MAYKON TAVARES DE OLIVEIRA
Genotipagem de amostras de Trypanosoma cruzi isoladas de pacientes
chagásicos de dois municípios da região do Vale do Jequitinhonha, MG,
Brasil.
OURO PRETO, MG, 2012.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO - UFOP
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Genotipagem de amostras de Trypanosoma cruzi isoladas de pacientes
chagásicos de dois municípios da região do Vale do Jequitinhonha, MG,
Brasil.
Autor: Maykon Tavares de Oliveira
Orientadora: Profa. Dra. Marta de Lana
Co-Orientadora: Profª. Drª. Helen Rodrigues Martins
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro
Preto, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre; área
de concentração: Imunobiologia
de Protozoários.
Ouro Preto, MG.
2012
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas do
Núcleo de Pesquisas em
Ciências
Biológicas
da
III
"O que chamamos de inspiração é a capacidade de reter e ampliar, com um toque próprio e
único, um flash ou insight, uma coisinha de nada que atravessa o nosso pensamento e pode
fugir. Porém, boa parte dessa inspiração é fruto da nossa capacidade de concentração, de
disciplina, de esforço mental e até de teimosia. Precisamos não de um dia bonito de céu azul,
mas de uma boa dose de paciência para produzir alguma coisa interessante, para organizar
raciocínios, transformar barro em tijolos e tijolos em casas."
Freitas, 2002.
IV
Dedicatória:
Dedico essa Dissertação a minha mãe e toda minha família, fonte de inspiração e força, por
terem me incentivado a não desistir nos momentos mais difíceis dessa caminhada...
V
Agradecimentos
Agradeço imensamente a Deus, fonte de luz, força e sabedoria.
À Professora Marta de Lana pela oportunidade, orientação e por ter me concedido esse
projeto, acreditando em minha capacidade. Obrigado pelos ensinamentos transmitidos, só
tenho a agradecer pela força e pelas demonstrações de carinho!!!
À professora Helen Rodrigues Martins, por ter me ensinado os primeiros passos na trajetória
da Ciência. Agradeço muito pelo apoio durante toda a realização desse projeto.
Às grandes amigas, Jaquelline e Lílian, a amizade de vocês foi fundamental. Jack obrigado pelo
apoio, incentivo e pelas brincadeiras... Tenho certeza que não foi por acaso que o destino fez
que nos conhecêssemos, e mesmo que a distância nos separe, nossa amizade vai perdurar pela
eternidade!!!
Ao Aufy pelo empenho e força de vontade em isolar os parasitos de seus pacientes para
analisarmos. Certamente sem seu trabalho, esse projeto não teria existido...
A todos os amigos do laboratório de Doença de Chagas, em especial ao Vitor, Arnaldo, Glaucia,
Renata, Mari, Feijuada, Rodrigão, Lívia e a todos que convivi e que não estão mais em Ouro
Preto, obrigado pela ótima convivência durante todos esses anos!
À professora Vanja Veloso pelo apoio incondicional durante a realização da técnica de RAPD e
pela carinhosa amizade.
Ao professor Evandro pela boa convivência, pelas brincadeiras, idéias, e pelo esclarecimento
das inúmeras dúvidas durante esses anos.
À professora Maria Terezinha Bahia e ao Professor André Talvani pelos ensinamentos e bons
momentos de descontração.
À toda turma de mestrado do NUPEB de 2010, em especial a Maíra, Magna, Vívian, Tassiane,
Gabi, Kelvinson e Guilherme, vocês tornaram as disciplinas do mestrado muito mais
agradáveis!!!
À Dani, Lud e Aninha pelo auxílio técnico e pela grande amizade.
A todos os professores do NUPEB.
Aos pacientes de Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha, MG. O maior valor
do nosso trabalho não são as publicações, e sim a possibilidade de tentar associações que
talvez levem alguma melhoria a vocês.
À Cida e Mateus, secretários do NUPEB.
Ao CNPQ e FAPEMIG pela concessão de todo financiamento do projeto.
À CAPES pelo financiamento da minha bolsa, sem ela seria impossível concluir esse mestrado.
VI
Agradecimentos
Á Prefeitura Municipal de Berilo pela parceria no Projeto de Doença de Chagas no Vale do
Jequitinhonha.
