UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
AVALIAÇÃO DO IMPACTO AMBIENTAL DO FORMICIDA MACEX: UTILIZAÇÃO
DE UMA BATERIA DE BIOTESTES AQUÁTICOS PARA ANÁLISE
TOXICOLÓGICA
Renan Chiprauski Testolin
Itajaí, SC, julho 2013
i
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
AVALIAÇÃO DO IMPACTO AMBIENTAL DO FORMICIDA MACEX: UTILIZAÇÃO
DE UMA BATERIA DE BIOTESTES AQUÁTICOS PARA AVALIAÇÃO
TOXICOLÓGICA
Renan Chiprauski Testolin
Dissertação apresentada à Universidade do Vale
do Itajaí, como parte dos requisitos para
obtenção do grau de Mestre em Ciência e
Tecnologia Ambiental.
Orientador: Claudemir Marcos Radetski, Dr.
Itajaí, SC, julho 2013
ii
AGRADECIMENTOS
Ao professor Dr. Claudemir Marcos Radetski, pela orientação, confiança, amizade e
disponibilidade para o desenvolvimento deste trabalho.
A minha família, em especial aos meus pais Sergio e Iris, meu irmão Alexandre e a
minha companheira Tatiane, pelo apoio incondicional.
A colega de curso e grande amiga, Albertina.
Aos colegas do Laboratório de Remediação Ambiental.
A Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI.
A todos aqueles, que direta ou inderatamente, contribuíram para este trabalho.
iii
RESUMO
As formigas desempenham um papel fundamental na ecologia dos ecossistemas. No
entanto, quando as formigas se tornam indesejáveis causam prejuízos econômicos, sendo
então combatidas com aplicação de formicidas. Por outro lado, o aumento da consciência
ambiental e um maior rigor na legislação ambiental conclamam por uma diminuição da
toxicidade dos agrotóxicos para minimizar/eliminar os impactos ambientais causados por
estes produtos. Uma alternativa para este problema é a utilização de formicidas naturais em
substituição aos produtos mais tóxicos disponíveis atualmente no mercado. Para a
comercialização dos agroquímicos exige-se testes prévios para avaliar possíveis impactos
ambientais sobre os organismos terrestres e aquáticos não-alvos. Assim, o objetivo deste
estudo foi o de avaliar o impacto ambiental no ecossistema aquático causado pelo formicida
natural Macex. Testes ecotoxicológicos com algas, peixes, bactérias e dáfnias, bem como
testes de fitogenotoxicidade com Vicia faba e de hidrólise do diacetato de fluoresceína
(atividade microbiológica) foram usados na avaliação, sendo que os resultados permitiram
estabelecer a concentração máxima deste formicida que não causa toxicidade significativa
nas espécies testadas. Os resultados dos testes de ecotoxicidade, com as concentrações
testadas de 0,03 até 2,0 g L-1, apresentaram valores de CE50 (ou CI50) variando de 0,49 (P.
subcapitata) a > 2,0 g L-1 (D. rerio). Já para o teste de fitogenotoxicidade com V. faba, as
concentrações testadas foram de 0,06 a 2,0 g L-1, onde se observou a formação de
micronúcleos somente na concentração mais alta.
Palavras-chaves: Formigas; Agrotóxicos; Ecotoxicologia aquática, Vicia faba.
iv
ABSTRACT
Ants play a key role in the ecology of the terrestrial ecosystems. However, when ants
become undesirable, these organisms can cause economic losses and are then countered
by the application of insecticides. But increased environmental awareness and more
stringent environmental legislation calls for a reduction in the toxicity of pesticides, in order to
mitigate the environmental impacts caused by these products. An alternative to this problem
is the use of natural insecticides that can replace the currently commercialized toxic
pesticides. Prior to marketing, agrochemicals must undergo testing to assess possible
environmental impacts on aquatic and terrestrial non-target organisms. Thus, the objective of
this study was to assess the environmental impact on the aquatic ecosystem caused by the
natural pesticide Macex. For this purpose, ecotoxicity tests with algae, fish, daphnids and
bacteria, as well as tests with Vicia faba and fluorescein diacetate hydrolysis (microbial
activity), were performed in this evaluation. The results enabled us to establish that the
maximum concentration of this pesticide that does not cause significant toxicity to the tested
species. The EC50 (or IC50) values ranged from 0.49 (Pseudokirchneriella subcapitata) to >
2.0 g L-1 (Danio rerio). In the phytogenotoxicity test with Vicia faba, the tested concentrations
ranged from 0.06 to 2.0 g L-1, but micronuclei formation was observed only at the highest
concentration.
Keywords: Ants; Pesticides; Aquatic biotests, Vicia faba test.
v
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 8
LISTA DE TABELAS .................................................................................................. 9
SIGLAS E ABREVIAÇÕES ...................................................................................... 10
1
INTRODUÇÃO ................................................................................................... 11
2
OBJETIVOS ....................................................................................................... 14
3
4
2.1
Objetivo Geral........................................................................................................ 14
2.2
Objetivos específicos ............................................................................................. 14
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 15
3.1
Formigas................................................................................................................ 15
3.2
Aspectos Econômicos-Ambientais Relativos Às Formigas ..................................... 17
3.3
Agrotóxicos ............................................................................................................ 20
3.4
Testes ecotoxicológicos ......................................................................................... 29
MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 33
4.1
Preparação do Tóxico ............................................................................................ 33
4.2
Testes de Ecotoxicidade ........................................................................................ 33
4.2.1 Teste Lumistox com a bactéria Aliivibrio fischeri .................................................. 34
4.2.2.
Teste de inibição do crescimento das algas Pseudokirchneriella subcapitata . 34
4.2.3 Teste de imobilidade com Daphnia magna .......................................................... 35
4.2.4.
Teste com peixe Danio rerio ........................................................................... 35
4.2.5.
Determinação da atividade enzimática pela hidrólise da FDA. ........................ 36
4.3
Teste de Genotoxicidade ....................................................................................... 36
vi
4.2.6
4.4.
5
Teste de genotoxicidade com Vicia faba......................................................... 36
Análise estatística dos dados dos testes de ecotoxicidade .................................... 37
RESULTADOS ................................................................................................... 38
5.1
Teste de estabilidade toxicológica do macex ......................................................... 38
5.2
Teste de toxicidade com Aliivibrio fischeri. ............................................................. 39
5.3
Teste de toxicidade com Pseudokirchneriella subcapitata. .................................... 40
5.4
Testes de Ecotoxidade do Macex com Daphnia magna......................................... 42
5.5
Testes de Ecotoxidade do Macex com Danio rerio ................................................ 43
5.6
Teste da Hidrólise Enzimática do FDA ................................................................... 44
5.7
Teste de Genotoxicidade com Vicia faba ............................................................... 45
6
DISCUSSÃO ...................................................................................................... 48
7
CONCLUSÃO ..................................................................................................... 52
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 54
9
ANEXOS............................................................................................................. 66
9.1
Artigos ................................................................................................................... 66
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ingredientes ativos mais comercializados no Brasil em 2009 em toneladas.
FONTE: IBAMA, 2010. ......................................................................................................... 22
Figura 2 – Locais potenciais de ação dos inseticidas sobre o axônico e o terminais porções
do nervo. Fonte: ECOBICHON, 2001................................................................................... 24
Figura 3 - Cálculo da área total de um formigueiro. FONTE: ZANETTI et al. 2005............... 27
Figura 4 – Fluxograma dos testes usados na avaliação ecotoxicológica e genotóxica do
formicida Macex. .................................................................................................................. 33
Figura 5 – Valores de luminescência para as bactérias Aliivibrio fischeri expostas à
diferentes concentrações do formicida Macex durante 30 minutos. ..................................... 39
Figura 6 - Valores médios da variação da fluorescência da alga Pseudokirchneriella
subcapitata exposta à diferentes concentrações de Macex durante 72 h. ............................ 41
Figura 7 - Valores médios de Daphnia magna imobilizada após 48 h de exposição a
diferentes concentrações de Macex. .................................................................................... 42
Figura 8 - Valores médios da variação da absorbância devido à hidrólise do FDA por
microorganismos presentes nas águas expostos à diferentes concentrações de Macex
durante 72 h......................................................................................................................... 44
Figura 9 - Média (± DP) da frequência de micronúcleos (Mcn/1000 células) e índice mitótico
(IM, %) em raízes de Vicia faba expostas 48h ao formicida Macex HM (hidrazida maleica):
controle positivo. .................................................................................................................. 46
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Áreas de plantio florestal com Eucalyptus e Pinus nos Estados do Brasil. FONTE:
ABRAF capturado em 2012 ................................................................................................. 19
Tabela 2 - Formicidas, dosagens e épocas de aplicação de alguns formicidas
comercializados no Brasil. FONTE: GALLO et al. 2002. ...................................................... 26
Tabela 3 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas à
diferentes concentrações do formicida Macex. Os valores são de 4 testes iniciados com 24 h
de intervalo usando a mesma solução estoque de Macex no preparo das diluições. ........... 38
Tabela 4 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as bactérias Aliivibrio fischeri expostas à
diferentes concentrações do formicida Macex. .................................................................... 40
Tabela 5 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas à
diferentes concentrações do formicida Macex. .................................................................... 41
Tabela 6 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para Daphnia magna expostas à diferentes
concentrações do formicida Macex. ..................................................................................... 43
Tabela 7 - Valores médio de letalidade de Danio rerio, após 96 h de exposição à diferentes
concentrações de Macex. .................................................................................................... 43
Tabela 8 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para microorganismos aquáticos expostos à
diferentes concentrações do formicida Macex. .................................................................... 45
Tabela 9 - Ecotoxicidade do Macex obtidos através de quatro espécies de organismos- teste
e outros dados de ecotoxicidade para formicidas comercializados a base de sulfluramida,
fipronil e clorpirifos. .............................................................................................................. 49
ix
SIGLAS E ABREVIAÇÕES
ABNT
Associação Brasileira de Normas Técnicas
ABRAF
Associação Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas
CCEO
Concentração Com Efeitos Observáveis
CE50
Concentração Efetiva (para 50% dos organismos expostos)
CI50
Concentração Inibidora (para 50% dos organismos expostos)
CL50
Concentração Letal (para 50% dos organismos expostos)
COT
Carbono Orgânico Total
CSEO
Concentração Sem Efeitos Observáveis
DBO
Demanda Bioquímica de Oxigênio
DQO
Demanda Química de Oxigênio
FDA
Diacetato de Fluoresceína
IBAMA
Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
ISO
International Organization for Standardization
MCN
Micronúcleos
USEPA
United States Environmental Protection Agency
x
1
INTRODUÇÃO
As formigas são um dos grupos de organismos que apresentam grande diversidade
de espécies na Terra e estão presentes em todos os ecossistemas terrestres, exceto em
regiões polares, algumas ilhas oceânicas e grandes altitudes (WARD, 2006). Com relação a
diversidade, abundância relativa e impactos ecológicos, as formigas desempenham um
papel importante em muitas comunidades, exibindo várias funções como organismos
detritívoros, predadores e herbívoros. Nos ecossistemas tropicais as formigas são um
componente notável, constituindo mais de 15% da biomassa animal total desses
ecossistemas (BEATTIE & HUGHES, 2002).
