Soros de Aglutinação
de Haemophilus
PT
influenzae
1.
Utilização Prevista
Os Soros de Aglutinação de Haemophilus influenzae foram
concebidos para serem utilizados no teste qualitativo de
aglutinação em lâmina e na contra-imunoelectroforese (CIE)
para identificar serologicamente o antigénio tipo das estirpes
patogénicas de H. influenzae (tipos a a f), para fins epidemiológicos
e de diagnóstico.
2.
Resumo e Explicação do Teste
As estirpes patogénicas possuem cápsulas e foram classificadas
serologicamente em seis tipos, de acordo com a estrutura
química do antigénio capsular 1. As estirpes que possuem
estes antigénios são aglutinadas especificamente pelo antisoro homólogo. Como tal, uma cultura capsulada poderá ser
diferenciada quanto ao tipo através dos testes de aglutinação
em lâmina. Um método alternativo para a diferenciação do
tipo, a contra-imunoelectroforese (CIE), baseia-se no facto de
que, sob condições apropriadas, os anticorpos deslocam-se em
direcção ao cátodo sob influência de uma corrente eléctrica, ao
passo que os antigénios deslocam-se em direcção ao ânodo. As
suspensões de bactérias de uma cultura sólida ou líquida e os
anti-soros são colocados em pequenos poços numa camada e
ágar de forma a que, quando uma corrente eléctrica atravessa
o ágar, os antigénios e os anticorpos deslocam-se em direcção
um ao outro, formando um precipitado visível num espaço de
tempo relativamente curto2. Em determinadas circunstâncias,
por exemplo, nos casos de meningite bacteriana, é importante
obter uma identificação presumível do agente infeccioso, com
um mínimo de demora, de forma a que seja possível iniciar uma
terapia anti-microbiana adequada. O antigénio livre pode muitas
vezes ser identificado nas amostras de fluido espinal, utilizandose o método de contra-imunoelectroforese (CIE) sensível3,4. Este
método tem particular importância nos casos onde o conteúdo
bacteriano do fluido espinal seja demasiado baixo para permitir
um isolamento ou onde a viabilidade dos organismos tenha sido
afectada devido a um tratamento antibiótico prévio.
3.
Princípio do Procedimento
Os testes serológicos baseiam-se no facto de que os anticorpos
presentes no soro, produzidos em consequência da exposição
a antigénios bacterianos, aglutinarão com bactérias que
transportam antigénios homólogos.
4.
4.1.
Reagentes
conteúdo do kit
5.1.3
Soros de Aglutinação de Haemophilus Influenzae
Tipo a
(ZM20/R30166001)
1 frasco conta-gotas
Tipo b
(ZM21/R30166101)
1 frasco conta-gotas
Tipo c
(ZM22/R30166201)
1 frasco conta-gotas
Tipo d
(ZM23/R30166301)
1 frasco conta-gotas
Tipo e
(ZM24/R30166401)
1 frasco conta-gotas
Tipo f
(ZM25/R30166501)
1 frasco conta-gotas
4.2.
2 ml
5.1.4
5.1.5
Descrição, Preparação para Utilização e
Condições de Armazenamento Recomendadas
Consultar igualmente a secção Avisos e Precauções
5.1.6
Os soros devem ser armazenados a uma temperatura entre 2
e 8°C para que conservem a sua eficácia pelo menos até à data
indicadano rótulo do frasco.
Soros de Aglutinação de H.
influenzae
Produzido em coelhos e conservado
com fenol a 0,5%. Cada frasco,
equipado com tetina e conta-gotas,
contém 2 ml de líquido e é fornecido
pronto para utilização.
Durante o período de armazenamento,
alguns soros poderão tornar-se
ligeiramente turvos. Isto não indica
necessariamente deterioração e,
normalmente, não interfere nos
resultados. Contudo, os soros poderão
ser submetidos a centrifugação ou
filtragem por membrana (0,45 µm)
antes de serem utilizados, para
ficarem transparentes. Uma grande
turvação indica contaminação e esses
soros deverão ser descartados.
5.
Avisos e Precauções
Apenas para diagnóstico in vitro.
Para uso profissional apenas.
Atenção: este produto contém borracha natural seca.
Consultar as folhas sobre dados de segurança do fabricante
e o rótulo do produto para obter mais informações sobre
componentes potencialmente perigosos.