Aos meus irmãos de república pela descontração, força e principalmente por entenderem o
quão estressante e corrido é a jornada de um mestrado. Saibam que aproveitei cada minuto
ao lado de vocês, aprendi muito com cada um e confesso que sinto e sentirei muita falta dos
moradores que dividiram parte da suas vidas conosco, e que já não se encontram aqui. Quero
sempre reencontrar todos para lembrarmos os bons momentos que passamos juntos... Meu
sincero agradecimento a todos da REPÚBLICA SETE PRAGAS!!!
Finalmente, volto a agradecer a toda minha família, em especial minha Mãe, Tia Filinha, Tia
Ada e Tio Tunico (que mesmo lá de cima continua sempre olhando e torcendo por nós), vocês
com certeza são as pessoas mais especiais em minha vida. Desculpem pela ausência, mas
saibam que cada segundo que estive longe nunca dexei de pensar e me preocupar com vocês.
OBRIGADO POR TUDO!!! AMO VOCÊS...
VII
Resumo
A espécie do Trypanosoma cruzi possui uma estrutura genética que permite a
subdivisão intraespecífica em seis grupos genéticos distintos, denominados TcI, TcII,
TcIII, TcIV, TcV e TcVI (Zingales et al., 2009) que tem apresentado diferenças frente a
distribuição geográfica, propriedades biológicas e susceptibilidade a droga. É
conhecido o predomínio das DTU’s TcII e TcVI em diversas regiões Brasileiras,
associados tanto ao ciclo doméstico como ao silvestre da Doença e Chagas, e estando
intimamente relacionados com as manifestações clínicas graves em pacientes
chagásicos crônicos. Conhecendo o predomínio dessas DTU’s no estado de Minas
Gerais, trabalhos anteriores do grupo realizando a genotipagem de um número
limitado de amostras destas mesmas localidades (municípios de Berilo e José
Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha, MG) mostrou a presença somente de
amostras de T. cruzi II, como ocorre em outras regiões do Brasil. Desse modo, o
objetivo principal do estudo foi caracterizar molecularmente amostras de T. cruzi
isoladas de pacientes chagásicos crônicos dos municípios de Berilo e José Gonçalves de
Minas, Vale do Jequitinhonha, MG, a fim de determinar o perfil genético do parasito
circulante nesta região e comparar esses dados com o observado no Brasil e em outras
regiões do Cone Sul. Para isto, os parasitos foram isolados dos pacientes através de
hemocultura e mantidos em crescimento em meio LIT para obtenção das massas
úmidas e posterior extração de DNA e caracterização por cinco diferentes marcadores
moleculares. A identificação inicial dos grupos genéticos do T. cruzi foi realizada
seguindo o tríplice ensaio proposto por Lewis et al.(2009). Essa metodologia explora a
análise em conjunto dos perfis de bandas gerados após a amplificação do domínio D7
do 24Sα rDNA, do perfil de corte gerado após a digestão dos produtos amplificados de
dois genes com suas respectivas enzimas de restrição (HSP60/ECORV e GPI/HhaI) via
RFLP-PCR. Nesta primeira etapa de caracterização foram identificadas 43 amostras,
sendo todas pertencentes ao grupo TcII, segundo a nova classificação consensual
proposta por Zingales et al. (2009). Entretanto, oito isolados não puderam ter sua
identificação definida baseada nessa metodologia e foram submetidas à análise do
polimorfismo do gene da citocromo oxidase subunidade II (CoII), 24Sα rDNA e do
espaçador intergênico do mini-exon (SL-IR), que permitiram em conjunto, classificá-las
como TcVI. A seguir, a técnica de RAPD foi empregada na avaliação da variabilidade
intra-específica dos isolados do T. cruzi empregando 10 iniciadores. Os dados obtidos
pela análise dos dez iniciadores, foram submetidos à análise de UPGMA para obtenção
do fenograma e os resultados obtidos corroboram os dos outros marcadores na
identificação da maioria dos isolados (43) como TcII e dos oito restantes como TcVI,
revelando ainda pouca variabilidade no interior desses grupos. Os resultados desse
trabalho confirmam dados preliminares obtidos na região em estudo, demonstrando a
predominância dos isolados de T. cruzi pertencentes ao grupo TcII no município de
Berilo, semelhante ao demonstrado por outros estudos que avaliaram isolados obtidos
de pacientes em outras regiões no eixo nordeste-sul do Brasil. Adicionalmente, foram
VIII
Resumo
detectados ainda alguns isolados de TcVI cuja ocorrência é mais rara no Brasil,
diferentemente de outros países da América do Sul.