Com relação aos insetos que se apresentam em sociedade, as formigas são as que
mais se adaptaram às cidades, sendo que no Brasil estima-se que das 2000 espécies de
formigas existentes, aproximadamente 50 espécies são pragas urbanas causando prejuízos
na jardinagem e nas plantações urbanas (e.g., nos parques alimentando-se de sementes e
desfolhando plantas) (CAMPOS-FARINHA et al., 2002). Já na agricultura, os prejuízos
econômicos podem ser tanto na produção como no armazenamento. Também causam
problemas em locais onde se manipulam alimentos, instituições de pesquisa, biotérios,
zoológicos, museus, cabines de eletricidades e centrais telefônicas, pois são portadores de
gérmens que podem contaminar estes diferentes locais.
Visando a proteção das culturas, o atual sistema de produção agrícola faz uso de
produtos químicos estranhos às condições naturais dos agroecossistemas. Esta utilização
de produtos químicos visa controlar populações de organismos em desequilíbrio, plantas
daninhas e doenças que proliferam de maneira desordenada em função de ambientes
favoráveis ao desenvolvimento destes organismos que são popularmente denominados de
pestes (MOREIRA et al., 1996)
Dentre os produtos químicos estranhos aos ecossistemas naturais estão os
pesticidas que também recebem a denominação de produtos agrotóxicos ou fitosanitários,
os quais são moléculas sintetizadas para afetar determinadas reações bioquímicas de
insetos, microrganismos, animais e plantas que se quer controlar ou eliminar. Busca-se
desenvolver agrotóxicos com efeito específico em um dado organismo a ser eliminado, e
assim, evitar que o efeito se manifeste nos outros seres que compõem os ecossistemas.
Contudo, a introdução de agrotóxicos no ambiente agrícola pode provocar perturbações ou
impactos ambientais, pois podem exercer uma pressão de seleção nos organismos e alterar
11
a dinâmica do ecossistema natural, tendo como conseqüência, mudanças na estrutura e na
função do ecossistema (SPADOTTO et al., 2004). Por outro lado, Tiepo et al. (2010)
definiram Pesticidas Verdes como biocidas naturais ou sintetizados produzidos de acordo
com os princípios da química verde e que agem de forma específica sobre um alvo preciso,
com o mínimo de efeitos prejudiciais ou nocivos sobre os componentes não-alvos presentes
no ecossistema onde o produto foi aplicado. O Pesticida Verde na verdade é uma
concepção ideal de um agrotóxico.
Enquanto as indústrias químicas se esforçam para desenvolver agrotóxicos menos
impactantes para o meio-ambiente, os governos exigem, além dos estudos toxicológicos
visando a proteção da saúde humana, estudos ecotoxicológicos que mostram a previsão de
impacto ambiental destes produtos no ambiente antes de autorizar a comercialização dos
mesmos. Nesse contexto, os testes ecotoxicológicos tem se consolidado como ferramenta
importante para a compreensão dos impactos potenciais provocados por agentes químicos
nas comunidades biológicas. Em decorrência da possibilidade de estender/extrapolar
resultados da ecotoxicidade obtido com um organismo-teste para um grande número de
organismos presentes no meio natural, esses biotestes tem sido empregados no
gerenciamento, manejo e monitoramento do meio-ambiente. Assim, para o planejamento de
políticas ambientais, criação de legislação específica e controle das emissões de efluentes,
procede-se à avaliação de riscos ambientais e, para tanto, dados ecotoxicológicos e
genotoxicológicos precisam ser gerados e usados nos setores de vigilância ambiental e de
saúde publica (LOURENÇO, 2006).
Existe no mercado um formicida de composição natural denominado Macex e que,
teoricamente, não deveria causar impacto ambiental significativo. Pelo fato deste produto
ser usado no ecossistema terrestre, os poucos dados ecotoxicológicos existentes na
literatura científica privilegiam este compartimento. Assim, Tiepo et al. (2010) sugeriram que
o formicida Macex seja classificado como pesticida verde com base em testes de toxicidade
com organismos terrestres: vegetais (Brassica oleracea, Lactuca sativa , Mucuna aterrima),
anelídeo (Eisenia fetida)
e
colêmbolas
(Folsomia
cândida). A
literatura
não
registra resultados de ecotoxicidade aquática e nem de genotoxicidade do Macex e sabe-se
que a maioria dos agrotóxicos usados nos ecossistemas terrestres acabarão por atingir o
ecossistema aquático, entrando em contato com os microorganismos e com os
macroorganismos que compõem este ecossistema. É essa falta de dados ecotoxicológicos
em organismos do meio aquático que justifica a escolha deste pesticida como objeto de
12
estudo nesta dissertação. Um teste de fitogenotoxicidade é de importância fundamental,
visto que as alterações genéticas são efeitos à parte, não sendo observados nos testes
ecotoxicológicos clássicos. A geração de dados preliminares servirá de base para futuras
avaliações de risco ecológico que busquem um gerenciamento otimizado deste produto
usado no controle das formigas que causam danos às culturas vegetais. Assim, o presente
trabalho está vinculado ao laboratório de Remediação Ambiental – UNIVALI, onde o mesmo
realiza estudos científicos nos diagnósticos ambientais e nas avaliação dos efeitos
ecotoxicológicos e genotoxicológicos dos compostos químicos liberados no meio ambiente.
13
2
2.1
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Utilizar uma bateria de biotestes aquáticos para avaliação preliminar da ecotoxicidade
e genotoxicidade potencial do formicida Macex.
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Determinar as concentrações letais, efetivas ou inibidoras (ao nível de 50%)
do formicida natural Macex para as espécies Danio rerio, Daphnia magna,
Scenedesmus subspicatus e Aliivibrio fischeri;
 Determinar se o formicida natural Macex é genotóxico ou não com o uso da
espécie Vicia faba;
 Determinar a concentração efetiva (ao nível de 50%) do formicida Macex nos
microorganismos presentes nas águas naturais;
 Estabelecer as Concentrações Sem Efeito Observado (CSEO) para todas as
espécies testadas a fim de basear futuros estudos de análise de risco
ecológico, permitindo o estabelecimento de valores-limites legais para este
produto no meio-ambiente;
14
3
3.1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
FORMIGAS
As formigas são um dos grupos de maior sucesso na história dos metazoários
terrestres. Em média, as formigas apresentam de 15% a 20% da biomassa terrestre animal,
e em regiões tropicais onde as formigas são especialmente abundantes, podem chegar a
25% ou mais. A família Formicidae soma mais de 9.500 espécies descritas e com número
estimado de 3.000 a 9.000 espécies desconhecidas para a ciência (SCHULTZ, 2000).
Constituem importantes componentes dos ecossistemas, não só por apresentarem uma
grande biomassa animal, mas também porque as formigas agem como engenheiros dos
ecossistemas (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Essa alta biodiversidade torna esses
organismos altamentes sensíveis aos impactos ambientais, podendo reduzir essa
biodiversidade (FOLGARAIT, 1998)
As formigas cortadeiras, pertencentes à tribo Attini, família Formicidae e subfamília
Myrmicinae, representando um grupo especial de formigas associadas à vegetação. Neste
grupo encontram-se os gêneros Atta e Acromyrmex. Embora existam outros gêneros, estes
assumem pouca importância no forrageamento de plantas cultivadas (GIESEL, 2007). A
tribo Attini (Hymenoptera: Formicidae) compreende 14 gêneros com aproximadamente 230
espécies de formigas descritas, que se especializaram em uma dieta essencialmente
fungívora (SCHULTZ & BRADY, 2008).
Um formigueiro típico é formado internamente por dezenas ou centenas de câmaras
(panelas) subterrâneas ligadas entre si e com a superfície por meio de galerias (canais).
Nas diversas panelas, as formigas cultivam o jardim de fungo, criam suas larvas e
depositam lixo. Externamente, o formigueiro apresenta um monte de terra solta, formado
pelo acúmulo de terra extraída das câmaras, além de pequenos montículos e numerosos
orifícios, denominados olheiros, os quais servem para ventilação, limpeza ou entrada de
material vegetal coletado (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Dos olheiros de trabalho saem
trilhas ou carreiros, que são os caminhos externos percorridos pelas formigas operárias à
procura de material vegetal. As trilhas geralmente são superficiais e limpas (facilmente
notadas) e muitas vezes bastante longas; terminam em olheiros que nem sempre indicam a
localização das panelas do formigueiro (DELLA LUCIA & MOREIRA, 1993; ANJOS et al.,
1998).
15
A população do formigueiro é constituída por indivíduos morfologicamente distintos,
de acordo com suas funções na colônia. Estas formigas possuem castas permanentes e
temporárias. As castas permanentes em Atta são compostas por uma fêmea áptera (rainha)
fundadora do sauveiro (casta reprodutiva) e por operárias (fêmeas estéreis) que
representam a maior parte da população e executam as mais variadas tarefas necessárias
ao funcionamento do formigueiro. Nas castas temporárias, estão os machos (bitus) e
fêmeas aladas (iças ou tanajuras), que aparecem nos formigueiros adultos anualmente,
garantindo a reprodução das espécies (DELLA LUCIA et al., 1993a; GALLO et al., 2002). As
operárias do gênero Atta são facilmente identificadas pela presença de três pares de
espinhos no dorso do tórax (ANJOS et al., 1998; GALLO et al., 2002).
Devido aos vários efeitos que podem causar na cadeia trófica, as consequências
ecológicas da ação das formigas sobre um ecossistema pode ser muito variado. No caso
das espécies herbívoras, isto é, cortadeiras que cultivam um fungo simbionte, é conhecido
que sua atividade cortadora nem sempre é negativa sobre a flora. Como estas espécies
cortam geralmente partes específicas de plantas, podem regular o crescimento diferencial
em uma mesma planta ou entre diferentes espécies de plantas, acelerando o crescimento
de flores, por exemplo, ou de espécies vegetais específicas. Por sua vez, estas formigas
acumulam grande quantidade de nutrientes em um só lugar, permitindo o crescimento de
certos vegetais que não podem sobreviver em solo pobre dos arredores, exercendo desta
forma, o papel de recicladores de nutrientes (BRASIL, 2012).
Outro efeito importante das formigas sobre um ecossistema é a predação sobre
outros insetos e artrópodos (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Algumas espécies são muito
eficientes como predadoras. É o caso das formigas-de-correção que arrasam com toda a
fauna de uma zona, obrigando a colônia a migrar continuamente em busca de novos
ambientes. A pressão depredadora destas e de outras formigas é tão importante que muitos
organismos têm desenvolvido, durante sua evolução, mecanismos de defesa específicos
contra formigas. É o caso de muitas vespas, cupins, mariposas e plantas (BRASIL, 2012).
Algumas espécies de formigas encontram-se associadas às atividades antrópicas
causando incômodo, infestando aparelhos eletrônicos e podendo ainda causar sérios
problemas na saúde pública quando a infestação se dá em hospitais (CAMPOS-FARINHA et
al, 2002)
16
Segundo Boaretto & Forti (1997), para o controle de formigas cortadeiras de folhas
pode-se usar métodos mecânicos, culturais, biológicos e químicos. O controle mecânico (ou
manual) praticamente não é utilizado, em virtude de ser de viabilidade restrita a pequenas
áreas e ninhos com até 4 meses de idade. Métodos químicos para controle de formigas
cortadeiras são os mais frequentemente utilizados, sendo o produto químico aplicado
diretamente nos ninhos, nas formulações em pó, líquido ou líquidos nebulizáveis, ou
apresentado na forma de iscas granuladas que são aplicadas nas proximidades das
colônias. Já o controle biológico certamente é uma área promissora de pesquisa, mas
atualmente está clara a necessidade de conhecimentos biológicos básicos para que
estratégias de controle para formigas cortadeiras possam ser de fato aplicadas. O preparo
do solo como aração e gradagem podem ser importantes na eliminação de sauveiros iniciais
e quenquenzeiros.
