation in the proliferative stage. This process is early stimulated by vascular endothelial growth factor (VEGF) and other factors produced by effector cells in the wound.12 The new blood vessels support the delivery of nutrients and inflammatory cells to the healing tissue, and facilitate the removal of debris and deposition of the fibrin-rich matrix required for wound closure.13 87 Although great advances have been verified in the understanding of different events that occur during tissue repair, the wound healing remains a challenging clinical problem, which depends on an efficient wound management. In recent years, much effort has been focused on understanding the physiology of healing and wound care with emphasis on new therapeutic approaches.3 Previous studies have shown that unsaturated fatty acids (UFAs) present in vegetable oils can be therapeutically used to treat cutaneous wounds.14-16 UFAs have been reported to modulated the wound repair process17-19 by regulating cell proliferation and signaling and through activation of growth factor and other mediators.5 Among several oleaginous plants, pumpkin (Cucurbita pepo L.; Cucurbitaceae) seeds contain between 400 and 540 g/kg oil, which is extraordinarily rich in UFAs and represent about 84% of the total fatty acids. It is also rich in minerals and antioxidants as tocopherols and carotenoids and others compounds such as phytosterols.20,21 Despite of various vegetable oils abundant in UFAs have been related to promote cutaneous cicatrization,22-25 the therapeutic effects of pumpkin seed oil (PSO) on skin wound repair were not reported. Thus, the aim of the present study was to investigate the effects of topical treatment with PSO on experimentally induced cutaneous lesions in mice, in order to evaluate the expression of mediators, COX-2 and VEGF, involved in the wound healing process. MATERIALS AND METHODS Chemical analysis The oils from the seeds of pumpkin (Curcubita pepo L.) and sunflower (Helianthus annus; reference oil) was acquired commercially from a natural products company specialized in the production and marketing of vegetable oils extracted by cold-pressing the seeds (Vital Âtman, Uchoa, São Paulo, Brazil). Fatty acid methyl esters were prepared following the AOCS Official Method Ce 162.26 The recovered methyl esters were analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry, using a CGC AGILENT 68650 series GC system under the following conditionscolumn: Methylpolysiloxane DB-23 AGILENT capillary column (60 m x 0.25 mm); carrier gas: He (1 mL/min); injector temperature: 250 °C; detector temperature: 280 °C; column temperature: 110 °C/5 min, 110-215 °C at 5 °C/min and then 215 °C/24 min; mass spectrum: electronic impact 70 eV. The identification of the constituents was performed by a computerbased library search, retention indices and visual interpretation of the mass spectra.27 88 Animals A total of 42 male Swiss albino mice, weighing 25-30 g, from the central vivarium of the Federal University of Ceará were used for this study. The animals were individually housed in clean polyethylene cages with free access to a commercial pellet diet and water ad libitum. The animals were maintained under standard experimental conditions of relative humidity (40-45%), room temperature (23-25 °C) and 12 h light dark cycle. The experimental protocols were approved by Ethics Committee for Use of Animals of the State University of Ceará, Fortaleza, Brazil (n° 103401806-49). Wound healing evaluation Excision wound model was used to evaluate the wound healing activity of PSO. Mice were anesthetized with xylazine (5 mg/kg, i.p.) and ketamine (80 mg/kg, i.p.) prior to the creation of the wounds.28 The dorsal surface of animals was shaved 48 h before surgical intervention and shaved area was disinfected with povidone-iodine. Four full thickness of the excision wounds of circular area were made with a 5 mm diameter punch on the dorsum of animals, below their shoulder blades at a distance of about 2.5 cm among wounds.22 In each animal, one wound was used for planimetry and the others three lesions were used for histological and immunohistochemical analyses. The animals were randomly divided into six groups (n=7/group). The test group animals were treated (20 μL for direct application into the wound bed) with in natura PSO and PSO at 50% (v/v) and 25% (v/v). Control groups animals received the vehicle (mineral oil) or saline 0.9% and reference group animals were treated with in natura sunflower seed oil (Helianthus annuus) at a dose of 20 μL per wound. The wounds were left undressed to open environment and observed daily. The treatments were applied topically once a day