CRESCIMENTO MICROBIANO
Profa. Karina Ponsoni Corbi
1. Fatores necessários para o crescimento
 - Fatores Físicos ( temperatura, pH, pressão osmótica)
 - Fatores Químicos (nutrientes, água, O2 etc.)
2. Meio de Cultura
 - Meio Complexo
 - Meio Definido
3. Crescimento da cultura bacteriana
 - Quantificação Direta (nº. de colônias viáveis ou
não)

- Quantificação Indireta (turbidez, peso seco etc.)
CRESCIMENTO MICROBIANO:
Em microbiologia, o termo crescimento refere-se
a um aumento do número de células e não ao
aumento das dimensões celulares.
Crescimento Microbiano = associado ao
crescimento de uma população de
células (uma célula dará origem a duas ao
fim de um certo tempo, tempo de
geração ou de duplicação.)
FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO
- FATORES FÍSICOS:
TEMPERATURA
PH
PRESSÃO OSMÓTICA (CONCENTRAÇÃO DE SAL)
- FATORES QUÍMICOS:
ÁGUA
FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO
MINERAIS
OXIGÊNIO
FATORES ORGÂNICOS
FATORES FÍSICOS
1. TEMPERATURA:
A MAIORIA DOS MICRORGANISMOS CRESCE BEM NAS TEMPERATURAS IDEAIS
PARA OS SERES HUMANOS.
- TEMPERATURA DE CRESCIMENTO MÍNIMA:
< TEMPERATURA ONDE A ESPÉCIE É CAPAZ DE CRESCER
- TEMPERATURA DE CRESCIMENTO ÓTIMA:
ONDE A ESPÉCIE APRESENTA MELHOR CRESCIMENTO
- TEMPERATURA DE CRESCIMENTO MÁXIMA:
> TEMPERATURA, ONDE AINDA É POSSÍVEL O CRESCIMENTO
Figura 1
Figura 1. Taxa de crescimento vs. temperatura
FATORES FÍSICOS
1. TEMPERATURA:
MICRORGANISMOS SÃO CLASSIFICADOS EM 3 GRUPOS:
- PSICRÓFILOS: CRESCEM EM BAIXAS TEMPERATURAS (-10 A 15 °C)
- MESÓFILOS: CRESCEM EM TEMPERATURAS MODERADAS (10 A 50 °C)
- TERMÓFILOS: CRESCEM EM ALTAS TEMPERATURAS (40 A 70 °C)
TERMÓFILOS EXTREMOS (68 A 110 °C)
Figura 2
Termófilos extremos
Figura 2. Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos
Área de Alimentos
Psicrófilos:
temperatura ótima: 15 °C
encontrados em oceanos e regiões da Ártica
não causam problemas na preservação de alimentos
Psicrotróficos:
temperatura ótima: 20 a 30 °C
crescem em temperatura de refrigeradores (4 °C)
encontrados em alimentos estragados
Mesófilos:
temperatura ótima: 25 a 40 °C (mais encontrados)
corpo de animais (temperatura da pele)
bactérias patogênicas: temp. ótima 37 °C
degradam alimentos e são patogênicos
Termófilos:
temperatura ótima: 50 a 60 °C
ambiente de águas termais (***não crescem em temp.
< 45 °C)
material estocado (altas temp.)= compostagem
FATORES FÍSICOS
2. PH:
-
REFERE-SE A ACIDEZ OU A ALCALINIDADE DE UMA SOLUÇÃO;
- MAIORIA DOS MICRORGANISMOS CRESCE MELHOR PERTO DA NEUTRALIDADE
(PH 6,5 – 7,5);
- POUCAS BACTÉRIAS SÃO CAPAZES DE CRESCER EM PH ÁCIDO (COMO PH 4,0)
BACTÉRIAS: FAIXA ENTRE PH 7,0
EXCEÇÕES:
- BACTÉRIAS
ACIDÓFILAS: ALTO GRAU DE TOLERÂNCIA À ACIDEZ
(THIOBACILLUS DE 0,5
6,0 COM ÓTIMO ENTRE 2 E 3,5)
- BACTÉRIAS ALCALIFÍLICAS: (BACILLUS E ARCHAEA) (PH 10 – 11).