IX
Resumo
Currently Trypanosoma cruzi is classified into six discrete taxonomic units
(DTUs) TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV and TcVI that present significant differences
concerned the geographic distribution and biological properties. This study was
conducted to verify the genetic profile of this parasite isolated of patients from
Berilo and José Gonçalves de Minas municipalities, Jequitinhonha Valley, MG,
an important endemic area of Chagas disease in Brazil. Molecular
characterization was performed through of five different markers in fifty T. cruzi
stocks isolated by hemoculture from patients in chronic phase of Chagas
disease. DNA extraction was performed using the DNA Purification KIT
(Promega, USA). The first identification of the six T. cruzi genetic groups
followed the methodology of Lewis et al. (2009). This methodology explores the
set of profiles of bands originated after the amplified products of dominium D7
of 24Sα rDNA, profile of bands originated after the digestion of products
amplified of two genes with their respective restriction enzymes
(HSP60/ECORV e GPI/HhaI) via RFLP-PCR. In this first phase of
characterization 43 samples were typed as T. cruzi of TcII group according to
the new consensual classification of Zingales et al. (2009). However, eight
isolates did not have the genetic identity defined based on this methodology,
being submitted to polymorphic analysis of the subunit II (CoII) of citochrome
oxidase and of the spliced leader intergenic region of mini-exon (SL-IR) which
when associated classified these isolates as TcVI. After, the RAPD technique
was employed in the evaluation of intra-especific variability of the T. cruzi
isolates using ten primers. Data obtained were submitted to the UPGMA
analysis and the results corroborate the originated from the other markers
identifying the majority of the isolates as TcII and the other eight isolates as
TcVI, showing yet some intra-groups variability with two groups defined into
them. The results of this work confirm the preliminary data obtained of the
studied region, showing a predominance of T. cruzi isolates of TcII in Berilo,
similar to the verified in other studies that evaluated isolates of patients in other
regions of Brazil. Additionally, although less frequently, some isolates of TcVI
were also detected. These data confirmed the distinct profile observed in Brazil
compared to other countries of South America.
X
Lista de Tabelas
Lista de Tabelas:
Tabela I: Resumo da revisão bibliográfica da variabilidade genética do Trypanosoma cruzi.
Tabela II: Informações das amostras de Trypanosoma cruzi e dos pacientes dos quais
foram isoladas.
Tabela III: Critérios de classificação dos isolados de Trypanosoma cruzi nas DTU(s) TcI
ao TcVI, segundo Lewis et al. (2009) e D’ávilla et al. (2009).
Tabela IV: Primers utilizados na caracterização dos isolados de Trypanosoma cruzi, por
RAPD (Brisse et al., 2000b).
Tabela V: Identificação das amostras de Trypanosama cruzi isolados de pacientes dos
Municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha MG, segundo o
novo consenso táxonômico (Zingales et al., 2009).
XI
Lista de Figuras
Lista de figuras:
Figura I: Mapa do estado de Minas Gerais localizando a região do Vale do
Jequitinhonha e mostrando algumas informações dos municípios de Berilo e José
Gonçalves de Minas.
Figura 2: Tripé de classificação dos isolados de Trypanosoma cruzi em seus respectivos
DTU(s) proposto por Lewis et al. (2009).
Figura 3: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi
provenientes de pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, MG obtidos pela
amplificação da região 3´do gene 24Sα rDNA.
PM – Peso molecular de 100pb, Br – controle negativo da reação, TcI – clone
representativo de TcI (P209 cl1, com perfil 110pb), TcII – clone representativo do grupo
TcII (MAS cl1, 125pb), TcIV clone representante do grupo TcIV (CANIII, XXpb??), TcIIIclone representativo da linhagem TcIII ( CM-17, 110pb), TcVI – clone representativo do
grupo híbrido TcVI (Tulahuen, 125 pb) e TcV – clone representativo do grupo TcV
(Bug2148, 110pb + 125pb). A1 – isolado 229, A2- isolado 452, A3-isolado 748, A4 –
isolado 798, A5- 1205, A6 – 1918, A7- 2535, A8- 2491, A9 264; A10- 376; A11- 646 e
A12 amostra 2118.
