Kirstern Lica Follmann Haseyama
Filogenia e tempos de divergência de Muscidae (Diptera, Calyptratae, Schizophora)
Tese de Doutorado apresentada à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Área de concentração em Entomologia) da
Universidade Federal do Paraná como requisito parcial
para a obtenção do título de mestre em Ciências
Biológicas.
Orientador:
Claudio José Barros de Carvalho
Co-orientadores:
Eduardo Andrade Botelho de Almeida (USP)
Brian Michael Wiegmann (NCSU)
Curitiba, março de 2014
ii
Agradecimentos
Agradeço às instituições que apoiaram este trabalho: Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico pela bolsa de doutorado; ao Conselho de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela bolsa no período inicial do doutorado,
pela oportunidade de visitar o Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pelo Programa
Nacional de Cooperação Acadêmica, e durante a minha estadia no exterior, pelo programa de
Doutorado Sanduíche; à Universidade Federal do Paraná, o Departamento de Zoologia e o
Programa de Pós-graduação em Entomologia por oferecer as condições necessárias para o
período do doutorado realizado em território nacional; à North Carolina State University e o
seu Departamento de Entomologia por possibilitar a execução de parte do trabalho durante os
11 meses nela passados.
Ao meu orientador, Claudio José Barros de Carvalho, pela orientação sobre moscas, o
mundo acadêmico, a minha carreira e tantas outras coisas, desde a graduação até agora.
Foram incontáveis horas, todas elas muito bem gastas, passadas na frente da lupa conferindo
todos os espécimes identificados, no computador, nos livros ou conversando. Ao meu coorientador, Eduardo Andrade Botelho de Almeida, por sempre estar a postos, mesmo à
distância, para tirar toda a sorte de dúvidas a respeito de biogeografia e filogenética, também
desde a graduação. Ao meu co-orientador Brian Michael Wiegmann, por sempre me ajudar
com as análises, organizar os planos futuros, pela sua visão sempre ampla e objetiva do
trabalho, e pela paciência quando eu queria apresentá-lo a cada nova topologia gerada. A
estas três pessoas devo o suporte da minha formação acadêmica nesses últimos quatro anos.
Às pessoas que muito me ensinaram nesses quatro anos, e também anteriormente no
mestrado e graduação, meus professores e colegas tanto na UFPR quanto na NCSU.
Agradeço especialmente aos que a mim se juntaram em cada tentativa de ressuscitar o
Cladson, nosso estimado grupo de discussão. E também, claro, os meus colegas de
laboratório, que tiveram muita paciência quando eu praticamente tomei uma lupa para mim e
lotei o congelador: Alessandre, André, Bia, Danilo, Diana, Gustavo, João, Juliana, Karine,
Keith, Kiany, Lyvia, Maíra, Marcelo, Mauren, Mírian, Rafael, Rosângela, Tatiana, Victor.
Também ao Brian C. Cassel, técnico que me ensinou, durante o meu estágio sanduíche, as
técnicas necessárias para a obtenção das sequências de DNA.
iii
Aos meus colaboradores nos artigos e matérias publicados e em preparação no
período, assim como os revisores e editores. Todas as discussões com os autores e as críticas
construtivas recebidas foram extremamente úteis. Alessandre Pereira Colavite, Claudio José
Barros de Carvalho, Danilo Pacheco Cordeiro, Diana Lucia Grisales, Marcos Barbeitos,
Mário Luis Pessôa Guedes, Peter Löwenberg-Neto, Rudolf Meier, Silvio Shigueo Nihei,
Alessandra Rung Chaves, e revisores anônimos.
Claro, aos coletores, e pesquisadores que abriram que abriram as portas de seus
laboratórios e coleções para que eu pudesse triar material. Adolfo Callor e colaboradores,
Ashton Kirk-Sprigs, Brian Wiegmann, Cecília Kosmann, Claudivã S. Maia, Danilo P.
Cordeiro, David Yeates, Diana G. Ochoa, Fernando Leivas, Flávia Fernandes, Guilherme Ide,
Jéssica H. Viana, José Albertino Rafael e colaboradores, Justin B. Runyon, Karine P. e Vairo,
Leandro Santos, Lucas Cezar, Luis R. R. Faria Jr., Marc Pollet e colaboradores, Mário L. P.
Guedes, Marion Kotbra, Paschoal Grossi, Ricardo Kawada, Rodrigo Krüger e colaboradores,
Rosaly Ale-Rocha e colaboradores, Satoshi Shinonaga, Silvio Nihei e colaboradores e
Thayana Monteiro. Agradeço especialmente os esforços empregados por Jorge Almeida, para
a obtenção do espécime de Achanthiptera utilizado neste trabalho. Se você coletou material
para mim, e seu nome não se encontra nesta lista, peço que me desculpe. Ou seu nome está
sob o desígnio de “e colaboradores” ou seu material não foi usado na fase final do trabalho.
No entanto, todo material foi triado e identificado ao menor nível possível no momento, está
apropriadamente armazenado, e espera-se será utilizado em futuros trabalhos. Agradeço
especialmente a Mirian N. Morales, cujo material africano e europeu está guardado a espera
de novos projetos.
Aos que me auxiliaram na identificação dos espécimes: Alessandre P. Colavite e suas
Neomuscina, Adrian Pont pelos conselhos dados na identificação de material Paleártico,
André C. Silva com os Anthomyiidae, Satoshi Shinonaga que muito gentilmente enviou do
Japão diversos Muscidae identificados e Silvio S. Nihei pela ajuda com os Muscini. E claro, o
prof. Claudio, que passou todas aquelas manhãs olhando todos os espécimes utilizados.
As pessoas que me apoiaram durante algumas das viagens feitas nesses quatro anos:
Jéssica Gilung, Júlia C. Almeida, Lucas Cezar, Roberta Figueiredo e Silvio Nihei, que me
ajudaram nas coletas na Costa Rica, e também Diana Grisales e Marta Wolff pela companhia
durante a estadia em San José no VII International Congress of Dipterology; Cinthia Chagas,
Edgar Alvin, Danilo P. Cordeiro, Diana L. Grisales, Francisco X. Filho, Gabriel A. Melo,
Mário P. Guedes, Raimundo N. Costa, Rodrigo Vieira, José A. Rafael e Rosaly Ale-Rocha e
iv
os integrantes de seus laboratórios, por proporcionar o apoio para o trabalho ou pela
paciência de passar um mês comigo em Manaus, durante o PROCAD; Mauren Turcatel e
Frederico D. Kirst, pessoas indispensáveis no período do estágio sanduíche, claro também
Brian M. Wiegmann, Brian C. Cassel e Keith M. Bayless, e Mirian N. Mendonça e Olivia
Evangelista por todas as dicas no período antes da viagem; aos integrantes do Wiegmann lab
e o Frederico Kirst, pelos 1000 km viajados em uma mini-van rumo ao encontro da North
American Dipterists Society, e ao Eric Fisher pelas dicas e apoio ao projeto após a minha
apresentação no encontro. Torsten Dikow e Raymond Gagne, que abriram as portas da
coleção de Diptera do Smithsonian Insitute e Christian Thompson, que recebeu muito bem a
mim e ao Frederico; ao time de professores e colegas dos principais cursos de formação
complementar no período: III Workshop em Sistemática Filogenética promovido pela Willi
Hennig Society e XXVI Workshop em Evolução Molecular, principalmente ao Brian
Wiegmann pelo financiamento do último e Diana L. Grisales, Eduardo A.B. Almeida e
Mauren Turcatel pela companhia durante estes eventos.
Andressa Paladini por revisar a primeira versão da tese e todas as discussões
anteriores. A Adrian Pont, pelo apoio ao longo da execução do projeto.
Finalmente, aos professores Márcia S. Couri, Marta Wolff, Silvio S. Nihei, Eduardo A. B.
de Almeida e Marcio R. Pie, que aceitaram o convite para participar da banca examinadora.
v
Sumário
Agradecimentos.......................................................................................................................... ii
Lista de Tabelas.......................................................................................................................... vi
Lista de Figuras..........................................................................................................................
vii
Resumo....................................................................................................................................... ix
Abstract......................................................................................................................................
x
1. Introdução..............................................................................................................................
1
2. Material e Métodos
2.1 Amostragem, escolha dos genes e desenho da composição da matriz de dados............ 6
2.2 Extração do DNA, amplificação e sequenciamento....................................................... 8
2.3 Alinhamento, escolhas dos modelos e outras análises...................................................
10
2.4 Análises filogenéticas..................................................................................................... 12
2.5 Estimativa dos tempos de divergência...........................................................................
14
Resultados
3.1 Análises preliminares.....................................................................................................
15
3.2 Inferência filogenética e estimativa dos tempos de divergência.................................... 17
Discussão
4.1 Inferência filogenética.................................................................................................... 18
4.2 Discussão taxonômica.................................................................................................... 21
4.3 Tempos de divergência..................................................................................................
27
Considerações finais................................................................................................................... 31
Referências................................................................................................................................. 32
Tabelas.......................................................................................................................................
41
Figuras........................................................................................................................................ 56
vi
Lista de tabelas
Tabela 1. Sequências utilizadas e números de acesso ao GenBank...................................
Tabela 2. Iniciadores utilizados no trabalho, com suas respectivas sequências e
referências...........................................................................................................................
Tabela 3. Resumo das análises filogenéticas e resultados...................................................
Tabela 4. Modelos indicados para cada gene ou partição, de acordo com os testes de
AIC e BIC............................................................................................................................
Tabela 5. Valores do desvio padrão das split frequencies médias e máximas...................
Tabela 6. Valores de verossimilhança marginal obtidos pelo método da média
harmônica, por esquema de particionamento, para o conjunto de dados reduzido e
completo..............................................................................................................................
Tabela 7. Comparação dos fatores de Bayes, usando as verossimilhanças marginais
obtidas pelo método da média harmônica, entre os esquemas de particionamento, para
os dados reduzidos e completos..........................................................................................
Tabela 8. Valores da verossimilhança marginal recuperados pelo procedimento de
“stepping-stone”, por esquema de particionamento, para o conjunto de dados reduzido e
completo...............................................................................................................................
Tabela 9. Comparação dos fatores de Bayes, usando as verossimilhanças marginais
obtidas pelo procedimento de “stepping-stone”, entre os esquemas de particionamento,
para o conjunto de dados reduzido e completo....................................................................
Tabela 10. Comparação entre a classificação atual e a proposta deste
trabalho.................................................................................................................................
41
50
51
52
52
52
53
53
53
54
vii
Lista de Figuras
Figura 1. Plots de saturação...............................................................................................
Figura 2. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema
de particionamento ‘SP_RED’ obtidas pela probabilidade posterior bayesiana ...............
Figura 3. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema
de particionamento ‘GENE_RED’ obtidas pela probabilidade posterior bayesiana .........
Figura 4. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema
de particionamento ‘GENE123_RED’ obtidas pela probabilidade posterior bayesiana ...
Figura 5. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema
de particionamento ‘CO1s3_RED’ obtidas pela probabilidade posterior bayesiana ........
Figura 6. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema
de particionamento ‘SP_COMP’ obtidas pela probabilidade posterior bayesiana ...........
Figura 7. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema
de particionamento ‘GENE_COMP’ obtidas pela probabilidade posterior bayesiana .....
Figura 8. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema
de particionamento ‘GENE123_COMP’ obtidas pela probabilidade posterior bayesiana
Figura 9. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema
de particionamento ‘CO1s3_COMP’ obtidas pela probabilidade posterior bayesiana .....
Figura 10. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de boostrap para o esquema de
particionamento ‘SP_RED’ obtidas pela máxima verossimilhança...................................
Figura 11. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘GENE_RED’ obtidas pela máxima verossimilhança............................
Figura 12. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘GENE123_RED’ obtidas pela máxima verossimilhança......................
Figura 13. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘CO1s3_RED’ obtidas pela máxima verossimilhança............................
Figura 14. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘SP_COMP’ obtidas pela máxima verossimilhança...............................
Figura 15. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
56
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59
60
61
62
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64
65
66
67
68
69
viii
particionamento ‘GENE_COMP’ obtidas pela máxima verossimilhança.........................
Figura 16. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘123GENE_COMP’ obtidas pela máxima verossimilhança...................
Figura 17. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘CO1s3_COMP’ obtidas pela máxima verossimilhança.........................
Figura 18. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘SP_RED’ obtidas pela parcimônia.........................................................
Figura 19. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘CO1s3_RED’ obtidas pela parcimônia..................................................
Figura 20. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘SP_COMP’ obtidas pela parcimônia.....................................................
Figura 21. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de
particionamento ‘CO1s3_COMP’ obtidas pela parcimônia...............................................
Figura 22. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco
espécies de outras famílias de Calyptratae e intervalos de 95% de confiança para os
tempos de divergência obtidos com o esquema de particionamento
‘GENE_RED’.....................................................................................................................
Figura 23. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10
espécies de outras famílias de Calyptratae e intervalos de 95% de confiança para os
tempos de divergência obtidos com o esquema de particionamento
‘GENE_COMP’.................................................................................................................
Figura 24. Resumo dos suportes obtidos por todas as análises reduzidas para as
relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras famílias de
Calyptratae, mapeados sobre a hipótese filogenética obtida pelo esquema de
particionamento ‘GENE’, pela probabilidade posterior bayesiana ..................................
Figura 25. Resumo dos suportes obtidos por todas as análises para as relações entre 138
espécies de Muscidae e 10 espécies de outras famílias de Calyptratae, mapeados sobre
a hipótese filogenética obtida pelo esquema de particionamento ‘SP’, pela
probabilidade posterior bayesiana .....................................................................................
Figura 26. Comparação entre as principais hipóteses filogenéticas para Muscidae .........
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
83
ix
Resumo
Muscidae
é
uma
família
de
moscas
de
distribuição
cosmopolita,
com
aproximadamente 5000 espécies distribuídas em 200 gêneros. A classificação atual divide a
família em oito subfamílias, mas estudos prévios, tanto com caracteres morfológicos de
adultos, imaturos e também moleculares, dão suporte a diferentes hipóteses de
relacionamento e composição destes grupos. Para propor uma hipótese para o relacionamento
filogenético entre as principais linhagens de Muscidae, bem como os tempos de divergência
entre elas, foram utilizados dados de 138 espécies da família, representando 62 gêneros
distribuídos em todas as subfamílias e tribos, exceto Eginiini, provenientes de todas as
regiões biogeográficas, mas com especial ênfase na Neotropical. As análises filogenéticas
foram feitas com dados de quatro genes (CO1, AATS, CAD e EF1α) e submetidos a análise
pelos critérios de máxima verossimilhança, parcimônia e probabilidades posteriores
bayesianas. Os tempos de divergência foram calculados pelo método bayesiano. Os
resultados encontrados mostram uma divisão principal da família em três linhagens: uma
correspondente a Muscinae, que inclui além de Muscini e Stomoxyini, Azeliini,
Achanthipterinae e Reinwardtia, sendo a inclusão deste último duvidosa pela instabilidade
quanto ao seu posicionamento em diferentes análises; uma segunda linhagem correspondente
a Cyrtoneurininae, composta por representantes desta subfamília, Mydaeinae, os demais
Reinwardtiini e Atherigoninae; a última linhagem corresponde a Mydaeinae, e além destes
engloba os Phaoniinae, Dichaetomyiini, Coenosiini e Limnophorini. Cariocamyia (um
Cyrtoneurininae neotropical), e Prohardyia (um Phaoniinae australiano) posicionaram-se
neste clado, mas em diversas análises eles foram recuperados junto aos Cyrtoneurininae. Em
algumas análises, Cariocamyia e Prohardyia foram encontrados como gêneros irmãos. Uma
discussão a respeito do posicionamento de diversos gêneros também é apresentada. A
divergência entre Muscidae e Anthomyiidae foi calculada entre 50 e 60 milhões de anos,
correspondente a um período entre o Paleoceno superior e o Eoceno inferior, e as principais
linhagens de Muscidae divergiram entre 50 e 35 milhões de anos.
x
Abstract
Muscidae is a family of flies with worldwide distribution, comprising about 5000
species in 200 genera. The current classification of house flies divides their members into
eight subfamilies. Previous studies based on both adult and immature stages morphology and
molecular characters support different hypothesis for the relationships and composition of
these groups. Herein we present a hypothesis on the relationships within the main lineages of
the family, as well as their divergence time estimation for the main clades. A total of 138
muscid species from 62 genera from all subfamilies and tribes (except for Eginiini) were
sampled for this study. They are representative of all biogeographic regions, in particular
from the Neotropical Region. Phylogenetic analyses were carried out with data from four
genes (CO1, AATS, CAD e EF1α) under Bayesian posterior probabilities, maximum
likelihood and parsimony criteria. Divergence times were estimated using the Bayesian
method. Results recovered three main lineages: one corresponding to the Muscinae, which
includes Muscini and Stomoxyiini, Azeliini, Achanthipterinae and Reinwardtia. This genus
changed its position among different analyses, so its position within the Muscinae is doubtful;
a second lineage corresponds to the Cyrtoneurininae, and is composed by the majority of the
representatives
of
this
subfamily,
Mydaeinae,
the
remaining
Reinwardtiini
and
Atherigoninae; the last lineage corresponds to the Mydaeinae, and besides representatives of
this subfamily, comprises the Phaoniinae, Dichaetomyiini, Coenosiini, and Limnophorini.
Cariocamyia (a Neotropical Cyrtoneurininae), as well as Prohardyia (an Australian
Phaoniinae) were positioned in this clade, but in several analyses they were recovered within
the Cyrtoneurininae. In some analyses, Cariocamyia and Prohardyia were recovered as
sister-genera. The divergence between Muscidae and Anthomyiidae was estimated between
50 and 60 million years, corresponding to a period between upper Paleocene and lower
Eocene. The main lineages of Muscidae diverged between 50 and 35 million years.