Entre os fatores comportamentais que podem influenciar no controle das formigas
cortadeiras destacam-se: a comunicação química, a sensibilidade olfativa, a capacidade de
aprendizagem, a seletividade e a produção de substâncias antibióticas. A comunicação
química (via odores) é muito importante na defesa e na agressividade, na seleção de
plantas, nas atividades sociais, corte e acasalamento e em outros tipos de comportamento.
Essa comunicação química é essencial no sucesso das colônias de cortadeiras (MARINHO
et al., 2006), sendo que estas causam impactos econômicos significativos, o que é abordado
na seção seguinte.
3.2
ASPECTOS ECONÔMICOS-AMBIENTAIS RELATIVOS ÀS FORMIGAS
No Brasil existem muitas áreas reflorestadas que apresentam problemas com as
formigas. Por exemplo, as formigas cortadeiras estão entre as pragas mais importantes em
fazendas brasileiras, porque seus ataques vorazes ocorrem durante o ano todo, se
espalhando pelo país. O dano é imenso, trazendo prejuízos às culturas pequenas e
grandes, culturas de frutas e legumes e pastos, sendo assim consideradas também como a
praga "número 1” entre as empresas de reflorestamento (BRASIL, 2012), o que se tem se
verificado também com outras espécies de formigas em outros países (GUTRICH et al.,
2007).
Entre os problemas silviculturais dessas florestas implantadas, sobressaem as
formigas cortadeiras dos gêneros Atta (saúvas) e Acromyrmex (quenquéns), que
17
alcançaram o nível de praga pela magnitude dos prejuízos que causam aos plantios de
pastagens ou florestais (MACARONI et al., 1963; NICKELE et al., 2009). Os danos das
formigas cortadeiras são mais expressivos nas plantas exóticas do que nas nativas, isso se
deve provavelmente devido à baixa co-evolução existente entre esses grupos (DELLA
LUCIA & VILELA, 1993).
Assim, as pastagens têm seu desenvolvimento prejudicado, pois o ataque de
formigas leva à morte das plântulas e à má formação do pasto. Além do mais, as formigas
competem diretamente com o gado pelo recurso forrageiro da área. Estudos demonstram
que 10 sauveiros adultos ocupam uma área de 715 m² e consomem em média 21 kg de
capim por dia, o equivalente a um boi em regime de pasto (GALLO et al., 2002).
No Brasil, as espécies vegetais mais usadas nos reflorestamentos são o Pinus e o
Eucalyptus, sendo que as formigas cortadeiras destacam-se como as principais pragas,
principalmente nas fases de pré-corte (áreas de reforma ou condução da floresta) e após o
plantio ou no início da condução de brotação.
Segundo a Associação Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas (ABRAF,
2013), a área ocupada de plantios em 2011 de Eucalyptus e Pinus no Brasil totalizou
6.515.844 há sendo 74,8% correspondente à área de plantios de Eucalyptus e 25,2% aos
plantios de Pinus. A Tabela 1 apresenta os valores das áreas de plantio das respectivas
espécies acima citadas nos diferentes estados do Brasil. Percebe-se na Tabela 1 que os
estados do Paraná e Santa Catarina se destacam em áreas reflorestadas por Pinus por
causa do clima predominante, pois a espécie rende mais em climas temperados, suportando
melhor temperaturas mais baaixas.
As formigas cortadeiras causam danos significativos em plantios homogêneos, os
quais favorecem o desenvolvimento dessas pragas pela falta de predadores naturais nas
áreas de plantio. Assim, essas formigas são consideradas como fatores limitantes ao
desenvolvimento da cultura, causando tanto perdas diretas, como a morte e a redução do
crescimento de mudas e árvores; quanto indiretas, como a diminuição da resistência das
árvores a outras pragas (ANJOS et al., 1993).
18
Tabela 1 – Áreas de plantio florestal com Eucalyptus e Pinus nos Estados do Brasil. FONTE:
ABRAF capturado em 2012
Florestas Plantadas no Brasil (Km2)
UF
Eucalyptus
Pinus
Total
%
MG
1.401.787
75.408
1.477.195
22,70%
SP
1.031.677
156.726
1.188.403
18,20%
PR
188.153
658.707
846.860
13,00%
BA
607.440
21.520
628.960
9,70%
SC
104.686
538.254
642.941
9,90%
RS
280.198
164.806
445.004
6,80%
MS
475.528
11.871
487.399
7,50%
ES
197.512
2.546
200.058
3,10%
PA
151.378
-
151.378
2,30%
MA
165.717
-
165.717
2,50%
GO
59.624
10.760
70.384
1,10%
AP
50.099
445
50.543
0,80%
MT
58.843
-
58.843
0,90%
TO
65.502
850
66.352
1,00%
PI
26.493
-
26.493
0,40%
RJ
8.844
-
8.844
0,10%
OUTROS
470
-
470
0,00%
TOTAL
4.873.951
1.641.893
6.515.844
100,00%
Segundo Zanetti et al. (2002), o ataque realizado pelas formigas cortadeiras é de
maneira intensa e constante, podendo ocorrer danos em qualquer fase do desenvolvimento
da planta, ocasionados por cortes de folhas, brotos, ramos finos e flores, os quais são
carregados para o interior de ninhos subterrâneos, dificultando o seu controle.
Zanetti et al. (2002; 2004) descrevem dados quantitativos sobre o impacto das ações
das formigas sobre plantas. Assim, estudos com Eucalyptus saligna demonstraram que as
árvores desfolhadas à 100 % deixaram de produzir cerca de 40% da madeira no ano
seguinte à desfolha e que as árvores com 50% de desfolha reduziram a produção da
madeira em 13,2% no ano seguinte, comparativamente às árvores não desfolhadas. Já para
o caso da espécie Pinus caribaea atacada pelas formigas, o crescimento em altura das
árvores diminuiu em 12%, enquanto o diâmetro diminuiu de 17,4% e a mortalidade média
aumentou em 11,7%. Quando árvores de Eucalyptus grandis de 6 meses de idade são
19
desfolhadas, elas tem 99,3% de probabilidade de morrerem, enquanto diminuem seus
crescimentos de altura e diâmetro em 31,7% e 25,1%, respectivamente, provocando uma
redução de 61,6% na produção da madeira, comparativamente às árvores não desfolhadas.
As árvores com idade de 1 a 3 anos são as mais susceptíveis aos ataques das formigas,
sendo que um desfolhamento total retarda significativamente o crescimento das mesmas,
mas dois ou três desfolhamentos consecutivos geralmente levam as plantas à morte. Ainda
segundo Zanetti et al. (2002), estudos demonstraram que a perda de rendimento em volume
de madeira na espécie Pinus spp provocada por 5 formigueiros de Atta sexdens ficou em
14% e que quando a densidade de formigueiros da espécie Atta laevigata for maior que
30/ha em plantios de Pinus caribaea com menos de 10 anos de idade, há uma redução de
mais de 50% na produção de madeira/ha. De uma maneira geral, há uma perda anual de
0,87% na produção do volume de madeira de Eucalyptus para cada 2,76 m2 de sauveiro/ha
(ZANETTI et al., 2004).
Para evitar todas estas perdas produtivas, as empresas de reflorestamento tem
empregado o controle químico de formigas cortadeiras de forma sistemática, através de
iscas, termonebulização e fumigantes, sendo o aspecto econômico das operações de
grande importância, em virtude dos altos custos envolvidos (FORTI & BOARETTO, 1997).
Nesse sentido, 75% dos custos e do tempo gasto no controle de pragas florestais dizem
respeito ao combate das formigas cortadeiras (ZANETTI et al., 2002)
Algumas considerações sobre o uso de agrotóxicos são abordadas nas seção
seguinte.
3.3 AGROTÓXICOS
Os agrotóxicos e afins são definidos como os produtos originários de processos
físicos, químicos ou biológicos que são destinados ao uso nos setores de produção, no
armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de
florestas (nativas ou implantadas) e de outros ecossistemas, e também de ambientes
urbanos (jardins e indústriais), cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna,
a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, podendo ser
ainda substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores
e inibidores de crescimento (BRASIL, 2002).
20
Segundo Pope (2005), agrotóxicos são substâncias ou mistura de substâncias
destinadas a prevenir, destruir, repelir ou mitigar qualquer praga (roedores, insetos,
nematóides, fungos, plantas daninhas, de outras formas de planta terrestre ou aquático ou
vida animal ou vírus, bactérias ou outros microorganismos, exceto os vírus, bactérias, ou
outros microrganismos sobre ou dentro do homem. Pode ser também qualquer substância
ou mistura de substâncias destinadas à utilização de um regulador de crescimento de
planta, desfolhantes, dessecantes. No termo agrotóxico estão incluídos os termos
herbicidas, inseticidas, nematicidas, fungicidas e fumigantes do solo, sendo que estas
substâncias representam um grupo diversificado de produtos químicos inorgânicos e
orgânicos (IMFELD & VUILLEUMIER, 2012).
De uma forma resumida, os agrotóxicos têm como objetivo o controle dos seres vivos
considerados indesejáveis para a conservação de outros seres vivos, produtos ou do meio
ambiente. Os agrotóxicos possuem em sua composição substâncias químicas tóxicas,
denominadas ingredientes ativos, que interferem na atividade biológica normal dos seres
vivos alvos de controle. O ingrediente ativo é o agente químico, físico ou biológico que
confere eficácia aos agrotóxicos e afins (BRASIL, 1989).
A Figura 1 apresenta os ingredientes ativos para os quais há maior comercialização
de agrotóxicos no Brasil. No entanto, no levantamento desses dados foi utilizado apenas
valores declarados em marcas comerciais de produtos formulados.
21
Figura 1 – Ingredientes ativos mais comercializados no Brasil em 2009 em toneladas. FONTE:
IBAMA, 2010.
Quando aplicados diretamente no solo, os agrotóxicos podem ser degradados por
vias químicas, por fotólise ou por ação de microorganismos. Contudo as moléculas com alta
persistência, ou seja, baixas taxas de degradação podem permanecer no ambiente sem
sofrer qualquer alteração por um longo período (AMARANTE JUNIOR et al., 2006). Essas
moléculas podem ser adsorvidas pelas partículas do solo, dessorvidas a partir dessas
mesmas partículas, sofrer lixiviação e atingir os lençóis subterrâneos ou sofrer carreamento
e atingir águas superficiais (VIJVER et al., 2008). Já nos ambientes aquáticos, os
agrotóxicos podem sofrer adsorção ou dessorção das partículas de sedimentos, ser
degradados por vias químicas, biológicas ou fotólise, bem como ser volatilizados. No ar, as
moléculas na forma de gás ou de vapor podem ser transportadas por muitos quilômetros,
atingindo áreas a grandes distâncias da região de aplicação (AMARANTE JUNIOR et al.,
2006).
Para o presente trabalho, o interesse sobre agrotóxicos recai mais especificamente
sobre os inseticidas, os quais são produtos à base de substâncias químicas ou agentes
biológicos, de ação direta ou indireta, que provocam a morte dos insetos. Quimicamente,
podem ser classificados de diferentes modos, sendo que uma delas é a divisão dos
22
inseticidas em três grandes grupos: os organoclorados; os inibidores da colinesterase
(fosforados orgânicos e carbamatos) e os piretróides naturais e sintéticos (IBAMA, 2010).
Segundo Costa (2008), os inseticidas desempenham um papel mais relevante no
controle dos insetos (como pragas), particularmente nos países em desenvolvimento. Todos
os inseticidas químicos em uso hoje são neurotóxicos e agem por interferência no sistema
nervoso dos organismos-alvo. O sistema nervoso central dos insetos é altamente
desenvolvido e não tão diferentes dos mamíferos, bem como o sistema nervoso periférico
que também apresenta semelhanças com os organismos superiores (ECOBICHON, 2001).