5.1. Informações sobre Saúde e Segurança
5.1.1
5.1.2
Manusear todas as bactérias em conformidade com os
regulamentos locais e legais adequados.
Os utensílios não descartáveis devem ser esterilizados
através de um procedimento adequado após a
utilização, embora o método preferido seja o autoclave
durante, pelo menos, 15 minutos a 121°C; os utensílios
descartáveis devem ser submetidos a autoclave ou
incinerados.
5.2.
O derrame de materiais potencialmente infecciosos
deve ser limpo imediatamente com papel absorvente
e as áreas contaminadas esfregadas com um
desinfectante antibacteriano normal ou álcool a
70%. Os materiais utilizados para limpar líquidos
derramados, incluindo luvas, devem ser descartados
como sendo potencialmente infecciosos.
Não pipetar com a boca. Utilizar luvas descartáveis e
protecção para a vista durante o manuseamento das
amostras e durante o ensaio. Lavar bem as mãos depois
de terminar o procedimento.
Estes reagentes contêm fenol. Embora a sua
concentração seja reduzida, o fenol é tóxico por
ingestão e em contacto com a pele. Evitar a ingestão
dos reagentes. Se qualquer destes reagentes entrar em
contacto com a pele ou os olhos, lavar imediatamente
toda a área com grandes quantidades de água.
De acordo com os princípios das Boas Práticas
Laboratoriais, recomenda-se vivamente que as
amostras e os reagentes sejam tratados como material
potencialmente infeccioso e manuseados com as
devidas precauções.
Precauções Analíticas
5.2.1
Não utilizar os anti-soros depois de findo o prazo de
validade. A contaminação microbiológica dos antisoros deve ser evitada, uma vez que poderá conduzir
a resultados erróneos e reduzir o tempo de vida do
produto.
5.2.2
Não alterar o procedimento de teste, o tempo de
incubação nem as temperaturas. Não diluir os soros de
aglutinação.
5.2.3
Após a utilização, voltar a colocar os soros à temperatura
de armazenamento recomendada.
5.2.4
Não utilizar uma ansa microbiológica para dispensar o
anti-soro. Utilizar o conta-gotas fornecido.
6.
Recolha, Transporte e Armazenamento das
Amostras
A diferenciação de tipos serológicos apenas fornece resultados
confiáveis se a cultura possuir cápsulas. Recomenda-se que a
diferenciação do tipo de estirpe seja realizada o mais rapidamente
possível após o isolamento, uma vez que a capacidade de
produção de cápsulas vai diminuindo com o tempo. As estirpes
capsuladas podem ser reconhecidas através da iridescência
característica que é observada quando uma luz branca intensa
é transmitida obliquamente através de uma cultura que esteja a
crescer em ágar de Levinthal1.
Para obter detalhes sobre a recolha e a preparação de amostras,
dever-se-á consultar um manual padrão. Recomenda-se a
utilização de culturas frescas no ágar de Levinthal.
7.
Procedimento
Materiais Fornecidos
Consultar a secção Conteúdo do Kit.
Materiais Necessários mas Não Fornecidos
1. Solução salina a 0,85%.
2.Lâminas de vidro.
3. Ansa microbiológica e bico de Bunsen.
4. Fonte de luz sobre fundo escuro.
5.Temporizador.
6. Pipeta de Pasteur.
7.Tampão de Barbitona-HCl, pH 8,6
Dissolver 8,25 g de dietilbarbiturato de sódio em 1 litro de
água destilada e adicionar 38,2 ml de ácido hidroclorídrico
0.2N para obter um pH de 8,6.
CUIDADO: a Barbitona-HCl é nociva por ingestão. Lavar bem
as mãos depois de manusear os produtos.
8. Agarose a 1%
Adicionar 1 g de agarose a 100 ml de tampão de barbitonaHCl dissolver aquecendo num banho de água em ebulição
durante cinco a dez minutos. Misturar suavemente, evitando
a formação de bolhas de ar e assegurar que toda a agarose é
dissolvida e distribuída de forma homogénea. Os frascos de
gel podem ser armazenados à temperatura ambiente (18 a
30°C) durante um período até quatro semanas.
9.Lâminas revestidas com agarose
Derreter um frasco de agarose a 1% num banho de água em
ebulição e colocar em lâminas de vidro limpas, em cima de
uma superfície plana e nivelada. A camada de gel deverá ter
uma espessura entre 1 e 1,5 mm; para uma lâmina de 26 x
76 mm, 3 ml de agarose são suficientes e para uma lâmina
de lanterna de 81 x 81 mm são necessários 10 ml de agarose.
