Artigo
Análise de umidade residual em produto
farmacêutico liofilizado através da espectroscopia
de infravermelho próximo
Analysis of residual moisture in a lyophilized
pharmaceutical product by near-infrared
spectroscopy (NIRS)
Resumo
O objetivo deste trabalho consistiu na determinação de umidade residual em produtos farmacêuticos liofilizados através da espectroscopia de infravermelho próximo (NIR). Neste
caso as amostras foram seladas em um vial de 30 mL. O peso médio do produto foi de 1,6
g com um teor de umidade de 1% e um limite aceitável de umidade de no máximo 2% em
peso. Amostras foram preparadas e adicionadas em vials, variando a quantidade de água.
Espectros com análises por reflectância difusa foram coletados na região do infravermelho
próximo e o tratamento matemático de regressão linear múltipla (MLR) aplicado para correlacionar mudanças espectrais com os valores de umidade medidos experimentalmente pelo
método de titulação Karl Fischer.
Eduardo Simões1
Karina Rancan2
Vinícius Cavalcanti3
Químico, Mestrando em
Química Analítica pela Unicamp,
Coordenador de Aplicação
2
Química, Especialista de
Aplicação em NIR
3
Químico, Especialista
de Produto em NIR
1
Palavras-chave: Espectroscopia de infravermelho próximo, produtos farmacêuticos liofilizados, titulação Karl Fischer, perda por secagem
Metrohm Pensalab
Instrumentação Analítica Ltda.
Laboratório de Aplicação
Abstract
Correspondências:
Eduardo Simões
[email protected]
This Application Bulletin describes the method of near-infrared spectroscopy in diffuse reflection for the purpose of determining residual moisture in a lyophilized pharmaceutical
product. Numerous sample vials containing freeze-dried pharmaceuticals were spiked with
varying amounts of water for calibration purposes. The resulting differences in the absorption
wavelengths of the OH-oscillation were correlated with the water content determined by Karl
Fischer titration using the algorithm of multiple linear regression (MLR).
Keywords: Near-infrared spectroscopy, lyophilized pharmaceuticals, water determination,
Karl Fischer titration, loss-on-drying (LOD)
Introdução
Em indústrias farmacêuticas, a quantificação da umidade
residual em produtos liofilizados é uma análise muito importante. As análises são realizadas rotineiramente para controle
do processo e para garantir que os lotes da produção satisfaçam os parâmetros de liberação especificados. Para fins
de desenvolvimento tais medidas são necessárias durante o
estudo de estabilidade e otimização do ciclo congelado/parte
seca usado no processo de liofilização.
Técnicas tradicionais para determinação de umidade
englobam a titulação Karl Fischer, cromatografia gaso-
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sa e análises termogravimétricas, esta última conhecida
também como perda por secagem (loss-on-drying - LOD).
Embora estas metodologias ofereçam vantagens como
sensibilidade, especificidade do solvente e custo do sistema, elas também apresentam desvantagens devido ao
alto consumo de tempo e destruição da amostra que está
sendo analisada.
Em contrapartida, a espectroscopia de infravermelho
próximo (NIR) tem demonstrado ser um método ideal para
obter rápidos resultados de umidade em materiais liofiliR evista A nalytica • Abril/Maio 2014 • nº 70
zados, com tempos típicos de análises menores que 30
s. A quantificação de umidade em baixos níveis (traços) é
possível devido às fortes bandas de absorção de água em
1450 nm e 1940 nm.
Em análises por reflectância difusa, a medição pode
ser realizada através do fundo do vial, desde que o vidro
de borosilicato comumente utilizado neste material seja
invisível na região do infravermelho próximo. Por esse motivo, pouca ou nenhuma preparação da amostra é requerida e a necessidade por reagentes caros e/ou nocivos é
eliminada.
A técnica é não destrutiva e não invasiva, atributos que
são particularmente vantajosos quando há componentes
ativos caros ou amostras que podem ser utilizadas para
estudo de estabilidade desde que os mesmos vials possam ser utilizados para ensaios subsequentes.
