Tubos Leucosep
LTK.615
FOLHETO INFORMATIVO
Para utilização em diagnóstico in vitro
PI-LT.615-PT-V3
Informações e instruções
Utilização a que se destina
Os tubos Leucosep destinam-se a ser utilizados na colheita e separação de células mononucleares
de sangue periférico (PBMCs) do sangue total. Os tubos facilitam a separação de PBMCs do
sangue total quando se utiliza o procedimento FICOLL-PAQUE* PLUS antes do uso destas células
em análises ELISPOT.
Introdução
As técnicas ELISPOT utilizam células T em PBMCs que foram separadas do sangue total. Um
método para separar estas células requer a utilização de FICOLL-PAQUE PLUS. Este
procedimento envolve uma série de etapas que devem ser executadas com cuidado para
assegurar resultados óptimos. A utilização de tubos Leucosep reduz o número de etapas, torna o
procedimento mais robusto e reduz a quantidade de tempo necessária para executar o
procedimento de separação.
Princípio do Método
Os tubos Leucosep foram desenvolvidos para obter uma separação óptima de PBMCs do sangue
total humano por meio de centrifugação por gradiente de densidade. Os tubos Leucosep são de
polipropileno transparente e têm uma barreira porosa. Esta barreira biologicamente inerte é
constituída por polietileno de grau elevado. O tubo Leucosep elimina o moroso e laborioso
processo de colocação do material da amostra sobre FICOLL-PAQUE PLUS. O sangue total
anticoagulado é misturado com meios de cultura sendo depois deitado no tubo Leucosep. A
barreira porosa não deixa o sangue misturar-se com o meio de separação (FICOLL-PAQUE
PLUS). Durante a centrifugação, as PBMCs são separadas de eritrócitos indesejados devido às
suas densidades diferentes e são acumuladas na interface acima do meio de separação. Quando
a separação está concluída, a barreira impede a recontaminação da camada de PBMC durante a
sua remoção.
Advertências e Precauções
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Apenas para utilização em diagnóstico in vitro.
Apenas para utilização profissional; os operadores devem receber formação sobre este
procedimento.
As amostras de sangue devem ser consideradas como potencialmente perigosas. É
necessário cuidado ao lidar com material de origem humana.
O manuseamento de amostras de sangue total e de componentes de análises durante a
utilização, conservação e eliminação deve ser feito de acordo com os procedimentos
definidos nas directrizes ou regulamentos nacionais apropriados em matéria de segurança
contra riscos biológicos.
Qualquer desvio dos procedimentos recomendados para pipetagem, técnicas de lavagem,
tempos e/ou temperaturas de centrifugação pode alterar a pureza dos isolamentos de PBMC
e influenciar resultados de testes posteriores.
Não colher sangue em Tubos de Preparação de Células (CPT™, Becton Dickinson) ou em
tubos de colheita de sangue com EDTA, porque são incompatíveis com os tubos Leucosep.
Não refrigerar nem congelar amostras de sangue total. Conservar e transportar as amostras
de sangue para o laboratório a temperaturas entre 18 e 25 °C ou 10 e 25 °C se as amostras
vão ser tratadas com o reagente T-Cell Xtend™.
O sangue não deve ser conservado durante mais de 8 horas, ou 32 horas se for tratado mais
tarde com o reagente T-Cell Xtend.
Utilizar apenas recipientes de uso único para a colheita de amostras de sangue venoso.
Não utilizar para além do prazo de validade.
Usar técnicas assépticas quanto utilizar este produto.
Não conservar os tubos Leucosep sob luz directa.
Não utilizar se os tubos Leucosep estiverem danificados ou se FICOLL-PAQUE PLUS se tiver
deteriorado, conforme indicado pelo aparecimento de uma cor amarela distinta ou matéria
particulada na solução transparente.
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Materiais fornecidos
Cada caixa contém:
50 tubos Leucosep pré-cheios com FICOLL-PAQUE PLUS.
CD contendo o folheto informativo e a folha de dados de segurança do material.