every 24 h, starting from the wound induction until complete healing. The wounding day was considered as day 0. Planimetry The progressive changes in wound area were monitored by a digital photographic camera (Sony, Tokyo, Japan). Planimetry was performed on days 0, 3, 7 and 10 on anesthetized animals. The anesthesia protocol used to create the wounds was repeated. The contraction rate was assessed by tracing the raw wound on each evaluation day using transparency paper and a permanent marker. The wound area and one piece of millimeter 89 paper with known area (1 cm2) were digitalized using a scanner (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA). The measuring area was obtained comparing the amount of pixels inside perimeter and inside the known area using the mathematic expression: Wa=(Ka×Nw)/Nk, where Wa = wound area, Ka = known area, Nw = number of pixels inside wound area and Nk = number of pixels inside known area. Thus, the unhealed wound area and the percentage of wound contraction were calculated as reduction of initial wound size on day 0 and used for statistical analysis.22 Histology Skin samples were isolated from different healed wounds of each group of mice on days 3, 7 and 10 for histological examination. Tissues sample were fixed in 10% neutral buffered formalin and were embedded in paraffin wax by usual histological processing. Fivemicrometer sections were cut and stained with hematoxylin-eosin. Sections were semiquantitatively assessed under the light microscope (Olympus BX51, Tokyo, Japan) at 400x magnification and graded as absent (0), partial (1) and total (2) for epidermal recovery. Also, the presence of edema, fibroblast proliferation, mononuclear and polymorphonuclear cells and neovascularization in dermis were scored as following: (0) absent or normal, (1) mild, (2) moderate and (3) intense. All histological sections were blindly evaluated by the same investigator. Immunohistochemistry Immunohistochemical investigations were performed on paraffin-embedded sections from skin tissue on days 3 or 7 for COX-2 and VEGF, respectively. Sections of 5 μm were mounted on positive-charged glass slides and dried for 1 h at 60°C. Slides were deparaffinised and submitted to retrieval antigen process with Dako EnVision TM FLEX Target Retrieval Solutions High pH (Code DM828) or Low pH (Code DM829) for 20 min. at 97 °C using the Dako pre-treatment (PT) link module (Dako, Glostrup, Denmark). Endogenous peroxidase activity was inhibited by Peroxidase Block (Dako) for 5 minutes, and slides were subjected either to mouse monoclonal anti-human COX-2 (clone CX-294; Dako) diluted 1:100; and mouse monoclonal anti-human VEGF (clone VG1; Dako) diluted 1:100 and incubated for 1 h at room temperature. The slides were then washed three times in phosphate-buffered saline (PBS, pH=7.2) and then incubated with EnVision polymer reagent (EnVision TM + Dual Link System/HRP; Dako) for 30 min at room temperature and finally diaminobenzidine 90 (DAB; Dako) for 10 min according to the manufacturer’s instructions (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA). The sections were counterstained with Mayer’s hematoxylin for 3 min. The specificity of this immunohistochemical procedure was verified using a negative and positive control before evaluation. For negative control purposes, a slide was treated according to the full protocol but without the primary antibody, which was replaced by antibody diluents. Samples from kidney and endometrium were used as positive control for COX-2 and VEGF, respectively, according to the manufacturer’s instructions (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA). The intensity of the staining was analyzed by light microscopy (Olympus BX51, Tokyo, Japan) at 400x magnification and scored accordingly to the following scale: (–), no immunohistochemical staining; (+), slight positive staining, up to 15% positive cells; (++), moderate positive staining, from 15% to 30% positive cells; and (+++), strong positive staining with more than 30% positive cells as described previously.29 Statistical analysis Parametric and nonparametric tests were performed using GraphPad Prism 5.0 software (San Diego, CA, USA). Unhealed wound area and wound contraction data were initially submitted to Shapiro-Wilk and Bartlett tests to confirm normal distribution and homogeneity of variance, respectively. Then, results were submitted to the one-way analysis of variance (ANOVA), followed by SNK post-test for comparison of means. Histological data were assessed by Kruskal-Wallis test. Values of p<0.05 were considered statistically significant. Results were expressed as means±standard desviation (S.D.). RESULTS