Figura 4: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi
provenientes de pacientes chagásicos da região do Vale do Jequitinhonha, MG, por
meio da análise do polirmorfismo do gene HSP60 submetidos a RFLP-PCR.
PM – Peso molecular de 100pb, A1- amostra 1918, A2- amostra PSF060, A3- amostra
438, A4- amostra 543, A5- amostra 229, A6-amostra 2119. Br – controle negativo da
reação de PCR; TcI a TcVI amostras do perfil de corte dos clones de referência dos 6
grupos de T. cruzi ( TcI – P209 cl1, 1 banda de 432 a 462pb; TcII – MAS cl1 1 banda de
432 a 462pb; TcIII CM-17, perfil de bandas duplas; TcIV CAN III cl1, banda única; TcV
Bug2148, bandas triplas; TcVI Tulahuen cl2, bandas triplas).
Figura 5: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi
provenientes de pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais, por meio
da análise do polirmorfismo do gene GPI/HhaI via RFLP-PCR.
PM – Peso molecular de 100pb, BR - controle negativo da reação, A1- amostra 2014,
A2 – amostra 646, A4 – amostra 229, A5 – 440, A6 – 501, A7 – 523, A8 – 2478, A9 PSF060, A10 – 1100, A11 – 820 e A12 isolado 2535. TcII (clone TU18 cl1 representativo
do DTU TcII), TcV (clone SO3 cl5, DTU TcV), TcI (clone 92101601P cl1, DTU TcI), TcIII
(Clone X109/2, DTU TcIII), TcIV (clone SO3 cl5, DTU TcIV) e TcVI (clone Tulahuen, DTU
TcVI).
XII
Lista de Figuras
Figura 6: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi
provenientes de pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, MG, por meio da
análise do polirmorfismo do gene da subunidade II da Citocromo Oxidase (COII).
PM – padrão de peso molecular de 1kb, C1-perfil de bandas o clone Cutia cl1
(haplótipo mitocondrial A - DTU TcI, Freitas et al., 2006), C2- clone Tu18 cl2 (haplótipo
C – DTU TcII), C3 - M6241 cl6 e C4 - Tulahuen cl2 (haplótipo mitocondrial B - DTU TcIII e
DTU TcVI), A1 - amostra 2119, A2- amostra 1205, A3- amostra 376, A4- amostra 2118,
A5- amostra 2408, A6 - amostra Be56, A7- amostra 1337, A8- amostra 1918, A9amostra 229, A10- amostra 748, A11- amostra 501, A12- amostra 2497 e A13- isolado
818, A14 – clone representativo do haplogrupo B (9212210R – TcIV), BR – controle
negativo livre de DNA. Entre os isolados nota-se somente a presença dos haplótipos B
e C.
Figura 7: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi
provenientes de pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, MG, por meio da
análise do polirmorfismo do espaçador intergênico do miniexon.
PM – padrão de peso molecular de 1KB; C1 - clone Cutia cl1(DTU TcI), C2 clone Tu18cl1
(DTU TcII), C3 e C4 clones X109/2 (DTU TcIII) e 9212210R2 (DTU TcIV), C5 e C6 clones
SO3cl5 e Tula cl2 representantes das DTU(s) TcV e TcVI respectivamente, A1: amostra
229; A2 - 452; A3 - 748; A4 - 798; A5 - 1205; A6 - 1337; A7 - 2118; A8 - 2119; A9 - 376;
A10 - 2497, A11 - 493; A12 - 820; A13 - 1107; A14 - 2478; A15 - 1918; A16 - 2014; Br:
controle negativo da reação. O espaçador intergênico do Mini-exon (Freitas et al.,
2006) é capaz de separar as DTU’s TcIII e TcIV, que apresentam perfis de bandas de
200pb, das demais DTU’s TcI, TcII, TcV e TcVI, esses com fragmentos de 150 a 157pb.