A
FUNGOS - TENDEM A SER MAIS ACIDÓFILOS QUE AS BACTÉRIAS (PH <5).
Figura 3
Figura 3. Distribuição de alguns microrganismos de acordo com o pH
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
FATORES FÍSICOS
3. PRESSÃO OSMÓTICA:
OS MICRORGANISMOS RETIRAM DA ÁGUA A MAIORIA DOS NUTRIENTES SOLÚVEIS
(CONTEÚDO CELULAR 80 – 90 % DE ÁGUA)
PRESSÃO OSMÓTICA: RETIRA A H2O DENTRO DA CÉLULA
REAÇÃO HIPERTÔNICA:
ATRAVÉS DA MEMBRANA
H2O DO MEIO INTRACELULAR PARA O EXTRACELULAR,
PLASMÁTICA (MEIO COM CONCENTRAÇÃO DE SAIS).
PERDA DE
PLASMÓLISE: DIMINUIÇÃO DA MEMBRANA PLASMÁTICA DA CÉLULA DEVIDO A PERDA DE
H2O POR OSMOSE.
Figura 4
Não Halófilos: não necessitam de sal e
não toleram a presença no meio.
Halotolerantes: não necessitam de sal
mas toleram a presença no meio.
Halófilos: necessitam de sal em uma
concentração moderada
Halófilos extremos: necessitam de sal
em altas concentrações.
Figura 4. Taxa de crescimento de alguns microrganimos vs. a concentração de sal.
Área de Alimentos
-adição de sais: plasmólise
preservação de alimentos (peixe salgado, mel e leite)
Alta concentração de sal ou açúcar
Halofílicos Extremos (ou obrigatórios):
necessitam de altas concentrações
de sais para o crescimento
Halofílicos Facultativos: mais abundantes
não exigem altas concentrações de sais
-Adição de ágar:
normalmente 1,5% para solidificar o meio
> concentração = inibição de alguns microrganismo
> concentração de sal = pressão osmótica
FATORES QUÍMICOS
1. ÁGUA:
- ESSENCIAL PARA OS MICRORGANISMOS
- DISPONIBILIDADE VARIÁVEL NO AMBIENTE
AMBIENTE COM < CONCENTRAÇÃO DE ÁGUA:
DESENVOLVEM MECANISMOS PARA OBTER ÁGUA ATRAVÉS DO AUMENTO DA
CONCENTRAÇÃO DE SOLUTOS INTERNOS SEJA PELO BOMBEAMENTO DE ÍONS
PARA O INTERIOR CELULAR OU PELA SÍNTESE DE SOLUTOS ORGÂNICOS
(AÇÚCARES, ÁLCOOIS OU AMINOÁCIDOS).
FATORES QUÍMICOS
2. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E
FÓSFORO:
A)
CARBONO:
ESSENCIAL PARA A SÍNTESE DE TODOS OS COMPOSTOS ORGÂNICOS
NECESSÁRIOS PARA A VIABILIDADE CELULAR (ELEMENTO ESTRUTURAL BÁSICO
PARA OS SERES VIVOS)
ORGANISMOS QUIMIO-HETEROTRÓFICOS: OBTÉM C A PARTIR DE MATERIAIS
ORGÂNICOS COMO PROTEÍNAS, CARBOIDRATOS E LIPÍDEOS.
ORGANISMOS QUIMIO-AUTOTRÓFICOS
ORGANISMOS FOTOAUTOTRÓFICOS
C a partir de CO2
B)
NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:
- N, S: SÍNTESE DE PROTEÍNAS
- N, P: SÍNTESE DE DNA E RNA, ATP
PESO SECO DE UMA CÉLULA BACTERIANA: 14 % N, 4 % S, P
NITROGÊNIO
- UTILIZADO PARA SINTETIZAR OS GRUPOS AMINOS PRESENTES NOS
AMINOÁCIDOS.