Chemical analysis of PSO showed similar fatty acid composition to reference oil, and the results are presented in Table 1. The main constituents were linoleic acid (ω-6), oleic acid (ω-9), palmitic acid and stearic acid. Other minor fatty acids as linolenic acid and palmitoleic acid were also identified. The effects of PSO on the wound healing in mice are shown in Figure 1, which demonstrates the evolution of cicatrization throughout 10 days of study. The wounds appeared clean and free of exudates throughout the study in all groups. The granulation tissue formation was noticeable at wound edges on day 3. It was verified an enhanced wound 91 closure in PSO treated group and reference group on days 3 and 7. The measured values of the progression of wound healing are shown in Table 2. On day 3, in natura PSO treated group significantly decreased the lesion area when compared to the control group (p<0.05). This effect was also observed on day 7, when this oil group showed higher wound contraction in comparison to the other groups (p<0.05), except to reference group. On day 10, all the lesions were completely closed and re-epithelized. Histological parameters of cicatrization process that were evaluated and scored throughout the study are presented in Table 3. Representative images demonstrating this process were also added (Figure 2). On the hematoxylin-eosin staining, epithelization, infiltration of inflammatory cells, fibroblastic and vascular proliferations were commonly seen on all the wounds; but differentiated results were noted in PSO treated group and reference group. The treatment with in natura PSO decreased polymorphonuclear cells infiltration at the wound bed (p<0.05) on day 3, and increased fibroblastic activity and vascular proliferation (p<0.05) on day 7 when compared to the control group, and this results was equivalent to the reference group. On day 10, all the wounds were completely reepithelized irrespective of treatments, despite the re-epithelization capacity have already been evidenced from day 3 in wounds treated with in natura PSO (p<0.05). Congestion and necrosis were not observed on the wound areas during the period of study. Immunohistochemical analysis results are summarized and displayed in Figure 3. The wounds treated with in natura PSO presented a slight COX-2 expression in inflammatory cells on day 3, and a moderate VEGF expression in both inflammatory and epidermal cells on day 7, as compared to the control group. Differences in the staining intensity of COX-2 and VEGF were not verified between lesions that received in natura PSO and reference oil. DISCUSSION In recent years, the search for topical new drugs and bioactive molecules that are effective in stimulating wound healing has been intensified. In this scenario, the role of fatty acids as effectors, mediators and regulators molecules in a variety of biological processes including those linked to homeostasis, immune responsiveness, and inflammation is still an object of scientific investigation. Fatty acids a diverse set of molecules that act as cell membranes constituents, gene expression regulators, signal transduction modifiers and cell proliferation, generating products that modulate the biological mechanisms.30 In the present work, we investigated the role of UFAs present in PSO on modulation of the inflammatory 92 and proliferative stages of cutaneous wound healing, in order to evaluate cellular and molecular mechanisms involved in this process. The fatty acids composition of PSO used in our study indicated the presence of linoleic acid (ω-6) and oleic acid (ω-9), which was similar to composition of other varieties of pumpkin seeds employed for oil production.20,21 Linoleic and oleic acids have been previously related to modulate the skin immune-inflammatory responses and wound repair,5,19,31,32 and we believed that the proportion of these UFAs in PSO may exert positive effects via regulation of molecular mediators expression during wound healing. Wound repair is a dynamic and complex process that requires inflammatory reaction, formation of new tissue, wound contraction and angiogenesis to heal the lesion.3 In this present study, the topical treatment with in natura PSO stimulated a higher wound contraction, which was confirmed by histological analysis. Among the microscopic findings, PSO induced an enhanced proliferation of fibroblasts in the granulation tissue. These activated cells are responsible for wound contraction and produce extracellular matrix proteins and growth factors, which regulate the proliferative and remodeling phases of wound healing.33 In addition, PSO presented equivalent reparative response to the