Tabela 1. Conjunto de calibração de amostras
Experimental
Resultados e Discussão
Espectros de infravermelho próximo foram obtidos com
o auxílio do espectrômetro NIRS XDS da Metrohm, equipado
com o módulo Rapid Content® Analyzer (RCA) (Figura 1). O
acessório de amostragem do RCA utiliza uma íris centralizadora para reprodutibilidade da posição dos vials sobre a radiação monocromática incidente e um arranjo de detectores
de sulfeto de chumbo, capazes de analisar a radiação difusa
refletida na região do infravermelho próximo, de 1.100 nm a
2.500 nm.
Cada dado espectral é resultado de uma média de 32
scans. A coleta de dados e análises foi realizada usando o
software Vision®. Um conjunto de calibração foi preparado
utilizando 46 vials de amostras, as quais foram divididas em
dez grupos, A a J. Em cada grupo de amostras foram adicionadas quantidades específicas de água para proporcionar
aumentos gradativos no teor de umidade conforme mostrado
na Tabela 1.
Calibração de amostras por titulação Karl Fischer
Grupo
Nº Vials
Adição de H2O
[% em peso]
Volume de H2O
adicionado (µL)
A
5
0,0
0
B
5
0,5
8
C
5
1,0
16
D
5
1,5
24
E
5
2,0
32
F
5
2,4
40
G
4
2,9
48
H
4
4,8
80
I
4
9,1
160
J
4
13,0
240
As análises de umidade foram realizadas utilizando um titulador Karl Fischer Metrohm, modelo Titrando 901 e as médias dos
resultados encontram-se no gráfico de barras da Figura 2.
Os valores medidos estão de acordo com o aumento gradativo de água realizado para cada grupo, o que mostra uma
facilidade para controlar experimentalmente a quantidade de
água adicionada.
O teor médio de umidade antes da adição foi determinado
em um valor de aproximadamente 0,7% através da subtração
da quantidade de água adicionada do valor de umidade medido para cada vial.
Umidade Karl Fischer
15
10
5
0
A
B
C
D
E
F
Amostras
G
H
I
J
Figura 2. Média dos resultados das análises por titulação Karl Fischer
para um conjunto de calibração de amostras
Dados espectrais do infravermelho próximo
Figura 1. Rapid Content® Analyzer (RCA) – Módulo de amostragem
utilizado para analisar materiais liofilizados.
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O espectro referente às bandas de água pode ser observado na Figura 3, ficando evidente a correlação entre o
aumento do teor de umidade e a mudança nas características
espectrais da banda de água em torno de 1.940 nm, característica observada pelo aumento dos picos nesta região.
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Espectros da segunda derivada são comumente utilizados
para quantificação dos resultados obtidos através da obtenção
de uma equação pelo tratamento matemático de regressão, pois
remove os efeitos de deslocamento e inclinação da linha base.
Estas variações são causadas por parâmetros físicos, tais
como diferenças no tamanho de partícula e aparência do sólido
remanescente do processo de liofilização. A Figura 4 mostra o
espectro da segunda derivada para as amostras da Figura 3.
Figura 3. Espectros de reflectância difusa no infravermelho próximo de
amostras liofilizadas contendo diferentes quantidades de umidade
Equação A: para amostras
com baixa umidade residual
Umidade prevista pelo NIR em % =
Figura 5. Valores de umidade determinados pelo NIR através da
equação A vs resultados obtidos pela titulação Karl Fischer. Amostras
do conjunto de treinamento são indicadas pela coloração azul e as
amostras do conjunto de teste pela coloração vermelha. O gráfico à
esquerda mostra os resultados para valores de umidade mais baixos,
sobre os quais a equação foi otimizada
Um segundo método de calibração foi desenvolvido utilizando a MLR e os espectros da segunda derivada de todas as
amostras do conjunto de treinamento, o que gerou uma nova
equação, B, a qual foi otimizada para amostras com alto teor
de umidade, com níveis de até 15% H2O.
