MONITORAMENTO DO TRATAMENTO DE ÚLCERAS DE PERNA
ATRAVÉS DO SOFTWARE IMAGEJ®
L. A. Santana1, M. A. C. Frade2, J. K. Kajiwara3, J.M. Alves4
1
Universidade de São Paulo-USP/ Bioengenharia, São Carlos, Brasil,
fone: 16 39313249, e-mail: [email protected]
23
Universidade de São Paulo-USP/Dermatologia, Ribeirão Preto, Brasil,
fone: 16 3602244, e-mail: [email protected]
3
Universidade de São Paulo-USP/Biologia Celular e Molecular, Ribeirão Preto, Brasil,
fone: 16 36023220, e-mail: [email protected]
4
Universidade de São Paulo-USP / Engenharia Elétrica / Bioengenharia, São Carlos, Brasil,
fone: 16 33739344, e-mail: [email protected]
Abstract – This investigation shows a
technique of image processing for
monitoring the treatment of leg ulcers. The
objective was to show the use of commercial
digital camera and a public domain software
for the image analysis of leg ulcers during
the treatment with low intensity ultrasound
(LIUS) or 1% silver sulfadiazine cream. The
venous leg ulcer have slow healing,
representing a common illness with high
treated cost. The ulcers were divided in two
experimental groups. In the group 1 the
ulcers were treated with 1% silvers
sulfadiazine cream. In the group 2 the ulcers
were treated with LIUS. The image analysis
quantified the parameters ulcer superficial
area, the growing factors TGFβ and VEGF
and the iNOS enzyme. The ulcer images
were taken at the beginning of treatment and
every 15 days. The treatment time last 90
days. The images at the beginning of
treatment and at the 45° day were used for
carrying out the immunohistochemistry
analysis. The ulcers healing area decreased
faster when treated with LIUS. The synthesis
of growth factors and enzyme was also
higher in the ulcers treated with LIUS. The
image analysis should be included in health
public services for monitoring the treatment
of leg ulcers.
Introdução
A área de pesquisa que envolve o uso de
ferramentas computacionais para auxílio ou
acompanhamento do diagnóstico em lesões
dermatológicas ainda é visto como muito
recente. Um dos problemas encontrados para o
acompanhamento da evolução das úlceras de
pele é o da padronização das medidas da
extensão da lesão e do reparo tecidual. Outro
obstáculo encontrado, até recentemente, era o
custo dos programas analisadores de imagens,
hoje encontrados a baixo custo, ou até mesmo
gratuitos.
As úlceras de perna surgem geralmente
a partir de um pequeno trauma ou de uma
infecção secundária em regiões da perna onde a
pele está sob distúrbios nutricionais,
apresentando assim uma difícil cicatrização[1].
Esta investigação tem o objetivo de
mostrar a utilização de câmara digital comercial
e de programa de análise de imagem de
domínio público no monitoramento da evolução
de úlceras de perna pré e pós-tratamento com
ultra-som de baixa intensidade (US),
quantificando a área superficial da úlcera, seus
respectivos tecidos, além de quantificar os
fatores de crescimento TGFβ (transforming
growth factor) e VEGF (vascular endothelial
growth factor) e a enzima iNOS (induced nitric
oxide synthase) no estudo imunohistoquimico.
Metodologia
Amostra: Úlceras tróficas de perna de pacientes
foram divididas em dois grupos: a) Grupo 1
(n=7 úlceras) constituindo de pacientes que
tiveram suas úlceras tratadas com curativos
diários à base de creme sulfadiazina de prata
1% (SDZ) e cobertura com gazes e ataduras
cirúrgicas, realizados no domicílio; b) Grupo 2
(n=9 úlceras) constituindo de pacientes que
tiveram suas úlceras tratadas com ultra-som de
baixa intensidade em dias alternados (segundas,
quartas e sextas-feiras). O tempo diário de
tratamento dependeu da extensão da úlcera. O
tratamento foi feito na periferia da lesão ficando
o transdutor ultra-sônico estacionário.