Conservação e Estabilidade
Conservar entre 4 e 30 °C sem abrir até à data de validade indicada na caixa. Conservar o
produto aberto à temperatura ambiente (18-25 °C) e utilizar nas 12 semanas a seguir à abertura do
saco exterior ou antes do prazo de validade na caixa, o que ocorrer primeiro.
Equipamento e materiais necessários mas não fornecidos
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Tubos de colheita de sangue heparinizados.
®
Meios de cultura de células AIM V e RPMI.
Tubos de centrifugação de 15 ml.
Uma centrifugadora para a separação das PBMCs com uma capacidade mínima de 1000
RCF (g) e capaz de manter as amostras à temperatura ambiente (18-25 °C).
Armário com um nível de biosegurança 2 (BL 2) (recomendado).
Pipetas e pontas de pipetas estéreis.
Kit ELISPOT.
O reagente T-Cell Xtend poderá ser necessário se forem utilizadas amostras com mais de 8
horas.
Procedimento
Nota: Os passos que se seguem devem ser executados utilizando os princípios de Boas
Práticas Laboratoriais:
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Certifique-se de que tem o número necessário de tubos Leucosep à temperatura ambiente
(18-25 °C) antes de utilizar.
Se FICOLL-PAQUE PLUS tiver acumulado acima da barreira porosa, centrifugar os tubos
Leucosep a 350 xg durante um minuto para o FICOLL-PAQUE PLUS ficar abaixo da barreira.
Inverter a amostra de sangue total e a seguir diluir numa proporção de 5 partes de sangue
para 3 partes de meio de cultura de células AIM V ou RPMI num tubo de centrifugação de
15 ml. Inverter o tubo de centrifugação várias vezes para misturar.
Deitar o sangue diluído directamente no tubo Leucosep e centrifugar a 1000 xg durante 10
minutos a 18-25 °C sem travão.
Aspirar a camada turva de PBMC e preencher até ~10 ml com AIM V ou RPMI num tubo de
centrifugação de 15 ml. Inverter o tubo de centrifugação para misturar.
Centrifugar a 600 xg durante 7 minutos. Eliminar o sobrenadante.
Resuspender o concentrado de células com AIM V ou RPMI, preencher até ~10 ml com AIM
V ou RPMI e centrifugar a 350 xg durante mais 7 minutos.
Eliminar o sobrenadante e resuspender o concentrado de células no volume de AIM V (não
RPMI) requerido pela análise ELISPOT.
Se forem necessárias células para estimulação de antigénio numa análise ELISPOT, diluir as
células de acordo com AIM V (não RPMI).
Limitações
1.
Tal como acontece com outros métodos de separação, os tubos Leucosep podem alterar a
proporção de alguns subconjuntos de PBMC (por exemplo, células T e B) em relação àqueles
do sangue total não separado. Crê-se que esta alteração é relativamente insignificante em
casos normais.
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Controlo de qualidade
As análises internas não revelaram uma diminuição significativa em rendimentos de PBMC,
quando comparado com FICOLL-PAQUE PLUS com tubos Leucosep. Como parte de uma
actividade de controlo de qualidade de laboratório individual, os métodos de contagem de células
devem ser concebidos e validados para garantir a obtenção de PBMCs suficientes para o sistema
de teste relevante. Além disso, as actividades de controlo de qualidade devem empregar a
utilização de controlos positivos e negativos, desenvolvidos para assegurar o desempenho
esperado das células T dentro do sistema de teste relevante.
Características do desempenho
Sangue conservado utilizando o reagente T-Cell Xtend
Foram obtidas duas amostras de sangue de 6 ml de 46 dadores. Uma amostra de cada dador foi
processada nas 8 horas a seguir à venipuntura por sistema de camadas FICOLL* manual. A
segunda amostra foi processada utilizando um tubo Leucosep ao fim de 29-32 horas de
conservação utilizando o reagente T-Cell Xtend.
Foram obtidas células suficientes utilizando ambos os métodos para as amostras a serem
processadas numa análise ELISPOT, e as células obtidas de todas as amostras mostraram-se
funcionais no ensaio.