Figura 8: Perfis de RAPD em isolados de Trypanosoma cruzi obtidos de pacientes dos
municípios de Berilo e José Gonçalvez de Minas, região do Vale do Jequitinhonha, MG,
submetidos a amplificação empregando os primers N9 (Gel A) e B15 (Gel B).
PM – padrão de peso molecular de 100pb, C1 a C6 perfis de bandas apresentado pelos
seis clones de referência dos seis DTU’s do Trypanosoma cruzi, onde nos géis A e B, C1
representa os perfis do clone de referência da DTU TcI, P209 cl1; C2: MAS cl1 (TcII), C3:
CM-17 (TcIII), C4: CANIII (TcIV), C5: Bug2148 cl1 (TcV), C6: Tulahen cl2 (TcVI),
respectivamente.
No gel A, a amostra A1, corresponde ao isolado 953, A2- 820, A3 - 458, A4 - 523, A52014, A6 - 2478, A7 - 467, A8 - 1536, A9 - 818, A10 - 060/05, A11 - 845, A12 - 452,
A13- 1315, A14 - 529, A15 - 1918, A16 - 2497 e A17 - 1107 respectivamente.
No gel B, A1 - corresponde a amostra 845, A2 - 264, A3 - 501, A4 - 953, A5 - 2478, A6 798, A7 - 2335, A8 - 2491, A9 - 440, A10 - 1442, A11 - 376, A12 - 820, A13- 493, A14 2408, A15 - 748, A16 - 896 e A17 - 1315 respectivamente.
XIII
Lista de Figuras
Figura 9: Fenograma obtido pelo método de UPGMA (Unweighted Pair-Group Method
Analysis) de todos os 51 isolados de Trypanosoma cruzi e respectivos clones
representativo de cada DTU do parasito, submetidos a analise do polimorfismo
genético analisados no programa TREECON, e Bootstrap com repetições de 1000
vezes.
P209 cl1, clone representativo do genótipo TcI; MAS cl1 - genótipo TcII; CM-17 – TcIII,
CANIII cl1 – TcIV; Bug2148 cl5 – TcV e Tula cl2 TcVI.
XIV
Lista de Abreviaturas
ALAT
Alanina aminotransferase
Alu I
Enzima de restrição Alu I
ASAT
Aspartato aminotransferase
ATP
Adenosina Trifosfato
COII
Gene mitochondrial Citocromo Oxidase subunidade II
dNTP’s
2’-desoxinucleotídeos-5’-trifosfato
DO
Densidade Óptica
DTU
Discrete Typing Unity
DTT
Dithiothreitol
ECG
Eletrocardiograma
ECORV
Endonuclease de restrição do tipo II
EDTA
Ácido etilenodietildinitritoteracético
FUNASA
Fundação Nacional de Saúde
GPI
Glicose-6-fosfato isomerase
gRNAs
RNAs guias
Hha I
Enzima de restrição
HIV
Vírus da Imunodeficiência adquirida
HSP60
Heat shock protein 60
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
JGM
José Gonçalves de Minas
kDNA
DNA do cinetoplasto
LIT
Liver Infusion Triptose
µg
Microgramas
µL
Microlitros
mL
mililitros
nm
nanômetros
OPAS
Organização Pan -Americana de Saúde
pb
Pares de base
PCR
Reação em cadeia da polimerase
PITs
Postos de Informação de Triatomíneos
PCDCh
Programa de controle da doença de Chagas
XV
Lista de Abreviaturas
PBS
Solução Salina Tamponada
RAPD
Randomly Amplified polymorphic DNA
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
rRNA
RNA ribssômico
SFM
Sistema fagocitário mononuclear
SL-IR
Espaçador intergênico dos genes mini-exon
Tc
Trypanosoma cruzi
UPGMA
Unweighted Pair-Group Method Analysis
WHO
Word Heath Organization
Z
Zimodema
24S rDNA
Gene ribossômico 24S
18 Sα rDNA
Gene ribossômico 18S
XVI
Sumário
1.0 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 1
1.1 A Doença de Chagas: aspectos históricos, biológicos, clínicos e epidemiológicos. ............ 2
1.2 O Trypanosoma cruzi........................................................................................................... 6
1.2.1 Organização Genômica do T. cruzi ................................................................................... 7
1.2.2 Variabilidade Biológica do T. cruzi ................................................................................... 8
1.2.3 Variabilidade Genética do Trypanosoma cruzi ................................................................ 9
1.2.4 Estrutura Populacional do Trypanosoma cruzi .............................................................. 15
1.2.5 Correlações com propriedades biológicas do parasito, clínicas e eco epidemiológicas da
Doença de Chagas ................................................................................................................... 17
1.3 A Doença de Chagas em Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ........................................... 20
3.0 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 25
3.1 Objetivo geral: .................................................................................................................. 26
3.2 Objetivos específicos: ........................................................................................................ 26
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................... 27
4.1 Caracterização da Área em Estudo ................................................................................... 29