Desta maneira os inseticidas não são seletivos em relação a espécie alvo no que diz
respeito a toxicidade e os mamíferos, incluindo os humanos, são altamente sensíveis a sua
toxicidade. Quando essa seletividade existe, esta é muita vezes, devido as diferenças na via
de desintoxicação existentes entre insetos e humanos (COSTA 2008).
Muitos inseticidas afetam o sistema nervoso em diferentes locais. O desenvolvimento
desses compostos tem sido baseado em relações específicas estrutura/atividade
requerendo a manipulação de uma estrutura química básica com intuito de se obter uma
forma ideal que afeta uma reação bioquímica específica em um organismo alvo. Esses
locais ou reações específicos e/ou mecanismo de ação pode ser semelhantes em todas as
espécies, no entanto, a dosagem (nível de exposição e duração) irá ditar a intensidade dos
efeitos biológicos. Os locais potencias de ação dos inseticidas e suas interferências no
transporte de íons de sódio, potássio, cálcio e cloretos nas membranas celulares podem ser
visto na Figura 2 onde ocorre a inibição das atividades enzimáticas especificas ou a
contribuição para a liberação e/ou a persistência dos transmissores químicos nas
terminações nervosas (ECOBICHON, 2001).
23
Figura 2 – Locais potenciais de ação dos inseticidas sobre o axônico e o terminais porções do
nervo. Fonte: ECOBICHON, 2001.
Entre a diversidade de produtos em que os invertebrados podem ser expostos, os
inseticidas são o grupo com os maiores efeitos, seguido dos fungicidas. Isto é em parte
devido à presença de receptores específicos bioquímicos (e.g., colinesterases, canais de
íons) que são os alvos da ação inseticida e que são encontradas em todas as espécies de
insetos (STRAALEN, 2004).
Os efeitos dos inseticidas (ou de qualquer agrotóxico) sobre a microflora do solo são
de suma importância, devido ao fato de que muitas funções microbianas são fundamentais
para a produção agrícola, sustentabilidade do solo e da qualidade ambiental (TOPP, 2003).
O mecanismo de ação dos inseticidas em organismos microbianos pode ser diferente do
24
que os apresentados para os organismos alvos (i.e., insetos). Em microorganismos, os
inseticidas tem apresentado interferência na respiração, na fotossíntese, em reações de
biossíntese, bem como no crescimento, divisão e composição molecular (DELORENZO et
al., 2001).
A literatura registra dados sobre a eficácia dos formicidas atualmente mais
comercializados no Brasil, os quais são: sulfluramida, fipronil e clorpirifós. A sulfluramida (Netilperfluoroctano sulfonamida) é o ingrediente ativo da isca granulada de Mirex-S Max,
Dinagro-S, AttaMax e Pikapau sendo esses os produtos mais comercializadas no Brasil.
Para esses produtos de isca granulado (0,6% de ingrediente ativo), Cameron (1990) relatou
que 1,8 g.m-2 de formigueiro foi suficiente para controlar a formiga A. texana. O metabólito
perfluoroctano sulfonamida (DESFA), atua no organismo no processo de fosforilação
oxidativa, em nível mitocondrial, interrompendo a produção de ATP (SCHNELLMAN &
MANNING, 1990).
O clorpirifos (O, O-dietilo O-3 ,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato) como formicida em
isca é comercializado no Brasil como Fersol 480 EC e Landrin-F, entre outros. Oliveira &
Zanuncio (1997) testaram este produto a base de clorpirifos para o controle da formiga Atta
laevigata, mas as iscas são eficazes apenas quando a aplicação é realizada
simultaneamente com um processo de fumigação (FORTI et al, 2003; TOMLIN, 2000). O
Clorpirifós age por contato e ingestão. Como todo inseticida organofosforado, o clorpirifós
liga-se ao centro esterásico da acetilcolinesterase (AChE), impossibilitando-a de exercer sua
função, ou seja, hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh), em colina e ácido acético.
Nos insetos, interfere com a transmissão dos impulsos nervosos, levando-os à paralisia e
morte (TOMLIN, 2000).
O fipronil, comercializado como Blitz, Frontline, Regent 800 WG e outros, apresenta
ação tóxica retardada na colônia de formigas, sendo eficaz em testes de laboratório a uma
concentração de 5 ppm (FORTI & BOARETTO, 1997). O fipronil pertence à família dos
fenilpirazóis. Seu mecanismo de ação baseia-se no bloqueio pré e pós-sináptico da
passagem dos íons cloro pelos neurotransmissores (ácido gama amino butírico – GABA),
matando os organismos por hiper-excitação (TOMLIN, 2000).
A Tabela 2 nos mostra as dosagens de alguns inseticidas comumentemente usados
no combate de formigas cortadeiras.
25
Tabela 2 - Formicidas, dosagens e épocas de aplicação de alguns formicidas comercializados no
Brasil. FONTE: GALLO et al. 2002.
Dosagem/m2
Compasso (área média
de uma aplicação)
Época
aconselhável
fenitrotion
(Sumithion 50 E)
5 ml + 0,5 L água
2 m2
Chuvosa
clorpirifós (Lorsban
480)
5 ml + 0,5 L água
2 m2
Chuvosa
0,25 g + 0,5 L
água
50 ml/olheiro (aplicar em
2 olheiros)
-
30 g
3 m2
Seca
fipronil (Blitz)
10 g
-
Seca
sulfuramida (Mirex-s)
10 g
-
Seca
Formicida
Líquido
Pó
fipronil (Reagente
800 WG)
permetrina (KOthrine 2%)
Iscas
A área do formigueiro é que determina a dosagem da maioria dos formicidas. Dentre
as formas de calcular essa área, destaca-se a seguir o método da área total de terra solta.
Por meio desse método, a área é obtida através da multiplicação do maior comprimento pela
maior largura da área ocupada pelos montículos de terra solta (ZANETTI et al., 2005). Para
economizar na quantidade de formicida usado, pode-se calcular área individual de cada
ninho. As dimensões podem ser medidas com o auxílio de uma trena, ou com passadas
largas de aproximadamente 1 metro.
26
Área Total = comprimento AB x comprimento CD
(•) = olheiro de abastecimento.
Figura 3 - Cálculo da área total de um formigueiro. FONTE: ZANETTI et al. 2005.
Forti et al. (2003) compararam a eficiência formicida de iscas formulados com
sulfluramida – 0.3% (Mirex-S Max e Dinagro-S), fipronil – 0.003% (Blitz) e clorpirifos –
0.125% (Pikapau) no controle da formiga Atta capiguara, cortadora de gramíneas. Foram
avaliados a frequência de transporte das iscas, a devolução das iscas, a frequência de corte
e cargas, a quantidade de formigas e a quantidade de solo solto nos ninhos. Estes
parâmetros foram avaliados durante 232 dias após o tratamento e os autores concluíram
que as iscas dos produtos Blitz e Pikapau não foram adequados para o controle de Atta
capiguara, enquanto que Mirex-S Max (8 g m-2) e Dinagro-S (10 g m-2) apresentaram alta
eficiência no controle das formigas.
Atualmente, o controle de formigas cortadeiras em áreas reflorestadas tem sido feito
quase que exclusivamente com a aplicação de inseticidas convencionais, que podem
provocar impactos negativos ao ambiente e ao homem. Alternativamente ao uso de
inseticidas sintéticos, surgem outros produtos e métodos de controle, como o uso de
produtos naturais, os quais têm sido utilizados para controlar pragas animais, doenças de
plantas e ervas daninhas, desde os tempos antigos. As plantas têm sido as mais
importantes fontes de pesticidas naturais durante séculos e preparações padronizadas para
o ingrediente(s) ativo(s) através de métodos analíticos modernos tornou-se disponível nas
últimas décadas, tornando possível a fabricação de produtos confiáveis (UJVÁRY, 2010).
Um produto considerado alternativo por sua composição natural é o formicida Macex,
fabricado pela Macex do Brasil, localizada na cidade de Caçador, SC. A empresa afirma em
seu site (www.macex.com.br) que este formicida é eficaz contra as formigas cortadeiras dos
27
gêneros Atta e Acromyrmex, os quais são os gêneros que causam maior impacto nas
plantações brasileiras. A composição química do Macex é a seguinte: cafeína (0,04%),
ácidos graxos (palmítico -1.5%, oleico -1.9%, linoleico – 6.2% e esteárico -0.4%), sendo que
polpas de maçã e de cítricos agem como agentes atraentes.
Uma revisão da literatura não mostrou dados toxicológicos para os ácidos graxos
concluindo-se que deve ser a cafeína o ingrediente ativo deste formicida. A cafeína é um
alcalóide da família metilxantina, agindo como um produto químico de defesa em certas
plantas e mostrando propriedades repelentes ou tóxicas (ARAQUE et al., 2007). As
metilxantinas, incluindo a cafeína e a teofelina, são naturalmente produzidas em frutos,
sementes e folhas de certas espécies de chás, café, cacau e cola. Entretanto, as
metilxantinas naturais e sintéticas inibem a alimentação dos insetos e também são
pesticidas, nas concentrações encontradas nas plantas. Esses efeitos são ocasionados
principalmente pela inibição da atividade de fosfodiesterase e um aumento no ciclo
intracelular do monofosfato de adenosina. Já em concentrações mais baixas, as
metilxantinas são sinérgicos potentes de outros pesticidas por ativar a adenilato ciclase, a
qual cataliza a conversão de ATP à AMPc em insetos (NATHANSON, 1984).
Enquanto a cafeína pode ser considerado um inseticida (ARAQUE et al., 2007), seria
interessante avaliar se o produto Macex apresenta um impacto ecotoxicológico quando em
contato com diferentes organismos que compõem os ecossistemas. O conhecimento pelo
diagnóstico ecotoxicológico dos problemas causados pelo uso de agrotóxicos é de suma
importância para uma visão prospectiva na avaliação do impacto ambiental das atividades
relacionadas à agricultura, incluindo o uso de inseticidas. Essa informação pode subsidiar o
desenvolvimento de alternativas que conduzem à sustentabilidade dos agroecossistemas
(MOREIRA et al., 1996). Assim, com respeito às características do Macex, não se tem dados
ecotoxicológicos deste formicida no ecossistema aquático, mas Tiepo et al. (2010)
publicaram um artigo abordando a ecotoxicidade deste produto sobre organismos terrestres
incluindo plantas (Brassica olaracea, Lactuca sativa e Mucuna aterrima), anelídeos (Eisenia
foetida), colêmbolas (Folsomia candida) e microorganismos (hidrólise do diacetato de
fluoresceína – FDA). O estudo mostrou que a maior concentração testada (i.e., 50 g kg-1 de
solo seco) não apresentou toxicidade para os organismos testados. Esta ausência de
toxicidade para estes diverssos organismos fez com que os autores sugerissem que o
formicida Macex fosse considerado um formicida ambientalmente correto, isto é, com baixo
impacto sobre os organismos não-alvos (TIEPO et al., 2010).