Obtenção de N:
- Decomposição de materiais orgânicos (proteínas, aminoácidos)
- Amônia (NH4 +)
- Nitrato (NO3-)
Bactérias Fixadoras de Nitrogênio
Fixação de N: algumas bactérias são capazes de utilizar N gasoso
diretamente da atmosfera.
Microrganismos do solo (ex. bactérias dos gêneros Rhizobium e
Bradyrhizobium) utilizam este processo para obtenção de N, tanto
para elas como para as plantas que convivem simbioticamente
(algumas leguminosas – soja, feijão).
Cultivo de leguminosas: > fertilidade do solo sem a necessidade de
implementação de fertilizantes químicos
ENXOFRE
- UTILIZADO NA SÍNTESE DE AMINOÁCIDOS CONTENDO S E DE VITAMINAS
(TIAMINA E BIOTINA).
Fontes naturais de S:
íon sulfato (SO4-2), sulfito de hidrogênio, aminoácidos
FÓSFORO
- ESSENCIAL PARA A SÍNTESE DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS E PARA OS
FOSFOLIPÍDEOS COMPONENTES DA MEMBRANA CELULAR.
Fontes naturais de P:
íon fosfato (PO4-3), DNA, RNA, ATP
C)
POTÁSSIO, MAGNÉSIO E CÁLCIO:
- TAMBÉM SÃO ELEMENTOS ESSENCIAIS PARA OS MICRORGANISMOS
- FREQÜENTEMENTE ENCONTRADOS COMO CO-FATORES PARA AS REAÇÕES
ENZIMÁTICAS.
D)
ELEMENTOS TRAÇOS:
- FERRO, COBRE, MOLIBDÊNIO, ZINCO
- UTILIZADOS COMO CO-FATORES ESSENCIAIS PARA ATIVIDADE DE ALGUMAS
ENZIMAS
UTILIZAR ÁGUA DESTILADA PARA MEIO DE CULTURA – CONTÉM TODOS OS ELEMENTOS
TRAÇOS
FATORES QUÍMICOS
3. OXIGÊNIO:
- EXTREMAMENTE IMPORTANTE NO DESENVOLVIMENTO MICROBIANO
- ORGANISMOS CLASSIFICADOS EM:
1. AERÓBIOS
- Estritos (obrigados): necessitam de O2
-
Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2
-
Microaerófilo: necessitam de O2 mas em níveis menores
2. ANAERÓBIOS
- Aerotolerantes: não necessitam de O2 mas crescem melhor sem O2
-
Estritos (obrigados): não toleram O2 (letal)
Figura 5
AERÓBIO
ESTRITOS
ANAERÓBIO
AERÓBIO
ANAERÓBIO
MICRO
ESTRITO FACULTATIVO AERÓFILO AEROTOLERANTES
alta [O2]
catalase
SOD
sem O2
ausência:
catalase
SOD
Catalase e a
superóxido
dismutase
reduzem
para H2O os
compostos
tóxicos.
alta e baixa
[O2]
catalase
SOD
baixa [O2]
alta e baixa
[O2]
SOD
Figura 5. Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.
MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTURA: MATERIAL NUTRIENTE PREPARADO NO LABORATÓRIO
PARA O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS.
CULTURA:
CULTURA.
MICRORGANISMOS QUE CRESCEM E SE MULTIPLICAM NO MEIO DE
MEIO DEFINIDO: TODA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA É CONHECIDA
MEIO COMPLEXO: COMPOSIÇÃO QUÍMICA NÃO CONHECIDA
(COMPOSTO POR NUTRIENTES COMO EXTRATO DE LEVEDURA, DE CARNE OU
PLANTAS)
DE
MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTIVO SELETIVO E DIFERENCIAL:
- MEIO SELETIVO: FAVORECE O CRESCIMENTO DE UMA DETERMINADA BACTÉRIA DE
INTERESSE, IMPEDINDO O CRESCIMENTO DE OUTRAS BACTÉRIAS.
Agar MacConkey: bactérias gram-negativas fermentadoras e não fermentadoras de
lactose, respectivamente
- meio diferencial: facilita a identificação de um determinado
organismo.