O protocolo de tratamento em todos os
casos foi de 90 dias. A análise fotográfica das
úlceras foi realizada a cada 15 dias e a análise
imunohistoquímica das amostras foi realizada
no início e após 45 dias de tratamento.
Captura das Imagens: A Figura 1 mostra um
dispositivo projetado com o objetivo de
padronizar a captura das imagens das úlceras
contendo as seguintes características: a) suporte
de alumínio na forma de arco para uma
máquina fotográfica digital (SonyDSC P93). O
suporte tem 80cm de altura, diâmetro de 70cm e
uma base de acrílico de 50cmx70cm; b)
iluminação com uma lâmpada tipo farol de
milha apontada para o teto com o intuito de
diminuir o reflexo. A lâmpada foi acoplada ao
suporte de alumínio e constituiu a única
iluminação do ambiente. As demais lâmpadas
foram desligadas e a iluminação natural
bloqueada com o uso de cortinas; c) Roldanas
permitem o movimento da máquina fotográfica
e da lâmpada; d) Uso de etiquetas auto colantes,
com marcação em centímetros, para uso na
borda da úlcera, com o intuito de ajustar as
angulações da úlcera durante análise de
imagem. As etiquetas também foram utilizadas
como régua durante o procedimento de
quantificação da imagem da úlcera, utilizandoas para padronização da escala. e) Uso de papel
tamanho ofício abaixo do membro do paciente
para delimitar a borda do mesmo o qual foi
usado sempre que a úlcera foi fotografada com
o intuito de manter o membro sempre na
mesma posição.
A Figura 2 mostra a imagem
padronizada fotografada através do dispositivo
da Figura 1.
Para
a
quantificação
da
imunohistoquímica as imagens das amostras de
biópsias dos pacientes foram capturadas por
uma câmera digital Nikon E995 acoplada a um
microscópio Zeiss com uma objetiva de 40x.
Para ajuste da escala foi utilizada uma régua
micrométrica fotografada nos mesmos padrões.
Fig. 1 - Dispositivo para Fig.2 - Captura
captura de imagem.
padronizada de imagem.
Estudo imunohistoquímico: Foi realizado
biopsias pré e pós tratamento (45 dias) para a
realização de estudo imunohistoquímico,
quantificando TGF-β, VEGF e iNOS,
utilizando o Método HRP-Streptavidina (Santa
Cruz Biotechnology). A quantificação dos
fatores de crescimento e da enzima estudada foi
realizada através do software ImageJ®.
O Método HRP-Streptavidina torna as
células que contém TGF-β, VEGF e iNOS na
cor cobre e os demais na cor violeta.
Características do programa de análise de
imagens utilizado: O ImageJ®1, desenvolvido
por Wayne Rasband do Research Services
Branch, National Institute of Mental Health
(Bethesda, Maryland, EUA), é um software
processador e analisador de imagens em Java de
domínio público inspirado no NIH Image para
o Apple Macintosh. Dessa forma pode ser
executado em diversos ambientes operacionais
desde que os mesmos possuam uma máquina
virtual Java apropriada. Além disso, o
repertório de funções deste software pode ser
expandido através de diversos plugins prontos,
disponíveis na internet, ou desenvolvendo-se
novos plugins.
Segmentação e Cálculo da Área Superficial e
Tecidual da Úlcera: A segmentação foi
realizada manualmente com o uso do mouse.
Para a seleção das áreas de granulação
(vermelha), tecido benéfico à cicatrização, e de
fibrina
(amarela),
tecido
maléfico
à
cicatrização, foram utilizadas as características
de matiz, brilho e saturação da luz refletida e
não somente o brilho, como é mais usual. Foi
através do plugin threshold_colour disponível
na Internet, que a seleção foi realizada,
bastando definir o intervalo da cor de interesse.
O software torna brancas as áreas que
satisfazem este padrão e pretas as demais áreas.