28
3.4 TESTES ECOTOXICOLÓGICOS
Segundo Lourenço (2006), os testes ecotoxicológicos constituem o elemento
fundamental da Ecotoxicologia, os quais permitem avaliar o efeito da relação entre dose,
tempo de resposta e efeitos dos organismos em teste, possibilitando estimar o potencial
tóxico do agente químico testado. O mesmo autor ainda cita que o potencial tóxico de uma
substância é calculado por meio de vários parâmetros que caracterizam sua ação, não em
um individuo isolado, mas em uma população. Os organismos vivos podem exibir diferentes
reações a uma mesma substância tóxica, dependendo do metabolismo próprio da espécie,
das quantidades absorvidas e do tempo de exposição. Desta forma, os parâmetros de
avaliação de toxicidade podem compreender desde alterações fisiológicas, bioquímicas e
histológicas e até a letalidade. Os testes de toxicidade são divididos basicamente em dois
tipos, o agudo e o crônico, podendo ainda estes serem estáticos (sem renovação do meio) e
dinâmicos (com renovação do meio).
A ecotoxicidade, assim como a toxicidade humana, seja crônica ou aguda, é muito
variável entre os agrotóxicos. Produtos muitos tóxicos para um organismo podem não ser
para outros e vice-versa. Entretanto, organismos muitos sensíveis a um dado agrotóxico
podem não ser expostos a ele em concentrações ou doses superiores aos níveis tóxicos
sendo que a exposição é função da biodisponibilidade do agrotóxico ao organismo-teste
(SPADOTTO, 2006).
A mensuração da sensibilidade (resposta) de um organismo frente à qualidade do
seu ambiente em função do tempo pode ser denominada de biomonitoramento, o qual pode
ser a nível bioquímico, fisiológico, morfológico e comportamental (KNIE & LOPES, 2004).
Toda essa sensibilidade depende não somente do fator a ser monitorado, mas também do
nível nutricional, idade do organismo, sexo, fase de desenvolvimento, características
genéticas, competição entre indivíduos ou espécies, além de fatores laboratoriais/ambientais
como luminosidade e temperatura do local onde o organismo é exposto (MAGALHÃES &
FERRÃO FILHO, 2008).
A escolha dos organismo-testes geralmente segue alguns critérios, tais como:
abundância e disponibilidade; representação ecológica; cosmopolitismo da espécie;
conhecimento da sua biologia, fisiologia e hábitos alimentares; estabilidade genética e
uniformidade de suas populações; baixo índice de sazonalidade; sensibilidade constante e
apurada; importância comercial; facilidade de cultivo em laboratório e, se possível, a espécie
29
deve ser nativa para a melhor representatividade dos ecossistemas estudados (KNIE &
LOPES, 2004).
Varias espécies de organismos vem sendo empregadas internacionalmente em
testes de toxicidade, gerando subsídios importantes para uma melhor avaliação e
caracterização dos efeitos agudos e crônicos de diversos agentes tóxicos por si só ou
quando presentes em corpos receptores. Em outros termos, os testes de ecotoxicidade são
ferramentas muito importantes nas avaliações de riscos ecológicos provocados por produtos
químicos. Dentre os principais grupos de organismos utilizados em ensaios laboratoriais,
destacam-se: microalgas, microcrustáCCEOs, equinóides, poliquetas, oligoquetas, peixes e
bactérias, representando os mais diversos ecossistemas e níveis tróficos (MAGALHÃES;
FERRÃO FILHO, 2008).
Assim, os testes de toxicidade são ferramentas desejáveis para avaliar a qualidade
das águas e/ou a carga poluidora de efluentes, uma vez que somente as análises físicoquímicas tradicionalmente realizadas (e.g., DQO, DBO, COT, concentrações de metais e de
outras substâncias de caráter orgânico ou inorgânico), cujos limites encontram-se
estabelecidos nas legislações ambientais, não são capazes de distinguir entre as
substâncias que afetam os sistemas biológicos e as que são inertes no ambiente e, por isso,
não são suficientes para avaliar o potencial de risco ambiental dos contaminantes
(BOUDOU & RIBEYRE, 1989; FERRARI et al., 2004; PANDARD et al., 2006).
Segundo Warne (2003), em uma mistura, três tipos de efeitos combinados são
referenciados: potenciação, sinergismo e antagonismo. A potenciação descreve os casos
em que a toxicidade da mistura é igual à esperada por adição do efeitos tóxicos de cada um
dos elementos da mistura. Já o sinergismo descreve casos em que a toxicidade da mistura
está mais elevada do que o esperado se a mistura fosse aditivo. Por último, o antagonismo
de uma mistura é realçada quando a sua toxicidade é menor do que a soma das toxicidades
do substâncias que compõem a mistura (WANE, 2003; PANOUILLÈRES et al., 2007).
Um outro tipo de resposta paralela à toxicidade clássica é a genotoxicidade, a qual
são agressões ao material genético. Há muito tempo já se conhece que no meio-ambiente
existem muitos agentes físicos e químicos capazes de provocar alterações no material
genético dos seres vivos (KIHLMAN, 1956), definidos aqui como agentes genotóxicos. O
interesse maior de estudar os agentes genotóxicos é que esta classe de poluentes ameaça
a integridade dos ecossistemas, pois estes dependem da sobrevivência e reprodução das
30
espécies/populações. Nesse sentido, a proteção das espécies/populações depende do
desenvolvimento de sistemas eficazes de deteção de agentes genotóxicos no ar, na água e
no solo. Uma abordagem mais pragmática do ponto de vista ambiental é a realização de
testes in vivo e/ou in situ, os quais durante suas execuções experimentais integram as
muitas variáveis ambientais que podem influenciar no potencial genotóxico de uma
substância química (KLEKOWSKI, 1982; SANDHU et al., 1994). Entre os organismos que
podem ser usados nestas avaliações genotóxicas, os vegetais ocupam um lugar de
destaque (GRANT, 1994, COTELLE et al., 1999)
Dentre os vegetais que podem ser utilizados, o teste com a espécie Vicia faba pode
ser considerado um dos mais simples (MA, 1982), permitindo variações experimentais
maiores, o que é de interesse para o presente projeto. O teste com V. faba geralmente é
baseado em aberrações cromossômicas e/ou formação de micronúcleos que podem ter
origem clastogênica (quebra de cromossomos pelo tóxico) ou aneugênica (não-migração de
algum cromossomo durante a divisão celular), sendo inclusive padronizado por
organizações como a Associação Francesa de Normalização (AFNOR) e Organização
Internacional de Padronização (ISO) para o caso da detecção de águas e solos
contaminados (AFNOR, 2004; ISO, 2010).
Com relação ao impacto do formicida sobre os micro-organismos aquáticos, a
hidrólise de FDA é um método que avalia a atividade hidrolítica indiscriminada e tem sido
correlacionada positivamente com a respiração dos micro-organismos no solo (SCHNÜRER
& ROSSWALL, 1982). Em particular, a atividade enzimática proporciona catálise de diversas
reações que são necessárias ao ciclo de vida dos microrganismos, na decomposição de
resíduos orgânicos durante o ciclo de nutrientes e na formação da matéria orgânica e na
estrutura do solo (BURNS, 1978). Diversas pesquisas utilizando FDA para determinar a
atividade enzimática já foram evidenciadas. As atividades enzimáticas (FDA, urease e β –
glicosidase) serviram como indicadoras do potencial da funcionalidade dos ecossistemas e,
aliadas aos demais atributos biológicos, tornam-se boas indicadoras da qualidade
microbiológica de uma amostra (CARVALHO, 2005).
Por outro lado, as alterações de comportamento podem ser resultantes dos efeitos
tóxicos e o comportamento dos organismos intoxicados permite explorar os possíveis
mecanismos de intoxicação envolvidos na ação dos tóxicos (HODGSON, 2010). As
formigas, sendo organismos eussociais (vivendo em comunidades), podem ter suas
31
mobilidades, comportamento e percepções alteradas pela influência do tóxico absorvido,
pois sabe-se que mudanças de comportamento podem ter bases fisiológicas e/ou
neurológicas (HODGSON, 2010). Qualquer mudança de comportamento nos organismos
que vivem em comunidade pode inviabilizar a cooperação entre os organismos e destruir a
comunidade (AYASSE et al., 2001).
32
4 MATERIAIS E MÉTODOS
A Figura 4 apresenta a sequência metodológica utilizada neste trabalho para a
avaliação do formicida. Os testes de ecotoxicidade foram realizados no Laboratório Ecotec,
localizado no município de Balneário Camburiú. Já os testes de genotoxicidade e hidrolise
do FDA foram realizados no laboratório de Remediação Ambiental da UNIVALI.
As
metodologias empregadas no presente estudo foram baseadas em trabalhos publicados e
são descritas a seguir.
Preparação do
Macex
Teste de
estabilidade
toxicológica
Testes
ecotoxicológicos
Teste da hidrólise
enzimática do
FDA
Teste de
Genotoxicidade
Resultados
Figura 4 – Fluxograma dos testes usados na avaliação ecotoxicológica e genotóxica do
formicida Macex.
4.1 PREPARAÇÃO DO TÓXICO
Como o formicida Macex é comercializado na forma de pequenos grãos (iscas),
este foi macerado usando um almofariz e pilão, obtendo assim um pó que foi
homogeneizado em água destilada levemente aquecida, com intuito de facilitar a diluição e
com uma temperatura máxima de 45 °C para que não ocorra a degradação térmica dos
compostos, em um período de duas horas, sob agitação na concentração de 5 g L -1. Em
seguida houve a diluição desta solução em diferentes concentrações que foram usadas na
exposição dos organismos-testes.
4.2 TESTES DE ECOTOXICIDADE
Para a realização dos testes ecotoxicológicos foram utilizados neste trabalho cinco
organismos testes, sendo eles: Danio rerio, Daphnia magna, Scenedesmus subspicatus,
Aliivibrio fischeri e Vicia faba e uma mistura de microorgaanismos presentes nas águas
naturais.
33
4.2.1 Teste Lumistox com a bactéria Aliivibrio fischeri
O teste bacteriano de inibição de luminescência utilizando Aliivibrio fischeri
(anteriormente conhecido como Aliivibrio fischeri) como organismo-teste (Lumistox, Dr.Bruno
Lange, Düsseldorf, Alemanha) foi realizado de acordo com a norma ISO (1996), seguindo as
condições protocolares (23°C ± 2°C, com pH igual a 7 e tempo de exposição de 30 min.). O
reagente
bacteriano
liofilizado
foi obtido
a
partir da
Deutsche
Sammlung
von
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM # 7151 N, Braunschweig, Alemanha). Executou-se
três ensaios diferente em duplicata a fim de avaliar a variabilidade do processo, onde o
composto 3,5 diclorofenol a 6 mg L-1 foi utilizado com controle positivo. A diluição da
amostra de formicida que causou 50% de inibição de luminescência das bactérias com
relação às bactérias–controles (CI50) foi calculada pelo programa acoplado ao equipamento
(Luminômetro), usando a interpolação gráfica.
4.2.2. Teste de inibição do crescimento das algas Pseudokirchneriella subcapitata
A espécie de alga utilizada foi a Pseudokirchneriella subcapitata (no passado
conhecida por Selenastrum capricornutum) Chodat (cepa 86.81 SAG, Göttingen, Alemanha).
Realizaram-se três testes com as algas de acordo com a ISO (1990), tendo, em cada teste,
três replicas para cada concentração e controle. Como controle positivo utilizou-se
dicromato de potássio. A densidade da mistura foi ajustada para 10.000 células.mL-1 através
de diluição com meio ISO. Já os frascos do ensaio foram incubados em um agitador (100
rpm), com iluminação contínua de 70 mE m-2 s-1 com lâmpadas brancas fluorescentes (luz
fria) e temperatura de 23 ± 2°C. Após 72 h de incubação, realizou-se a medição do efeito
inibidor com base na atividade fluorescente (excitação/emissão foram fixados em
comprimentos de ondas 488/685 nm) com um espectrofotômetro Shimadzu RF-551 (Kyoto,
Japão).