4.2 Pacientes e Amostras de T.cruzi ....................................................................................... 30
4.2.1 Obtenção das amostras.................................................................................................. 30
4.3 Obtenção do sedimento celular de T. cruzi...................................................................... 32
4.4 Extração de DNA............................................................................................................... 32
4.5 Classificação Genética das amostras isoladas dos pacientes ........................................... 33
4.5.1 Amplificação da região 3’ do gene 24sα rDNA - LSU rDNA ............................................ 33
4.5.2 RFLP–PCR (Restriction fragment length polymorphism) dos genes HSP60 (Proteína do
choque térmico) e GPI (Glicose 6-Fosfato Isomerase) ............................................................ 34
4.5.3 Caracterização pela PCR do gene Mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade II (COX
II) ............................................................................................................................................. 35
4.5.4 Espaçador intergênico dos genes mini-exon de T. cruzi (SL-IR) ..................................... 36
4.6 Análise para Classificação dos isolados nas respectivas DTU(s)....................................... 37
5.0 RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) ...................................................................... 39
5.1 Análise dos resultados de RAPD ....................................................................................... 40
XVII
Sumário
6.0 RESULTADOS ......................................................................................................................... 41
6.1 Análises do polimorfismo do domínio divergente do gene D7 do 24Sα rDNA (LSUrDNA)42
6.2 Análise de polimorfismo do gene da Proteína do choque térmico (HSP60) ..................... 43
6.3 Análise de polimorfismo do gene da Glicose-6-fosfato isomerase (GPI) ......................... 44
6.4 Análise de polimorfismo do gene Citocromo Oxidase II .................................................. 44
6.5 Análise do polimorfismo do Espaçador Intergênico dos Genes Mini-exon de T. cruzi (SLIR) ............................................................................................................................................ 45
6.6 Identificação das DTU(s) do Trypanosoma cruzi segundo o novo consenso taxonômico
(Zingales et al., 2009) .............................................................................................................. 46
6.7 RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) ...................................................................... 49
7.0 DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 53
8.0 CONCLUSÕES ......................................................................................................................... 67
9.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................. 70
10.0 ANEXO ................................................................................................................................. 93
XVIII
1.0 INTRODUÇÃO
Introdução
1.1 A Doença de Chagas: aspectos históricos, biológicos, clínicos e epidemiológicos.
A Doença de Chagas ou Tripanossomíase Americana, causada pelo protozoário
flagelado Trypanosoma cruzi, foi descrita em 1909 pelo pesquisador brasileiro Carlos
Ribeiro Justiniano das Chagas, enquanto trabalhava na campanha anti-malárica no
município de de Lassance - MG durante a construção da estrada de ferro Central do
Brasil. Esse brilhante pesquisador não só decifrou o ciclo biológico do parasito
revelando seus hospedeiros vertebrados e invertebrados, mas também a
epidemiologia e parte da patologia da doença.
A área de abragência da doença de Chagas é ampla e se estende desde o
México até a Argentina, representando uma das doenças parasitárias com maior
impacto social e econômico na América Latina. Segundo a Organização Mundial de
Saúde (WHO, 2010), cerca de 10 a 15 milhões de pessoas ainda encontram-se
infectadas pelo T. cruzi nesse continente e, 100 milhões de indivíduos estão em risco
de infecção. Embora o número de casos da doença tenha caído consideravelmente em
toda América Latina, nas últimas décadas, estima-se a ocorrência de 200 mil novos
casos agudos da doença por ano em toda América latina (WHO 2010). O número de
países endêmicos para a doença reduziu drasticamente de 1986 a 2006 e um dos
grandes responsáveis por tal redução foi a eliminação do principal vetor doméstico do
parasito, o Triatoma infestans (WHO, 2007).