reference oil used in this work, which may be attributed to similar UFAs composition. Sunflower seed oil (H. annuus) was selected as reference oil because it is used widely to treat skin lesions in clinical dermatology (Declair, 1997). Alternatively, the topical use of others vegetable oils rich in ω-6 and ω-9 UFAs, such as pequi,22 sesame,23 linseed,24 and avocado25 oils, has also been reported to accelerate the cutaneous repair process. However, when these UFAs were used separately, it was observed that ω-9 UFA induced faster wound closure when compared to ω-3 and ω-6 UFAs.31 To understand part of the molecular mechanisms through which topical treatment with PSO modifies the rate of the wound contraction, we investigated the immunohistochemical staining intensity of COX-2 and VEGF on days 3 or 7, respectively. It is known that wound healing involves induction of COX-2 expression in different mammalian species.8-11 In the present work, despite low COX-2 expression, we did not observe significant differences in edema induced by PSO treatment (Table 3). The COX-2 pathway is responsible for the production of the PGs and thromboxanes from AA, whose precursor is linoleic acid.5 Some PGs are potent vasodilators that also act synergistically with other mediators to increase microvascular permeability and promote edema; stimulate local neovascularization, cellular migration, fibroblastic proliferation and differentiation along with extracellular matrix synthesis during the wound healing.4-7 However, it has been demonstrated that administration 93 of selective COX-2 inhibitor does not affect healing of cutaneous wounds.9 Considering that oleic acid is not metabolized into AA derived metabolites19 and the high content linoleic acid present in PSO, we suggest that the reduced COX-2 expression verified in our study can be associated with a low production of pro-inflammatory lipid mediators in PSO treated lesions without affect wound repair. In contrast to declined COX-2 expression, we also verified diminished polymorphonuclear cells infiltration in lesions treated with in natura PSO (Table 3). Previous study have demonstrated that the accumulation of phagocytes in the inflamed area is possible through the activation of endothelial cells and the increased expression of adhesion molecules, which are regulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF-α).34 In addition, TNF-α production is regulated by nuclear factor κB (NF-κB), which is the principal transcription factor involved in up-regulation of others inflammatory cytokines, adhesion molecules and COX-2 genes.35 In this context, UFAs can affect the gene expression of inflammatory mediators.32 It was previously reported that the use of ω-3,17 ω-6 and ω-9 UFAs18 may increase pro-inflammatory cytokines production in wound site during cicatrization process. In a more recent study, an elevated TNFα expression was detected in oleic acid treated cutaneous lesions.19 In contrast, a diminished leukocyte infiltration and low COX-2 gene expression in lesions treated with this ω-9 UFA was also verified, which were associated to an enhanced reparative response in vivo.19 Another study reported that NF-κB activation can be mediated by linoleic acid in endothelial cells, which increased production of TNF-α and other inflammatory mediators.36 Taken together, these information supported the suggestion that the proportions of linoleic and oleic acids present in PSO may down-regulate the TNF-α expression and, consequently, reduce polymorphonuclear cells infiltration in lesions treated with this oil. Moreover, we also suggest that oleic acid may modulate COX-2 expression in cutaneous wounds treated with PSO. Angiogenesis is another important event that plays a central role in tissue repair. Formation of vessels-rich granulation tissue is regulated by locally liberated potent angiogenic factors as VEGF.12,13 VEGF is a glycoprotein that enhances vascular permeability, induces chemotaxis and activation of monocytes/macrophages, and promotes growth of vascular endothelial cells.12 In our work, we verified that in natura PSO treatment stimulated neovascularization in the granulation tissue and induced a moderate VEGF expression in inflammatory cell. Previous studies reported that ω-6 and ω-9 UFAs relatively increased expression of VEGF and promoted higher angiogenesis in wound healing experimental models.18,23,37 Furthermore, it is interesting to observe that VEGF is produced by multiple 94 cells in different phases of the wound repair, such as polymorphonuclear cells, macrophages, fibroblast-like cells, and endothelial cells.38 Thus, we can assume the important role of this mediator during