Ex: Ágar Manitol Salgado, utilizado para a identificação de
Staphylococcus aureus (colônias amarelo ouro).
Staphylococcus aureus em ágar Manitol Salgado
MEIO DE CULTURA
MEIO DE ENRIQUECIMENTO:
FAVORECE O DESENVOLVIMENTO DE UMA POPULAÇÃO BACTERIANA QUE ESTÁ EM
DESVANTAGEM ENTRE OUTRAS POPULAÇÕES.
MEIOS REDUTORES:
MEIOS COM REAGENTES, COMO O TIOGLICOLATO DE SÓDIO, QUE É CAPAZ DE SE
COMBINAR COM O OXIGÊNIO DISSOLVIDO ELIMINANDO ESTE ELEMENTO DO MEIO DE
CULTURA (ESPECÍFICO PARA MICRORGANISMOS ANAERÓBICOS).
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
- DIVISÃO BACTERIANA:
- FISSÃO BINÁRIA
- BROTAMENTO
- TEMPO DE GERAÇÃO:
- FASES DE CRESCIMENTO:
-
FASE LAG
FASE LOG
FASE ESTACIONÁRIA
FASE DE MORTE CELULAR
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
DIVISÃO BACTERIANA:
É CONSIDERADO O AUMENTO DO NÚMERO DE INDIVÍDUOS E NÃO DO
TAMANHO CELULAR.
1. BROTAMENTO: < Nº DE BACTÉRIAS (FORMA UM BROTO QUE QUANDO
ATINGE O TAMANHO DA CÉLULA PARENTAL SE SEPARA)
2. FISSÃO BINÁRIA:
(1) ALONGAMENTO DA CÉLULA E A REPLICAÇÃO DO DNA CROMOSSOMAL;
(2) INÍCIO DA INVAGINAÇÃO DA PAREDE CELULAR E DA MEMBRANA
PLASMÁTICA;
(3) EM UM DETERMINADO MOMENTO, AS DUAS SEÇÕES DA PAREDE CELULAR
DE ENCONTRAM;
(4) PRODUÇÃO DE DUAS CÉLULAS INDIVIDUAIS IDÊNTICAS À CÉLULA MÃE.
Figura 6
Fissão Binária
Figura 6. Fissão binária bacteriana.
(Adaptado de Tortora, G.J., et al., Microbiology,2003)
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
TEMPO DE GERAÇÃO:
É O TEMPO NECESSÁRIO PARA UMA CÉLULA SE DIVIDIR (E SUA POPULAÇÃO
DOBRAR DE TAMANHO).
- TEMPO VARIA DE ACORDO COM O ORGANISMO;
- DEPENDE DAS CONDIÇÕES AMBIENTAIS (NUTRICIONAIS, TEMPERATURA, ETC);
- MAIORIA DAS BACTÉRIAS: 1 – 3 H
FASES DE CRESCIMENTO
CURVA DE CRESCIMENTO:
DEMONSTRA O CRESCIMENTO DAS CÉLULAS DURANTE UM PERÍODO DE TEMPO.
CURVA DE CRESCIMENTO OBTIDA PELA CONTAGEM DA POPULAÇÃO EM
INTERVALOS DE TEMPO APÓS UM INÓCULO DE UM NÚMERO PEQUENO DE
BACTÉRIAS EM MEIO DE CULTURA.
FASE lag: pouca ou ausência de divisão celular (fase de adaptação) - ≥ 1 hora
(estado de latência, com intensa atividade metabólica)
FASE log: início do processo de divisão (período de crescimento ou aumento
logarítmo)
(reprodução celular extremamente ativa, sensíveis as mudanças
ambientais - * EFEITO DE ANTIBIÓTICOS)
FASE ESTACIONÁRIA: velocidade de crescimento diminui
nº de células vivas = nº de células mortas
FASE DE MORTE CELULAR: nº de células mortas excede o de células novas.