1
1. Introdução
Muscidae é uma família de moscas com mais de 5000 espécies distribuídas em 200
gêneros (Pape & Thompson 2013), e dentre os dípteros, é uma família relativamente bem
estudada. Sua monofilia foi recuperada por diversos estudos, tanto pela análise da morfologia
(Michelsen 1999), quanto análises utilizando o princípio filogenético com dados morfológicos
(Hennig 1965, McAlpine 1989) e também com dados moleculares (Kutty et al. 2008, 2010). A
sua autapomorfia mais importante é a perda dos espiráculos pós abdominais na fêmea, mas
Cariocamyia e Achanthiptera readquiriram independentemente o espiráculo 6 (Hennig 1965).
Vários autores construíram propostas de classificação, baseados tanto em análises da
morfologia quanto em hipóteses filogenéticas. A classificação mais recente divide a família em
oito subfamílias: Achanthipterinae Rondani, 1856, Atherigoninae Fan, 1965, Azeliinae
Robineau-Desvoidy, 1830, com as tribos Azeliini Robineau-Desvoidy, 1830 e Reinwardtiini
Brauer & Bergenstamm, 1889, Coenosiinae Verrall, 1888, subdividido em Coenosiini Verrall,
1890 e Limnophorini Villeneuve, 1902, Cyrtoneurininae Snyder, 1954, Muscinae Latreille,
1802, constituído por Muscini Latreille, 1802 e Stomoxyini Meigen, 1824, Mydaeinae Verrall,
1888 e Phaoniinae Malloch, 1917 (Carvalho et al. 2005). Esta proposta, baseada em uma análise
filogenética com caracteres morfológicos de adultos (Carvalho 1989), é em grande parte
condizente com aquela baseada no extensivo estudo de caracteres dos estágios imaturos
(Skidmore 1985). Uma diferença importante entre estas classificações é o posicionamento de
Eginiini. Carvalho (1989) considerou os gêneros reunidos em Eginiini como não pertencentes à
Muscidae, seguindo o posicionamento de Hennig (1973), que considerou as espécies deste
táxon como uma família separada, pela presença de cerdas no mero e veia anal se estendendo
até a margem da asa. Por outro lado, McAlpine (1989), mantem o grupo em Muscidae, pela
ausência dos espiráculos seis e sete nas fêmeas (autapomorfia da família), além de caracteres da
genitália masculina. Pont (1986) alocou estas espécies na subfamília Phaoniinae, tribo Eginiini.
Por outro lado, em sua classificação, Skidmore (1985) mantém o grupo como uma subfamília de
Muscidae, deixando claro, porém, que o provavelmente não pertence à família.
Duas hipóteses filogenéticas utilizando dados morfológicos já foram propostas para a
família. A primeira foi constituída por Hennig (1965), que apesar de formalmente não ter
2
apresentado uma árvore filogenética, fez um extenso trabalho de revisão da literatura e de análise
morfológica, principalmente dos adultos. Na mais recentemente proposta, Carvalho (1989)
amostrou 27 espécies terminais pertencentes a nove das dez subfamílias reconhecidas para
Muscidae à época, já que Eginiini, tratada pelo autor como Eginiinae, não foi utilizada. As
principais diferenças entre os trabalhos de Hennig (1965) e Carvalho (1989) são: a posição de
Azeliinae (naquele trabalho tratada como Hydrotaeini), que no primeiro compõe uma tribo de
Muscinae; Atherigoninae, que no primeiro é um gênero sem posição definida, possivelmente
relacionado a Phaoniinae, assim como Dichaetomyiini; Coenosiini e Limnophorini, que no
trabalho mais antigo constituem subfamílias; Cyrtoneurininae, que no trabalho mais antigo foi
tratado como uma subfamília de posicionamento incerto; e Stomoxyini, a qual Hennig
considerou como proximamente relacionada a Glossinidae e Hippoboscidae, por caracteres da
probóscidae, e sem um posicionamento definido dentro da família; Reinwardtiini, que no
esquema de Hennig não tem o status de táxon: Reinwardtia é posicionada por ele em Muscinae e
os demais gêneros da tribo em Phaoniinae. Apesar das diferenças na composição das
subfamílias, nas duas hipóteses Achanthipterinae, Muscinae e Azeliinae divergiram
anteriormente em relação a Phaoniinae, Mydaeinae e Coenosiinae.
Existem também hipóteses para os relacionamentos intrafamiliares propostas com dados
moleculares. Schuehli et al. (2007) amostraram 24 terminais de cinco subfamílias e utilizaram
quatro genes (CO1, CO2, EF1α e CAD). Neste trabalho, os resultados foram congruentes com a
monofilia de apenas duas subfamílias, Muscinae e Phaoniinae. Kutty et al. (2008) trabalharam
com a filogenia de “Muscoidea” (McAlpine 1989), um agrupamento parafilético em relação aos
demais Calyptratae, constituído pelas famílias Anthomyiidae, Fanniidae, Muscidae e
Scathophagidae. Foram utilizadas 46 espécies de Muscidae, em sua maioria paleárticas,
amostrando sete subfamílias. Os autores analisaram dados de oito genes (12S, 16S, 18S, 28S,
CO1, CYT, EF1α e CAD), e apenas Coenosiinae e Muscinae foram consideradas monofiléticas
(Kutty et al. 2008). Subsequentemente, estes dados foram reanalisados em um trabalho que tinha
como objetivo criar uma hipótese a respeito dos relacionamentos entre os Calyptratae, e apenas
Coenosiinae foi reconhecida como monofilética (Kutty et al. 2010).
Além destes estudos abrangentes, há filogenias morfológicas de alguns subgrupos de
Muscidae: Coenosiini (Couri & Pont 2000), Azeliini (Savage & Wheeler 2004), Muscini (Nihei
3
& Carvalho 2007a) e Reinwardtiini (Soares 2008). Há também um estudo a respeito das relações
entre Philornis, Passeromyia e gêneros próximos, juntamente com representantes de diversas
subfamílias de Muscidae (Couri & Carvalho 2003). Nesta publicação os autores sugeriram que
os gêneros de Cyrtoneurininae poderiam ser incluídos em Dichaetomyiini, um grupo
Paleotropical, Paleártico e Australiano, não incluso no sistema de Carvalho (1989), e que
usualmente é tratado como tribo de Phaoninae (e.g. Hennig 1965). Naquele trabalho, no entanto,
o grupo é tratado como subfamília e não forma um clado com Phaoninae. Foram publicadas
também duas abordagens moleculares: de Reinwardtiini, onde foram utilizados 36 terminais e
três genes (CAD, CO1 e CO2), resultando em Coenosiinae e Phaoniinae monofiléticas (Soares
2008), e um estudo englobando diversas espécies de Stomoxys e representantes de Haematobia,
Haematobosca, Prostomoxys (todos Stomoxyini) e Musca (Muscini), com três genes (CO1,
CYTB e ITS2), onde a monofilia de Stomoxyini foi recuperada (Dsouli et al. 2011).
Considerando em conjunto os cinco estudos com dados moleculares (Schuehli et al. 2007,
Soares 2008, Kutty et al. 2008, 2010, Dsouli et al. 2011), todas as subfamílias e tribos estão
amostradas, com exceção de Eginiini, Dichaetomyiini e Achanthipterinae, a qual possui apenas
Achanthiptera rohrelliformis, de distribuição Paleártica.
À parte os relacionamentos intrafamiliares, outro aspecto bastante discutido e controverso
com relação à Muscidae é a sua idade. Diversos autores têm proposto estimativas de tempos de
divergência baseadas em diferentes metodologias, mas principalmente embasados em dados de
distribuição e análises biogeográficas. Hennig (1965) propôs que a família teria se originado no
Cretáceo Superior (65-99 milhões de anos - MA) baseado no padrão de distribuição da família.
Os muscídeos teriam chegado ao hemisfério sul por dispersão a partir dos continentes do norte.
Michelsen (1991) sustenta esta ideia para Anthomyiidae, que de acordo com o autor, é grupo
irmão de Muscidae. Já Couri & Carvalho (2003), através da análise filogenética e biogeográfica
parcial da família propuseram um padrão gondwânico para explicar o relacionamento próximo
entre gêneros neotropicais e paleotropicais, reduzindo então a idade da família para o Cretáceo
Inferior (99-145 MA). No entanto, os autores reforçam que a idade da família continua incerta.
Outra perspectiva foi dada por Löwenberg-Neto et al. (2011), cujos resultados mostram que a
história evolutiva de Muscidae, ao menos na América do Sul, pode ser explicada pela Hipótese
de Conservação Tropical. Esta hipótese procura explicar a alta diversidade de táxons nas regiões
4
quentes do mundo, argumentando que as regiões frias são mais recentes, e por isso possuem
menos linhagens adaptadas a sobreviver nestes locais. Assim, o conservantismo de nicho nos
locais mais quentes do continente e o resfriamento da região Andina ocorrido no Cenozóico,
explicaria a evolução de Muscidae na região. Apesar desta hipótese não estabelecer uma idade
para a família como um todo, denota que as linhagens adaptadas às regiões mais frias teriam tido
uma evolução bastante recente, ao menos na região Neotropical.
Uma forma alternativa para se estimar as idades mínimas de grupos é pela idade de
fósseis pertencentes a um clado. No entanto, o registro fóssil de Muscidae é escasso. Pont &
Carvalho (1997) descreveram três espécies encontradas no âmbar Dominicano, cuja idade é
estimada entre 15 a 20 MA (Iturralde-Vinent & MacPhee 1996): Phaonia succini e Phaonia
electrica (Phaoniinae), que pertencem a um gênero atual, e Archaeopolietes tertiaria (Muscinae),
única espécie conhecida do gênero, que parece estar extinto. Além destes três fósseis bem
documentados, ainda há registros entre o Oligoceno e o Holoceno que não oferecem suficiente
evidência morfológica para identificação segura (Adrian Pont, comunicação pessoal). Das
famílias do grado Muscoidea, Anthomyiidae possui o fóssil mais antigo (Michelsen 2000,
Evenhuis 2004), com idade estimada em 44 MA.
A primeira estimativa de tempos de divergência entre Diptera baseada em dados
moleculares foi feita por Wiegmann et al. (2003), que calcularam, entre outros, o tempo de
divergência entre os gêneros Musca (Muscidae) e Drosophila (Drosophilidae), representando a
radiação de Schizophora, a qual teria ocorrido entre 81 e 48 MA (Cretáceo superior ao Eoceno
médio). Os próprios autores ressaltam, no entanto, que uma estimativa da idade de Muscidae,
que estava fora do escopo daquele trabalho, só seria possível com a utilização do grupo-irmão
apropriado. Recentemente, utilizando terminais representando as principais linhagens de Diptera,
incluindo várias famílias de Calyptratae e todas as do grado Muscoidea, a idade da radiação de
Muscidae foi calculada como tendo ocorrido há cerca de 50 MA (Wiegmann et al. 2011). Em
outro estudo foram estimados também os tempos de divergência entre espécies de Stomoxys,
alguns outros gêneros dentro de Stomoxyini e Musca (Dsouli et al. 2011). O tempo de
divergência estimado para Stomoxys foi entre 40 e 20 MA, e a divergência entre Muscini e
Stomoxyini entre 44 e 25 MA. Como Stomoxyini não possui registro fóssil conhecido, os autores
utilizaram grupos externos bastante distantes para fazer a calibração (Dolichopodidae, Syrphidae
5
e Drosophilidae), além da estimativa obtida anteriormente para a divergência de Schizophora
(Wiegmann et al. 2003).
As relações entre os Calyptratae é um questão em aberto, e não há acordo na literatura
sobre qual seria o grupo irmão de Muscidae, havendo quatro principais propostas: 1)
Anthomyiidae (Michelsen 1991, Nihei & Carvalho 2004); 2) Fanniidae (Hennig 1973, McAlpine
1989); 3) um clado composto pela superfamília Oestroidea, e as famílias irmãs Scatophagidae e
Anthomyiidae, hipótese esta recorrentemente recuperada por estudos com dados moleculares
(Bernasconi et al. 2000, Kutty et al. 2008, 2010, Wiegmann et al. 2011). Neste último cenário,
Fanniidae é a família irmã das linhagens citadas; 4) Oestroidea, hipótese suportada tanto por uma
filogenia com dados morfológicos (Lambkin et al. 2013), onde Anthomyiidae era grupo irmão de
Muscidae + Oestroidea (Fanniidae não foi incluída na análise), quanto por uma filogenia inferida
por genomas mitocondriais (Zhao et al. 2013). Neste último trabalho, no entanto, onde Fanniidae
e Anthomyiidae não foram inclusos, os autores encontraram tanto suporte para Muscidae como
grupo irmão de Oestroidea, pelo critério bayesiano, quanto para um posicionamento de Muscidae
dentro de Oestroidea, quando o critério foi a máxima verossimilhança. Neste caso, Oestridae foi
recuperado como grupo irmão do clado (Muscidae, (Sarcophagidae + Calliphoridae)).
Neste contexto, em que as relações entre as principais linhagens de Muscidae, apesar de
todos os esforços empregados, ainda não estão esclarecidas, o objetivo principal é propor uma
hipótese para as relações filogenéticas em Muscidae e estimativas de idades para os eventos de
cladogênese. Como objetivos específicos, pretende-se amostrar pela primeira vez, em uma única
análise, todas as subfamílias e tribos da família, à exceção de Eginiini; analisar um maior número
de táxons terminais de linhagens neotropicais, claramente subamostradas em estudos anteriores;
propor uma idade para as principais linhagens da família utilizando uma combinação de dados
moleculares e registro fóssil; propor uma classificação para a família com base na hipótese
filogenética resultante.
6
2. Material e métodos
2.1 Amostragem, escolha dos genes e desenho da composição da matriz de dados
Para a classificação a priori do grupo interno em subfamílias e tribos seguiu-se a
proposta do catálogo de Muscidae para a região Neotropical (Carvalho et al. 2005) com a adição
da subfamília Achanthipterinae e a divisão de Phaoninae em Phaoniini e Dichaetomyiini. Para
gêneros presentes exclusivamente em outras regiões, foram utilizados catálogos correspondentes
(Pont 1980, 1986, Evenhuis 2014). Os espécimes foram identificados quando possível até
espécie, usando chaves para a identificação de gêneros (e.g. Zimin & Eldberg 1988, Carvalho
2002, Gregor et al. 2002, Couri 2007, 2010, Nihei & Carvalho 2009) e espécies (e.g. Pont 1966,
1969, Carvalho 2002, Savage 2003, Schuehli & Carvalho 2004, Nihei & Carvalho 2007b,
Pereira-Colavite & Carvalho 2012). Posteriormente as espécies foram confirmadas com material
depositado na Coleção Entomológica Padre Jesus de Santiago Moure (DZUP) e no Smithsonian
Institution (USNM).
As amostras procedem de localidades principalmente das regiões Neotropical e
Paleártica, mas também Neártica, Paleotropical e Australasiana (Tabela 1) e foram coletadas por
diversos colaboradores entre e 2008 e 2012. O material foi adquirido de forma ativa ou com a
ajuda de armadilhas, especialmente Malaise e van Someren, e preservado em álcool. Todos os
vouchers estão depositados no DZUP. Foram também usadas diversas sequências disponíveis no
GenBank, tanto de Muscidae quanto dos grupos externos, somando 141 espécies de Muscidae,
em 63 gêneros, representando todas as suas subfamílias e tribos, exceto Eginiini (Tabela 1).
Como grupos externos foram utilizadas nove espécies de Fanniidae e Anthomyiidae, as quais são
as famílias mais próximas de Muscidae de acordo a maior parte das propostas encontradas na
literatura.
Algumas considerações foram feitas na escolha dos genes a serem amplificados: 1)
privilegiaram-se aqueles com diversas sequências disponíveis no GenBank para Muscidae, e que
tivessem iniciadores (primers), gerais ou específicos para a família, previamente publicados; 2)
deu-se preferência para genes mitocondriais e nucleares codificadores de proteínas, pela
facilidade do alinhamento das suas sequências (Wiegmann et al. 2000); 3) como o foco deste
estudo são as relações entre as linhagens principais e os gêneros de Muscidae, optou-se por
7
utilizar mais genes nucleares, os quais possuem uma taxa de evolução de cinco a dez vezes mais
lenta do que os mitocondriais em animais (Brown et al. 1979), e por consequência são mais
conservados.
Desta forma, foram utilizados o gene mitocondrial Citocromo Oxidase 1 (CO1) e os
seguinte genes nucleares codificadores de proteína: Aspartil-tRNA Sintetase (AATS), o domínio
Carbamoil Fosfato Sintetase (CAD, fragmento 4) e Fator de Elongação (EF1α). Todos figuram
entre os mais comuns para reconstrução filogenética em Diptera (Gibson et al. 2011) e foram
previamente utilizados em estudos filogenéticos que incluem espécies de Muscidae (e.g.
Schuehli et al. 2007, Kutty et al. 2008, 2010, Wiegmann et al. 2011). O AATS não possui muitas
sequências de interesse no GenBank, e no entanto foi escolhido por ser um gene amplamente
utilizado na reconstrução filogenética em Diptera (e.g. Dikow 2009, Gibson et al. 2010,
Wiegmann et al. 2011), e de fácil amplificação, comparado a outros genes nucleares, ao menos
para Muscidae.