Sangue fresco
Foram obtidas duas amostras de sangue de 6 ml de 52 dadores. Ambas as amostras de cada
dador foram processadas nas 8 horas a seguir à venipuntura. A primeira amostra foi processada
pelo sistema de camadas FICOLL manual. A segunda amostra foi processada utilizando um tubo
Leucosep.
Foram obtidas células suficientes utilizando ambos os métodos para as amostras a serem
processadas numa análise ELISPOT, e as células obtidas de todas as amostras mostraram-se
funcionais no ensaio.
Guia para resolução de problemas na colheita e separação de PBMCs para ELISPOT
Problema
Baixa produção de células
Folheto informativo de Leucosep
Causa potencial
Leucopenia
Solução possível
Adicionar mais um tubo de
colheita de sangue
Colheita de sangue mal feita
Os tubos CPT e de colheita de
sangue contendo EDTA não
são compatíveis com tubos
Leucosep
O tubo de colheita de sangue
não está à temperatura
ambiente (18-25 °C)
Deixar o tubo de colheita de
sangue equilibrar à
temperatura ambiente
O sangue não foi conservado
à temperatura necessária
Certificar-se de que o sangue
é expedido a 18-25 °C ou
10-25 °C se for utilizado
reagente T-Cell Xtend
Utilização de volumes ou
diluições diferentes dos
recomendados
Certificar-se do cumprimento
correcto das instruções
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Contaminação
vermelhos
de
glóbulos
O sangue não foi conservado
à temperatura necessária
Certificar-se de que o sangue
é transportado a 18-25 °C ou
10-25 °C se for utilizado
reagente T-Cell Xtend
O tubo de colheita de sangue
não está à temperatura
ambiente (18-25 °C)
Deixar o tubo de colheita de
sangue equilibrar à
temperatura ambiente
O sangue não está diluído
Certificar-se de que o sangue
é diluído de acordo com o
procedimento
Inversão da amostra de
sangue dentro do tubo
Leucosep
Certificar-se de que o tubo
Leucosep permanece na
vertical antes da centrifugação
Centrifugação incorrecta
Certificar-se do cumprimento
das instruções de
centrifugação
Verificar se a centrifugadora
tem capacidade de
refrigeração a 18-25 °C
Certificar-se de que o travão
da centrifugadora está
desligado
Camada mononuclear não
definida ou distinta
Resultados inválidos
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Separação incompleta da
amostra
Aumente 10 min o passo de
centrifugação
Separação incompleta da
amostra
Aumente 10 min o passo de
centrifugação
A centrifugadora não está
correctamente calibrada
Calibrar a centrifugadora
Centrifugação incorrecta
Certificar-se do cumprimento
das instruções de
centrifugação
Amostra hiperlipémica
Fazer colheita da amostra de
sangue em jejum
Consultar as secções acima
Os resultados inválidos
podem ser causados por uma
série de questões
relacionadas com o
manuseamento incorrecto da
amostra
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Glossário de símbolos
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4
´
Ó
i
1
j
²
Prazo de validade (ano-mês-dia)
Número de lote
Número de catálogo
Atenção, ver as instruções de utilização
Fabricante
Suficiente para “n” testes
Produto para diagnóstico in vitro
Limite de temperatura/Conservar entre
Consultar as instruções de utilização
T-Cell Xtend e o logótipo Oxford Immunotec são marcas comerciais da Oxford Immunotec Limited.
AIM V é uma marca comercial da Invitrogen.
CPT é uma marca comercial da Becton Dickinson.
* FICOLL e FICOLL-PAQUE são marcas comerciais das empresas GE.
O utilização do reagente T-Cell Xtend está protegida pelas seguintes patentes e patentes pendentes:
EP2084508; US13/253,598, CN101529221, AU2007-303994, JP2009-530943, IN2165/DELNP/2009,
CA2665205
© Oxford Immunotec Limited, 2013. Todos os direitos reservados.
Fabricante:
Oxford Immunotec Ltd
94C Innovation Drive, Milton Park, Abingdon
Oxfordshire, OX14 4RZ, Reino Unido
+44(0)1235 442796
www.oxfordimmunotec.com
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