A Figura 3a mostra duas imagens uma com
seleção de área tecidual amarela e outra com
seleção de área tecidual vermelha, já convertida
em preto e branco, comparada a uma imagem
real da úlcera segmentada na Figura 3b.
Definida a área de interesse, quer seja
recoberta por fibrina, quer seja de granulação,
pode ser utilizado o analisador de área do
ImageJ®, para calcular a área superficial e
tecidual, após ajuste apropriado da escala
Fig.3a - Seleção de área amarela Fig. 3b - Imagem real
e seleção de área vermelha,
da úlcera segmentada.
respectivamente.
Para a quantificação das áreas de
superfície das úlceras e seus referentes tecidos
de granulação e fibrina foram quantificados os
seguintes parâmetros: a) razão (r1) entre a área
inicial da úlcera menos a área do seguimento
dividido pela área inicial com a seguinte
interpretação: área fechada se r1=1, área
inalterada se r1=0, diminuição da área se r1>1 e
aumento da área se r1<1; b) razão (r2) entre a
área do tecido de granulação e a área da úlcera
no mesmo dia da avaliação; c) razão (r3) entre a
área do tecido de fibrina e a área da úlcera no
mesmo dia da avaliação.
Segmentação e Cálculo da Área de
Imunohistoquímica da Amostra:
Para
a
seleção da área de cor cobre foi utilizado o
Gimp®, software empregado na formatação de
imagens, semelhante ao Photoshop®, porém
disponível na Internet. Optou-se pelo Gimp®
para a seleção da área de cor cobre devido este
ser mais preciso que o ImageJ® quando as
imagens mostram problemas de background,
isto é, restos de enzimas ou fatores de
crescimento espalhados sobre a amostra,
decorrentes do processo de imunohistoquímica.
Este background não faz parte da área de
interesse. A imagem foi decomposta em RGB,
que é a abreviatura do sistema de cores aditivas
formado por vermelho (Red), verde (Green) e
azul (Blue). A escala de RGB varia de 0 (mais
escuro) a 255 (mais claro). O RGB converte a
imagem em escalas de cinza nos 3 sistemas de
cores. Foi utilizada a imagem em escala de
cinza na cor verde, já que esta representou
melhor a cor cobre e violeta da amostra. A
figura 4a ilustra a imagem real de uma amostra
de imunohistoquímica, comparada à imagem
convertida em escala de cinza na cor verde pelo
Gimp® (Figura 4b). Observa-se que a área de
interesse, ou seja, células marcadas com cobre
estão na cor preta de tonalidade mais forte; já o
background está em tons de preto desbotado,
cinza ou branco. Em seguida, a imagem em
escala de cinza na cor verde foi analisada no
ImageJ®, a segmentação é realizada
manualmente com o uso do mouse. E através
do plugin threshold, também disponível na
internet, selecionou-se a área de interesse. O
software torna vermelha esta área. A figura 5
mostra a imagem segmentada com seleção da
cor cobre já convertida em vermelha.
Definida a área de interesse, pode ser
utilizado o analisador de área do ImageJ®, para
calcular a área, após ajuste apropriado da
escala.
Fig. 4a - Imagem real
de imunohistoquímica.
Fig. 4b - Imagem de
imunohistoquímica convertida
em escala de cinza.
1
Resultados
As evoluções das áreas das úlceras
estão expressas nas figuras 6 à figura 11.
Para o estudo imunohistoquímico,
foram coletadas 24 biópsias das úlceras
previamente estudadas (5 para grupo 1 e 7 para
o grupo 2) em suas fases pré e pós-tratamento.
Em apenas uma biópsia do grupo 2 não foi
realizada a análise imunohistoquímica, devido
a problemas relacionados à coleta. O estudo
foi realizado pela quantificação das células
marcadas pela cor cobre através do softeware
ImageJ®, expresso na Tabela 1.