Além disso, com intuito de verificar a estabilidade tóxica do Macex, foram realizados
4 ensaios com algas colocadas em microplacas (96 poços) em dias consecutivos de acordo
com o procedimento descrito no Radetski et ai. (1995), usando sempre a solução de agente
tóxico preparada no primeiro dia. Nestes testes com as microplacas, a pré-cultura de algas
com idade de 3-d foi preparada de meio ISO concentrado 2 vezes. A densidade celular da
mistura foi ajustada a 40.000 células.mL-1 e 110 µL dessa solução de algas foi micro
34
pipetado em 60 poços da microplacas (os poços exteriores não foram usados), onde
também foram acrescentados 110 µL das soluções tóxicas concentradas 2 duas vezes
(água para os controles). Aos se misturarem, as soluções de algas e de tóxico caem pela
metade pela diluição entre elas. Antes da incubação, cada microplaca foi selada em sacos
plásticos transparente para minimizar a evaporação durante o período de exposição. Ao fim
de 72 h, os conteúdos das microplacas foram novamente suspensos e o volume total de
cada poço foi micro-pipetado para uma frasco contendo 20 ml de uma solução eletrolítica
(Isoton II, Coulter-França, Paris, França). O fator de diluição foi estimado em 20/0,22, tendo
a evaporação sido inferior a 5%. As algas foram enumeradas com um contador Coulter
(modelo ZM, a abertura da célula de 70 mm). A determinação da porcentagem de inibição, a
área sob a curva de crescimento foi calculada com apenas dois tempos de exposição
(exemplo 0 e 72 h). A determinação da concentração inibidora de 50% do crescimento
(CI50) foi determinada pelo método Probit.
4.2.3 Teste de imobilidade com Daphnia magna
O teste de imobilização de Daphnia magna com duração de 48 horas foi realizado
em conformidade com a norma ISO (1999) à 23±2°C, utilizando 5 indivíduos para cada
réplica (com menos de 24 horas de vida) em copos de vidro de 50 mL com 30 mL do meio
teste contendo o tóxico. Dois ensaios diferentes (em triplicatas) foram realizados para cada
concentração do formicida e controle a fim de avaliar a variabilidade do processo, tendo o
dicromato de potássio com controle positivo à 0,9 mg L-1. Após 48 h de exposição foi
verificado o número de indivíduos imobilizados, o que permitiu a determinação do valor de
CE50 através do teste de Fischer.
4.2.4. Teste com peixe Danio rerio
Os testes de toxicidade estáticos foram conduzidos de acordo com a norma ISO
(1993) utilizando Danio rerio. As amostras de peixes zebras Danio rerio Hamilton Buchanan,
foram obtidos a partir de um fornecedor comercial (indivíduos jovens, recém eclodidos) e
aclimatados ás condições de teste com água sem cloro (pH: 8,1; condutividade: 56 mS.cm-1;
OD: 10,5 mg L-1; dureza total: 88 mg mg L-1 de CaCO3; alcalinidade: CaO 71 mg mg L-1) 9
dias antes da experiência. A concentração de oxigénio dissolvido nas soluções-teste foi
medida no início e no fim da experiência utilizando um eletrodo de Oxigénio. Os peixes
35
foram expostos à diferentes concentrações de Macex durante 96 h, com três replicas de
quatro indivíduos por diluição e colocados em frascos de 2,5 L de solução de teste
ligeiramente arejadas sob 23±2°C, onde para os controles foi utilizado água da torneira sem
cloro. Realizaram-se dois diferentes testes para cada concentração do tóxico a fim de
verificar a variabilidade do processo, sendo que para o controle positivo utilizou-se
dicromato de potássio (concentração de 97 mg mg L-1). Após 96 h de exposição foi
verificado o número de indivíduos mortos, o que permitiu a determinação do valor de CI50
através do teste de Fischer.
4.2.5. Determinação da atividade enzimática pela hidrólise da FDA.
O
método
consiste
em
quantificar
o
Diacetato
de
Fluoresceína
[3’,6’-
diacetilfluoresceina (FDA)] hidrolisada em amostras que contém microorganismos. O teste
foi iniciado com a preparação de uma solução tampão de fosfato de sódio 60 mM, pH 7,6
(8,7 g de K2HPO4 + 1,3 g KH2PO4 para 1 L de água), sendo que o pH foi ajustado com o HCl
0,01M. As amostras de água coletadas em campo foram distribuídas em tubos de ensaios (5
mL de amostra) em três repetições para cada amostra. Concluída esta fase, acrescentou-se
0,2 mL da solução de FDA (concentração final no tubo del 2 mg.mL-1). A preparação da
solução de FDA foi feita pela dissolução de 40 mg de Diacetato de Fluoresceína (FLUKA)
em 1 mL acetona p.a. e 15 mL água destilada. Posteriormente a esta etapa os frascos sem
formicida e com diferentes concentrações do formicida foram fechados com folhas de
alumínio e incubados na temperatura de 27ºC por até 72 h. As amostras foram analisadas
no espectrofotômetro à 490 nm (Espectrofotômetro INSTRUTHERM, Modelo UV 1100). Os
resultados foram expressos de forma bruta, em valores de variação das unidades de
absorbância. A determinação da concentração inibidora de 50% da coloração (CI50) foi
determinada pelo método Probit.
4.3 TESTE DE GENOTOXICIDADE
4.2.6 Teste de genotoxicidade com Vicia faba
Para
os
testes
de
genotoxicidade
foram
utilizadas
sementes
secas de
Vicia faba. Um protocolo já publicado foi adotado com pequenas modificações para este
teste (AFNOR, 2004). As sementes foram deixadas em água deionizada durante 24 h
e depois se colocará as sementes entre duas camadas de algodão molhado a 22 ºC para
36
durante 3 dias para que a germinação pudesse ocorrer. Após a remoção das pontas das
raízes primárias, as plantas foram colocadas em solução nutritiva Hoagland a 22 ºC durante
4 dias para promover o desenvolvimento de raízes secundárias. O formicida foi diluído
em solução de Hoagland em uma série de diluição partindo da concentração de 5 g.L-1,
tendo como controle negativo uma solução de Hoagland e controle positivo a hidrazida
maleica
(10
μM) (HM; CAS
No. 123-33-1)
Hoagland. Colocou-se 3 plantas de Vicia faba
diluído
em solução
nutritiva de
em cada recipiente contendo 100 mL da
solução-teste em triplicatas por concentração, sendo que a exposição ocorreu em
lugar escuro e com duração 72 horas sem renovação do meio de exposição.
Após a
exposição, as raízes secundárias foram lavadas com água deionizada em abundância. Para
o teste de micronúcleo, a ponta de cada raiz foi cortada e fixada durante a noite em solução
de Carnoy (25% de ácido acético glacial: etanol 75%, v:v) a 4 ºC e armazenada, se
necessário, em etanol a
70% a
4
ºC. Em seguida,
as pontas de
raízes foram
hidrolisadas em HCl 1 N a 60 ºC durante 6 minutos e esmagadas entre uma lâmina e uma
lamela,
sendo
coradas
com solução
a
1% de
aceto-orceína.
As
frequências de
micronúcleos foram numeradas com 1.000 células por ponta de raiz (duas raízes por réplica)
em um microscópio com aumento de 400X. Ao mesmo tempo, houve a anotação do número
de células mitóticas. A razão entre o número de células na mitose e do número total
de células é chamado o índice mitótico (IM), sendo este indicador de citotoxicidade,
enquanto que o número de micronúcleos é indicador de gentoxicidade.
4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS DOS TESTES DE ECOTOXICIDADE
A análise estatística foi realizada através de um microcomputador utilizando o
programa TOXSTAT 3.0. Utilizou-se o teste de William (P 0,05) para obter a concentração
sem efeitos observáveis (CSEO) e menor concentração com efeitos observáveis (CCEO),
após a verificação da normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e a homogeneidade da
variância pelo teste de Hartley. Em alguns casos (peixe e dafnídeos) foi utilizados o teste de
Fischer (P 0.05). Por fim, os valores de CI50 ou CE50 foram calculados por interpolação
gráfica ou análise Probit.
37
5 RESULTADOS
5.1 TESTE DE ESTABILIDADE TOXICOLÓGICA DO MACEX
Em virtude da duração dos testes ecotoxicológicos, procurou-se conhecer a
estabilidade tóxica do formicida Macex em solução em função do tempo. Assim, um
experimento foi concebido para verificar se os compostos sofriam degradação em solução, o
que se poderia perceber pela diminuição de sua toxicidade em função do tempo. Os
resultados dos testes realizados com a mesma solução estoque do formicida, mas com
idades diferentes, são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas à diferentes
concentrações do formicida Macex. Os valores são de 4 testes iniciados com 24 h de intervalo
usando a mesma solução estoque de Macex no preparo das diluições.
Dia
1
2
3
4
CSEO (g L-1)
CCEO (g L-1)
CI50 (g L-1)
0,06
0,12
0,63
0,03
0,06
0,49
0,06
0,12
0,59
0,06
0,12
0,55
Intervalo de
Confiança
(95%)
0,52 – 0,60
As leituras para os testes foram realizadas durante 4 dias com intervalo de 24 horas,
totalizado para o ultima leitura um total de 7 dias após o preparo da solução estoque. Os
resultados da Tabela 3 mostram que o Macex em solução é estável para o período testado,
pois se contarmos desde o dia do preparo da solução estoque até o último dia do último
teste. Assim, no conjunto dos dados obtidos, a CI50 média dos 4 testes foi de 0,56 g L-1 com
um desvio-padrão de ± 0.06 g L-1 e um coeficiente de variação de 10.6%. Esta estabilidade
tóxica do Macex assegura que os resultados dos testes não sofreram nenhum viés devido à
degradação intrínseca do produto em solução. A estabilidade da toxicidade do produto pode
ser explicada pela composição do formicida, pois os ácidos graxos e a cafeína não são
facilmente degradados ou hidrolisados em solução com pH próximo do neutro. Entretanto,
38
não se realizou analise química para cada leitura e sim, só para a solução estoque a qual
mostrou valor similar à concentração nominal com variação de concentração menor do que
10 % entre a concentração medida e a concentração nominal.
5.2 TESTE DE TOXICIDADE COM ALIIVIBRIO FISCHERI.
O teste de ecotoxicidade mais realizado no mundo em termos de custo e rapidez é o
que utiliza a bactéria marinha bioluminescente Aliivibrio fischeri, o qual recebe o nome de
Microtox® ou Lumistox®. Nesse teste é medida a redução da luminescência emitida
naturalmente pela bactéria quando ela é posta em contato com um agente tóxico, o qual
inibe a atividade da enzima luciferase. O tempo de duração do teste varia entre 15 e 60 min.
Este teste é considerado rápido, sensível, fácil de executar e de baixo custo que pode ser
utilizado no controle da poluição das águas e efluentes industriais, tendo este teste o maior
banco de dados ecotoxicológicos. Em termos de amostras testadas. Apesar dessas
vantagens é um teste criticado por empregar uma bactéria marinha de pouco significado
ecológico (ZAGATTO e BERTOLETTI, 2006), no entanto, o metabolismo e o comportamento
da A. fischeri é parecido com os das bactérias heterotróficas presentes no meio ambiente.
Conforme mostra a Figura 4, houve diferença significativa na luminescência
bacteriana entre os microrganismos controles e os que foram expostos ao formicida Macex.
Figura 5 – Valores de luminescência para as bactérias Aliivibrio fischeri expostas à diferentes
concentrações do formicida Macex durante 30 minutos.