Quanto ao desenho da composição da matriz de dados, optou-se por não fazer a
amplificação de todos os genes para todas as espécies utilizadas no trabalho, seguindo a
estratégia proposta por Wiens et al. (2005). Os táxons foram divididos em duas categorias: uma
com todas as espécies de interesse e outra com uma espécie para cada gênero. No caso do gênero
possuir mais de uma espécie disponível para a extração e amplificação do DNA, optou-se, para a
segunda categoria, quando possível, pela espécie tipo. Quando esta não estava disponível, foi
escolhido o material que potencialmente tivesse o DNA mais bem conservado, considerando data
e método de coleta. As espécies que se encaixavam apenas na primeira categoria tiveram
somente o CO1 amplificado. Já aquelas que se encaixavam na segunda passaram pela tentativa
de amplificação de todos os genes envolvidos no estudo. A escolha deste desenho experimental
teve como motivação, além do corte substancial de custos e de tempo de laboratório, a hipótese
de que as sequências dos genes nucleares em espécies selecionadas seriam o suficiente para
garantir a estrutura dos nós mais internos da árvore, enquanto o CO1 poderia estruturar os nós
mais recentes. Além disso, como o foco do trabalho não são as relações intragenéricas, optou-se
por concentrar esforços e recursos nas espécies que poderiam resolver os relacionamentos
intergenéricos.
8
Esse tipo de estratégia traz como consequência uma matriz com muitos dados ausentes.
Na literatura existe um embate a respeito dos efeitos dos dados ausentes na matriz sobre a
inferência filogenética. De forma geral, acredita-se que os dados ausentes possam diminuir
chance de recuperar a hipótese filogenética correta (para uma revisão sobre o tema vide Wiens &
Moen 2008). Há evidências, no entanto, de que tais efeitos estejam ligados à proporção de dados
ausentes, e não ao número absoluto deles. Em uma simulação com uma matriz de 2000
caracteres, constatou-se que a árvore verdadeira pode ser encontrada mesmo quando metade dos
táxons tenham 90% de dados ausentes (Wiens 2006). Outro estudo, no entanto, constatou que é
importante a distribuição dos dados ausentes, pois a distribuição não aleatória destes pode levar a
recuperação da árvore incorreta (Simmons 2012). Então, como as informações presentes na
literatura eram conflitantes, decidiu-se por fazer dois conjuntos de análises: um com a matriz
completa, com as espécies das duas categorias, daqui para frente denominada ‘COMP’ e outra
com as espécies da segunda categoria (reduzida a uma espécie por gênero), daqui para frente
denominada ‘RED’, com uma proporção menor de dados ausentes.
2.2 Extração do DNA, amplificação e sequenciamento
A extração do DNA, amplificação e sequenciamento dos genes de interesse foi realizada
no laboratório de Diptera da North Carolina State University, chefiado pelo professor doutor
Brian M. Wiegmann.
O DNA foi extraído usando o conjunto DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia,
Estados Unidos) seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante com as seguintes modificações:
as moscas inteiras ou pernas foram individualmente colocadas em lenços de papel para a
evaporação do álcool no qual se encontravam preservadas, e incubadas em proteinase K e buffer
por duas noites; a diluição final foi realizada com 60μl de tampão, a fim de obter DNA genômico
mais concentrado.
As Reações em Cadeia da Polimerase (PCR) foram realizadas usando iniciadores
anteriormente publicados ou desenhados para este estudo (Tabela 2). Todos os iniciadores foram
utilizados na concentração de 10nmol/μl. As reações foram conduzidas usando TaKaRa Ex Taq
(Takara Bio, Shiga, Japão) seguindo as especificações do fabricante, sendo que para o CO1 foi
utilizado 1μl de iniciador e 0,8μl de DNA, e para os genes nucleares 2μl de iniciador, 1μl de
DNA e 2μl de MgCl2, para um volume total de 49μl. A PCR para o CO1 foi efetuada com os
9
seguintes ciclos: iniciação a 95ºC por 5’, desnaturação a 93ºC por 20”, anelamento a 50ºC por
40”, extensão a 72ºC por 2’. O ciclo de desnaturação, anelamento e extensão foi repetido 33
vezes, seguido por um período final de extensão a 72ºC por 5’. Para os genes nucleares, foi
utilizada PCR touchdown, a qual tem o objetivo de minimizar a amplificação de produtos
espúrios através da diminuição sucessiva da temperatura de anelamento (Don et al. 1991). Os
ciclos utilizados foram: iniciação a 94ºC por 4’, desnaturação a 94ºC por 30”, anelamento a 51ºC
por 30”, extensão a 72ºC por 2’. O ciclo de desnaturação, anelamento e extensão foi repetido 4
vezes, seguido por 6 ciclos nas mesmas condições mas com anelamento a 47ºC por 1’,
posteriormente 36 ciclos com anelamento a 42ºC por 20” e extensão a 72ºC por 2’30” e um
período final de extensão a 72ºC por 3’. Os produtos das PCRs dos genes EF1α e CAD tiveram
em muitos casos que ser reamplificados. Nessas ocasiões, os ciclos foram levemente
modificados, sendo a extensão do primeiro ciclo mantida por 1’20” e o segundo ciclo com
anelamento a 45ºC por 30” e extensão a 72ºC por 1’20” repetido 36 vezes. A maior parte das
sequências de CAD foram obtidas através de uma amplificação inicial dos fragmentos 3 e 4,
seguida de uma reamplificação do fragmento 4.
Os produtos da PCR passaram por processo de eletroforese em gel de baixo ponto de
fusão para separação de possíveis amplificações indesejadas. Os produtos foram corados com
solução de brometo de etídio e as bandas de interesse cortadas e purificadas usando o QIAquick
PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, Estados Unidos). Para cada amostra, 1 μl do DNA
purificado juntamente com 4μl de corante passaram novamente por eletroforese, mas em gel de
agarose comum. Os géis foram observados sob luz ultravioleta e o brilho das bandas usado como
uma medida indireta da quantidade de DNA, permitindo adequar a concentração a ser utilizada
na reação de sequenciamento. As pré-reações de sequenciamento foram feitas usando BigDye
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), e em seguida enviadas para o
North Carolina State University Genomic Sciences Laboratory para sequenciamento em ambas
as direções.
As sequências foram editadas usando o programa SEQUENCHER 4.9 (Gene Codes
Corporation, 2009). Para cada sequência, observou-se a concordância entre o cromatograma e os
nucleotídeos, bem como entre as duas fitas complementares. Todas as regiões amplificadas para
cada um dos genes eram compostas exclusivamente por éxons. No total, foram adquiridas 197
sequências e outras 131 foram obtidas no GenBank.
10
2.3 Alinhamento, escolhas dos modelos e outras análises
Para o alinhamento foram utilizadas as configurações padrão do programa MUSCLE
(Edgar 2004), através da plataforma MEGA 6.05 (Tamura et al. 2013), que também foi utilizada
para a visualização e edição dos mesmos. Após o alinhamento pelo programa, foi feita uma
inspeção visual através da tradução para aminoácidos. Os alinhamentos de cada um dos genes
foram concatenados com o programa SequenceMatrix v. 1.7.8 (Vaidya et al. 2010).
Para tentar identificar regiões dos alinhamentos com áreas pouco confiáveis, as quais
podem levar a uma diminuição do sinal filogenético (Tavalera & Castresana 2007), utilizou-se o
programa GBlocks (Castresana 2000). Ele foi criado no intuito de extrair regiões onde o
alinhamento é problemático, pela seleção de blocos conservados. As regiões descartadas
caracterizam-se por blocos contínuos com alto grau de heterogeneidade ou abundância de gaps.
As regiões contíguas aos blocos homogêneos também precisam ser altamente conservadas para
serem mantidas (Castresana 2000). O programa oferece opções para tornar a análise mais ou
menos rigorosa. As opções que a tornam menos rigorosa, e que, portanto, retiram menos sítios do
alinhamento final, são: permitir blocos finais menores, que relaxa, nas pontas do alinhamento, o
número mínimo de sítios conservados contíguos para um bloco ser mantido; permitir gaps nos
blocos finais, que possibilita sequências de comprimentos diferentes, quando há uma ou mais
sequências muito mais curtas do que as demais; e, permitir o relaxamento dos parâmetros de
corte das posições adjacentes aos blocos conservados. Foram testados três conjuntos de
parâmetros: todas as opções para uma análise menos restritiva; apenas as duas primeiras opções;
nenhuma das opções. O programa foi utilizado através de seu servidor online (Castresana 2000,
Tavalera & Castresana 2007).
Além das regiões hipervariáveis, outra característica dos dados que pode trazer efeitos
deletérios sobre a inferência filogenética é a saturação das substituições, que é a presença de
múltiplas substituições nos mesmos sítios, levando a perda do sinal filogenético (Xia et al.
2003). Para testar se os dados apresentam saturação, o programa DAMBE 5.3.74 (Xia 2013) foi
utilizado para gerar gráficos com o número observado de transições e transversões versus a
distância genética corrigida pelo modelo escolhido pelo JModelTest (Darriba et al. 2012) (vide
abaixo). É esperado que o número de transições e transversões aumente com o tempo, mas que o
11
número de transições seja maior que o número de transversões. Quando tal premissa é violada há
evidência de saturação (Simon et al. 1994). Para cada gene foram feitos três gráficos: para as
primeiras e segundas posições dos códons, para as terceiras e todas em conjunto. Como os sítios
sem informação causam ruído nesta análise, o alinhamento teve as pontas cortadas e sequências
muito curtas foram retiradas.
Tanto para a análise pelo critério de máxima verossimilhança (MV) quanto pelas
probabilidades posteriores bayesianas (PPB) é necessário utilizar modelos de substituição dos
nucleotídeos, os quais descrevem taxas de substituição entre as bases nitrogenadas e suas
frequências relativas. A escolha dos modelos é crítica, pois tanto a subparametrização quanto a
hiperparametrização interferem na inferência filogenética. A escolha de modelos que
subestimam as taxas de substituição pode levar à atração de ramos longos (Felsenstein 1978).
Especificamente
na
inferência
pelo
método
bayesiano,
há
evidências
de
que
a
hiperparametrização é menos problemática do que a escolha de modelos muito simples,
especialmente quando estes deixam de levar em conta a variação da taxa de evolução entre os
sítios (Huelsenbeck & Rannala 2004). No entanto, a hiperparametrização pode aumentar o erro
aleatório e diminuir a precisão da análise. Para escolher o modelo que mais adequadamente
explica os dados, existem testes estatísticos, sendo alguns dos mais comuns o critério de
informação de Akaike (AIC) e sua versão corrigida (AICc), e o critério de informação bayesiano
(BIC). O critério de Akaike corrigido é recomendado para matrizes pequenas (Sullivan & Joyce
2005), e por isso não foi utilizado. Os dois testes foram aplicados conforme implementados no
programa JModelTest 2.1.4 (Darriba et al. 2012). No caso dos critérios divergirem na escolha,
utilizou-se o teste de razão de verossimilhança para indicar o modelo mais apropriado.
Considerando que os alinhamentos possuem regiões heterogêneas, é interessante testar
diferentes partições, para separar conjuntos de sítios que possam ter evoluído de formas distintas.
É plausível esperar que diferentes genes sejam heterogêneos sob este aspecto. Assim também, as
posições dos códons podem ter taxas de evolução diferentes, especialmente as das primeiras e
segundas posições em relação as terceiras. Por isso, é preciso decidir como lidar com a
diversidade de processos de substituição, tanto na escolha dos modelos quanto no
particionamento (Sulivan & Joyce 2005). Assim como na eleição dos modelos, é preciso fazer
um balanço, pois o super-particionamento dos dados pode levar a um aumento significativo da
demanda computacional da análise (ao menos para a inferência pela máxima verossimilhança), e
12
a potencialização de erros aleatórios na estimativa dos parâmetros de cada partição (causados
pela diminuição na quantidade de dados disponíveis) (Bradley et al. 2005). Com base nisto e nos
resultados do teste de saturação, optou-se por comparar quatro formas de divisão do
alinhamento, onde todos os genes foram utilizados com todas as posições dos códons, exceto o
CO1, onde indicado: todos os genes juntos (=sem particionamento), daqui por diante referida
como ‘SP’; por gene (=quatro partições), daqui por diante referida como ‘GENE’; por gene com
o CO1 sem as terceiras posições (=quatro partições), daqui por diante referida como ‘CO1s3’;
por gene e também com primeiras e segundas posições separadas das terceiras (=oito partições),
daqui por diante referido como ‘GENE123’.
2.4 Análises filogenéticas
Existem atualmente três critérios principais para a escolha das hipóteses filogenéticas
ótimas: parcimônia (Pa), máxima verossimilhança (MV) e probabilidade posterior bayesiana
(PPB). Não existe na literatura consenso sobre qual critério recupera hipóteses filogenéticas mais
robustas, embora existam evidências de que a parcimônia seja mais suscetível a problemas como
atração de ramos longos (Felsenstein 1978) e dados faltantes (e.g. Dunn et al. 2003). Não há, no
entanto, nenhuma garantia de que algum método possa ser melhor sob todas as circunstâncias, ou
para todos os conjuntos de dados (Lewis 1998). Assim sendo, os três critérios foram utilizados,
em uma espécie de análise de sensitividade (Wheeler 2001), porém, ao invés da congruência
topológica, utilizada na proposta original dessa análise, foi utilizada a congruência de suporte.
Para a inferência de hipóteses filogenéticas pela PPB, o programa MrBayes 3.2.2
(Ronquist et al. 2012) foi utilizado através do portal Cipres (Miller et al. 2010) com o algoritmo
MCMCMC (Metropolis coupled Markov Chain Monte Carlo). Para cada análise foram feitas 2
corridas simultâneas, com 8 cadeias cada por 108 de gerações com um topologia salva a cada
1000 gerações, utilizando as configurações padrão do programa. É praticamente impossível
explorar a totalidade do espaço amostral, e por isso é interessante fazer mais de uma corrida
independente, partindo de pontos aleatórios e distintos do espaço. A convergência entre amostras
(corridas), é um sinal de que o espaço amostral foi satisfatoriamente explorado. A convergência
foi inferida pela comparação do desvio padrão médio e máximo da probabilidade dos clados
(split frequencies), que é um indicativo do grau de similaridade entre as topologias filogenéticas
13
obtidas pelas diferentes corridas. Também foi verificado se o espaço dos parâmetros foi
corretamente explorado (mixing) pela da análise dos gráficos de traço de trajetória (trace plots)
visualizados no programa Tracer 1.6 (Rambaut et al. 2013).
Para verificar se alguma das hipóteses gerada por diferentes esquemas de
particionamento era estatisticamente superior as outras, foi feita uma análise sobre a estimativa
da verossimilhança marginal. Ela pode ser estimada por diferentes métodos, como média
harmônica (Newton & Raftery 1994) e amostragem por “stepping-stone” (Xie et al. 2011).
Embora a média harmônica seja o método mais comumente utilizado, ela possui a tendência de
superestimar a verossimilhança marginal (Xie et al. 2011, Fan et al. 2011). O procedimento de
amostragem por “stepping-stone” foi feito com 1000000 de gerações com amostragem a cada
1000. Os valores de verossimilhança marginal resultantes das duas análises foram comparadas
pelo cálculo dos fatores de Bayes (Bayes factors), que é simplesmente a divisão do valor de
verossimilhança marginal de uma partição (P1) pelo valor de uma partição alternativa (P0)
(Nylander et al. 2004). O valor resultante pode ser interpretado de acordo com uma tabela, onde
fatores de Bayes maiores do que 20 indicam evidência forte e maiores do que 150 evidência
muito forte contra P0 (Kass & Raftery 1995).
Para a análise de máxima verossimilhança utilizou-se o programa Garli 2.0 (Zwickl
2006), com 50 buscas independentes nas opções padrão, exceto pelo valor de melhora da
verossimilhança nas últimas 20000 gerações necessário para encerrar a busca corrente
(scorethreshforterm = 0,01), e pelo controle de quais árvores terão os comprimentos de ramos
extensivamente otimizados (treerejectionthreshold = 100,0). Para recobrar uma noção de
convergência também para a máxima verossimilhança, tentou obter-se a mesma topologia
filogenética em pelo menos duas análises distintas. Assim, cada análise foi rodada no mínimo
duas vezes, e no máximo quatro. Quando a convergência não foi alcançada, utilizou-se a árvore
com maior valor de verossimilhança. Como medida de suporte dos nós utilizou-se o bootstrap
não paramétrico (Felsenstein 1985). As buscas foram feitas com 1000 pseudo-réplicas sob as
condições padrão do servidor on-line do Garli (Bazinet & Cummings 2011). O processamento
das pseudo-réplicas e mapeamento dos valores de bootstrap na melhor árvore foi feita com o
programa DendroPy 3.12 (Sukumaran & Holder 2010).
14
A análise de parcimônia foi conduzida pelo programa TNT 1.1 (Goloboff et al. 2008),
com new technology search com os seguintes algoritmos: sectorial search (Goloboff 1999),
ratchet (Nixon 1999) e tree drifting (Goloboff 1999), todos com as configurações padrão e tree
fusing (Goloboff 1999) com 100 rodadas. A combinação destes algoritmos permite ao programa
sair de possíveis ilhas de topologias filogenéticas subótimas. A análise de bootstrap com 1000
replicações foi feita sob as mesmas condições, a exceção do tree fusing, que foi utilizado sem
modificação das configurações padrão. Para o cálculo dos valores de bootstrap das matrizes
completas, não foi utilizado o algoritmo sectorial search, já que este causava um erro na análise.
