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Técnicas de biologia
molecular
da análise de genes e
produtos gênicos únicos a
abordagens em larga escala
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os mesmos genes, qual a diferença?
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Dogma central
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Localizando alvos
• Técnicas iniciais para evidenciar
determinadas moléculas de interesse
• DNA / RNA métodos baseados em
hibridização
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Hibridização
desnaturação / renaturação de ácidos nucléicos
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Light absorption and temperature in DNA denaturation. (a) Melting of doubledstranded DNA can be monitored by the absorption of ultraviolet light at 260 nm. As
regions of double-stranded DNA unpair, the absorption of light by those regions
increases almost twofold. The temperature at which half the bases in a doublestranded DNA sample havedenatured is denoted Tm (for temperature of melting).
Light absorption by single-stranded DNA changes much less as the temperature is
increased. (b) The Tm is a function of the G·C content of the DNA; the higher the
G·C percentage, the greater the Tm.
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Southern blot
• DNA é hibridizado com uma sonda – um
fragmento de DNA de seqüência conhecida que
contém algum tipo de marcação e pode ser
detectado.
• Mostra sequências complementares à sonda
• detecta pequenas quantidades (1 to 10 pg por
banda) de uma sequência específica 1000
vezes mais sensível que EtBr
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Southern blot - etapas
• Etapas: amostra de DNA
submetida à eletroforese
– mobilidades registradas
• DNA transferido para um
filtro (nitrocelulose ou
nylon) criando uma cópia
do gel
• DNA é imobilizado no
filtro
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Sothern blot - marcação de sonda
•
•
•
Incorporação no DNA de nt
marcado radioativamente (p
ex. alfa fosfato P-32), ou por
adição de um grupamento
químico (digoxigenina ou
biotina)
COMO?
"End labeling“ enzima
polinucleotídeo quinase
transfere fosfato terminal de nt
radioativo P-32-gamma- para
a extremidade 5’ do DNA
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Sothern blot - Hibridização da sonda ao DNA
imobilizado no filtro
• A sonda é desnaturada
(fervida) e adicionada
(em excesso) em solução
sobre filtro
• Sonda hibridiza com
seqüências
complementares
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Sothern blot - lavagens e detecção
• Lavagens retiram
excesso de sonda e
desfazem ligações
inespecíficas
(temperatura, força
iônica)
• Permanecem as
ligações específicas
• Revelação com base
na marcação da
sonda
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Sothern blot - revelação
• Sonda radioativa- filtro
é exposto a filme raio X,
revelado
• Sonda marcação
química – filtro é
exposto a anticorpo
conjugado a enzima (p
ex. fosfatase alcalina) +
substrato que pode
gerar produto colorido
ou luz
• a posição da sonda é
revelada
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os mesmos genes, qual a diferença?
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Análise dos transcritos: Northern Blot
•
•
•
•
•
•
•
•
Extrair RNA dos organismos ou tecidos
eletroforese de RNA
transferência do RNA para uma membrana
marcação de sequências conhecidas
(sondas)
Hibridização para localizar sequências alvo
Visualização e
quantificação do sinal
de hibridização
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Análise da expressão de proteínas:
Western Blot
• Extrair proteínas das
células
• eletroforese
desnaturante
• transferência das ptns
para uma membrana
• Reação com anticorpo
• 2o anticorpo marcado
• Visualização e
• quantificação do sinal
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Sequenciamento de DNA
• Reação de sequenciamento replicação de DNA
• molde: DNA plasmídeo, fragmento ou
produto de PCR (200 ng)
• um primer 20 nt complementar a uma
região de uma das fitas de DNA
• tampão + dNTPs
• enzima variante da Taq polymerase
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Reação de polimerização
• Desnaturação do DNA 96oC 10 min + formamida
• PCR 96oC 10’’, 50oC 5´´, 60oC 4 ´25 X
• 2 fitas de DNA molde se separam, primer anela a
uma delas especificamente,
polimerase estende
o primer
• apenas uma fita é
sintetizada, não
amplifica DNA
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Método término da síntese de DNA por dideoxint
• dideoxinucleotídeos sem 3' OH
• ao serem adicionados
à extremidade do DNA
não há como continuar
a síntese
• atuam como
terminadores da
síntese
• a maior parte dos nt
são normais, uma
fração são ddNTP
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Sequenciamento de DNA - reação Ex: ddTTP
dTTP normal em excesso,
incorporado na maioria dos
casos, a extensão continua
entrada de ddTTP aleatória, a
fita para
ao fim milhões de moléculas
incluem paradas em todas as
posições de T
todas as moléculas têm o
mesmo início mas términos
variados
tamanhos variados são
separados por eletroforese
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Sequenciamento de DNA - reação
• Dideoxi nt
quimicamente
modificados por
adição de corante
fluorescente.
• Reação com os 4
ddNTPs (A, G, C, T)
cada um com uma
cor diferente permite
ler a seqüência de
DNA
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Sequenciamento de DNA - automático
Leitura: sequenciador de DNA contém fonte de laser que atravessa
o gel com um scanner, são registrados os comprimentos de
onda de emissão quando cada fragmento de DNA passa pelo
detector. Cada tipo de base com um comprimento de onda
próprio.
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Sequenciamento de DNA - resultado
Software de análise de sequência fornece a leitura das
bases e um gráfico com intensidade de sinal,
qualidade da sequência, tamanho pode chegar a 700
nt