As lâminas sobressalentes, uma vez endurecidas, poderão
ser armazenadas durante 24 horas numa caixa humedecida,
a uma temperatura entre 2 e 8°C.
10.Aparelho electroforético adequado para electroforese com
gel de ágar. Existem inúmeros fornecedores de equipamento
apropriado.
11.Impulsor de gel (tubo com extremidade fina, com 3 mm de
diâmetro) e aparelho de sucção.
8.
8.1.
Procedimento de Teste
Teste de Aglutinação em Lâmina
Etapa 1
Colocar duas gotas separadas (40 µl cada)
de solução salina numa lâmina de vidro.
Emulsionar partes da cultura a ser testada
com uma ansa em cada gota de solução
salina para obter uma suspensão suave e
razoavelmente densa.
Etapa 2
Para uma suspensão como controlo
adicionar uma gota (40 µl) de solução
salina e misturar. Para a outra suspensão,
colocar uma gota (40 µl) de anti-soro não
diluído e misturar.
Etapa 3
Agitar a lâmina durante um minuto e
procurar aglutinação. Esta poderá ser
mais facilmente observada contra um
fundo escuro utilizando luz indirecta.
Para uma desinfecção e eliminação em
segurança, descartar a lâmina utilizada.
8.2.
contra-imunoelectroforese
Etapa 1
Encher o tanque electroforético com tampão
de barbitona-HCl até ao nível desejado.
Etapa 2
Fazer poços na agarose e remover o núcleo
de cada poço aspirando cuidadosamente com
uma pipeta de Pasteur ligada ao aparelho de
sucção. Evitar danificar as paredes dos poços.
Uma unidade de teste simples é composta por
dois poços com 3 mm de diâmetro, colocados
a uma distância de 5 mm entre si, ao longo do
eixo electroforético. Muitas destas unidades
podem ser cortadas em cada lâmina: uma
lâmina de 81 x 81 mm pode acomodar 18
pares de poços. (Consultar a Figura 1, que
pode ser utilizada como modelo.)
9.
reSUltAdoS
Aglutinação em Lâmina
A aglutinação deverá ser forte e nitidamente visível no prazo de
um minuto. não deverá existir aglutinação visível na suspensão de
controlo e, caso seja visível, tal significa que a suspensão não é
adequada para ser testada através deste método.
contra-imunoelectroforese
num resultado positivo, poder-se-á ver uma linha branca de
precipitação entre um par de poços, perpendicularmente ao
eixo da electroforese (Figura 2). numa reacção negativa, não se
observará precipitação entre os poços.
Figura 2
Figura 1
complementar e não substituir as técnicas convencionais.
Se a concentração do antigénio não for suficiente na amostra,
então será obtido um resultado negativo.
Os anti-soros facultam apenas identificação serológica; a
identificação completa de um organismo deve ser realizada
apenas em conjunto com testes bioquímicos.
13.
reSUltAdoS eSPerAdoS
Aglutinação ou precipitação visível na presença de culturas e
antigénios homólogos.
14.
cArActeríSticAS eSPecíFicAS de deSemPenHo
Os anti-soros ZM20/R30166001 a ZM25/R30166501 deverão
exibir uma aglutinação visível no teste de aglutinação em lâmina e
uma linha de precipitação no teste de contra-imunoelectroforese
(CIE)com os antigénios capsulares de H. influenzae tipos a, b, c,
d, e e f respectivamente.
15.
BiBliogrAFiA
1
2
3
10.
Etapa 3
Utilizando uma pipeta de Pasteur fina, colocar
uma quantidade de anti-soro suficiente no
poço anodal de cada par, preenchendo-os,
mas sem derramar.
Etapa 4
do mesmo modo, colocar a amostra de teste
no poço catodal de cada par.
Etapa 5
Em seguida, colocar a lâmina em posição no
tanque electroforético e fazer as ligações
entre as extremidades da lâmina e os
compartimentos do tampão com pavios de
papel de filtro macio embebidos em tampão.
Apenas 10 mm de agarose na extremidade
devem ficar cobertos pelos pavios. Suavizar
gentilmente de forma a eliminar as bolhas de
ar. Recolocar a tampa do tanque.