Os resultados foram mapeados sobre o consenso estrito das árvores mais parcimoniosas com o
programa DendroPy. Os gaps foram interpretados como dados faltantes. Os esquemas de
partição não são aplicáveis à Pa, por isso as foram conduzidas análises apenas com todas as
posições dos códons e sem as terceiras posições do CO1.
Todas as árvores foram enraizadas entre Fannia canicularis e os demais táxons terminais,
e graficamente manipuladas usando o programa FigTree 1.4 (Rambaudt & Drummond 2012).
2.5 Estimativa dos tempos de divergência
Os tempos de divergência entre as linhagens de Muscidae foram calculados através do
programa BEAST 1.7.5 (Drummond et al. 2012) através do portal Cipres. O arquivo com os
dados e comandos foi criado através da interface gráfica BEAUTi 1.7.5 (Drummond et al. 2012).
Da mesma maneira que na inferência da hipótese filogenética pelo método bayesiano, verificouse se o espaço dos parâmetros foi corretamente explorado através da análise dos traços de
trajetória. Como os genes podem ter taxas de evolução distintas, e dentre as análises
particionadas o esquema ‘GENE’ foi um dos que obteve melhores resultados com a PPB (vide
Resultados e Discussão), optou-se por fazer as análises com o BEAST utilizando-se este
esquema de particionamento. Os modelos de substituição das partições foram considerados
individualmente (unlinked), assim como o modelo do relógio molecular relaxado, enquanto a
árvore foi considerada única para o conjunto de partições (linked). Para todas as partições foi
utilizado o modelo GTR+Ι+Γ. O modelo a priori para a distribuição das árvores e dos
comprimentos de ramos escolhido foi o birth-death incomplete sampling (Stadler 2009), e a
árvore inicial foi aleatória. Este modelo, que conta com taxas constantes de especiação e
15
extinção, considera que a amostragem do grupo não é completa (Stadler 2009). Foi utilizado um
modelo de relógio molecular relaxado para acomodar a heterogeneidade entre as linhagens, mais
especificamente, o modelo escolhido foi o uncorrelated log-normal, que de forma geral tem
performance superior em relação a versão exponencial do mesmo modelo (Drummond et al.
2006). Foram utilizados três pontos de calibração com distribuição log-normal a priori para
acomodar as idades estimadas dos fósseis conhecidos para o grupo sob estudo: 1)
Protoanthomyia minuta Michelsen, 2000, designado para o clado dos Anthomyiidae, encontrado
no depósito de âmbar báltico com idade estimada 42 MA (Michelsen 2000); 2) Archaeopolietes
tertiaria Pont & Carvalho, 1996, do âmbar dominicano, que tem idade estimada entre 15-20 MA
(Pont & Carvalho 1996, Iturralde-Vinent & MacPhee 1996); 3) Phaonia electrica Pont &
Carvalho, 1996, com as mesmas características do último. As seguintes configurações foram
utilizadas: para os Anthomyiidae, média de log 2,565, desvio padrão de log 0,357 e offset de 42,
equivalente a uma média e 55 MA e 95% da densidade a priori até 65,01 MA; e para os dois
Muscidae média e offset de 15 MA, desvio padrão de 0,421, resultando em uma mediana de
28,73 MA e 95% da densidade a priori em até 42,44 MA com a opção mean in real space. Um
quarto ponto de calibração foi utilizado, para todo o grupo (equivalente ao parâmetro
treemodel.rootheight), com distribuição normal a priori baseada na idade estimada para a
divergência do clado de Fanniidae, Muscidae, Anthomyiidae e Oestroidea por Wiegmann et al.
(2011). A média utilizada foi de 53 MA com desvio padrão de 5,3, resultando em 95% da
densidade a priori até 58,76 MA. Cada análise foi rodada duas vezes, e os arquivos de árvores
foram combinados e processados no DendroPy, com as primeiras 25000 árvores descartadas. As
árvores finais foram visualizadas no programa FigTree.
3. Resultados
3.1 Análises preliminares
As análises com os três esquemas do GBlocks resultaram em alinhamentos concatenados
com comprimento de 2472, 2141 e 1284 pares de bases, do menos restritivo para o mais
16
restritivo. Como os alinhamentos deste trabalho são bastante conservados, o programa limitou-se
a cortar as pontas, que tornam-se alvos pela sua concentração de dados ausentes. Análises
experimentais demonstraram que a resolução das topologias filogenéticas piorou conforme
menos dados foram disponibilizados, tendência também encontrada em estudos de simulação, ao
menos para a máxima verossimilhança (Castresana 2000, Tavalera & Castresana 2007). Por isso,
optou-se por fazer as análises finais com o alinhamento resultante do conjunto de opção menos
restritivas do Gblocks, com 2472 sítios. Destes, 465 são do AATS (92% do comprimento
original), 730 do CAD (83% do original), 620 do EF1α (86% do original) e 656 do CO1 (78% do
original). A matriz contém 148 espécies, 2472 caracteres e uma proporção de 48% de dados
ausentes. A matriz reduzida contém 67 espécies, 2472 caracteres e 27% de dados ausentes.
Os gráficos de saturação não conseguiram demonstrar claramente se há ou não saturação,
a exceção do EF1α, que não apresenta saturação, já que transversões e transições aumentaram
linearmente em relação a distância genética, e com um número maior de transições, indicando
ausência de saturação (Salemi 2009). Por isso, optou-se por fazer análises experimentais sem as
terceiras posições dos genes, as quais resultaram em topologias filogenéticas com resolução
muito baixa, e por isto foram descartadas do trabalho. Foi mantida apenas a análise sem as
terceiras posições do CO1, já que este revelou uma quantidade superior de transversões, uma das
características de genes saturados.
A busca pelos melhores modelos de substituição para cada bloco de dados resultou em
grande parte no modelo GTR+Ι+Γ, que possui o maior número de parâmetros entre os modelos
analisados (Tabela 4), mesmo com a punição sobre a adição de parâmetros utilizada tanto pelo
AIC quanto pelo BIC. Quando o teste de razão de verossimilhança foi utilizado para escolher
entre modelos apontados por diferentes abordagens, o modelo com menos parâmetros foi sempre
preferido. A fórmula do teste [2(lnL1 – lnL0)] envolve o valor de verossimilhança dos modelos
sob escrutínio, e a aceitação da hipótese alternativa ocorre, neste caso (onde as hipóteses são
aninhadas), quando o resultado converge com a distribuição do Χ2. Ou seja, a aceitação da
hipótese alternativa depende tanto dos valores de verossimilhança quanto dos graus de liberdade,
e como os valores de verossimilhança resultaram parecidos, aqueles modelos com menos
parâmetros foram preferidos.
17
3.2 Inferência filogenética e estimativa dos tempos de divergência
Estão resumidas, na Tabela 3, as análises realizadas, os seus resultados, e quais
convergiram no sentido utilizado neste trabalho, e quais falharam sob esse aspecto.
Com o critério das probabilidades posteriores bayesianas, todas as análises foram bem
sucedidas em explorar o espaço amostral dos parâmetros, conforme a inspeção visual dos traços
de trajetória (dados não apresentados), com exceção da análise do esquema de particionamento
‘GENE123_COMP’. Adicionalmente, mesmo após 108 gerações com este conjunto de dados, o
desvio padrão das split frequencies não chegou ao valor inferior a 0,01, que indica a
convergência das corridas. O mesmo ocorreu com o ‘CO1s3_RED’ (Tabela 5).
Os valores da verossimilhança marginal estimados pelo método de médias harmônicas
(Tabela 6), quando comparados pelos fatores de Bayes indicaram como melhor esquema de
particionamento o ‘CO1s3’ (Tabela 7). No entanto, é dúbio que o valor deste possa ser
diretamente comparável aos demais. Dentre os esquemas de particionamento com todas as
posições dos códons, ‘GENE123_RED’ e ‘GENE_COMP’ foram os indicados pelo teste. A
estimativa por comparação de verossimilhanças marginais calculadas segundo o procedimento de
“stepping-stone” (Tabela 8), gerou resultados semelhantes, indicando o esquema de
particionamento ‘CO1s3’ como o que melhor explica os dados, e dentre os conjuntos com todas
as posições, ‘GENE123’, tanto para os dados reduzidos quanto os completos (Tabela 9). Em se
tratando das hipóteses filogenéticas com dados reduzidos, apenas a análise de ‘GENE’ recuperou
a monofilia de Muscidae. Já nas hipóteses filogenéticas com os dados completos, apenas a
análise de ‘SP’ recuperou Muscidae como monofilética. As hipóteses filogenéticas resultantes
encontram-se nas Figuras 2-9.
As análises pela máxima verossimilhança com os conjuntos de dados reduzido
convergiram já na segunda análise, exceto pelo esquema de particionamento ‘GENE’, que
convergiu na terceira. Já com o conjunto total a análise de ‘SP’ convergiu na segunda tentativa, e
os outros esquemas de particionamento falharam em convergir, no sentido utilizado neste
trabalho. A análise de ‘CO1s3’ foi a que obteve o maior valor de verossimilhança dentre as
quatro análises, seguida por ‘GENE’. Porém, as diferenças são bastante pequenas e não foram
estatisticamente testadas. Nenhuma análise recuperou Muscidae como monofilética. As hipóteses
filogenéticas resultantes encontram-se nas Figuras 10-17.
18
As duas hipóteses filogenéticas com dados reduzidos produzidas pelo critério da
parcimônia recuperaram Muscidae como monofilética, em contraste com as com os dados
completos. A análise de ‘SP’ resultou em 13 árvores igualmente parcimoniosas com 8866
passos, enquanto ‘CO1s3’ resultou em 8 árvores, com 7054 passos. Com os dados completos, a
análise de ‘SP’ resultou em 11 árvores com 12353 passos, e a ‘CO1s3’ em 28 árvores com 8822
passos. Os consensos estritos de cada análise e os valores de bootstrap encontram-se nas figuras
18-21.
Na análise de tempos de divergência, os dois conjuntos de dados apresentaram bom
mixing, conforme inspeção visual no Tracer. No entanto, os parâmetros prior e posterior
apresentaram baixo valor amostral efetivo na análise com dados reduzidos. Os resultados da
análise reduzida e completa, com as estimativas de tempo dadas pelo intervalo de confiança de
95% estão nas Figuras 22 e 23, respectivamente.
4. Discussão
4.1 Inferência filogenética
Pelo tamanho da matriz era esperado que os dados faltantes não causassem efeitos
deletérios na inferência filogenética pelo método bayesiano (Wiens & Morril 2011), e que a
parcimônia fosse mais afetada (e.g. Dunn et al. 2003). No entanto, comparando a performance
das análises com o conjunto de dados reduzido e completo, percebe-se que as hipóteses
filogenéticas recuperadas no último caso tinham resolução e suporte consideravelmente menor.
Notou-se também nestas análises, que os valores do desvio padrão das split frequencies máximas
ficaram acima de 0,01, indicando que alguns relacionamentos continuavam ambíguos, mesmo
após as 108 gerações. Ainda, a maioria das análises de MV com dados completos não chegou a
convergência, em oposição ao ocorrido com os dados reduzidos. Para se ter uma noção do grau
de resolução nas análises reduzidas e completas, dividiu-se o número de nós com bom suporte
(aqui considerado como probabilidade posterior ≥95% e bootstrap ≥70%) pelo número de
terminais, e percebeu-se que todos os critérios tiveram diminuição da resolução e do suporte,
mas a MV em menor grau. É possível que as análises pelo método bayesiano com dados
19
completos
convergissem
caso
fossem
rodadas
por
mais
gerações,
o
que
seria
computacionalmente muito custoso. A análise do esquema de particionamento ‘CO1s3_COMP’,
por exemplo, caso mantivesse a tendência das últimas 50 milhões de gerações, demoraria mais
170 milhões de gerações par convergir. Assim, como o interesse principal deste trabalho são as
relações entre as principais linhagens, e nãos as intragenéricas, as hipóteses filogenéticas com o
conjunto de dados reduzidos serão as utilizadas para discutir as relações entre os Muscidae, e as
completas apenas para fazer inferências a respeito de alguns gêneros.
A comparação da verossimilhança marginal pelos fatores de Bayes preferiu sempre
esquema de particionamento ‘CO1s3’. No entanto, é provável que este número não seja
comparável aos dos demais esquemas. Se considerarmos apenas os conjuntos de dados com
todas as posições dos códons, o esquema de particionamento preferido foi sempre o com mais
parâmetros, ‘GENE123’, a exceção do teste pelas médias harmônicas para os conjuntos de dados
completos, o qual preferiu ‘GENE’. Os valores recuperados pelas médias harmônicas são
considerados menos confiáveis do que aqueles obtidos pelo procedimento de “stepping-stone”, já
que têm a tendência de superestimar a verossimilhança marginal e escolher modelos mais
complexos (Xie et al. 2011). No presente estudo, os valores encontrados pela média harmônica
são realmente maiores do que os calculados pela amostragem “stepping-stone” (Tabelas 6 e 8), e
no entanto, como visto acima, isto não se refletiu na escolha do modelo mais complexo em todos
os casos. É interessante notar que o esquema de particionamento ‘GENE123’, preferido pelos
fatores de Bayes na maioria das vezes não recuperou Muscidae como um grupo monofilético, e
também não chegou ao desvio padrão das split frequencies abaixo de 0.01. No caso das análises
feitas pelo Garli, comparando-se os valores de verossimilhança, observou-se que aquela com
maior valor foi novamente o esquema de particionamento ‘CO1s3’, seguida de ‘GENE’.
As análises que recuperaram a monofilia de Muscidae foram ‘SP_COMP’ pela PPB,
‘SP_RED’ pela Pa, ‘GENE_RED’ pela PPB, ‘CO1n3_RED’ pela PPB e Pa e ‘CO1n3_COMP’
pela Pa. Diversas análises obtiveram hipóteses filogenéticas nas quais a monofilia de Muscidae
não foi recuperada pela presença de um ou dois terminais entre a raiz (Fannia canicularis) e os
Anthomyiidae, na maioria dos casos Reinwardtia sp. nov. (‘SP_COMP’ pela MV, ‘SP_RED’
pela PPB e MV, ‘GENE123_RED’ pela PPB); mas também Cyrtoneurina geminata
(‘SP_COMP’ pela Pa); Reinwardtia sp nov. e Cyrtoneurina geminata (‘GENE123_COMP’ pela
MV); ou ainda Reinwardtia sp nov. e Potamia littoralis (‘GENE_RED’ pela MV). As demais
20
hipóteses filogenéticas recuperaram Anthomyiidae como um clado inserido na linhagem de
Muscidae. No entanto, todo o conhecimento sistemático e taxonômico corrente leva a crer que o
posicionamento dos gêneros de Anthomyiidae utilizados nesta análise dentro de Muscidae tratase de um artefato, já que a monofilia desta família é amplamente reconhecida, sendo sustentada
por estudos morfológicos e moleculares.
Considerando os sinais conflitantes entre diferentes fontes de evidência, tanto dentre os
testes estatísticos quanto entre estes e o conhecimento sistemático, optou-se por não escolher
uma hipótese filogenética como sendo a melhor, mas sim utilizar a congruência dos suportes da
análise de sensitividade para a discussão taxonômica. Foram utilizadas para fazer o mapeamento
das informações encontradas nas análises as hipóteses filogenéticas que tivessem recuperado a
monofilia de Muscidae, e que tivessem o maior número possível de clados resolvidos, para
facilitar a discussão. Para o conjunto de dados reduzido, o esquema de particionamento ‘GENE’
cumpriu os requisitos, enquanto para o conjunto de dados completos, o esquema de
particionamento ‘SP’, ambas recuperadas pela PPB. Nestas hipóteses filogenéticas foi mapeado
o suporte de todas as outras análises, quando estas apresentavam probabilidade posterior ≥95% e
bootstrap ≥70%. Os dados de ‘CO1s3_RED’ e ‘123GENE_COMP’ analisados pela PPB não
foram adicionados, já que não chegaram a convergência. Alguns clados com suporte superior ao
mínimo eram diferentes em relação aqueles encontrados nas hipóteses filogenéticas escolhidas
para o mapeamento. Nesses casos, foram feitas inserções mostrando os relacionamentos
alternativos para esses clados (Figuras 24 e 25).
Ressalta-se o fato de que as topologias filogenéticas variaram quanto ao posicionamento
de diversos terminais, principalmente aqueles que não ficaram subordinados a clados menores.
Isto refletiu-se na resolução das árvores, que em casos como o ‘CO1s3_COMP’ (Fig. 9) pela
PPB foi extremamente baixa. No entanto, todas as hipóteses filogenéticas com os dados
completos resgataram os três clados principais (conforme Fig. 24), ou subunidades deles, no caso
das topologias filogenéticas de baixa resolução. Ainda, todas as análises apontaram um
relacionamento mais próximo entre o Clado 2 e 3 em relação ao 1, exceto ‘CO1s3_COMP’, que
não possui resolução nos relacionamentos entre os clados principais. No caso das hipóteses
filogenéticas com dados reduzidos, a análise de ‘SP’ pela PPB resgatou o Clado 1 na mesma
linhagem do Clado 3, mas sem bom suporte. Todas as outras análises foram congruentes em
recuperar os três clados principais e seus relacionamentos da mesma forma que a análise com a
21
matriz completa (Tabela 3). As análises pela parcimônia com a matriz reduzida resgataram o
Clado 2 como um agrupamento parafilético em relação ao Clado 3.