the wound healing process. In summary, the current study provides firm evidences that PSO presents wound healing potential and highlights its underlying molecular pathways, in party by reduced COX-2 expression associated with diminished inflammatory cells infiltration as well as ameliorated VEGF expression in skin lesions. Considering that there is an exacerbated production of inflammatory mediators in skin inflammatory diseases, it is possible that down-regulated expression of COX-2 may accelerate the wound healing by reducing inflammatory response. The modulation of reparative activity may be attributed to promising proportions of ω-6 and ω9 UFAs present in PSO, due to either their individual activity or the synergistic effect of these bioactive molecules. This study opens new perspectives in the use of PSO as alternative option for topical wound healing therapy in reparative medicine. If translated to the clinic, this will lower costs and make skin care easier. Nevertheless, further understanding of others signaling pathways involved in this process should be provided to support its use in clinical practice. ACKNOWLEDGEMENTS The authors are grateful to Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) for financial support, and to Vital Âtman for providing the pumpkin seed oil and chemical analysis. They also extend their thanks to Maria do Socorro França Monte for help with histological processing, to Suzana Moreira de Souza for assistance with the PT link module, and to Conceição da Silva Martins for immunohistochemical techniques help. REFERENCES 1. Bangert C, Brunner PM, Stingl G. Immune functions of the skin. Clin Dermatol 2011; 29: 360-76. 2. Werner S, Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol Rev 2003; 83: 835-70. 3. Velnar T, Bailey T, Smrkoli V. The wound healing process: an overview of the cellular and molecular mechanisms. J Int Med Res 2009; 37: 1528-42. 95 4. 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Constituents Fatty acids Yield (% m/m) Structural formula PSO Reference Lauric acid C12:0 0.02 - Myristic acid C14:0 0.17 0.10 Pentadecanoic acid C15:0 0.03 - Palmitic acid C16:0 12.87 6.45 Margaric acid C17:0 0.17 0.10 Stearic acid C18:0 6.24 4.46 Arachidic acid C20:0 0.47 0.32 Behenic acid C22:0 0.13 0.88 Lignoceric acid C24:0 0.10 0.32 Palmitoleic acid C16:1 (ω-7) 0.13 0.13 Cis-10-heptadecenoic acid C17:1 ω-7) 0.07 0.07 Oleic acid C18:1 (ω-9) 23.47 32.15 Linoleic acid C18:2 (ω-6) 55.83 54.65 Linolenic acid C18:3 (ω-3) 0.21 0.08 Eicosenoic acid C20:1 (ω-9) 0.09 0.17 Saturated Mono and polyunsaturated 99 Table 2. Effect of pumpkin seed oil (PSO) on wound healing by excision wound model. Unhealed wound area (mm2) and wound contraction (%) Day 0 3 7 10 PSO (in natura) PSO 50% PSO 25% Reference Vehicle Saline 0.9% 21.992.53a 22.862.03a 22.301.98a 20.212.50a 21.642.70a 23.441.76a 10.272.37a 13.011.83ab 12.461.96ab 10.032.78a 14.111.94b 15.032.35b (51.108.05)A (34.339.03)B (35.988.07)B (53.129.32)A (42.808.98)AB (43.5711.09)AB 1.060.43a 2.731.18b 2.600.61b 1.830.75ab 4.591.01c 4.501.39c (95.122.07)A (88.025.38)B (88.292.93)B (91.202.84)AB (78.455.95)C (80.805.60)C 0.000.00 0.000.00 0.000.00 0.000.00 0.000.00 0.000.00 (100.0) (100.0) (100.0) (100.0) (100.0) (100.0) Results are expressed as means±S.D. (n=7). Different small letters within the same line indicate significant difference of unhealed wound area among groups (p<0.05). Different capital letters within the same line indicate significant difference of wound contraction among groups (p<0.05). 100 Table 3. Histological evaluation of wound healing process in different groups of treatment per biopsy day. Wound healing process Treatment groups per biopsy day Ed PMN MNC FP NV RE 1.331.03a Day 3 PSO (in natura) 0.501.22a 1.670.52a 0.170.41a 1.500.55a 0.670.52a PSO 50% 0.830.98a 2.830.41b 0.170.41a 0.670.52b 0.500.55ab 0.830.98ab PSO 25% 1.000.89a 2.670.52b 0.670.82a 0.500.55b 0.000.00b Reference 0.330.52a 2.000.71a 0.830.75a 1.000.63ab 0.330.52ab 0.600.55ab Vehicle 1.171.47a 3.000.00b 0.330.52a 0.170.41b 0.000.00b 0.000.00b Saline 0.9% 1.001.55a 2.830.41b 0.500.84a 0.330.52b 0.000.00b 0.000.00b PSO (in natura) 0.000.00a 0.330.52a 2.000.89a 2.670.52a 2.170.75a 1.670.52a PSO 50% 0.170.41a 0.500.55a 2.000.63a 1.830.41b 1.170.41b 1.670.52a PSO 25% 0.330.82a 0.670.52a 1.331.03a 1.170.75b 0.670.82b 1.170.75a Reference 0.170.41a 0.330.52a 2.170.75a 2.000.63ab 2.000.63a 1.170.41a Vehicle 0.670.82a 0.670.52a 1.670.82a 1.330.52b 0.830.75b 1.001.10a Saline 0.9% 0.500.84a 0.670.82a 1.830.98a 1.500.55b 1.000.63b 1.330.52a PSO (in natura) 0.000.00 0.000.00 0.670.52a 1.670.52ab 1.330.52a 2.000.00 PSO 50% 0.000.00 0.000.00 0.830.41ab 1.000.63a 1.170.98a 