IB/RC – UNESP
UFSCar – Araras
II CURSO DE MONITORAMENTO DA FERMENTAÇÃO ETANÓLICA
PERÍODO: 11 a 15 DE FEVEREIRO DE 2008
ATIVIDADES PRÁTICAS
4° Aula Prática – Microscopia, Coloração de Gram, Teste de CIM,
Exame das Placas com as Bactérias e Meio de Cultivo para Leveduras
1 – OBJETIVO:
1.1 Verificar as placas com as culturas de bactérias, bem como, a
natureza de uma colônia (cocos, bastonetes), se gram (+) ou gram (-) e sua
pureza mediante análise microscópica.
1.2 Proceder à verificação de sua sensibilidade frente a um biocida para
estabelecer o nível de aplicação na indústria.
1.3 Elaborar um micro cultivo de levedura.
2 – MATERIAL:
•
Tecido para limpeza tipo perfex;
•
Placas com as culturas de bactérias;
•
Haste de inoculação;
•
Fósforo;
•
Lâmina, lamínula, microscópio;
•
Óleo de imersão;
•
Conta gotas para água destilada;
•
Corantes cristal violeta, lugol, safranina e etanol;
•
Bandeja com suporte para a coloração de gram;
•
Pinça;
•
Papel absorvente;
1
•
Solução de biocida/ antibiótico;
•
Caneta de retroprojetor;
•
Tubas com meio de cultura para o teste de CIM;
•
4 pipetas esterilizadas;
•
Espátula;
•
Tubo com a cultura ativada;
•
Bico de Bunsen;
•
Placa com lâmina, lamínula, algodão molhado;
•
Meio de “corn meal” (meio de fubá) para o microcultivo.
3 – PROCEDIMENTO:
3.1 Coloração de Gram
a) Colocar 1 gota da cultura ativada sobre uma lâmina com auxílio da haste
de inoculação. Espalhar e esperar secar.
b) Fixar as bactérias passando a lâmina suavemente sobre a chama do
bico de bunsen (3 vezes)
c) Esperar esfriar, colocar a lâmina sobre a cuba de coloração e cobri-la
pingando corante cristal violeta. Deixar 1 minuto.
d) Esgotar a lâmina e cobri-la com lugol. Deixar 1 minuto.
e) Lavar a lâmina com álcool ou álcool/acetona até desaparecer o corante
azul.
f) Cobrir a lâmina com safranina. Deixar 30 seguntos.
g) Lavar a lâmina com água, deixar secar e examinar com óleo de imersão.
3.2 Preparo do Micro cultivo de levedura
Colocar assepticamente com o auxílio de uma espátula sobre a
lâmina que está na placa de Petri – dois quadradinhos de meio “corn meal”.
A seguir, com a alça de inoculação transferir uma porção da
cultura a ser inclinada sobre o meio “corn meal”.
Com o auxílio da pinça colocar a lamínula sobre o inóculo do
bloco de meio.
Inocular a 28 ºC e examinar ao microscópio após 24 – 48 horas.
2
3.3 Preparar o Teste de Concentração Inibitória Mínima (MIC)
Concentração
inibitória
mínima
refere-se
à
menor
dose
necessária de um agente químico (ou condições físicas) para inibir o
crescimento de um microrganismo.
O meio pode ser: meio sólido ou líquido.
3.3.1 Meio Sólido
Coloca-se volumes de 10 a 12 mL de meio nos tubos de cultura,
estes são tamponados, esterilizados e mantidos em banho-maria a 49±2 ºC. A
estes tubos adiciona-se quantidades crescentes de biocida ou de antibiótico,
nas concentrações recomendadas.
Acrescenta-se também de 0,1 a 0,2 mL da cultura a ser analisada.
Antes de sua solidificação o conteúdo é colocado na placa e imediatamente
homogeneizado.
Procede-se desta forma com várias concentrações de produto.
Após a encubação para bactérias 24h a 30 – 36 ºC verifica-se qual foi a menor
concentração que permitiu o crescimento do microrganismo.
Esta será a CIM ou “minimal inhibitory concentration”(MIC)
comparando com as placas de controles (uma não inoculada com
microrganismos e outra sem biocida com microrganismo).
Observação: o meio de cultura a ser empregado no teste é aquele
que o microrganismo apresenta bom crescimento.
3.3.2 Meio Líquido
Preparo de tubos com meio líquido para as usinas em ensaios na
área de fermentação, o meio CSN líquido (sem antibióticos e sem actidiona)
representa uma opção bem econômica.
Preparar um protocolo experimentos, seguindo o exemplo:
3
Nº tubos
0
1
2
3
4
5
6
7
Vol. meio mL
9
9
9
9
9
9
9
9
0,2
-
-
-
0,2
0,2
0,2
0,2
-
-
0,1
0,5
0,1
0,2
0,4
0,8
0,8
2
0,9
0,5
0,7
0,6
0,4
0
0
0
1
1,5
1
2
4
8
mL
suspensaçao
mL solução
biocida
mL salina
esterilizada
PPM produto
A verificação dos resultados é baseada nas leituras de turvação do meio.
Pode-se empregar o meio de cultura com verde de bromocresol que é um bom
indicador visual do crescimento.
Observação: o meio pode ser ajustado em pH igual 6,8 ou 5,5 ou ainda,
sem o indicador.
Para avaliar adequadamente a cultura pode-se usar a escala de
turvação de Mac Farland ou as linhas de Wickerhan (cartão com três linhas:
uma fraca, uma média e uma forte). Coloca-se o tubo na frente e faz-se a
comparação.
A intensidade da turvação indicará o crescimento do microrganismo.
(CIM será avaliada onde não ocorrer crescimento).
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