4.2 Discussão taxonômica e classificação
Atherigoninae foi a única subfamília de Muscidae que teve a sua monofilia recuperada,
de acordo com a composição de gêneros dos catálogos utilizados como referência. No entanto,
como apenas duas espécies foram utilizadas e seu agrupamento não obteve bom suporte, este
resultado precisa ser visto com cautela. Quanto às tribos, Stomoxyini e Coenosiini foram
recuperadas como monofiléticas, e obtiveram bom suporte nas três análises por inferência
bayesiana. Limnophorini também teve sua monofilia recuperada, com bom suporte em quatro
análises, duas por inferência bayesiana, uma por máxima verossimilhança e outra por parcimônia
(Fig. 24). Da mesma forma, Dichaetomyiini obteve bom suporte de todas as análises realizadas
(Fig. 25c), mas com apenas duas espécies na amostragem, conclusões mais gerais precisam ser
criteriosas.
Apesar desses resultados à primeira vista pouco congruentes com o conhecimento atual
da sistemática de Muscidae, é possível reconhecer grupos monofiléticos mais abrangentes, bem
como relacionamentos propostos por diversos pesquisadores, conforme discussão abaixo. A
Tabela 10 resume a classificação proposta a partir dos resultados encontrados neste trabalho e a
compara com a atual. As diferenças entre as hipóteses de relacionamento entre os principais
grupos de Muscidae de acordo com Hennig (1965), Carvalho (1989) e o encontrado neste
trabalho estão representadas na Figura 26.
Para cada clado discutido, faz-se uma breve discussão a respeito de quais gêneros foram
recuperados como monofiléticos e quais não foram. É preciso deixar claro que o objetivo do
trabalho não foi testar a monofilia dos gêneros, e nem a amostragem era adequada para tanto. No
entanto, os resultados aqui encontrados são relevantes, por ser a primeira vez em que mais de um
representante de determinados gêneros são inclusos em uma filogenia. Em outros casos, foi
utilizada aqui a maior amostragem com dados moleculares para o gênero. Assim, os resultados,
ainda que inconclusivos a respeito da monofilia dos gêneros, podem apontar caminhos para
novos trabalhos.
22
O Clado 1 (Fig. 24) é composto por gêneros tradicionalmente alocados em
Achanthipterinae, Azeliini e Reinwardtiini (Azeliinae), e Muscini e Stomoxyini (Muscinae).
Destes, apenas Stomoxyini, na composição dos catálogos atuais, teve sua monofilia recuperada,
sendo congruente com estudos anteriores (Carvalho 1989, Kutty et al. 2008). Embora o Clado 1
encontre suporte apenas nas análises dos esquema de particionamento ‘SP’ e ‘GENE', ambos
pela PPB, o estreito relacionamento entre Muscini, Stomoxyini e Azeliini (Azeliinae) já havia
sido notado anteriormente por outras filogenias moleculares (Schuehli et al. 2007, Kutty et al.
2008, 2010). Filogenias morfológicas apontaram Muscini como um grupo monofilético (Hennig
1965, Carvalho 1989, Nihei & Carvalho 2007a), assim como Stomoxyini (Carvalho 1989) e
Azeliini (Carvalho 1989, Savage & Wheeler 2004). Porém, características principalmente do
ovipositor longo e a presença de cerda fronto-orbital proclinada e calcar favorecem a monofilia
de um grupo formado por Azeliini e Muscinae (Hennig 1965). Conquanto essa afinidade não seja
suportada por caracteres larvais, há similaridade entre as larvas de Mesembrina e Polietes
(ambos Muscini) e Azeliinae (Skidmore 1985). Justamente estes dois gêneros, juntamente com
Polietina (outro Muscini), foram aqueles que resultaram mais proximamente relacionados com
os Azeliinae (Fig. 24). Considerando a composição aqui encontrada, o Clado 1, portanto,
equivale a Muscinae, com um agrupamento mais amplo que aquele contido no seu conceito
tradicional.
Achanthipterinae é tida como a linhagem irmã dos demais grupos de Muscidae (Hennig
1965, Carvalho 1989), e aqui Achanthiptera rohrelliformis foi recuperada como grupo irmão de
Micropotamia sp. 1. Este relacionamento, embora tenha sido encontrado em diversas análises,
não possui bom suporte. No entanto, Hennig (1965) aponta diversos caracteres comuns entre
Achanthipterinae e Muscinae, a qual ele considera uma linhagem derivada imediatamente após a
primeira. A morfologia larval de Achanthipterinae e Azeliinae é bastante similar, especialmente
de Potamia (Skidmore 1985), o que pode indicar que A. rohrelliformis forme efetivamente um
grupo natural com os Muscinae e Azeliini (Azeliinae).
O posicionamento de Reinwardtia sp. nov. é bastante problemático, conforme visto na
sessão de resultados. Conquanto a sua posição dentre os Muscini (Muscinae) encontre algum
apoio na literatura (Hennig 1965), o mais provável é que a posição encontrada no presente
trabalho seja um mero artefato, e ela forme um agrupamento natural junto ao Clado 2, conforme
estudos baseados em caracteres morfológicos (e.g. Soares 2008). No entanto, os resultados deste
23
trabalho não permitem tirar uma conclusão mais acurada por isso optou-se por classificar o
gênero como Muscidae incertae sedis.
Pont (1986) considerou Ophyra como sinônimo júnior de Hydrotaea. No entanto, a
filogenia obtida neste trabalho sustenta que Ophyra seja gênero irmão de Azelia, enquanto
Hydrotaea encontra-se na base deste clado, mas sem bom suporte (Fig. 24). Com a amostragem
completa, há suporte de duas análises para uma maior proximidade entre Hydrotaea e Drymeia, e
mais uma vez Ophyra e Azelia posicionam-se como gêneros irmãos, na base de Muscinae (Fig.
25a). Assim, os resultados deste trabalho suportam Ophyra como um gênero à parte de
Hydrotaea.
Os seguintes gêneros inclusos no Clado 1 foram recuperados como monofiléticos (Fig.
25a): Drymeia, Hydrotaea, Mesembrina, Polietes, Polietina, Musca e Morellia. Destes, apenas
Polietes e Morellia não têm sua monofila recuperada por hipóteses filogenéticas utilizando dados
morfológicos (Savage & Wheeler 2004, Nihei & Carvalho 2007a). Na sua filogenia de Muscini,
Nihei & Carvalho (2007a) separam um grupo de espécies, composto por M. nigricosta e M.
xanthoptera, que não foi recuperado junto ao restante das espécies do gênero. O mesmo não
ocorreu nos resultados do presente estudo, já que as espécies supra citadas foram encontradas
como espécies irmãs, mas juntamente aos demais representantes de Morellia utilizados no
estudo, todos eles pertencentes a Morellia sensu strictu, de acordo com a delimitação proposta
por Nihei & Carvalho (2007a). A monofilia de Thricops não foi recuperada, pela presença de
Huckettomyia watanabei dentro do gênero. Dasyphora foi recuperado como um agrupamento
parafilético em relação a Sarcopromusca, e Neomyia como polifilético. O relacionamento entre
os gêneros Mesembrina, Polietes e Polietina foi recobrado de duas formas diferentes, e na
literatura há mais suporte para que Polietes seja mais próximo de Mesembrina do que de
Polietina (Skidmore 1985, Nihei & Carvalho 2007a) (Fig. 25a, Quadro 1).
O Clado 2 (Fig. 24) é composto por gêneros alocados nas subfamílias Atherigoninae,
Cyrtoneurininae, Mydaeinae e na tribo Reinwardtiini (Azeliinae). Embora esta linhagem tenha
suporte apenas da análise com o esquema de particionamento ‘GENE’ pela PPB, a afinidade
entre gêneros de Reinwardtiini e Cyrtoneurininae já havia sido apontada por outras filogenias
moleculares (Schuehli et al. 2007, Soares 2008) e investigações morfológicas (Skidmore 1985).
Como Reinwardtia, embora sem bom suporte, está alocada em Muscinae (Clado 1), o Clado 2
24
será denominado Cyrtoneurininae, mesmo com todos os outros gêneros alocados em
Reinwardtiini utilizados nesta análise encontrando-se no Clado 2. Atualmente é consenso que
Cyrtoneurininae, a qual foi constituída por Snyder (1954) e Pont (1972) para agrupar as
linhagens neotropicais com cerdas no anepímero e sem calcar, não constitui uma subfamília
monofilética (Carvalho et al. 1993). Baseado em caracteres larvais, Skidmore (1985) agrupou os
Cyrtoneurininae, Reinwardtiini e gêneros paleotropicais cujas larvas se desenvolvem em
moluscos gastrópodes terrestres (Ochromusca, Aethiopomyia e Alluaudinela), todos alocados em
Dichaetomyiini. Por outro lado, com base em uma filogenia inferida por caracteres morfológicos
de adultos e de biologia das larvas, Couri & Carvalho (2003) propuseram alocar os gêneros de
Cyrtoneurininae em Dichaetomyiini, já que Dichaetomyia, Cyrtoneurina, Cyrtoneuropsis e os
gêneros paleotropicais supracitados formaram um grupo monofilético com Charadrella, gênero
neotropical de Cyrtoneurininae cujas larvas possuem o mesmo hábito malacófago. Esta hipótese
foi recuperada por filogenias baseadas exclusivamente em caracteres de adultos, as quais
incluíram Cariocamyia na mesma linhagem (Soares 2008, Haseyama & Carvalho 2012a). Foi
observado que Cariocamyia maculata Snyder, 1951, uma das duas espécies do gênero, utiliza
gastrópodes terrestres como sítio de criação de imaturos (d´Almeida 1994). É interessante notar
que em diversas análises Cariocamyia e Prohardyia encontram-se no equivalente ao Clado 2,
associados a Cyrtoneuropsis (Figs. 18, 6, 7, 14-16, 20 e 21). Prohardyia, que foi utilizado aqui
pela primeira vez em uma análise filogenética, é tradicionalmente agrupado com outros gêneros
com carena facial que ocorrem na região australiana, ora junto com os Dichaetomyiini (Hennig
1965) ora com os Phaoniinae (Pont 1966). Embora a posição do gênero tenha variado nas
análises, é interessante que por vezes ele tenha se agrupado com Cyrtoneuropsis, já que tanto
este gênero quanto Cyrtoneurina também apresentam carena facial (Haseyama & Carvalho
2012b), naquele trabalho denominada tubérculo facial. Aliando esta evidência à suposição a
respeito da biologia de Cariocamyia, supõe-se que a posição natural destes gêneros seja junto ao
Clado 2. No entanto, devido as evidências conflitantes das diferentes hipóteses filogenéticas,
optou-se por classificar tanto Cariocamyia quanto Prohardyia como Muscidae incertae sedis.
Quanto a Atherigoninae (representada aqui por duas espécies de Atherigona), a
subfamília já foi considerada por Hennig (1965) como um grupo possivelmente relacionado a
Phaoniinae, subfamília que incluía a maior parte dos gêneros atualmente classificados em
25
Reinwardtiini. Da mesma forma, a proximidade entre Atherigoninae e Reinwardtiini já havia
sido apontada através de caracteres larvais (Skidmore 1985).
Alguns relacionamentos entre gêneros encontrados neste trabalho já haviam sido
apontados anteriormente com base em caracteres morfológicos, como Chaetagenia e
Pseudoptilolepis (Schuehli & Carvalho 2005, Soares 2008) e Cyrtoneurina e Cyrtoneuropsis
(Pamplona 1999). Scutellomusca, que foi recuperado com o gênero irmão de Cyrtoneurina e
Cyrtoneuropsis em todas as análises, está atualmente em Mydaeinae (Couri & Carvalho 1992).
Conquanto a posição aqui encontrada possa parecer deslocada, o gênero já foi considerado como
Cyrtoneurininae (Hennig 1965). Hemichlora, outro Mydaeinae (Carvalho et al. 2005) também
foi recuperado dentre os Cyrtoneurininae.
Os seguintes gêneros de Cyrtoneurininae (Clado 2) foram recuperados como
monofiléticos (Fig. 25): Muscina, Atherigona, e dependendo da análise, Philornis e
Pseudoptilolepis. Pseudoptilolepis possui características que deixam poucas dúvidas a respeito
de sua unidade natural (Schuehli & Carvalho 2005). A monofilia de Philornis também foi
recuperada por estudos filogenéticos morfológicos (Couri & Carvalho 2003, Couri et al. 2007,
Soares 2008), tornando a hipótese em que o Gênero Novo aparece na base do clado de Philornis
mais plausível. Este gênero novo possui duas espécies, ambas coletadas em áreas de elevada
altitude no Equador (Carvalho et al., em preparação). Neomuscina pode ser considerado
monofilético com a inclusão de Cyrtoneurina costalis. Espécies de Cyrtoneurina não só se
agruparam com Neomuscina, mas também com Cyrtoneuropsis, em dois clados distintos, e
Atherigona em algumas análises, cenário pouco provável. Cyrtoneuropsis foi recuperado em três
clados distintos. Parece precipitado, no entanto, afirmar que Cyrtoneurina e Cyrtoneuropsis
sejam polifiléticos. Quanto a Cyrtoneurina, a posição de C. costalis dentre Neomuscina e C.
alifusca dentre Cyrtoneuropsis são bem suportadas, mas é preciso uma inspeção morfológica
para afirmar se estas espécies podem ser realocadas ou se os gêneros precisam ser reavaliados. Já
C. geminata mudou diversas vezes de posição nas análises, e sua posição é incerta. No que diz
respeito a Cyrtoneuropsis, na maioria das análises foram observados três agrupamentos, dois no
equivalente a Cyrtoneurininae e outro, com C. conspersa, C. fuscicosta e C. gemina na base de
Muscidae. O posicionamento deste último grupo não possui suporte, e provavelmente ele
pertence Cyrtoneurininae também. É interessante notar que todas as espécies de Cyrtoneuropsis
utilizadas neste trabalho que possuem ovipositor encurtado e com espinhos fortes foram
26
agrupadas (C. multomaculata, C. pararescita, C. neotrita, C. protosetosa, C. similata e C. nisae),
a espelho de filogenias morfológicas (Pamplona 1999, Haseyama & Carvalho 2012b). É
possível, portanto, que este constitua um gênero a parte, mas não se pode descartar a
possibilidade de que a separação destes grupos seja apenas um efeito da amostragem.
O Clado 3 é composto por gêneros alocados nas subfamílias Cyrtoneurininae,
Phaoniinae, Mydaeinae e Coenosiinae (Fig. 24), e pela lei da prioridade será denominado
Mydaeinae. Mais uma vez, embora as diferentes análises não suportem este relacionamento
encontrado analisando o esquema de particionamento ‘GENE_RED’, o estreito relacionamento
entre Phaoniinae, Mydaeinae e Coenosiinae já havia sido recuperado anteriormente com base em
dados moleculares (Schuehli et al. 2007, Kutty et al. 2008, 2010). A proximidade entre estas
subfamílias já havia também sido indicada também por análises filogenéticas morfológicas
(Hennig 1965, Carvalho 1989). Conforme discutido anteriormente, é possível que Cariocamyia e
Prohardyia sejam Cyrtoneurininae (Clado 2). Dolichophaonia em nenhuma análise entrou em
algum clado subordinado, à exceção da análise do esquema de particionamento ‘SP_COMP’ pela
parcimônia (Fig. 20), onde o gênero encontra-se em um agrupamento com Hebecnema,
Hemichlora e Psilochaeta. Dolichophaonia foi descrito em Phaoniinae, e indicou-se que estaria
proximamente relacionado a Phaonia (Carvalho 1993), e, posteriormente, Vockeroth (1996)
sinonimizou os dois gêneros. Nenhuma das propostas é congruente com os resultados deste
trabalho, já quem em nenhuma análise os gêneros formaram um grupo monofilético. Apenas
duas outras filogenias utilizaram espécies de Dolichophaonia, e nenhuma delas com amostragem
representativa de outros Phaoniinae (Couri & Carvalho 2003, Soares 2008), dificultando uma
análise mais aprofundada a respeito do posicionamento aqui encontrado para o gênero. Por esse
motivo, optou-se por classificar Dolichophaonia como Mydaeinae incertae sedis.
Os Mydaeinae (Clado 3), podem ser subsequentemente divididos em unidades coesas. O
Clado 3a é composto por gêneros de Mydaeinae, Phaoninae e Dichaetomyiini, e será
denominado Mydaeini, já que Mydaea encontra-se nele. Assim como nas publicações de Kutty et
al. (2008, 2010), membros das duas subfamílias encontraram-se combinados em uma única
linhagem. Pela primeira vez uma espécie de Dichaetomyiini foi incluída em uma filogenia
molecular, e os resultados favorecem a hipótese de que Dichaetomyiini é uma linhagem
relacionada a Phaoniinae (Skidmore 1985), e não a Cyrtoneurininae. O posicionamento de
Hebecnema em Mydaeini não possui bom suporte, mas a relação entre Mydaea, Helina, Phaonia
27
e Dichaetomyia tem bom suporte em todas as análises pela inferência bayesiana e em duas pela
máxima verossimilhança.
O Clado 3b1 é composto por alguns Mydaeinae e pelos Limnophorini e é equivalente a
Limnophorini, já que Limnophora se encontra nele. Skidmore (1985) já havia apontado que a
diferenciação entre Mydaeinae e Limnophorini é arbitrária, e que Graphomya pertence aos
Limnophorini. Villeneuvia foi recuperado entre os Coenosiini (Fig. 25), contrariando as hipóteses
de posicionamento dentre os Limnophorini (Hennig 1965, Skidmore 1985, Kutty et al. 2008,
2010). A monofilia de Limnophorini (Clado 3b1) é apoiada pelo suporte de duas análises pela
inferência bayesiana.