A transmissão do T. cruzi está amplamente relacionada com a presença do
inseto vetor, um hemíptero hematófago pertencente à subfamília Triatominae. Esse
protozoário era exclusivo e restrito ao ambiente silvestre, circulando entre mamíferos
reservatórios naturais e insetos vetores, mas com o processo de invasão e modificação
ambiental promovida pelo homem, ele se aproximou das habitações humanas
estabelecendo um novo ciclo de transmissão, com a colonização de ecótopos artificiais
(Chagas, 1909; Dias, 1992; Dias, 2000).
A principal via de transmissão do T. cruzi ao hospedeiro vertebrado é a vetorial.
No intestino médio do triatomíneo, as formas epimastigotas do parasito mutiplicam-se
por divisão binária e, na região posterior, diferenciam-se em formas infectantes
denominadas tripomastigotas metacíclicas (Chagas, 1909). A transmissão do T. cruzi ao
2
Introdução
homem ocorre durante o repasto sanguíneo pela deposição das fezes e ou urina do
inseto vetor contendo a forma infectante sobre a pele com ferimentos ou sobre a
mucosa (Dias, 1934; Brener, 1972; Brener, 1976).
Nestes locais, o parasito irá penetrar em células do sistema mononuclear
fagocitário (SMF) e, nestas células, transformam-se nas formas amastigotas, que se
dividem intracelularmente por divisão binária e se diferenciam em formas
tripomastigotas sanguíneas que infectam o vetor durante o repasto sanguíneo,
fechando assim o ciclo evolutivo deste parasito. Estas, após vários ciclos de
multiplicação promovem o rompimento celular e, uma vez livres, podem penetrar nas
células adjacentes ou cair na circulação sanguínea e linfática, infectando novas células
de outros órgãos e tecidos (Tanowitz et al., 1992).
Além da via vetorial, o parasito pode ser também transmitido por transfusão
sanguínea (Dias e Brener, 1984) e pela via congênita (Chagas, 1911), consideradas a
segunda e terceira vias em importância epidemiológica. Em muitos países onde a
doença é endêmica, ainda não há controle em larga escala dos bancos de sangue (Dias,
2007). Além disso, com as migrações humanas, a doença de Chagas também se tornou
um problema em localidades onde ela não é endêmica como os EUA, o Japão a Europa
e Austrália, devido ao risco de transfusão com sangue de indivíduos infectados, que
migraram das áreas endêmicas para essas regiões (Garraud et al., 2007; Schmunis,
2007).
O risco de transmissão vertical parece variar de 0,5 a 10% entre as diferentes
regiões geográficas, o que poderia estar relacionado à falha no controle pré-natal e
diferenças biológicas entre as cepas circulantes nestas áreas (Bittencourt, 2000).
Atualmente, a transmissão oral tem se tornado uma grande preocupação para
os programas de controle da Doença de Chagas no Brasil, uma vez que vários casos
foram relatados nos estados de Santa Catarina, SC (Ministério da Saúde, 2005)
Amazônia, AM (Marcili et al., 2009) e Bahia, Ba (Dias et al., 2008).
Após a infecção por qualquer uma dessas vias, o indivíduo desenvolverá a fase
aguda da doença de Chagas. A fase aguda geralmente é assintomática na maioria dos
3
Introdução
casos (98%) e, ocasionalmente, pode ser caracterizada pela presença de sinais de porta
de entrada como o Chagoma de inoculação e o Sinal de Romanhã, edemas,
linfoadenopatias e febre (Dias et al., 1984). Nos casos mais graves, podem ocorrer
miocardite intensa e envolvimento neurológico, principalmente, em crianças menores
de dois anos de idade (Brener, 1992), grupo em que pode atingir cerca de 10-15% de
mortalidade. Essa fase dura em média de um a quatro meses durante a qual são
observadas altas taxas de parasito no sangue detectado pelo exame de sangue a fresco
e por exames histopatológicos que detectam as formas amastigotas nos tecidos.