Figura 7
Figura 7. Curva de crescimento bacteriano mostrando as 4 fases típicas.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
-
CONTAGEM EM PLACAS
FILTRAÇÃO
MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL
CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
- TURBIDIMETRIA
- ATIVIDADE METABÓLICA
- PESO SECO
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(1) CONTAGEM EM PLACAS
- TÉCNICA MAIS UTILIZADA NA DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DA POPULAÇÃO
BACTERIANA;
VANTAGEM: QUALIFICAÇÃO DE CÉLULAS VIÁVEIS
DESVANTAGEM: TEMPO (24 H PARA O APARECIMENTO DAS COLÔNIAS)
Figura 8
Cálculo:
nº de colônias na
placa x índice de
diluição da amostra =
nº de bactérias/mL
-DILUIÇÃO SERIADA
-MÉTODO
ESPALHAMENTO
PLACA
DE
EM
Figura 8. Contagem em placas e diluição seriada
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(2) FILTRAÇÃO
- < Nº DE BACTÉRIAS = PODE SER UTILIZADO O MÉTODO DE FILTRAÇÃO PARA
A SUA CONTAGEM.
-
CONCENTRAÇÃO DE BACTÉRIAS SOBRE A SUPERFÍCIE DE UMA MEMBRANA DE
FILTRO DE POROS MUITO PEQUENOS APÓS A PASSAGEM DE UM VOLUME DE
100 ML DE ÁGUA.
- FILTRO POSTERIORMENTE TRANSFERIDO PARA UMA PLACA DE PETRI
CONTENDO MEIO SÓLIDO.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
- UTILIZADO PARA MICRORGANISMOS QUE NÃO CRESCEM BEM EM MEIO SÓLIDO.
A) DILUIÇÃO A PARTIR DE UM ALTO VOLUME DE INÓCULO (EX. 10 ML)
B) DILUIÇÃO A PARTIR DE UM MÉDIO VOLUME DE INÓCULO (EX. 1 ML)
C) DILUIÇÃO A PARTIR DE UM BAIXO VOLUME DE INÓCULO (EX. 0,1 ML)
D) CONTAGEM DO Nº DE TUBOS POSITIVOS
E) ESTIMATIVA DO Nº DE CÉLULAS/ML DE BACTÉRIAS
Figura 9
10 mL de inóculo
6 tubos positivos
(com crescimento
bacteriano)
3 tubos positivos
1 mL de inóculo
0,1 mL de inóculo
1 tubos positivos
Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
Tabela de combinações (NMP)
6
6-3-1
3
Índice de NMP/100 mL = 110
Inferior = 40
Superior = 300
1
Confiabilidade de 95%
Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
- UM VOLUME CONHECIDO DE SUSPENSÃO BACTERIANA É COLOCADO EM UMA
ÁREA DEFINIDA DA LÂMINA DE MICROSCÓPIO.
- A AMOSTRA PODE SER CORADA OU ANALISADA A FRESCO.
- UTILIZAM CÂMARAS DE CONTAGEM
DESVANTAGENS:
- NÃO SEPARA CÉLULAS MORTAS E VIVAS
- PODE HAVER ERROS DE CONTAGEM
- DIFÍCIL CONTAGEM PARA BACTÉRIAS MÓVEIS
Figura 10
Figura 10. Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
(1) TURBIDIMETRIA
- MONITORAMENTO DO CRESCIMENTO BACTERIANO ATRAVÉS DA TURBIDEZ
- ESPECTROFOTÔMETRO (660 NM)
(2) ATIVIDADE METABÓLICA
- QUANTIDADE DE UM CERTO PRODUTO (COMO ÁCIDO OU CO2) É
DIRETAMENTE PROPORCIONAL AO NÚMERO DE CÉLULAS BACTERIANAS.
Figura 11
A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº.
de bactérias.
Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida
Figura 11. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
(3) PESO SECO
-
PRINCIPALMENTE PARA FUNGOS FILAMENTOSOS
A) FUNGO É REMOVIDO DO MEIO POR FILTRAÇÃO
B) SECO EM DESSECADOR
C) POSTERIOR PESAGEM.