Extracção de lípidos e determinação de colesterol
NOTA: o procedimento para as sementes neste caso noz (A) e para a gema de ovo (B)
tem algumas diferenças, mas a maioria dos passos pode ser executada em simultâneo.
Leia o protocolo e planeie a maneira de aproveitar os passos comuns de modo mais
eficiente. No final do protocolo tem tabelas para registar os resultados.
A. Extracção de lípidos de sementes oleaginosas (noz)
1. Pese cerca de 1g de sementes (de preferência já moídas), e registe o peso às
centésimas de grama (Tabela 1).
2. Transfira para um almofariz, adicione 5 mL de mistura clorofórmio:metanol 2:1
(v/v) e homogenize cuidadosamente.
3. Transfira o extracto para um tubo de vidro com esmerilado, lavando o conteúdo do
almofariz com mais 5 mL de mistura clorofórmio:metanol 2:1 (v/v).
4. Coloque o tubo (tapado) num banho termostatizado a 50ºC durante 10 min. Arrefeça
em água fria.
5. Filtre o extracto anterior para um tubo graduado previamente pesado (o peso do
tubo vazio deve ser registado na Tabela 1).
6. Adicione ao tubo um volume de solução de CaCl2 0,02% (p/v) correspondente a 0,2
vezes o volume de filtrado. Homogenize brevemente, sem exagerar, espere até se
distinguirem duas fases e retire a fase superior com uma pipeta de Pasteur,
eliminando-a.
7.
Adicione
o
mesmo
volume
medido
no
ponto
6
de
uma
solução
clorofórmio:metanol:água (2:50:50, v/v/v). Misture, deixe no gelo até separação das
duas fases e aspire a fase aquosa com uma pipeta de Pasteur, eliminando-a.
8. Meça o volume total da fase orgânica e registe.
9. Retire 1 mL para um tubo de ensaio normal para determinação do teor de colesterol
(parte C do protocolo).
10. Coloque o tubo graduado na hotte e deixe evaporar o solvente até à secura
(provavelmente, só estará evaporado no dia seguinte).
11. Pese o extracto seco, registe na Tabela 1 e, a partir do valor obtido, determine a
quantidade de "lípidos totais" por grama de tecido fresco. Identifique e guarde o
extracto lipídico para a próxima aula prática.
B. Extracção de lípidos de gema de ovo
1. Tal como anteriormente, pese cerca de 1g de gema de ovo, directamente para um tubo
de vidro com esmerilado, não se esquecendo de registar o peso certo da gema (Tabela
1).
2. Adicione 10 mL de mistura clorofórmio:metanol 2:1 e homogenize bem no vórtex.
3. Filtre o extracto anterior para um tubo graduado, previamente pesado (registe o peso
na Tabela 1).
4. Adicione ao tubo um volume de solução de CaCl2 0,02% (p/v) correspondente a 0,2
vezes o volume de filtrado. Homogenize brevemente, sem exagerar, espere até se
distinguirem duas fases e retire a fase superior com uma pipeta de Pasteur,
eliminando-a.
5. Adicione o mesmo medido em 4 (o volume do filtrado) de uma solução
clorofórmio:metanol:água (2:50:50, v/v/v). Misture brevemente, deixe no gelo até
separação das duas fases e aspire a fase aquosa com uma pipeta de Pasteur,
eliminando-a.
6. Meça o volume total da fase orgânica. Retire 1 mL para um tubo de ensaio, para
determinação do teor de colesterol (parte C do protocolo).
7. Coloque o tubo graduado na hotte e deixe evaporar o solvente até à secura (tal como
no caso anterior, provavelmente só estará evaporado no dia seguinte).
8. Pese o extracto seco, registe nsa Tabela 1 e determine a quantidade de "lípidos totais"
por grama de tecido fresco. Identifique e guarde o extracto lipídico para a próxima aula
prática.
C. Quantificação do colesterol total
1. Ños pontos anteriores, colocou em tubos de ensaio 1 mL de cada extracto lípidico.
2. Coloque em tubos de ensaio diferentes 1 mL de uma solução referência (solução de
colesterol 10 mM) e de clorofórmio para o controlo negativo.
2. Adicione a cada tubo 5 mL de reagente de Liebermann-Buchard na hotte.
CUIDADO, O REAGENTE É CORROSIVO!!!
3. Tape os tubos e coloque-os em banho-maria a 35ºC durante 10 min.
4. Observe a cor dos tubos ao fim desse tempo e quantifique o teor de colesterol numa
escala de 1 (não tem colesterol) a 5 (tem colesterol numa concentração de1,7 mM);
registe as suas observações na Tabela 2.
Bibliografia:
Barreto, M.C. "Lipid Extraction and Cholesterol Quantification: A Simple Protocol." J.
Chem. Educ. 2005, 82, 103-104.
Cholesterol
Analysis:
http://employees.oneonta.edu/helsertl/CholesterolLab.html
(consultado em 15/1/2009).
Extracção e quantificação do colesterol: A. P. Kenny, The determination of cholesterol
by
the
Liebermann-Burchard
reaction,
Biochem
J.
1952
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1198067
52(4):
611–619.
(consultado
em
15/1/2009).
Tabela 1. Extracção de lípidos e quantificação de lípidos totais.
Tecido
Peso do tecido
volume de
(g)
extracto lipídico
Peso do tubo Peso do tubo
graduado
com "lípidos
vazio (g)
totais" (g)
"Lípidos
totais" (g)
semente (noz)
gema de ovo
Tabela 2. Resultados do teste de Liebermann-Buchard.
Tubo
A (noz)
B (gema de ovo)
C (colesterol)
D (controlo)
Cor / intensidade
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