O Clado 3b2 é composto exclusivamente por gêneros de Coenosiini, uma linhagem cuja
monofilia é bem estabelecida com base em caracteres morfológicos (Hennig 1965, Carvalho
1989, Couri & Pont 2000). O suporte para os Coenosiini vem de todas as análises pela inferência
bayesiana. A presente análise, além de recuperar a monofilia da tribo, também é congruente com
os dois grandes grupos separados por Hennig (1965) e posteriormente recuperados por uma
filogenia morfológica (Couri & Pont 2000): o grupo Lispocephala, aqui composto por este
gênero, Pygophora e Orchisia, e o grupo Coenosia, com os demais.
Os seguintes gêneros de Mydaeinae (Clado 3) foram recuperados como monofiléticos:
Myospila, Mydaea e Dichaetomyia. As espécies de Cordiluroides e Neodexiopsis encontram-se
em um clado sem resolução, por isso nenhuma inferência pode ser feita. Outros gêneros, como
Coenosia, Phaonia, Helina e Limnophora são agrupamentos especiosos, amplamente
distribuídos e longamente reconhecidos como unidades não naturais (e.g. Hennig 1965,
Skidmore 1985, Couri & Carvalho 2002), à exceção do último, considerado monofilético por
Hennig (1965).
4.3 Tempos de divergência
Nota-se que os tempos de divergência obtidos pela análise reduzida e completa não são
idênticos. Embora sob um ponto de vista teórico fosse esperado que a inferência pelo método
bayesiano diminuísse este efeito da amostragem sob as inferências (Heath et al. 2008), estudos
empíricos constataram o contrário (Linder et al. 2005). Estudos anteriores também constataram
28
que idades mais antigas foram recuperadas quando comparadas análises com menos terminais
(Yoder & Yang 2004, Linder et al. 2005). Assim, as inferências feitas a partir da amostragem
completa serão a referência para a discussão que segue.
A idade de Muscidae foi estimada entre 50 a 60 MA (Fig. 27), correspondente a um
período entre o Paleoceno superior e o Eoceno inferior, mais recente do que as estimativas
baseadas na distribuição da família, entre o Cretáceo inferior e superior (Hennig 1965, Couri &
Carvalho 2003). Vários recursos utilizados por diferentes linhagens já estavam disponíveis no
Paleoceno superior, possibilitando o uso de diversos nichos e a radiação dos Muscidae. A
maioria dos imaturos de muscídeos é de alguma forma saprófago, sejam carnívoros, não
carnívoros ou coprófagos (Skidmore 1985). No entanto, hábitos mais especializados são também
encontrados (Skidmore 1985): as larvas de Eginiini são parasitas de Diplopoda; as de gêneros
como Cariocamyia, Charadrella, Ochromusca, Alluaudinella e Aethiopomyia se desenvolvem
em Gastropoda terrestres; a fitofagia é registrada em algumas larvas de Atherigona; as de
Limnophorini são predadoras em ambientes aquáticos; as de Philornis e Passeromyia vivem
associadas a pássaros ou seus ninhos. No caso de Philornis, são tanto encontradas larvas
coprófagas, semi-hematófagas e hematófagas subcutâneas que habitam os ninhos de seus
hospedeiros, quanto hematófagas subcutâneas (Couri et al. 2007). Quanto aos Muscidae adultos,
a maioria é saprófaga, mas são encontradas espécies antófilas (algumas espécies de Graphomya),
hematófagas (alguns Muscinae) e predadores de outros insetos (Coenosiini e Limnophorini)
(Skidmore 1985).
As três principais linhagens de Muscidae, conforme definidas neste trabalho, Muscinae,
Cyrtoneurininae e Mydaeinae divergiram aproximadamente entre 50 e 35 MA. Nesta época, os
continentes do sul ainda estavam conectados através da Antártica, provendo uma possível rota de
intercâmbio. Estima-se que Austrália e América do Sul mantiveram conexão via Antártica até
cerca de 32 MA, enquanto a África isolou-se destes muito antes, tendo completado a sua
desconexão da América do Sul há cerca de 105 MA (McLoughlin 2001). Adicionalmente,
embora o Istmo do Panamá ainda estivesse submerso, o que viria a ser as Grandes Antilhas
provia uma rota de expansão de área para a biota entre o norte e o sul do continente americano
no fim do Eoceno, entre 33 e 35 MA (Antonelli & Sanmartín 2011). Durante o Cenozóico, uma
série de transformações ocorreram na geologia da região Neotropical, sendo a formação dos
Andes uma das mais impactantes. A cordilheira teve um longo período de soerguimento, que
29
começou no sul e se estendeu para o norte até 2,5 MA (Hoorn et al. 2010). O surgimento da
cordilheira, que se intensificou a partir do final do Eoceno, há 34 MA, criou nichos totalmente
novos ao longo da cadeia em si, mas também provocou diversas mudanças no clima do
continente e criou novos ambientes (Antonelli & Sanmartín 2011). Estes eventos, entre outros,
como a formação do mar amazônico ocorrida há cerca de 10 MA (Webb 1995), provavelmente
promoveram diversos eventos de isolamento dentre as espécies de Muscidae da região, e
posteriormente a sua divergência, já que até cerca de 10 MA a maior parte dos gêneros de
presentes nesta análise já haviam divergido. Eventos de divergência entre espécies continuaram
acontecendo até menos de 1 MA, podendo ser explicados por fenômenos ainda mais recentes,
como eventos de glaciação ocorridos ao longo do Pleistoceno.
O cenário de evolução espacial e temporal sugerido pelos resultados deste trabalho é bem
diverso daqueles anteriormente propostos para a família. Para Hennig (1965), os muscídeos
teriam se originado no hemisfério norte, e se dispersaram até a América do Sul em épocas
diferentes, o que seria evidenciado pela presença no continente de espécies pertencentes a
linhagens diferentes. Os relacionamentos encontrados neste trabalho são compatíveis com a
hipótese de múltiplas invasões, já que as linhagens sul-americanas não formam um grupo
monofilético. No entanto, os relacionamentos encontrados, bem como os tempos de divergência,
sugerem que além de processos de expansão de área pelo norte do continente, as trocas com a
Australásia pelo sul foram igualmente importantes na formação da biota dos muscídeos da
América do Sul. Da mesma forma, o tempo de divergência encontrado entre Muscidae e
Anthomyiidae não é congruente com o cenário biogeográfico proposto por Couri & Carvalho
(2003), em que a evolução espacial de Muscidae teria sido afetada pela quebra do Gondwana,
incluindo a separação da África do restante das massas continentais do hemisfério sul. Os autores
propuseram esta narrativa baseados no relacionamento próximo encontrado entre gêneros
endêmicos da região neotropical e da paleotropical em dois clados distintos. Os idades aqui
encontradas são congruentes apenas com um cenário em que Muscidae é afetado parcialmente
pela quebra do Gondwana, na separação entre América do Sul, Antártica e Austrália.
A divergência da linhagem de Muscinae, Clado 1 (Fig. 24), foi estimada entre 50 a 37
MA, a mais antiga dentre as três principais. Os Muscinae hematófagos (aqui representados por
Haematobosca, Neivamyia, Rhinomusca e Stomoxys) tiveram a divergência estimada entre 31 e
18 MA, condizente, mas um pouco mais restrita do que aquela estimada pelo estudo específico
30
da tribo, entre 40 e 22 MA (Dsouli et al. 2011). Conforme visto acima, existem poucas
associações específicas conhecidas para Muscidae, sendo a associação entre Rhinomusca e os
rinocerontes africanos uma interessante exceção, onde os imaturos se desenvolvem em fezes dos
rinocerontes, e os adultos sugam o sangue dos mesmos (Skidmore 1985). Rhinocerotidae, família
a qual os rinocerontes pertencem, divergiu de Tapiridae (antas) entre 49 e 54 MA (Steiner &
Ryder 2011). No entanto, a associação com Rhinomusca é apenas conhecida para as espécies
africanas, Ceratotherium simum (Burchell, 1817), o rinoceronte branco e Diceros bicornis
(Linnaeus, 1758), o rinoceronte negro. A divergência entre os rinocerontes de Sumatra e a
linhagem destas espécies foi estimada entre 30 e 19 MA (Steiner & Ryder 2011), enquanto a
divergência entre Neivamyia flavicornis e Rhinomusca dutoiti foi estimada entre 26,5 e 13,5 MA.
Assim, existe compatibilidade entre o surgimento do recurso e a divergência de Rhinomusca.
A idade dos Cyrtoneurininae, equivalente ao Clado 2 (Fig. 24) foi estimada entre 49 e 37
MA. Este clado contém principalmente gêneros neotropicais, mas também contém Atherigona,
um gênero essencialmente paleotropical, e Muscina, essencialmente holoártico. Dentre as
linhagens da América do Sul recuperadas neste clado, encontra-se o Gênero Novo, com
distribuição na porção equatoriana dos Andes, e cuja divergência foi estimada entre 21 e 3 MA.
É possível, então que a formação dos Andes esteja relacionada a diversificação desta linhagem.
No cronograma recuperado, algumas espécies de Cyrtoneuropsis, Cariocamyia e Prohardyia
encontram-se em um clado à parte dos Cyrtoneurininae, mas é interessante como a relação entre
estes gêneros foi mais uma vez recuperada. A divergência entre Prohardyia e os Cyrtoneuropsis
foi estimada entre 39 e 23 MA, período em que as regiões australasiana, onde Prohardyia ocorre,
e neotropical, onde Cyrtoneuropsis ocorre, ainda estavam conectadas via Antártica.
Mydaeini, o Clado 3a (Fig. 24) teve a divergência estimada em 39 a 27 MA, e
corresponde possivelmente à radiação mais recente dentre as principais linhagens Muscidae. A
linhagem de Limnophorini, equivalente ao Clado 3b1 teve a idade estimada em 42-30 MA, e
aquela equivalente ao clado 3b2 teve a idade estimada em 40-28 MA. Os membros dos clados
supra citados não possuem ligações ecológicas específicas conhecidas que permitam discutir as
implicações das datações inferidas. No entanto, é interessante notar que os Coenosiini
neotropicais formaram um clado (exceto por Bithoracochaeta calopus) com divergência bastante
recente (entre 21 e 10 MA). Porém a amostragem e o suporte indicam que tais resultados devam
ser vistos com cautela.
31
5. Considerações finais
Apesar das diferenças entre as hipóteses filogenéticas geradas por diferentes critérios e
tratamentos dos dados, os três principais clados, Muscinae, Cyrtoneurininae e Mydaeinae foram
encontrados em praticamente todas as análises (16 de um total de 18 análises que convergiram),
dando maior confiança aos relacionamentos encontrados. Os relacionamentos aqui recuperados
encontram suporte em hipóteses dos principais trabalhos com a filogenia e morfologia de
Muscidae, tanto com adultos (Hennig 1965, Carvalho 1989), quanto imaturos (Skidmore 1985).
Apesar dos esforços empregados, a dificuldade na obtenção de larvas e ovos faz com que
diversos gêneros possuam pouca ou nenhuma informação a esse respeito. Quando estão
disponíveis, por vezes os caracteres de diferentes semaforontes são conflitantes. Isto não é
nenhuma surpresa, já que até mesmo dentro de um mesmo estágio de desenvolvimento estados
de caracteres indicando diferentes relacionamentos são comuns. No entanto, a falta de estudos
detalhados em morfologia larval pode estar ofuscando caracteres relevantes sob um ponto de
vista filogenético. Recentemente, estudos usando microscopia óptica e eletrônica de varredura
esclareceram detalhes das estruturas de algumas espécies (Grzywacz 2013, Grzywacz et al.
2013), mas ainda há grande diversidade a ser estudada até que qualquer uso filogenético possa
ser feito destes avanços. Apesar destas dificuldades, ressalta-se que os relacionamentos aqui
encontrados levam a crer que uma estimativa robusta da filogenia de Muscidae a partir de dados
morfológicos precisará tanto de caracteres de adultos quanto de imaturos, conforme apontado
anteriormente por Carvalho (1989).
Os resultados apresentados iluminam algumas questões tanto a respeito das relações
filogenéticas quanto dos tempos de divergência de Muscidae. Mas também geram questões, cujas
respostas dependem da inclusão de outros táxons terminais, como os gêneros cujas larvas se
desenvolvem em Gastropoda. Também seria interessante a inclusão de espécies de Eginiini, cujo
posicionamento em Muscidae ainda não possui suporte filogenético. Da mesma forma, assim
como este trabalho expandiu o número de terminais neotropicais incluídos na filogenia da
família, é preciso também trabalhar para expandir a representação das linhagens paleotropicais e
australasianas, o que seria de grande utilidade para inferências a respeito da evolução espacial de
Muscidae. Além disso, uma análise biogeográfica é necessária para explorar mais eficientemente
32
os resultados da análise dos tempos de divergência. Apesar da ausência desses táxons, a
amostragem utilizada neste trabalho é a mais abrangente e completa utilizada até o momento
para a família, e a filogenia resultante poderá ser utilizada como base para estudos filogenéticos
mais específicos. Da mesma forma, a hipótese a respeito dos relacionamentos e os tempos de
divergência aqui recuperados poderão servir de base para estudos biogeográficos que possam
fazer inferências mais realistas a respeito dos processos que influenciaram a evolução de
Muscidae, levando em conta o fator temporal.
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41
Tabelas
Tabela 1. Sequências utilizadas e número e acesso ao GenBank. As sequências obtidas durante este trabalho ainda não foram publicadas, e por isso os número de acesso estão
representados por um asterisco. As localidades de coleta estão listadas apenas para as sequências adquiridas durante este trabalho. A classificação segue Pont (1980, 1986), Carvalho
et al. (2005) e Evenhuis (2014). As espécies utilizadas na amostragem reduzida estão indicados em negrito. Códigos da distribuição: Au = australasiana; Co = cosmopolita; Na =
neártica; Nt = neotropical; Or = Oriental Pa = paleártica; Pt= paleotropical.
*Comprimento total, em pares de base
Família
Sufamília
Tribo
Espécie
Anthomyiidae
Anthomyiinae
Anthomyiini
Botanophila fugax (Meigen, 1826)
Anthomyiidae
Anthomyiinae
Anthomyiini
Anthomyiidae
Anthomyiinae
Anthomyiini
Localidade de
coleta / distribuição
PB*
AATS
CAD
EF1α
CO1
-
-
FJ025665
-
KC178314
KC178409
-
-
551
-
-
GQ409461
-
Na, Pa
1921
-
EF531164
FJ025677
EF531194
Pa
563
Delia radicum (Linnaeus, 1758)
Na, Pa
1195
Eutrichota paratunicata (Hennig,
1973)
Pa
Anthomyiidae
Anthomyiinae
Anthomyiini
Hydrophoria lancifer (Harris, 1780)
Anthomyiidae
Anthomyiinae
Anthomyiini
Hylemya vagans (Panzer, 1798)
Pa
619
-
-
FJ025681
-
Anthomyiidae
Anthomyiinae
Anthomyiini
Hylemya variata (Fállen, 1823)
Na, Pa
619
-
-
FJ025682
-
Anthomyiidae
Anthomyiinae
Anthomyiini
Lasiomma latipenne (Zetterstedt, 1838)
Na, Pa
466
-
-
FJ025683
-
Anthomyiidae
Anthomyiinae
Anthomyiini
Lasiomma seminitidum Zetterstedt,
1845)
Pa
1179
-
-
DQ657112
JX438037
Co
1921
-
1606
*
-
*
*
2466
*
*
*
*
653
-
-
-
*
609
-
-
*
-
Na, Pa
1495
-
FJ025572
FJ025669
FJ025608
Pa
1743
-
FJ025573
FJ025670
FJ025609
Fanniidae
-
-
Fannia canicularis (Linnaeus, 1761)
Muscidae
Achanthipterinae
-
Achanthiptera rohrelliformis
(Robineau-Desvoidy, 1830)
Muscidae
Atherigoninae
-
Atherigona oryzae Malloch, 1925
Brasil: Feira de
Santana / Na, Nt,
Pa, Pt
Japão: Tóquio /
Au, Or, Pa
Azelia nebulosa (Robineau-Desvoidy,
1830)
Alemanha:
Schöngeising / Pa
Atherigona orientalis Schiner, 1868
Muscidae
Muscidae
Atherigoninae
Azeliinae
Azeliini
Portugal:
Candeeiro / Pa
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Drymeia alpicola (Rondani, 1871)
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Drymeia hamata (Fállen, 1823)
EF531184
AJ871202
EF531197
42
Família
Muscidae
Muscidae
Sufamília
Azeliinae
Azeliinae
Tribo
Azeliini
Espécie
Localidade de
coleta / distribuição
PB*
AATS
CAD
EF1α
CO1
Huckettomyia watanabei Pont &
Shinonaga, 1970
Japão: Montanhas
Daietsu / Pa
2286
*
*
*
*
Hydrotaea dentipes (Fabricius, 1805)
Japão: Montanhas
Daietsu / Na, Nt,
Or, Pa
1856
*
FJ025579
FJ025679
FJ025623
Pa
1865
-
FJ025580
FJ025680
FJ025624
Brasil: Manaus / Nt
2471
*
*
*
*
1308
-
FJ025598
-
FJ025654
Azeliini
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Hydrotaea irritans (Fállen, 1823)
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Micropotamia sp. 1
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Potamia littoralis Robineau-Desvoidy,
1830
Na, Or, Pa
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Thricops aculeipes (Zetterstedt, 1838)
Pa
612
-
-
FJ025699
FJ025660
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Thricops cunctans (Meigen, 1826)
Pa
1682
-
FJ025600
FJ025700
FJ025661
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Thricops diaphanus (Wiedemann,
1817)
Na, Ne, Pa
1683
*
*
-
*
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Thricops genarum (Zetterstedt, 1838)
Pa
1210
-
-
FJ025701
FJ025662
Muscidae
Azeliinae
Azeliini
Thricops nigritellus (Zetterstedt, 1838)
Pa
1072
-
-
FJ025792
FJ025663
Muscidae
Azeliinae
Reinwardtiini
Muscidae
Azeliinae
Chaetagenia stigmatica Malloch, 1928
Brasil: Antonina /
Nt
1697
*
-
*
*
Muscina angustifrons (Loew, 1858)
Japão: Tóquio / Or,
Pa
1842
*
*
-
*
Na, Nt, Pa
1165
-
-
FJ025688
FJ025638
Japão: Tóquio / Or,
Na, Pa
1121
*
-
-
*
Reinwardtiini
Muscidae
Azeliinae
Reinwardtiini
Muscidae
Azeliinae
Reinwardtiini
Muscina levida (Harris, 1780)
Muscina pascuorum (Meigen, 1826)
Muscidae
Azeliinae
Reinwardtiini
Muscina stabulans (Fállen, 1817)
Co
1922
-
EF531167
FJ025689
EF531210
Muscidae
Azeliinae
Reinwardtiini
Philornis blanchardi Garcia, 1984
Nt
1264
-
-
AJ605068
AJ617699
Muscidae
Azeliinae
Reinwardtiini
Philornis downsi Dodge & Aitken
1968
Brasil: Manaus / Nt
641
-
-
-
*
Philornis falsificus Dodge & Aitken
1968
Brasil: Manaus / Nt
656
-
-
-
*
Philornis niger Dodge & Aitken 1968
Brasil: Manaus / Nt
648
-
-
-
*
Muscidae
Muscidae
Azeliinae
Azeliinae
Reinwardtiini
Reinwardtiini
43
Família
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Sufamília
Azeliinae
Azeliinae
Azeliinae
Azeliinae
Coenosiinae
Coenosiinae
Tribo
Reinwardtiini
Reinwardtiini
Espécie
Reinwardtia sp. nov.