39
Assim, para A. fischeri, o valor de CI50 foi de 0,89 g L-1, enquanto os valores de
CSEO e CCEO foram de 0,12 g L-1 e 0,25 g L-1, como podem ser vistos na Tabela 4. Os
valores dos coeficientes de variação, geralmente menores que 15%, são aceitáveis, visto
que a literatura preconiza como valor aceitável de até 20%. Baseado nesses valores obtidos
nos testes, o Macex apresenta baixa toxicidade, podendo assim concluir que a quantidade
solubilizada do formicida no meio ambiente não afetará significativamente a atividade
bacteriana dos ecossistemas aquáticos. O único estudo de ecotoxicologia aquática sobre o
Macex encontrado na literatura e que usou A. fischeri, mostrou uma CI50 de 0,98 g L-1, com
CSEO e CCEO de 0,25 e 0,50 g L-1, o que são valores muito próximos daqueles obtidos no
presente trabalho (BURGA-PEREZ et al., 2013).
Tabela 4 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as bactérias Aliivibrio fischeri expostas à
diferentes concentrações do formicida Macex.
Macex
Luminescência
(g L−1)
0
0,03
0,06
0,12
0,25
0,5
1
1,23
1,21
1,28
1,19
1,04
0,89
0,4
CV
(%)
CSEO
(g L−1)
CCEO
(g L−1)
CI50
(g L−1)
Intervalo de
confiança (95%)
15,2
12,8
9,5
13,7
10,6
12,3
15,9
0,12
0,25
0,89
0,87-0,91
5.3 TESTE DE TOXICIDADE COM PSEUDOKIRCHNERIELLA SUBCAPITATA.
Quando se trata de um teste crônico em meio aquático relativamente rápido, as algas
ocupam lugar de destaque, pois a cada cerca de 20 h, uma nova geração de algas é
formada. Os ensaios com algas também possibilitam determinar o potencial de eutrofização
que os outros organismos aquáticos não medem. A Figura 5 mostra os resultados dos
ensaios de inibição do crescimento das algas P. subcapitata expostas à diferentes
concentração de Macex.
40
Figura 6 - Valores médios da variação da fluorescência da alga Pseudokirchneriella
subcapitata exposta à diferentes concentrações de Macex durante 72 h.
Após análise estatítica obteve-se um valor de CI50 de 0,49 g L-1, CSEO de 0,06 g L-1e
CCEO de 0,12 g L-1 (tabela 5) O estudo de Burga-Pérez et al. (2013) com Macex e P.
subcapitata encontrou um valor de CI50 de 0,79 g L-1, com valores de CSEO e CCEO de
0,25 e 0,50 g L-1, respectivamente. Estes valores não são tão próximos aos encontrados
neste trabalho realizado em Erlenmeyers, pois os testes realizados por Burga-Pérez et al.
(2013) foram realizados em microplacas.
Tabela 5 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas à diferentes
concentrações do formicida Macex.
Macex
Fluorescência
(g L−1)
0
0,03
0,06
0,12
0,25
0,5
1
1,49
1,54
1,42
1,21
1,09
0,71
0,31
CV
(%)
CSEO
(g L−1)
CCEO
(g L−1)
CI50
(g L−1)
Intervalo de
confiança (95%)
13,5
14,9
10,8
13,5
18,1
11,5
20,3
0,06
0,12
0,49
0,44-0,54
41
5.4 TESTES DE ECOTOXIDADE DO MACEX COM DAPHNIA MAGNA.
Na Ecotoxicologia, o uso de espécies de pequeno porte e ciclo de vida não muito
longo se mostram ideal nos estudos em laboratórios. A espécie Daphnia magna (entre
outros cladóceros) tem o protocolo de cultivo em laboratório bem estabelecido e não
apresenta muitas dificuldades para sua manutenção (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2006). As
dáfnias são importantes nas cadeias alimentares e são fonte significativa de alimento para
peixes, como também são sensíveis a vários contaminantes do ambiente aquático (COSTA,
2008). Além disso, a reprodução assexuada desses crustáCCEOs por partenogênese
garante a produção de organismos geneticamente idênticos permitindo, assim, a obtenção
de organismos-teste com sensibilidade constante.
A Figura 6 mostra os resultados dos ensaios de mobilidade do cladócero Daphnia
magna expostos à diferentes concentração de Macex.
Figura 7 - Valores médios de Daphnia magna imobilizada após 48 h de exposição a diferentes
concentrações de Macex.
Os resultados da Tabela 5 mostram uma baixa toxicidade do formicida Macex face
ao cladócero Daphnia magna, uma vez que os valores CE50 foi de 0,68 g L-1 e para o CSEO
o valor foi de 0,12 g L-1 e CCEO de 0,25 g L-1, sendo esses valores próximos aos obtidos
para A. fischeri e P. subcapitata. No estudo de Burga-Perez et al. (2013), os valores de
CE50 encontrados para D. magna foi de 0,82 g L-1, enquanto os valores de CSEO e CCEO
foram respectivamente de 0,25 e 0,50 g L-1.
42
Tabela 6 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para Daphnia magna expostas à diferentes
concentrações do formicida Macex.
Macex
(g L−1)
Imobilidade
0
0,03
0,06
0,12
0,25
0,5
1
0
0
0
6,7
20
43,3
80
(%)
CV
CSEO
(g L−1)
CCEO
(g L−1)
CE50
(g L−1)
Intervalo de
confiança (95%)
12,3
13,1
15,8
14,6
0,12
0,25
0,68
0,61-0,75
5.5 TESTES DE ECOTOXIDADE DO MACEX COM DANIO RERIO
Os principais representantes dos consumidores secundários nas cadeias alimentares
são os peixes (GHERARDI-GOLDSTEIN et al., 1990). Diversas espécies de peixes são
utilizadas como bioindicadores. No Brasil a espécie mais utilizada é o Danio rerio, o qual é
vulgarmente conhecido como peixe paulistinha ou peixe zebra. Outra espécie recomendada
pela ABNT é Pimephales promelas (ABNT, 2004). Os peixes, por serem considerados como
importante recurso alimentício, podem ser a principal via de contaminação de produtos
químicos tóxicos para o homem, via bioacumulação, daí a sua importância como
organismos indicadores.
A Tabela 7 mostra os resultados dos ensaios de letalidade do peixe Danio rerio
expostos à diferentes concentração de Macex.
Tabela 7 - Valores médio de letalidade de Danio rerio, após 96 h de exposição à diferentes
concentrações de Macex.
Macex
(g L−1)
Letalidade
(%)
CV
CSEO
(g L−1)
CCEO
(g L−1)
CL50
(g L−1)
Intervalo de
confiança (95%)
0
0,06
0,12
0,25
0,5
1
2
0
0
0
0
0
0
12,5
16,9
1
2
>2
-
43
Os valores obtidos no teste de ecotoxicidade para Danio rerio nas diferentes
concentrações do Macex não foram suficiente para calcular uma CL50. Entretanto os valores
obtidos para CSEO e CCEO foram de 1,00 g L-1 e 2,00 g L-1 respectivamente. Assim os
resultados sugerem uma baixo impacto ambiental do Macex para peixes após exposição
aguda.
5.6 TESTE DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO FDA
O impacto do Macex sobre a atividade hidrolítica dos microorganismos presentes nas
águas naturais foi analizada pela variação da absorbância relativa à hidrólise do FDA, a qual
forma a fluoresceína, deixando a solução com coloração verde. Assim, a Figura 8 mostra os
resultados dos ensaios de variação da absorbância provocada pela hidrólise da FDA quando
exposta aos microorganismos aquáticos expostos à diferentes concentração de Macex.
Figura 8 - Valores médios da variação da absorbância devido à hidrólise do FDA por
microorganismos presentes nas águas expostos à diferentes concentrações de Macex durante
72 h.
Assim, para a hidrólise do FDA pelos microorganismos apresentados na Tabela 8, o
valor de CI50 foi > 1,0 g L-1, enquanto os valores de CSEO e CCEO foram de 0,25 g L-1 e
0,50 g L-1. Estes valores podem ser comparados com os valores obtidos com o outro
microorganismo usado neste trabalho, a bactéria A. fischeri, cujo valor de CI50 foi de 0,89 g
L-1, enquanto os valores de CSEO e CCEO foram de 0,12 g L-1 e 0,25 g L-1. Poder-se-ía
44
concluir que os microorganismos naturais são um pouco mais resistentes à toxicidade do
Macex, mas mesmo assim, o valor da CI50 foi relativamente alto, com baixa probabilidade
de causar efeitos nefastos aos microorganismos, pois dificilmente encontraremos situações
no meio ambiente onde o Macex estará em concentrações tão elevadas quanto estas.
Tabela 8 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para microorganismos aquáticos expostos à
diferentes concentrações do formicida Macex.
Macex
(g L−1)
Absorbância
CV
(%)
CSEO
(g L−1)
CCEO
(g L−1)
CI50
(g L−1)
Intervalo de
confiança (95%)
0
0,03
0,06
0,12
0,25
0,5
1
0,95
0,99
0,88
1,02
0,87
0,71
0,61
15,8
16,9
17,8
16,5
17,0
14,9
14,2
0,25
0,5
>1
-
5.7 TESTE DE GENOTOXICIDADE COM VICIA FABA
A Figura 3 apresenta o índice mitótico e as frequências de micronúcleos obtidos na
exposição de Vicia faba em diferentes concentrações do formicida. As concentrações de
Macex até 0,25 g L-1 não promoveram efeitos no índice mitótico da Vicia faba, mas as
concentrações de 0,5 e 2,0 g L-1 apresentaram uma diminuição estaticamente significativa
no índice mitótico.
Em relação as frequência de micronúcleos, foi observado a não-indução para
concentrações inferiores de 2,0 g L-1, enquanto que, o controle positivo (isto é, B2) mostrou
um aumento significativo na frequência de micronúcleos em comparação com o controle
negativo, ou seja, B1 (solução Hoagland).
45
Mcn/1000 células
60
12
Mcn
IM
*
50
10
IM (%)
*
40
8
**
30
6
20
4
*
10
2
**
0
0
0
0.125
0.25
0.5
2
HM
Formicida (g L-1)
Figura 9 - Média (± DP) da frequência de micronúcleos (Mcn/1000 células) e índice mitótico (IM,
%) em raízes de Vicia faba expostas 48h ao formicida Macex HM (hidrazida maleica): controle
positivo.
* diferença estatisticamente significativa com relação ao controle (P ≤ 0.05)
** diferença estatisticamente significativa com relação ao controle (P ≤ 0.01).
Na literatura não há relatos sobre a genotoxicidade/mutagenicidade dos ingredientes
do Macex nas concentrações utilizadas para este estudo. A cafeína, possível ingrediente
ativo do Macex, foi relatada como sendo fracamente mutagênica em alguns modelos
animais não mamíferos. Nos ensaios de Salmonella (teste de Ames), não houve
mutagenicidade e este composto (cafeína) não teve efeitos significativo na frequência de
indução nas trocas de cromátides irmãs (KIHLMAN & STURELID, 1978)
Apesar do número pequeno de ensaios utilizados neste estudo, esses resultados são
promissores em relação aos impactos ambientais a partir da genotoxicidade, pois enquanto
o Macex não apresenta este efeito, o formicida clorpirifos tem sido relatado como genotóxico
para a espécie de peixe da espécie Channa punctatus e em leucócitos de ratos (ALI et al.,
2008; PORICHHA et al., 1998; RAHMAN et al., 2002.). Também há estudos relatando este
46
produto como genotóxico para células de raízes das plantas Crepis capilares, Allium cepa e
para ensaio de micronúcleo com Tradescantia (ASITA & MAKHALEMELE, 2008; DIMITROV
& GADEVA 1997; RODRIGUES et al., 1998).