Evolução clinica das áreas
Úlcera 1
0,7
0,6
Úlcera 2
0,5
0,4
Úlcera 4
0,3
0,2
Úlcera 6
Úlcera 3
Úlcera 5
Úlcera 7
0,1
0
1°
15°
30°
45°
60°
75°
90°
Dias de tratamento
Fig.8 - Evolução clínica de r2 (área granulação/área
superficial) das úlceras do grupo 1(SDZ).
1
Evolução clínica das úlceras
Fig. 5 - Imagem de imunohistoquímica segmentada com
seleção de cobre.
0,9
0,8
0,9
Úlcera 1
0,8
Úlcera 2
0,7
Úlcera 3
0,6
Úlcera 4
0,5
Úlcera 5
Úlcera 6
0,4
Úlcera 7
0,3
Úlcera 8
0,2
Úlcera 9
0,1
0
1°
15° 30° 45° 60° 75°
Dias de tratamento
90° 105°
Fig.9
Evolução
clínica
de
r2
(área
granulação/superficial) das úlceras do grupo 2 (US).
1
0,6
úlcera 1
0,4
úlcera 2
0,2
úlcera 3
úlcera 4
0
-0,2
1°
15°
30°
45°
60°
75°
90°
úlcera 5
úlcera 6
-0,4
úlcera 7
-0,6
-0,8
-1
0,9
Evolução clínica das úlceras
Taxa de cicatrização da úlcera (cm²)
1
0,8
0,8
Úlcera 1
0,7
Úlcera 2
0,6
Úlcera 3
0,5
Úlcera 4
Úlcera 5
0,4
Úlcera 6
0,3
Úlcera 7
0,2
0,1
Dias de tratame nto
Fig.6 - Taxa de cicatrização das úlceras do grupo 1
(SDZ).
1
0
1°
15°
30°
45°
60°
75°
Dias de tratamento
90°
Fig.10 - Evolução clínica de r3 (área fibrina/área
superficial) das úlceras do grupo 1(SDZ).
úlcera 1
0,6
úlcera 2
1
0,4
úlcera 3
0,9
0,2
úlcera 4
úlcera 5
0
-0,2
1°
15°
30°
45°
60°
75°
90°
105°
úlcera 6
úlcera 7
-0,4
úlcera 8
-0,6
úlcera 9
-0,8
-1
Dias de tratame nto
Fig.7 - Taxa de cicatrização das úlceras do grupo 2 (US).
Evoluçaõ clínica das úlceras
Taxa de cicatrização da úlcera
(cm²)
0,8
Úlcera 1
0,8
Úlcera 2
0,7
Úlcera 3
0,6
Úlcera 4
Úlcera 5
0,5
Úlcera 6
0,4
Úlcera 7
0,3
Úlcera 8
0,2
Úlcera 9
0,1
0
1°
15°
30°
45°
60°
75°
90°
105°
Dias de tratamento
Fig. 11 - Evolução clínica de r3 (área fibrina/área
superficial) das úlceras do grupo 2 (US).
Tabela 1 – Análise imunohistoquímica das
biópsias das úlceras segundo a área marcada de
iNOS, TGFβ e VEGF no primeiro e 45º dia de
tratamento dos pacientes do Grupo 1 (SDZ) e
Grupo 2 (US).