Equador:
Cajanuma
1062
*
-
*
-
Synthesiomyia nudiseta (Wulp, 1883)
Brasil: Feira de
Santana / Nt, Pa, Pt
1780
*
*
Bithoracochaeta calopus (Bigot, 1885)
Brasil: Curitiba –
Nt
2431
*
*
*
*
539
-
-
-
FJ025605
1124
-
FJ025770
-
FJ025606
-
-
AJ879590
Coenosia testacea (RobineauDesvoidy, 1830
Coenosiini
Cordiluroides megalopyga
Albuquerque, 1954
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Coenosiinae
Coenosiini
Coenosiinae
Coenosiinae
Coenosiini
Coenosiini
Muscidae
Coenosiinae
Coenosiini
Muscidae
Coenosiinae
Pa
Na, Pa
-
Nt
612
Equador:
Cajanuma
278
*
-
-
-
Cordiluroides sp. 2
Brasil: Camacan
437
-
-
-
*
Japão: Tóquio / Pa,
Pt
*
2318
*
*
Lispocephala miki (Strobl, 1893)
Neodexiopsis paranaensis Costacurta,
Couri & Carvalho, 2005
Brasil: Ponta
Grossa / Nt
1694
*
-
*
*
Neodexiopsis setipuncta Snyder, 1957
Argentina: Tucumã
/ Nt
653
-
-
-
*
Orchisia costata (Meigen, 1826)
Japão: Tóquio /
Au, Pa, Pt
2291
*
*
*
*
Pilispina sp. 1
Brasil: Camacan
359
*
-
-
-
Pygophora confusa Stein, 1919
Japão: Tóquio / Or,
Pa
2415
*
*
*
*
Plumispina sp. 1
Brasil: Wenceslau
Guimarães
1077
*
-
*
-
Coenosiini
Coenosiinae
*
Cordiluroides sp. 1
Coenosiini
Muscidae
*
-
Coenosiinae
Coenosiini
*
*
Muscidae
Coenosiinae
*
-
Coenosia tigrina (Fabricius, 1775)
Muscidae
*
*
Coenosiini
Coenosiini
2462
1048
Coenosiini
Coenosiinae
CO1
Brasil: Petrópolis /
Nt
Reinwardtiini
Muscidae
EF1α
Psilochaeta pampiana (Shannon &
Del Ponte, 1926)
Coenosiinae
Coenosiinae
CAD
Brasil: Brasília / Nt
Muscidae
Muscidae
AATS
PB*
Philornis zeteki Dodge & Aitken
1963
Reinwardtiini
Coenosiini
Localidade de
coleta / distribuição
Coenosiini
*
44
Família
Sufamília
Tribo
Espécie
Muscidae
Coenosiinae
Coenosiini
Muscidae
Coenosiinae
Coenosiini
Spathipheromyia sp. 1
Muscidae
Coenosiinae
Coenosiini
Villeneuvia aestuum (Villeneuve,
1902)
Schoenomyza sp. 1
Localidade de
coleta / distribuição
AATS
CAD
EF1α
CO1
2431
*
*
*
*
1164
-
-
*
*
603
-
-
FJ025664
-
Nt
850
-
-
AJ871204
AJ879594
Nt, Pa
1330
-
FJ025581
FJ025684
FJ025626
EUA: Limestone
Creek
Brasil: Guaratuba
PB*
Pa
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Limnophora deleta (Wulp, 1896)
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Limnophora exuta (Kowarz, 1893)
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Limnophora maculosa (Meigen, 1826)
Pa
1928
-
FJ025582
FJ025685
FJ025627
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Limnophora olympiae Lyneborg, 1965
Pa
1897
-
FJ025628
FJ025583
FJ025686
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Limnophora orbitalis Stein, 1965
Japão: Tokachi / Pa
1826
*
*
-
*
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Limnophora riparia (Fállen, 1824)
Pa
1279
-
FJ025584
-
FJ025629
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Japão: Tóquio / Na,
Or, Pa
1659
*
*
-
*
Lispe sinica Hennig, 1960
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Lispe tentaculata de Geer, 1776
Co
1198
-
FJ025585
FJ025687
FJ025630
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Spilogona caliginosa (Stein, 1916)
Pa
578
-
-
-
FJ025657
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Spilogona dispar (Fállen, 1823)
Pa
1143
-
FJ025590
-
FJ025658
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
1814
*
*
-
*
Muscidae
Coenosiinae
Limnophorini
Syllimnophora sp. 1
Japão: Montanhas
Daietsu / Pa
Brasil: Camacan
1022
*
-
-
*
Muscidae
Cyrtoneurininae
-
Cariocamyia sp. nov.
Brasil: Maringá
1851
*
*
-
*
Muscidae
Cyrtoneurininae
-
1232
-
-
*
*
Muscidae
Cyrtoneurininae
-
1322
-
*
-
*
Muscidae
Cyrtoneurininae
-
656
-
-
-
*
1147
-
-
*
*
646
-
-
-
*
Muscidae
Muscidae
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
-
Spilogona japonica Shinonaga, 2000
Cyrtoneurina costalis (Walker, 1853)
Costa Rica: Santa
Rosa / Nt
Brasil: Brasília / Nt
Cyrtoneurina geminata (Stein, 1904)
Costa Rica: Santa
Rosa / Nt
Cyrtoneurina alifusca Couri, 1982
Cyrtoneuropsis conspersa (Stein,
1911)
Brasil: Manaus / Nt
Cyrtoneuropsis dubia (Snyder, 1954)
Brasil: Manaus / Nt
45
Família
Muscidae
Muscidae
Sufamília
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
Tribo
-
Espécie
Cyrtoneuropsis fuscicosta Curran,
1934
Cyrtoneuropsis gemina (Wiedemann,
1830)
Muscidae
Muscidae
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
-
Cyrtoneuropsis maculipennis
(Macquart, 1843)
-
Localidade de
coleta / distribuição
Colômbia:
Corregimiento El
Arenal / Nt
Cyrtoneuropsis multomaculata (Stein,
1904)
Brasil: Manaus / Nt
-
Cyrtoneuropsis neotrita (Snyder, 1954)
Brasil: Manaus / Nt
Muscidae
Cyrtoneurininae
-
Cyrtoneuropsis nisae Haseyama &
Carvalho, 2012
Brasil: Manaus / Nt
Cyrtoneuropsis pararescita (Couri,
1995)
Brasil: Joinville /
Nt
Cyrtoneuropsis protosetosa (Snyder,
1954)
Brasil: Manaus / Nt
Muscidae
Cyrtoneurininae
-
CAD
EF1α
CO1
655
-
-
-
*
484
-
-
-
*
1257
-
-
AJ871201
AJ879591
622
-
-
-
*
656
-
-
-
*
656
-
-
-
*
484
-
-
-
*
656
-
-
-
*
Nt
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
AATS
Brasil: Manaus / Nt
Muscidae
Muscidae
PB*
Muscidae
Cyrtoneurininae
-
Cyrtoneuropsis similata (Couri, 1982)
Brasil: Óbidos / Nt
644
-
-
-
*
Muscidae
Cyrtoneurininae
-
Cyrtoneuropsis veniseta (Stein, 1904)
Brasil: Manaus / Nt
2428
*
*
*
*
Muscidae
Cyrtoneurininae
Neomuscina currani Snyder, 1949
Brasil: São Gabriel
da Cachoeira / Nt
1756
*
*
-
*
Neomuscina goianensis Lopes &
Khouri, 1995
Brasil: São Gabriel
da Cachoeira / Nt
581
-
-
-
*
Neomuscina inflexa (Stein, 1918)
Brasil: Curitiba /
Nt
1276
-
-
AJ871206
*
Neomuscina neosimilis Snyder, 1949
Brasil: Mariléria /
Nt
621
-
-
-
*
Neomuscina pictipennis pictipennis
(Bigot, 1878)
Brasil: Curitiba /
Nt
656
-
-
-
*
Neomuscina stabilis (Stein, 1911)
Brasil: Manaus / Nt
656
-
-
-
*
Pseudoptilolepis aff. fluminensis
Albuquerque, 1949
Brasil: Barra do
Ribeiro
*
*
-
*
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
Cyrtoneurininae
-
1708
46
Família
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Sufamília
Cyrtoneurininae
Muscinae
Muscinae
Tribo
Muscini
Espécie
Localidade de
coleta / distribuição
Pseudoptilolepis fulvapoda Snyder,
1949
Nt
Biopyrellia bipuncta (Wiedemann,
1830)
Brasil: Manaus / Nt
Muscini
Curranosia sp. 1
Rep. da África do
Sul: Nduno Game
Muscidae
Muscinae
Muscini
Dasyphora cyanella (Meigen, 1826)
Pa, Pt
Muscidae
Muscinae
Muscini
Dasyphora cyanicolor (Zetterstedt,
1845)
Japão: Tokachi / Pa
Mesembrina meridiana (Linnaeus,
1758)
Pa
Mesembrina resplendens Wahlberg,
1844
Japão: Tokachi / Pa
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Muscinae
Muscinae
Muscinae
Muscini
Muscini
Muscini
Morellia aenescens RobineauDesvoidy, 1830
AATS
CAD
EF1α
CO1
1245
-
-
AJ871214
AJ879603
2327
*
*
*
AJ623298
1103
*
*
-
-
1725
-
FJ025574
FJ025671
465
*
-
-
-
1289
-
FJ025586
-
FJ025633
1111
*
-
-
*
1213
-
FJ025587
-
FJ025634
PB*
FJ025611
Pa
Muscidae
Muscinae
Muscini
Morellia hortorum (Fállen, 1817)
Or, Pa
1271
-
FJ025588
-
FJ025635
Muscidae
Muscinae
Muscini
Morellia nigricosta Hough, 1900
Nt
656
-
-
-
*
Muscidae
Muscinae
Muscini
Morellia obscuripes (Bigot, 1887)
Nt
1262
-
-
AJ605066
AJ617697
Muscidae
Muscinae
Muscini
1823
*
*
-
*
Morellia semimarginata (Stein, 1918)
Brasil: Mariléria /
Nt
Muscidae
Muscinae
Muscini
Morellia simplex (Loew, 1857)
Pa
1213
-
FJ025589
-
*
Muscidae
Muscinae
Muscini
Morellia xanthoptera Pamplona, 1986
Nt
1259
-
-
AJ605065
AJ617696
Muscidae
Muscinae
Muscini
Musca autumnalis De Geer, 1776
Or, Na, Nt, Pa, Pt
1300
-
FJ025590
-
FJ025637
Muscidae
Muscinae
Muscini
Musca domestica Linnaeus, 1758
Co
2443
KC178316
FJ025591
DQ657113
AF104622
Muscidae
Muscinae
Muscini
Muscidae
Muscidae
Muscinae
Muscinae
Muscini
Neomyia cornicina Walker, 1859
Brasil: Manaus /
Co
1808
*
*
-
*
Neomyia timorensis (RobineauDesvoidy, 1830)
Japão: Tóquio /
Au, Or, Pa
650
-
-
-
*
Ophyra aenescens (Wiedemann, 1830)
Brasil: Curitiba /
Na, Nt
2384
*
*
*
*
Muscini
47
Família
Muscidae
Muscidae
Sufamília
Muscinae
Muscinae
Tribo
Espécie
Muscini
Muscini
Localidade de
coleta / distribuição
FJ025597
FJ025695
FJ025653
Polietes nigrolimbatus (Bonsdorff,
1866)
Japão: Montanhas
Daietsu / Pa
484
-
-
-
*
484
-
-
-
*
656
-
-
-
*
Polietina orbitalis (Stein, 1904)
Costa Rica: Área
de Conservação
Guanacaste / Nt
2393
*
*
*
*
Polietina prima (Couri & Machado,
1990)
Brasil: São Gabriel
da Cachoeira / Nt
631
-
-
-
*
1264
-
-
AJ871208
AJ879598
1033
*
*
-
-
620
-
-
FJ25673
Brasil: Manaus / Nt
Muscidae
Muscinae
Muscini
Polietina nigra Couri & Carvalho,
1996
Brasil: Manaus / Nt
Muscini
Muscini
Muscidae
Muscinae
Muscini
Polietina steini (Enderlein, 1927)
Nt
Muscidae
Muscinae
Muscini
Sarcopromusca pruna (Shannon &
Del Ponte, 1926)
Nt
Haematobosca stimulans (Meigen,
1824)
Or, Pa
Muscidae
Muscinae
Stomoxyini
Muscidae
Muscinae
Stomoxyini
Muscidae
Muscinae
Stomoxyini
Muscidae
Muscinae
Stomoxyini
Muscidae
Mydaeinae
-
Muscidae
Mydaeinae
Mydaeinae
-
Muscidae
Mydaeinae
-
Muscidae
Mydaeinae
Neivamyia flavicornis (Malloch, 1928)
Brasil: Manaus / Nt
2447
*
*
*
*
Rhinomusca dutoiti Zumpt, 1950
Rep. da África do
Sul: Nduno Game /
Pt
1760
*
*
-
*
Co
2339
EF531173
FJ025698
EF531216
Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1748)
Brasil: Ponta Grossa
KC178317
Brontaea debilis (Williston, 1896)
/ Na, Nt
1776
*
*
-
*
Graphomya rufitibia (Stein, 1918)
Japão: Tóquio /
Au, Or, Pa
1809
*
*
-
*
Or, Pa
584
-
-
-
FJ025616
Hebecnema umbratica (Meigen, 1826)
Japão: Tóquio / Or,
Na, Pa
413
-
-
-
*
Hebecnema vespertina (Fállen, 1823)
Alemanha:
Schöngeising /Na,Pa
1743
*
*
-
*
-
Muscidae
CO1
*
Polietina bicolor Albuquerque, 1956
Muscinae
EF1α
2327
Muscini
Muscidae
CAD
Alemanha:
Schöngeising / Pa
Muscinae
Muscinae
AATS
Polietes lardarius (Fabricius, 1781)
Muscidae
Muscidae
PB*
Hebecnema fumosa (Meigen, 1826)
-
48
Família
Muscidae
Muscidae
Sufamília
Mydaeinae
Mydaeinae
Tribo
Espécie
-
Localidade de
coleta / distribuição
PB*
AATS
CAD
EF1α
CO1
Hemichlora scordalus (Walker, 1861)
Brasil:
Comendador Levy
Gasparian / Nt
1062
*
-
-
*
Mydaea affinis Meade, 1891
Japão: Tokachi /
Na, Pa
653
-
-
-
*
1898
-
FJ025592
FJ025690
FJ025639
707
-
*
-
-
-
Muscidae
Mydaeinae
-
Mydaea ancilla (Meigen, 1826)
Muscidae
Mydaeinae
-
Mydaea humeralis Robineu-Desvoidy,
1830
Pa
Japão: Tokachi / Pa
Muscidae
Mydaeinae
-
Mydaea rufinervis (Pokorny, 1889)
Na, Pa
578
-
-
-
FJ025640.2
Muscidae
Mydaeinae
-
Mydaea urbana (Meigein, 1826)
Na, Pa
729
-
FJ025593
FJ025691
FJ02564 1
Muscidae
Mydaeinae
-
Myospila meditabunda (Fabricius,
1791)
Na, Nt, Or, Pa
1927
-
FJ025594
FJ025692
HM389225
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Mydaeinae
Mydaeinae
Phaoninae
Phaoniini
Muscidae
Phaoninae
Phaoniini
Muscidae
Phaoninae
Phaoniini
Myospila sp. 1
Brasil: São Gabriel
da Cachoeira
2417
*
*
*
*
Scutellomusca scutellaris (Fabricius,
1805)
Brasil: Mariléria /
Nt
2330
*
*
*
*
Dolichophaonia santoamarensis
(Albuquerque, 1958)
Brasil: Camacan /
Nt
959
*
-
*
-
Helina celsa (Harris, 1780)
Pa
1163
-
-
FJ025674
FJ025618
Helina evecta (Harris, 1780)
Japão: Tóquio / Ne,
Nt, Or, Pa, Pt
1641
*
-
FJ025619
FJ025619
1193
-
-
FJ025676
FJ025620
1893
-
FJ025577
AJ605067
FJ025621
1369
-
*
-
*
Muscidae
Phaoninae
Phaoniini
Helina impuncta (Fállen, 1825)
Pa
Muscidae
Phaoninae
Phaoniini
Helina lasiophthalma (Macquart,
1835)
Pa
Muscidae
Phaoninae
Phaoniini
Phaonia angelicae fuscitibia
Shinonaga & Kano, 1971
Japão: Montanhas
Daietsu / Pa
Muscidae
Phaoninae
Phaoniini
Phaonia subventa (Harris, 1780)
Pa
603
-
-
-
FJ025652
Muscidae
Phaoninae
Phaoniini
Phaonia tuguriorum (Scopoli, 1763)
Pa
644
-
-
-
AJ617700
Muscidae
Phaoninae
Phaoniini
2279
*
*
*
*
Prohardyia sp. 1
Australia: Black
Mountain
49
Família
Muscidae
Muscidae
Muscidae
Sufamília
Phaoniinae
Phaoniinae
?