Equação B: Para amostras com alta umidade residual
Umidade prevista pelo NIR em % =
Figura 4. Espectro da segunda derivada correspondente ao espectro
de absorção da Figura 3
Criação de uma equação pelo
método de regressão linear
Quando modelos quantitativos são desenvolvidos,
espectros de calibração de amostras são tipicamente
divididos em dois grupos distintos, o conjunto de treinamento e o conjunto de teste. As amostras do conjunto
de treinamento são utilizadas para desenvolvimento de
uma equação através da regressão linear, enquanto que
amostras no comjunto de teste são utilizadas para validar as equações. Espectro de uma amostra particular não
deve ser utilizado em ambos os conjuntos.
Para obter uma calibração para as análises das amostras
com teores de umidade dentro de uma faixa próxima ao limite de aceitação especificado de aproximadamente 2% H2O,
a regressão linear múltipla (MLR) foi aplicada para o espectro da segunda derivada das amostras calibradas dos grupos A a F. Isso resultou na equação de calibração A, a qual
foi otimizada para as amostras com baixo teor de umidade,
ou seja, 0% a 3,5% H2O. O termo em parênteses minimiza
os efeitos devidos à dispersão causada pela diferença no
caminho óptico das amostras.
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Figura 6. Valores de umidade determinados pelo NIR através da
equação B vs resultados obtidos pela titulação Karl Fischer. Amostras
do conjunto de treinamento são indicadas pela coloração azul e as
amostras do conjunto de teste pela coloração vermelha. O gráfico à
direita mostra os resultados para valores de umidade mais elevados,
sobre os quais a equação foi otimizada
Ambas as equações de regressão renderam excelentes
coeficientes de correlação, com R² > 0,99. O erro padrão de
calibração (SEC) para a equação B foi ligeiramente maior do
que o da equação A, em virtude da faixa sobre a qual a calibração foi desenvolvida. Como esperado, a equação A mostrou um bom desempenho na previsão do teor de umidade
das amostras no conjunto de teste com valores menores que
3,5% de H2O, e resultou em um erro padrão relativamente
baixo, SEP = 0,119% H2O.
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No entanto, quando aplicado o conjunto de treinamento
para amostras contendo níveis de umidade mais elevados,
> 8% H2O, a equação A tendeu a superestimar a quantidade real de umidade, para valores medidos pela titulação Karl
Fischer. Em tais casos, seria necessário aplicar a equação B,
a qual provou ser mais precisa para as amostras com altos
níveis de umidade, porém menos precisa para amostras com
menores quantidades de água.
Comparação entre NIR e LOD
Perda de peso por secagem (LOD) é um método comumente utilizado para medir os solventes residuais em pós e materiais liofilizados. Um experimento foi realizado para comparar
os resultados da metodologia NIR descrita acima com os das
análises por LOD. Para isto foram utilizadas dez amostras analisadas utilizando dois métodos. Duas das dez amostras foram
identificadas por seus elevados níveis de umidade. Os resultados estão apresentados no gráfico de barras da Figura 7.
Figura 7. Comparação de análises NIR e LOD para dez amostras
liofilizadas. Dois dos frascos foram identificados por terem altos níveis
de umidade. Para estas amostras, a equação B foi aplicada para obter
o resultado NIR
Os resultados obtidos pelo NIR e LOD estão bem próximos, conforme observado pelo gráfico da Figura 7. Entretanto, em média, os valores da metodologia NIR apresentaram
resultados ligeiramente superiores aos correspondentes pela
metodologia LOD em 0,20 (± 0,17) %. Isto ocorreu devido à
titulação Karl Fischer ter sido utilizada como método primário
para determinação de umidade da amostra, relacionando os
valores encontrados aos espectros obtidos pelo espectrômetro NIRS, permitindo assim a quantificação da umidade por
meio do desenvolvimento de equações através da regressão.
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O método de perda por secagem (LOD) emprega uma
abordagem gravimétrica para medir um processo em equilíbrio. Devido à interação das pontes de hidrogênio é praticamente impossível remover toda a água da superfície de uma
substância através da simples secagem em um forno durante
um longo período de tempo.
Consequentemente, a LOD terá tipicamente um menor
rendimento para valores de umidade residual do que a titulação Karl Fischer. A correlação entre os métodos NIR e LOD
pode ser melhorada através da aplicação de uma correção da
equação. Este seria o caso, uma vez que as diferenças são
explicadas e parecem ser consistentes ao longo das faixas de
umidade para a qual as equações foram desenvolvidas.