2.000.00 PSO 25% 0.000.00 0.000.00 1.000.00ab 0.670.82a 1.170.41a 2.000.00 Reference 0.000.00 0.000.00 0.830.41ab 1.500.55ab 1.330.82a 2.000.00 Vehicle 0.000.00 0.000.00 1.330.52ab 2.330.52b 1.830.41a 2.000.00 Saline 0.9% 0.000.00 0.000.00 1.500.55b 2.170.75b 1.670.52a 2.000.00 0.330.82ab Day 7 Day 10 Results are expressed as means±S.D. (n=6). Different small letters within the same column indicate significant difference of histological parameters among groups per biopsy day (p<0.05). Haematoxylin and eosin stained sections were scored as absent or normal (0), mild (1), moderate (2) and intense (3) for epidermal and/or dermal re-modeling. Re-epithelization was scored as absent (0), partial (1) and total (2). Ed: edema; PMN: polymorphonuclear cells; MNC: mononuclear cells; FP: fibroblast proliferation; NV: neovascularization; RE: re-epithelization. 101 Figure 1. Macroscopic wound closure on days 0, 3, 7 and 10 post-surgery. The in natura PSO treated group shown an enhanced wound closure when compared to other treatment groups, except to reference group on day 7. 102 Figure 2. Histological progression of the wound healing in PSO (in nature) treated group, reference and saline 0.9% control groups (top to bottom, respectively) on days 3 (left column) and 7 (right column). On day 3, a single cells layer in re-epithelized epidermis could be observed in group treated with in natura PSO, while ulcer areas could still be verified in the other groups. Wound healing was characterized by a complete re-epithelization and higher proliferation of fibroblasts and neovascularization in PSO (in nature) treated group on day 7. Haematoxylin and eosin staining. Original magnification: 100x. Scale bar: 200 μm. 103 Figure 3. Immunohistochemical staining for COX-2 and VEGF on days 3 and 7, respectively. In natura PSO treated lesions decreased COX-2 expression on day 3 and increased relatively VEGF expression as compared to saline 0.9% control group on day 7. Similar results was found in reference group. Sections were scored as +, slight positive staining, up to 15% positive cells; ++, moderate positive staining, from 15% to 30% positive cells; +++, strong positive staining with more than 30% positive cells. Original magnification: 400x. Scale bar: 50 μm. 104 9 CONCLUSÕES O óleo essencial de L. sidoides, quando usado continuamente sobre a pele, possui efeito irritativo e promove uma resposta inflamatória no tecido afetado. Entretanto, a atividade pró-inflamatória observada não retarda o fechamento de lesões durante o processo de cicatrização cutânea. Essas atividades biológicas podem estar relacionadas ao alto teor de timol encontrado nesse óleo. O óleo fixo de C. pepo possui atividades anti-inflamatória tópica e cicatrizante, sendo capaz de inibir processos inflamatórios cutâneos agudos e crônicos, e modular a expressão dos mediadores COX-2 e VEGF, envolvidos nas diferentes fases do processo cicatricial. Esses efeitos podem ser atribuídos à proporção promissora de AGI ω-6 e ω-9 presentes neste óleo, seja pelos efeitos individuais ou sinérgicos dessas moléculas bioativas. 105 10 PERSPECTIVAS Os resultados obtidos neste trabalho, associados à ação antimicrobiana do óleo essencial de L. sidoides previamente relatada na literatura, sugerem que a utilização deste óleo em concentrações adequadas pode ser indicada como uma modalidade terapêutica alternativa para tratamento tópico de feridas cutâneas infectadas. No entanto, estudos mais aprofundados envolvendo os mecanismos celulares e moleculares da resposta cutânea modulada pelo óleo essencial de L. sidoides deverão ser realizados para o estabelecimento de protocolos clínicos em diversas espécies. Além disso, a partir deste estudo surgem novas perspectivas sobre a utilização do óleo fixo de C. pepo como uma nova opção terapêutica para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas associadas ou não à lesões cutâneas na medicina alternativa e complementar. No entanto, torna-se necessário o entendimento de outras vias de sinalização envolvidas nesses processos, para definir mecanismos de ação mais precisos e, assim, apoiar o uso terapêutico deste óleo na prática clínica humana e veterinária. 106 REFERÊNCIAS ABENA, A. A.; DIATEWA, M.; GAKOSSO, G.; GBEASSOR, M.; HONDI-ASSAH, T.; OUAMBA, J.M. Analgesic, antipyretic and anti-inflammatory effects of essential oil of Lippia multiflora. Fitoterapia, v. 74, p. 231-236, 2003. ABU-AL-BASAL, M. A. Healing potential of Rosmarinus officinalis L. on full-thickness excision cutaneous wounds in alloxan-induced-diabetic BALB/c mice. Journal of Ethnopharmacology, v. 131, p. 443-450, 2010. ADAMS, R. P. 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