≠
1° dia
45° dia
3,3
2,9
1,6
1,4
4,0
M 2,6
2 3,0
3 4,4
4 1,7
5 3,1
8 1,5
9 3,4
M 2,9
2,0
2,0
3,0
3,0
3,5
2,7
-1,3
-0,9
1,4
1,6
-0,5
-0,1
5,6
4,2
2,2
1,5
3,6
3,6
3,5
2,6
-0,2
0,5
-1,6
2,1
0,2
-0,6
1,3
4,0
2,1
1,3
2,2
2,5
2,2
1
2
3
4
5
45° dia
≠
VEGF (cm²)
1° dia
45° dia
Úlcera
TGFβ (cm²)
1° dia
ULTRA-SOM
SULFADIAZINA
iNOS (cm²)
≠
1,8
1,6
1,6
1,2
2,0
1,6
1,8
2,4
1,2
1,2
1,9
1,7
0,0
0,8
-0,4
0,0
-0,1
-0,1
1,0
1,2
1,3
1,2
2,2
1,4
1,5
1,6
1,7
2,3
2,0
1,8
0,5
0,4
0,4
1,1
-0,2
-0,4
2,4
5,1
2,0
1,4
3,5
3,5
3,0
1,1
1,1
-0,1
0,1
1,3
1,0
-0,8
0,9
1,8
1,2
1,3
2,1
1,4
1,5
3,3
3,7
1,4
1,8
1,9
3,5
2,6
2,4
1,9
0,2
0,5
-0,2
2,1
-1,1
M=Média
Discussão
Observando as áreas das úlceras pode-se
notar que no grupo 1 as úlceras tiveram
aumento da área superficial seguido por uma
diminuição, porém chegando ao fim do
tratamento com as dimensões inalteradas
comparadas ao primeiro dia. No grupo 2
primeiramente se obteve um aumento das
úlceras e após o 30° dia começou a ocorrer uma
redução das mesmas. Os resultados mostraram
que tanto a SDZ quanto o US em um primeiro
momento proporcionou aumento das áreas
ulceradas, o que sugere uma ativação da fase
inflamatória e conseqüente desbridamento das
úlceras. Em um estudo anterior foi observado a
ocorrência de proliferação inflamatória em ratas
tratadas com ultra-som na freqüência de
0,75MHz e intensidade de 0,1w/cm². Sugerindo
que com isso a cicatrização possa ocorrer mais
precocemente [2].
As áreas superficiais das úlceras do
grupo 1 ficaram inalteradas com 90 dias de
tratamento, enquanto que o grupo 2 tiveram
uma redução de 0,4cm², isto é, houve um
aumento
de
40%
de
reepitelização,
comparando-as ao primeiro dia de tratamento.
No grupo 1 pode ser observado uma
diminuição da granulação e um aumento da
fibrina nos dias de tratamento comparando ao
primeiro dia, já no grupo 2 pode-se observar
um aumento da granulação e uma diminuição
da fibrina em quase todos os dias de tratamento.
Este fato não ocorreu apenas no 15° e 60° dia.
Em ambos os grupos houve um aumento da
fibrina no 75° de tratamento, quando
comparado ao 60° dia. Observa-se no grupo 2
que ao mesmo tempo que a fibrina aumentou
houve uma diminuição do diâmetro da úlcera.
Isto é conseqüência do aparecimento natural de
fibrina no final da reepitelização, devido a lise
do colágeno velho e a síntese do colágeno novo,
que é caracterizada por uma fibrina mais
esbranquiçada que a anterior[3]. Em estudo de
2002[4] Swist-chimielewska observou que não
houve diferença entre o grupo de ultra-som e o
grupo controle no desenvolvimento da
granulação, porém o grupo de ultra-som
mostrou melhores resultados na diminuição da
área e do volume de úlceras venosas, levandoas a uma cicatrização mais rápida.
Na análise imunohistoquímica as úlceras
do grupo 2, em 45 dias, tiveram um aumento
23% maior de iNOS que as do grupo 1. Isto
sugere uma possível estimulação na fase
inflamatória pois esta enzima faz parte de uma
das etapas da cicatrização. Este aumento da
enzima iNOS nos primeiro 45 dias de
tratamento pode justificar o aumento da área
superficial nos primeiros dias de tratamento.
Houve também um aumento dos fatores
de crescimento TGFβ e VEGF em 44% e 31%,
respectivamente, em relação ao aumento dos
mesmos fatores no grupo 1. Com isso sugere-se
que no grupo 2 está ocorreu estímulo à
fibroblasia e proliferação de vasos sanguíneos,
levando a cicatrização mais rápida das úlceras.