Etapa 6
Etapa 7
Verificar se a fonte de alimentação está ligada,
com a polaridade correcta (anti-soro nos
poços anodais). ligar a fonte de alimentação
e ajustar para uma corrente contínua com 2,5
mA/cm de largura com gel.
Após uma hora, desligar a alimentação e retirar
a lâmina do tanque. Visualizar utilizando um
iluminador de fundo escuro ou utilizando uma
fonte de luz oblíqua contra um fundo escuro. A
leitura é muitas vezes mais fácil se a lâmina for
imersa em solução salina, num prato de Petri,
durante a observação.
controlo de QUAlidAde
Aglutinação em Lâmina
de tempos a tempos, é aconselhável testar os anti-soros como
descrito, utilizando culturas reconhecidamente positivas e
negativas.
As culturas homólogas devem ser utilizadas para organismos de
controlo positivo. Para uma cultura de controlo negativo utilize a
Neisseria lactamica. Estirpes com os serotipos adequados podem
ser obtidas a partir de uma escolha de uma colecção de culturas
reconhecidas, tal como nCtC ou AtCC.
11.
interPretAção doS reSUltAdoS
Aglutinação em Lâmina
A aglutinação das estirpes de tipo “e” é normalmente mais fina
do que as outras.
As reacções de aglutinação em lâmina fracas ou que demoram
mais do que um minuto a aparecer não são significativas. Se se
observar uma aglutinação na suspensão de controlo, a cultura
não é adequada para teste.
contra-imunoelectroforese
Se a concentração de antigénio for baixa, a linha poderá aparecer
esbatida e, neste caso, poder-se-á utilizar uma lupa para facilitar
a avaliação. As reacções são razoavelmente estáveis e, embora
as lâminas devam ser inspeccionadas imediatamente após a
electroforese, os resultados deverão permanecer inalterados
durante várias horas. Se for necessário um registo permanente,
as lâminas poderão ser lavadas, coloridas e secas através da
utilização de métodos convencionais.
12.
limitAçõeS do Procedimento
Os Soros de Aglutinação de H. influenzae foram absorvidos
conforme necessário para torná-los específicos dentro da espécie
H. influenzae. no entanto, foram relatadas reacções cruzadas
em organismos de outras espécies1,5,6. É importante confirmar
a espécie dos organismos sujeitos ao teste através das técnicas
de morfologia, cultura e bioquímicas estabelecidas. Esta nota
de advertência aplica-se a todos os métodos de teste serológico
e realça o facto de que a contra-imunoelectroforese (CIE) deve
4
5
6
turk, d.c. and may, J.r. (1967). Haemophilus influenzae. london, English
Universities Press.
myhre, e.B. (1974). typing of Haemophilus influenzae by counterimmunoelectrophoresis. Acta path. microbiol. scan. B., 82, 164.
edwards, e.A., muehl, P.m. et al. (1972). diagnosis of bacterial meningitis
by counterimmunoelectrophoresis. J. Lab. Clin. Med., 60, 449.
myhre, e.B. (1974). Rapid diagnosis of bacterial meningitis. Scand. J.
infect. Dis., 6, 237.
Aaron, l., Handzel, z. et al. (1974). Monospecific serum for typing
Haemophilus influenzae type b produced by immunization with
Escherichia coli strain ‘Easter’. J. Biol. Stand., 2, 25.
Argaman, m., liu, t.Y. et al. (1974). Polyribitol-phosphate: an antigen
of four gram-positive bacteria cross-reactive with the capsular
polysaccharide of Haemophilus influenzae type b. J. immunol., 112, 649.
16.
emBAlAgem
ZM20/R30166001..........................................2 ml
ZM21/R30166101..........................................2 ml
ZM22/R30166201..........................................2 ml
ZM23/R30166301..........................................2 ml
ZM24/R30166401..........................................2 ml
ZM25/R30166501..........................................2 ml
legenda dos símbolos
número de Catálogo
dispositivo médico para diagnóstico in vitro
Consultar as instruções para utilização (IFU)
limites de temperatura (temperatura de
Armazenamento)
Código de lote (número de lote)
Utilizar antes de (Final do Prazo de Validade)
Fabricado por
IFU X7809A, Revisado em outubro 2013
Remel Europe ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT
Reino Unido
Para obter assistência técnica, entrar em contacto com o
distribuidor local.