Tribo
Dichaetomyiini
Espécie
Localidade de
coleta / distribuição
PB*
AATS
CAD
EF1α
CO1
Dichaetomyia bibax (Wiedemann,
1830)
Japão: Tóquio / Or,
Pa
2375
*
*
*
*
Dichaetomyia johannis Pont, 1967
Austrália: Beven
Emy
2209
*
*
*
*
573
-
-
*
-
Dichaetomyiini
?
Gênero novo
Equador:
Cajanuma
50
Tabela 2. Iniciadores utilizados no trabalho, com suas respectivas sequências e referências.
CO1
EF1α
CAD
AATS
Gene Iniciador
M13A1x 92f
Sequência
95f
M13rA1x 244r
253r
M13rA1x 322r
787f
806f
1098f
1124r
rcEF4f
EF5r
EF2f
TGT AAA ACG ACG GCC AGT TAY CAY CAY ACN TTY TTY
GAR ATG
ACG TTT TTT GAG ATG YTD GG
CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATN CCR CAR TCN ATR TGY TT
GAA CGC TTG GTY TCW GTT AT
CAG GAA ACA GCT ATG ACC ACR TAN CCN CGN CCN GTR TT
GGD GTN ACN ACN GCN TGY TTY GAR CC
GTN GTN AAR ATG CCN MGN TGG GA
TTN GGN AGY TGN CCN CCC AT
CAT NCG NGA RAA YTT RAA RCG ATT YTC
GAR CGT GGT ATY ACM ATT GA
CTC ATA TCA CGT ACA GCR AAR CG
GGA TGG CAY GGY GAC AAC ATG
musEF2f
GGH TGG CAY GGY GAY AAC ATG
LCO-1490f
HCO-2198r
C1-N-2191r
C1-N-2329r
GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G
TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA
GAA GTT TAT ATT TTA ATT TTA CCG GG
ACT GTA AAT ATA TGA TGA GCT CA
*Iniciador desenhado para este trabalho.
Referência
Regier et al. 2008
Jerome Regier,
com. pess.
Moulton &
Wiegmann 2003
Yang et al. 2000
Meier & Wigmann
2002
Brian Cassel, com.
pess.*
Folmer et al. 1994
Simon et al. 1994
51
Tabela 3. Resumo das análises filogenéticas realizadas e resultados. Para cada esquema de particionamento, apresenta-se as relações
encontradas entre os três principais clados, conforme a Figura 24, para cada um dos critérios de otimalidade utilizados. O Clado 1 equivale a
Muscinae, o Clado 2 a Cyrtoneurininae e o Clado 3 a Mydaeinae. Os cladogramas indicados em negrito são aqueles que convergiram, no
sentido utilizado neste trabalho. Para a parcimônia, nenhum critério de convergência foi utilizado.
Sem partição (SP)
Particionamento por gene
Particionamento por gene
Particionamento por gene e com 1 as
as
(GENE)
com o CO1 sem as 3
e 2 as posições separadas das 3as
posições (CO1s3)
(GENE123)
Probabilidades
posteriores
bayesianas
(PPB)
Máxima
verossimilhança
(MV)
Parcimônia (Pa)
Dados
reduzidos
(SP_RED)
Dados
completos
(SP_COMP)
Dados
reduzidos
(GENE_RED)
Dados
completos
(GENE_COMP)
Dados
reduzidos
(CO1s3_RED)
Dados
completos
(CO1s3_COMP)
Dados
reduzidos
(GENE123_RED)
Dados
completos
(GENE123_COMP)
(2 (1,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1, 2, 3)
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3))
(1 (2,3)) (1 (2,3))
Inaplicável
(1 (2,3))*
(1 (2,3))*
Inaplicável
*Como os esquemas de particionamento não são aplicáveis à parcimônia, estas análises referem-se a àquelas feitas com alinhamentos onde as
terceiras posições do CO1 foram retiradas.
Tabela 4. Modelos indicados para cada gene ou partição, de acordo com os testes de AIC e BIC. Nos 52
casos de divergência entre as respostas, indica-se em negrito aquela favorecida pelo LRT.
Gene ou partição
Teste AIC
Teste BIC
AATS, completo
GTR+Ι+Γ
GTR+Ι+Γ
AATS, primeiras e segundas posições
GTR+Γ
K80+ Γ
CAD, completo
GTR+Ι+Γ
SYM+Ι+Γ
CAD, primeiras e segundas posições
GTR+Ι+Γ
GTR+Ι+Γ
EF1α, completo
GTR+Ι+Γ
GTR+Ι+Γ
EF1α, primeiras e segundas posições
GTR+Ι+Γ
HKY+Ι+Γ
CO1, completo
GTR+Ι+Γ
GTR+Ι+Γ
CO1, primeiras e segundas posições
GTR+Ι+Γ
GTR+Ι+Γ
CO1, terceiras posições
GTR+Ι+Γ
HKY+Ι+Γ
Todos os genes combinados
GTR+Ι+Γ
GTR+Ι+Γ
Tabela 5. Valores do desvio padrão das split frequencies médias e máximas, por esquema de
particionamento, para o conjunto de dados reduzido e completo.
Conjunto de dados / Esquema de particionamento
Reduzido
Completo
Média
Máxima Média
Máxima
‘SP’
0.0028
0.0161
0.0101
0.0985
‘GENE’
0.0029
0.0129
0.0066
0.0466
‘GENE123’
0.0190
0.0897
0.0803
0.7070
‘CO1s3’
0.0376
0.1878
0.0118
0.1295
Tabela 6. Valores da verossimilhança marginal obtidos pelo método da média harmônica, por esquema
de particionamento, para os conjuntos de dados reduzidos e completos. Valores em logaritmo negativo
(-lnL).
Conjunto de dados / Esquema de particionamento
Reduzido
Completo
‘SP’
36446.32
49593.64
‘GENE’
35898.02
48697.54
‘GENE123’
35862.50
49240.55
‘CO1s3’
29232.87
36196.49
53
Tabela 7. Comparação dos fatores de Bayes, usando as verossimilhanças marginais obtidas pelo
método da média harmônica, entre os esquemas de particionamento, para os dados reduzidos e
completos. As colunas foram arbitrariamente selecionadas para serem o P0, e por isso números
positivos indicam que o modelo da linha é favorecido em relação ao da coluna.
Dados reduzidos
Esquema de particionamento
‘SP’
‘GENE’
‘GENE123’ ‘CO1s3’
.
.
.
‘SP’
0
.
.
‘GENE’
548.3
0
.
‘GENE123’
583.5
35.52
0
‘CO1s3’
7213.45
6665.15
7213.45
0
Dados totais
Esquema de particionamento
‘SP’
‘GENE’
‘GENE123’ ‘CO1s3’
.
.
.
‘SP’
0
.
.
‘GENE’
896.01
0
.
‘GENE123’
353.09
-543.01
0
‘CO1s3’
13397.15 12501.05 13044.66
0
Tabela 8. Valores da verossimilhança marginal calculados pelo procedimento de “stepping-stone”,
por esquema de particionamento, para os conjuntos de dados reduzidos e completos. Valores em
logaritmo negativo (-lnL).
Conjunto de dados / Esquema de
Reduzido
Completo
particionamento
‘SP’
39169.13
55276.47
‘GENE’
38401.18
54141.11
‘GENE123’
37760.57
53671.20
‘CO1s3’
31480.41
40366.98
Tabela 9. Comparação dos fatores de Bayes, usando as verossimilhanças marginais calculadas
pelo procedimento de “stepping-stone”, entre os esquemas de particionamento, para os conjuntos
de dados reduzidos e completos. As colunas foram arbitrariamente selecionadas para serem o P0, e
por isso números positivos indicam que a partição da linha é favorecida em relação ao da coluna.
Dados reduzidos
Esquema de particionamento
‘SP’
‘GENE’
‘GENE123’ ‘CO1s3’
.
.
.
‘SP’
0
.
.
‘GENE’
767.95
0
.
‘GENE123’
1408.56
640.61
0
‘CO1s3’
7688.72
6920.77
6280.16
0
Dados totais
Esquema de particionamento
‘SP’
‘GENE’
‘GENE123’
‘CO1s3’
‘SP’
0
1135.36
1605.27
14909.49
‘GENE’
‘GENE123’
‘CO1s3’
.
.
.
0
469.91
12501.05
.
.
0
13304.22
.
0
54
Tabela 10. Comparação entre a classificação atual e a proposta deste trabalho. A classificação atual foi
baseada na proposta do catálogo de Muscidae para a região Neotropical (Carvalho et al. 2005) com a adição
das tribos Dichaetomyiini e Phaoniini (Phaoninae). Para gêneros presentes exclusivamente em outras
regiões, foram utilizados catálogos correspondentes (Pont 1980, 1986, Evenhuis 2014).
Nova proposta de classificação
Gêneros
Classificação atual
Subfamília
Tribo
Tribo
Subfamília
Achanthiptera
Achanthipterinae
Biopyrellia
Curranosia
Dasyphora
Mesembrina
Morellia
Muscini
Musca
Neomyia
Muscinae
Polietes
Polietina
Sarcopromusca
Muscinae
-
Cyrtoneurininae -
Haematobosca
Neivamyia
Rhinomusca
Stomoxys
Azelia
Drymeia
Hydrotaea
Huckettomyia
Micropotamia
Ophyra
Potamia
Thricops
Chaetagenia
Muscina
Philornis
Psilochaeta
Synthesiomyia
Atherigona
Cyrtoneurina
Cyrtoneuropsis
Neomuscina
Pseudoptilolepis
Hemichlora
Scutellomusca
Stomoxyini
Azeliini
Azeliinae, em parte
Reinwardtiini,
em parte
-
Atherigoninae
-
Cyrtoneurininae, em parte
-
Mydaeinae, em parte
55
Nova proposta de classificação
Subfamília
Tribo
Mydaeini
Limnophorini
Mydaeinae
Coenosiini
Incertae sedis
Incertae sedis
Gêneros
Incertae sedis
Dichaetomyia
Helina
Phaonia
Hebecnema
Mydaea
Brontaea
Graphomya
Myospila
Limnophora
Lispe
Spilogona
Syllimnophora
Classificação atual
Tribo
Dichaetomyiini
Phaoniini, em
parte
-
Subfamília
Phaoninae, em parte
Limnophorini
Coenosiinae
Mydaeinae, em parte
Bithoracochaeta
Coenosia
Cordiluroides
Lispocephala
Neodexiopsis
Orchisia
Pilispina
Plumispina
Pygophora
Schoenomyza
Spathipheromyia
Coenosiini
Cariocamyia
Dolichophaonia
Prohardyia
Reinwardtia
Phaoniini
Cyrtoneurininae, em parte
Phaoninae, em parte
Reinwardtiini,
em parte
Azeliinae, em parte
56
Figuras
Figura 1. Plots de saturação. A primeira coluna de gráficos representa as 1as e 2as posições dos códons, a
segunda coluna as 3as e a última as três posições. A: AATS, B: CAD, C: EF1α, D: CO1. Em azul estão
representadas as transições e em azul as transversões.
57
Figura 2. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras
famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema de particionamento ‘SP_RED’ obtidas
pela PPB. Raiz omitida.
58
Figura 3. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras
famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema de particionamento ‘GENE_RED’
obtidas pela PPB. Raiz omitida.
59
Figura 4. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras
famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema de particionamento ‘GENE123_RED’
obtidas pela PPB. Raiz omitida.
60
Figura 5. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras
famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema de particionamento ‘CO1s3_RED’
obtidas pela PPB. Raiz omitida.
61
Figura 6. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema de particionamento ‘SP_COMP’
obtidas pela a PPB. Raiz omitida.
62
Figura 7. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema de particionamento ‘GENE_COMP’
obtidas pela a PPB. Raiz omitida.
63
Figura 8. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema de particionamento ‘GENE123_COMP’
obtidas pela a PPB. Raiz omitida.
64
Figura 9. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e probabilidades posteriores para o esquema de particionamento ‘CO1s3_COMP’
obtidas pela a PPB. Raiz omitida.
65
Figura 10. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de boostrap para o esquema de particionamento ‘SP_RED’ obtidas pela
MV. Raiz omitida; valor de verossimilhança (-lnL) = 38306,01.
66
Figura 11. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de boostrap para o esquema de particionamento ‘GENE_RED’ obtidas
pela MV. Raiz omitida; valor de verossimilhança (-lnL) = -37802,49.
.
67
Figura 12. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de boostrap para o esquema de particionamento ‘GENE123_RED’ obtidas
pela MV. Raiz omitida; valor de verossimilhança (-lnL) = 39515,77.
.
68
Figura 13. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de boostrap para o esquema de particionamento ‘CO1s3_RED’ obtidas
pela MV. Raiz omitida; valor de verossimilhança (-lnL) = 31184,12.
.
69
Figura 14. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de particionamento ‘SP_COMP’ obtidas pela
MV. Raiz omitida; valor de verossimilhança (-lnL) = 53899,05.
70
Figura 15. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de particionamento ‘GENE_COMP’ obtidas
pela MV. Raiz omitida; valor de verossimilhança (-lnL) = 52706,91.
71
Figura 16. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de particionamento ‘GENE123_COMP’
obtidas pela MV. Raiz omitida; valor de verossimilhança (-lnL) = 54468,11.
72
Figura 17. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de particionamento ‘CO1s3_COMP’ obtidas
pela MV. Raiz omitida; valor de verossimilhança (-lnL) = 39382,84.
73
Figura 18. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de
boostrap para o esquema de particionamento ‘SP_RED’ obtidas pela Pa. Raiz omitida.
74
Figura 19. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras famílias de Calyptratae e valores de
boostrap para o esquema de particionamento ‘CO1s3_RED’ obtidas pela Pa. Raiz omitida.
75
Figura 20. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de particionamento ‘SP_COMP’ obtidas pela
Pa. Raiz omitida.
76
Figura 21. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae e valores de bootstrap para o esquema de particionamento ‘CO1s3_COMP’ obtidas
pela Pa. Raiz omitida
77
Figura 22. Hipótese filogenética para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de outras famílias de Calyptratae e intervalos de 95% de
confiança para os tempos de divergência obtidos com o esquema de particionamento ‘GENE_RED’. Raiz omitida.
78
Figura 23. Hipótese filogenética para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras famílias de Calyptratae e intervalos de 95% de confiança para os tempos de divergênciaobtidos com o esquema de
particionamento ‘GENE_COMP’. Raiz omitida.
79
Figura 24. Resumo dos suportes obtidos por todas as análises que convergiram, para as relações entre 62 espécies de Muscidae e cinco espécies de
outras famílias de Calyptratae, mapeados sobre a hipótese filogenética obtida pelo esquema de particionamento ‘GENE’, pela PPB. Raiz omitida.
80
Figura 25a. Resumo dos suportes obtidos por todas as análises que convergiram, para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae, mapeados sobre a hipótese filogenética obtida pelo esquema de particionamento ‘SP’, pela PPB. Raiz omitida e clado dos
Anthomyiidae resumido.
81
Figura 25b. Resumo dos suportes obtidos por todas as análises que convergiram, para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae, mapeados sobre a hipótese filogenética obtida pelo esquema de particionamento ‘SP’, pela PPB.
82
Figura 25c. Resumo dos suportes obtidos por todas as análises que convergiram, para as relações entre 138 espécies de Muscidae e 10 espécies de outras
famílias de Calyptratae, mapeados sobre a hipótese filogenética obtida pelo esquema de particionamento ‘SP’, pela PPB.
83
Figura 26. Figuras esquemáticas representando as principais hipóteses filogenéticas para Muscidae. A. Hennig (1965), onde as linhas pontilhadas representam
grupos de posicionamento incerto, e aqueles apresentados entre aspas são os apontados pelo autor como agrupamentos não monofiléticos. Hydrotaeini é
equivalente a Azeliini de Carvalho (1989). Reinwardtia encontra-se em Muscini e os demais Reinwardtiini em Phaoniinae; B. Carvalho (1989); C. Hipótese
deste trabalho, onde Muscinae inclui Achanthipterinae, Muscini, Stomoxyini e Azeliini, Cyrtoneurininae inclui Atherigoninae e a maior parte dos
Reinwardtiini, e Mydaeini inclui Phaoninae. Os Mydaeinae, no sentido tradicional, estão dispersos pelos Cyrtoneurininae, Mydaeini e Limnophorini.