Foi estudado por alguns pesquisadores o efeito
do ultra-som (15 e 30mw/cm²) na produção de
IL-8, FGF e VEGF in vitro em células de
monócitos, fibroblastos e osteoblastos. Neste
estudo foiobservado que o VEGF alcançou o
maior número de produção observado nos 3
tipos de células, e por ambos mecanismos de
ultra-som [5].
O processo de medida da área de uma
úlcera ainda é predominantemente visual[6].
Um estudo comprovou que não é somente o
tamanho da ferida que determina o estado de
melhoria, mas outros indicadores visuais, como
área de fibrina e tecido de granulação, ambos
localizados na parte interna da úlcera[7]. Sabese também que quantificar os fatores de
crescimento e enzimas que estão presentes na
cicatrização é importante uma vez que isto
ajuda a avaliar as verdadeiras condições em que
se encontra a evolução da cicatrização. O
monitoramento da área de uma úlcera, dos
tecidos de fibrina e de granulação e dos seus
fatores de crescimento e enzima através de
processamento de imagem tem maior precisão e
permite, ao longo do tratamento, a
determinação de vários parâmetros que
caracterizam a cicatrização.
Conclusões
O US acelera as diferentes fases da
cicatrização quando comparado ao tratamento
com curativos diários à base de creme
sulfadiazina de prata 1% (SDZ). Ele estimula a
cicatrização das úlceras crônicas, quais são de
difícil tratamento. Na fase inflamatória houve
aumento da enzima iNOS proporcionando o
desbridamento da ferida. Houve aumento dos
fatores de crescimento TGFβ e VEGF que
atuam na neovascularização e na remodelagem.
No decorrer do tratamento o LIUS mostrou ser
mais eficiente no aumento da granulação e
diminuição da fibrina. Consequentemente, as
úlceras tratadas com US são estimuladas à uma
reepitelização mais rápida.
O processamento das imagens de
úlceras é uma ferramenta computacional que
deve ser implantada na rotina clínica de
tratamento de úlceras para que os profissionais
da
área
da
saúde
possam
avaliar
quantitativamente a área da lesão e dos tecidos
presentes e parâmetros imunohistoquímicos
visando o aperfeiçoamento dos serviços de
estomatoterapia.
Referências:
[1] Fishman, T., Diabetic foot ulcers – The
Wound Care Information Network, Internet site
address:http://medicaledu.com/diabetic.htm
acessado em 16/02/2005.
[2] Young, S. R.; Dyson, M. The Effect of
Therapeutic Ultrasound on Angiogenesis.
Ultrasound in Med. & Biol. Vol. 16 (3):
October, 1989. p. 261-9.
[3] Mitchelli, N. R. Tecido de Renovação e
Reparação: Regeneração, Cicatrização e
Fibrose. In: KUMAR, V; ABBAS, A. K.;
FAUSTO, N. Robbins & Cotran Patologia:
bases patológicas das doenças. 7a ed. Vol. 29
Rio de Janeiro, Interamericana, 2005.
[4] Swist-Chmielewska, D. ; Franek, A. ;
Brzezinska-Weilo, L. ; Blaszczak, E. ; Polak,
A. ; Krol, P. Experimental selection of best
physical and application parameters of
ultrasound in the treatment of venous crural
ulceration. Pol Merkuriusz Lek, jun, Vol. 12
(72): 2002. p.500-5.
[5] Reher, P.; Doan, N.; Bradnock, B.; Meghji,
S.; Harris, M. Effect of ultrasound on the
production of IL-8, basic FGF and VEGF.
Cytokine, vol 1, N° 6: June. 1999. p. 416-423.
[6] Medeiros, G. C. F., Uso de Texturas para o
Acompanhamento da Evolução do Tratamento
de Úlceras Dermatológicas, Dissertação de
Mestrado, Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Elétrica, Escola de Engenharia de
São Carlos-USP, 2001.
[7] Berris, P. W., “Acquisition of Wound
Images and Measurement of Wound Healing
Rate and Status Using Colour Image
Processing, Ph. D. Thesi, Department of
Engineering, University of Reading, 2000.