Análises NIR para amostras contendo
imperfeições de amolecimento do sólido
Uma imperfeição que pode ser observada em produtos
liofilizados é o amolecimento total do sólido remanescente
após o processo de liofilização, fato causado pela dissolução
parcial. Isto ocorre se o processo de liofilização não é finalizado e há elevados níveis de umidade residual nos vials.
O amolecimento do sólido pode ser desenvolvido também
se durante o processo de liofilização a temperatura e/ou a
pressão não são mantidas abaixo do ponto de transição onde
a liquefação ocorre. O sólido remanescente do processo de
liofilização apresenta caracteristicas diferentes do sólido ideal
que deve apresentar cor e textura uniformes.
Amostras que sofrem o processo de amolecimento total
do sólido serão tipicamente menores e com aparências não
uniformes. Entretanto, se um sólido liofilizado é relativamente
grande, é possível que o amolecimento seja contido dentro
do sólido remanescente do processo de liofilização, uma vez
que esta seja a região onde a última fração de umidade é
removida da amostra. Em tais casos pode ser difícil detectar a falha simplesmente por inspeção visual. Uma amostra
contendo um amolecimento é considerada como tendo uma
falha crítica, desde que a degradação da droga ativa ocorra,
afetando assim a eficácia do produto final.
A metodologia NIR foi utilizada para analisar um grupo de 15
amostras de produção que apresentavam pontos de amolecimento do sólido. Em cada caso, as amostras foram selecionadas
pelo seu alto teor de umidade, variando de 5 a 20% de H2O.
O método NIR foi capaz de identificar essas amostras
como tendo alta umidade apesar do fato de a matriz da amostra estar significativamente comprometida, isto é, a radiação
difusa refletida na região do infravermelho próximo a partir de
uma amostra contendo um ponto de amolecimento pode ser
muito diferente de uma que não o contém.
Embora os níveis de umidade reais destas amostras não tenham sido determinados, os resultados são significativos uma
vez que eles demonstram que o método NIR pode também ser
utilizado como uma ferramenta de inspeção qualitativa. Uma vez
que a análise é não destrutiva, seria possível automatizar as análises de tal modo que cada amostra de produção seja analisada.
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Conclusão e recomendações
A espectroscopia de infravermelho próximo é idealmente adequada para a análise da umidade residual em
produtos liofilizados. Amostras de calibração podem ser
facilmente preparadas pela injeção de quantidades específicas de água nos vials. Este procedimento proporciona um meio conveniente para a preparação de conjuntos
de calibração com uma mesma distribuição dos níveis de
umidade.
Equações de regressão podem ser obtidas a fim de fornecer medidas de umidade residual em diferentes faixas,
ou seja, altos e baixos valores de H2O (%) se os conjuntos
de treinamentos são compostos por amostras com níveis
de umidade adequados. Desvios podem ser observados
quando se compara as previsões NIR com os resultados
de métodos que não foram utilizados para obter as equações de regressão.
Em muitos casos, estas diferenças podem ser explicadas e subsequentemente corrigidas pela aplicação
do ajuste das equações calibradas. Uma vez que a metodologia NIR é uma técnica não destrutiva, é possível
reanalisar as amostras utilizando um segundo método.
Isso é particularmente útil quando amostras são utilizadas
para estudos de estabilidade ou para verificar o alto teor
de umidade em amostras que aparentam possuir teores de
umidade acima do valor especificado.
A velocidade e facilidade da técnica permitem a análise
de grandes conjuntos de amostras. Ao automatizar a
análise, seria possível incorporar o teste de umidade residual como parte integrante dos testes de controle de qualidade de todos os vials liofilizados.
Referências
Metrohm Application Bulletin AB-358/1, Analysis of residual moisture in a lyophilized pharmaceutical product by near-infrared spectroscopy
Metrohm Monograph: NIR Spectroscopy – A guide to near-infrared spectroscopy analysis of industrial manufacturing
processes, Metrohm Ltd., CH-9101 Herisau, Switzerland, 8.108.5026EN – 2013-02
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