47
6
DISCUSSÃO
A crise de biodiversidade que se observa atualmente é devido, entre outras causas,
à presença de substâncias químicas tóxicas liberadas no meio ambiente. No caso dos
agrotóxicos, um estudo recente analizou os índices de biodiversidade de invertebrados em
riachos da França, Alemanha e Austrália (BEKETOV et al., 2013). Estes autores
constataram perdas de até 42% para certas famílias e espécies, mesmo em regiões onde o
uso de agrotóxicos está bem regulamentada, obedecendo aos padrões de proteção
ambiental. Para se evitar este tipo de problema, é de fundamental importância o uso dos
testes de ecotoxicidade antes de se liberar o produto para o mercado e mesmo depois de
ser liberado, pois pode haver casos em que as transformações ambientais deixam os
metabólitos do produto mais perigosos. Também podem existir espécies de organismos não
testados previamente que possam ser sensíveis a este produto e/ou metabólitos.
A Tabela 9 mostra baixos efeitos a curto prazo (testes agudos) de ecotoxicidade em
diferentes espécies de organismos aquáticos. Com base nesses valores, é possível
descrever a toxicidade do Macex como não sendo altamente tóxico, apresentando CE(CI)50
maiores que 0,1 g L-1, limite aceito como sendo não tóxico (KAMRIN, 1977). Essa baixa
ecotoxicidade pode ser explicado pelo fato que os ingredientes do Macex não são tóxicos e
também pelo fato que o produto comercializado mostra baixa solubilidade em água. Nesse
sentido, alguns estudos realizados em várias regiões do mundo mostram que a
porcentagem dos produtos utilizados na agricultura que atingem os ambientes aquáticos é
geralmente baixa (JURY et al., 1987; SOLOMON et al., 1996).
Deve-se salientar que os bioensaios utilizados para este estudo incluem organismostestes requeridos pela Diretiva 91/414/CEE para os novos produtos químicos industriais
(MARTINS et al. 2007).
48
Tabela 9 - Ecotoxicidade do Macex obtidos através de quatro espécies de organismos- teste e
outros dados de ecotoxicidade para formicidas comercializados a base de sulfluramida,
fipronil e clorpirifos.
Organismos
Teste
Parâmetros
(CI, CL ou
CE50)
Macex
Sulfluramida
Fipronil
Clorpirifos
Bacteria
Inibição de
luminescência
890 (30
min)
-
> 100
(30 min)
2,8
(30 min)
Microorganismos
Hidrólise FDA
>1000
(72 h)
-
-
-
Alga
Inibição de
crescimento
490
(72 h)
68,1 (96 h)
0,16 (96 h)
3,0 (96 h)
Dafnia
Imobilidade
680
(48 h)
0,39 (48 h)
0,19 (48 h)
0,0017 (48 h)
Peixe
Letalidade
> 2000
(96 h)
9,9
85
0,43
Produto (mg L-1)
Segundo a classificação de toxicidade aguda da Organização Mundial da Saúde
(OMS), a sulfluramida é classificada como pouco perigoso, enquanto finopropil e clorpirifos
são classificados como moderadamente perigosos. Entretanto, de acordo com os dados
publicados, a ecotoxicidade destes inseticidas é diferente, com finopropil e clorpirifos sendo
classificados como altamentes ecotóxicos (BARRON & WOODBURN 1995; GUNASEKARA
et al. 2007) e enquanto sulfluramida e considerando como ligeiramente ecotóxico
(KRIEGER, 2001).
No caso do Macex, a classificação da OMS para testes de toxicidade em ratos,
permite classificar este inseticida como “Improvável que seja perigoso”, onde o valor de CE
(CI ou CL)50 é maior que 100 mg kg-1 de peso corporal no teste oral agudo. Devido a este
elevado valor tóxico apresentado pelo Macex, este não pode ser classificado de acordo com
a Diretiva Europeia 93/67/CEE (Comissão Européia 1996). O principal composto ativo de
ação deste químico (provavelmente a cafeína), interfere com os sistemas semioquimicos e
não pode ser considerado um produto tóxico na concentração presente no Macex. Isto é
apoiado com base em observações em campo, onde se verificou que as formigas não foram
mortas pela a ingestão do produto, mas sim na alteração comportamental e por
consequência desestruturação social da colônia, levando as mortes individuais.
Com relação aos ensaios de genotoxicidade realizados neste estudo, aplicou-se um
teste ambiental baseado no ensaio de micronúcleos da V. Faba. Os níveis de citoxicidade
49
de um agente pode ser observado pelo índice mitótico, uma vez que este reflete o índice de
freqüência da divisão celular, sendo considerado como um parâmetro importante na
determinação da taxa de crescimento da raiz (FERNANDES et al. 2007). Os efeitos
adversos genotóxicos e/ou mutagênicos dos pesticidas através da alteração genéticas
induzidas nas sementes, leva à alterações na constituição genética na populações, o que é
motivo de preocupação fundamental em se pensando em um ecossistema, pois um tempo
prolongado de exposição crônica pode levar a mudanças na estrutura do ecossistema
(WURGLER & KRAMERS 1992). Além disso, a presença de genotoxinas em qualquer
compartimento ambiental é indesejável, em particular no ponto de vista de risco para os
humanos (WURGLER & KRAMERS, 1992).
Os resultados mostram que o formicida Macex apresenta genotoxicidade apenas em
concentrações muito altas (não realísticas), na ordem do ppmil para a V. faba. No entanto,
os resultados mostraram que o índice mitótico (IM) da V. faba diminuiu significamente em
uma concentração de 0,5 mg L-1 de formicida. O IM reflete a atividade mitótica dos
meristemas e a diminuição deste índice é sinal de citoxicidade (AFNOR, 2004; SMAKAKINCL et al., 1996; ÜNYAYAR et al., 2006). Além disso, a inibição da multiplicação celular
prejudicará o crescimento das raízes (FUSCONI et al., 2006; NOODÉN, 1969). Assim, o
aumento é resultados da indução da divisão celular, evento que pode ser caracterizado
como prejudicial para as células (HOSHINA, 2002), mas ainda há pouca informação
disponível na literatura em relação ao estudo relacionado ao índice mitótico e o
desenvolvimento das plantas.
Os diferentes compartimentos ambientais estão recebendo cada vez mais mais
produtos químicos de variadas composições, os quais necessitam de avaliações
ecotoxicológicas, não só previamente à colocação no mercado, como após o uso no meio
ambiente para poder avaliar o impacto ambiental em função das transformações que
possam ter ocorrido durante a estadia e passagem da substância nos diferentes
compartimentos. O contato desses produtos químicos com os organismos desses
compartimentos acaba dificultando a compreensão de quais substâncias são mais perigosas
para a fauna e para a flora. Os ensaios em laboratório ajudam nessa compreensão, pois
pode-se trabalhar com uma única substância e assim, pode-se obter dados dos efeitos
dessa substância em vários tipos de organismos (PAULUS, 2005; KLAUSENER et al.,
2007).
50
Uma questão importante e que tem relação com o objetivo deste tabalho é a
translocação/transferência das substâncias químicas entre os compartimentos. Nesse
aspecto, o formicida natural Macex é aplicado no solo, mas existe a possibilidade de que
parte do produto chegue no ecossistema aquático, principalmente pelo fenômeno de
carreamento pelas águas das chuvas (PEREIRA et al., 2009; POGÃCEAN & GAVRILESCU,
2009), pois na forma de isca, este formicida é resistente à solubilização e a via de entrada
deste formicida nos organismos é a via gástrica. Como já citado, Tiepo et al. (2010)
publicaram um trabalho sobre a ecotoxicidade deste produto em alguns organismos
terrestres, contudo, até a elaboração deste projeto de dissertação, não se encontrou na
literatura nenhum trabalho de ecotoxicidade deste produto sobre organismos aquáticos, com
exceção do trabalho de BURGA-PEREZ et al. (2013). Assim, os dados levantados nesta
dissertação podem servir de base para futuros trabalhos relativos à ecotoxicidade do
formicida Macex.
Do ponto de vista etológico, a base da estrutura social das formigas é o sistema de
comunicação, sendo essencial para a troca de informações entre esses insetos e
manutenção da ordem no formigueiro. Em virtude da falta de dados toxicológicos da cafeína
frente às formigas é necessário também outros estudos com insetos sociais da ordem
Himenoptera (por exemplo, abelhas e cupins) para avaliar os impactos do Macex nesse tipo
de espécies e pesquisas mais detalhadas para compreender o mecanismo de ação do
Macex com intuito de obter mais informações sobre o efeito no sistema de comunicação, o
qual poderia justificar o conceito de formicida disruptor semiótico nesses insetos sociais.
51
7 CONCLUSÃO
Com relação a ecotoxicidade do Macex, os resultados mostraram que a alga P.
subcapitata (CI50 de 0,49 g L-1 para 72-h) foi a mais sensível das espécies estudada seguido
por D. magna (CI50 de 0,68 g L-1 para 48-h). As bactérias A. fischeri (CI50 0,89 g L-1 para 30
min) apresentaram a menor toxicidade, juntamente com os microorganismos responsáveis
pela hidrólise do FDA (CI50 >1,0 g L-1 para 72 h) e o peixe D. rerio (CL50 > 2,0 g L-1 para 24h). Com base nos dados obtidos a partir dos testes de ecotoxicidade, o formicida Macex
pode ser classificado como um produto de baixa toxicidade e baixo impacto sobre
organismos não-alvos.
Nas concentrações testadas no teste de genotoxicidade (0,06 à 1,0 g L-1), não foi
observado genotoxicidade, no entanto as concentrações de 0,5 g L-1 e 2,0 g L-1 mostraram
diminuição do índice mitótico para V. faba, sendo que para a concentração de 2,0 g L-1
houve um aumento significativo no número de micronúcleos. Assim, os resultados
mostraram que o Macex pode ser classificado como genotóxico, mas em altas
concentrações em comparação a outros formicidas.
A possibilidade de lixiviação do Macex, evitando assim a dispersão do mesmo no
meio ambiente e a interação das moléculas do inseticida com as partículas do solo antes
destas atingirem as águas superficiais e subterrâneas pode fazer com que a ecotoxicidade
potencial do Macex seja mais baixa comparativamente aos resultados dos biotestes em
laboratório. Outro aspecto ambiental relacionado a utilização de formicidas é o fato de que
estes não são utilizados apenas no contexto agrícola, pois as formigas estão presentes
também em ambientes urbanos (GREY et al., 2005). Assim, o combate desses insetos por
autoridades públicas, empresas privadas e manutenção de jardins particulares são
potenciais consumidores dos formicidas e a exposição das pessoas á esses compostos
tóxicos poderia ser evitada utilizando produtos de baixa toxicidade. A baixa genotoxicidade e
ecotoxicidade deste formicida é devido ao seu mecanismo de ação, o qual possivelmente
interfere nos sistema semioquímicos de comunicação entre os insetos, o que é especifico
para os organismos da ordem dos Himenópteros.
Esses dados de toxicidade aquática do Macex podem ser muito úteis para gestores
ambientais e comunidade científica. Entretanto, devido ao número limitado de testes e
condições testadas, este estudo também deve ser considerado como uma investigação
52
inicial dos possíveis problemas decorrentes da aplicação do formicida no ambiente, sendo
necessário uma maior amplitude de testes buscando conhecer aspectos específicos deste
formicida frente a diferentes organismos.
53
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9 ANEXOS
9.1 ARTIGOS
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