Após a fase aguda, a maioria dos indivíduos evolui naturalmente para a fase
crônica da infecção, que pode durar por toda a sua vida (Rassi et al., 2000; Prata, 2001;
Rassi et al., 2010). Esta fase é marcada pela escassez de parasitos no sangue, devido ao
desenvolvimento de uma resposta imune específica capaz de controlar a multiplicação
do parasito. Essa fase é caracterizada por um curso clínico bastante variável. A maioria
dos indivíduos (60-75%) apresenta a forma indeterminada da fase crônica da doença
de Chagas, caracterizada pela ausência de sinais e sintomas clínicos, alterações
radiográficas e eletrocardiográficas. Entretanto, cerca de 10 a 30 anos após a infecção,
30-35% dos infectados desenvolvem as formas clínicas sintomáticas, caracterizando as
formas cardíacas, digestivas e ou mista (Rassi et al., 1992) da doença de Chagas, com
graus variáveis de severidade clínica.
Na forma cardíaca são observadas complicações relacionadas com alterações
no ritmo cardíaco e na condução do impulso nervoso (Amorim et al., 1979); enquanto
na forma digestiva os órgãos mais acometidos são o esôfago e o cólon . Esses
problemas podem estar associados à intensa destruição neuronal presente nesses
órgãos e aos aspectos imunológicos que geram inflamação no tecido parasitado
seguida de fibrose (Rezende, 1979).
Para tentar explicar o pleomorfismo do quadro clínico observado na doença de
Chagas, vários estudos foram realizados com intuito de averiguar as possíveis
correlações entre as formas clínicas com a variabilidade genética do parasito. Contudo,
até o momento os resultados são bastante incipientes e controversos (Brenière et al.,
4
Introdução
1985; Apt et al, 1987; Brenière et al., 1989; Vago et al., 2000; Lages-Silva, 2001; LagesSilva et al., 2006; D’Avila et al., 2006; D´avila et al., 2009).
Algumas hipóteses foram propostas para explicar o insucesso em estabelecer
essa correlação, a primeira delas está relacionada ao fato de que os pacientes
poderiam ser infectados por várias subpopulações do parasito e, que a população
recuperada no sangue não refletiria exatamente aquela que estaria gerando as lesões
nos tecidos do indivíduo infectado, reforçando a teoria do Modelo Histiotrópico Clonal
levantada por Macedo e Pena, (1998). No ciclo de transmissão natural do T. cruzi, os
triatomíneos provavelmente estão em contato com diferentes hospedeiros
vertebrados e, conseqüentemente, um mesmo triatomíneo pode realizar seu repasto
sanguíneo em diferentes animais. Além disto, um mesmo animal pode ser infectado
por vários triatomíneos. Esses diferentes eventos favorecem a circulação de
populações multiclonais entre hospedeiros e vetores, as quais poderiam predominar
no ambiente silvestre em conseqüência da existência de um número maior de vetores
e reservatórios em relação ao ciclo doméstico no qual os mamíferos ainda atuariam
como um filtro biológico, selecionando parte ou subclones das subpopulações
existentes (Macedo e Pena, 1998; Macedo et al., 2002, 2004; Veloso et al., 2005;
Lages-Silva et al., 2006).
Outras hipóteses que poderiam estar relacionadas a esse insucesso são,
provavelmente, o fato de a doença ser um processo multifatorial, em que tanto
aspectos do parasito como do hospedeiro estão inter-relacionados ou ainda a escolha
inadequada de alvos no genoma do parasito utilizados como marcadores de
patogenicidade na tentativa de estabelecer a tão desejada correlação entre as formas
clínicas com a variabilidade genética do parasito. Portanto, ainda são necessário mais
estudos nessa área para elucidação dessas lacunas.
Nesse panorama, o parasito, certamente, tem um papel importante nesse
processo, e diferenças na sua distribuição poderiam refletir na prevalência das
diferentes formas clínicas. Já está bem estabelecido que propriedades biológicas
específicas estão mais associadas a certos grupos genéticos do T. cruzi (Toledo et al.,
2004; Toledo et al., 2002; Buscaglia et al., 2006), o que poderia influenciar a resposta
5
Introdução
ao tratamento etiológico, o curso da infecção e, conseqüentemente as manifestações
clínicas (Macedo et al., 2004).
Andrade, (1997) descreveu que as formas clínicas da doença apresentam
diferenças quanto à distribuição geográfica, sendo a forma cardíaca mais associada a
cepas dos Biodemas Tipo I e II (Z2), muito presentes no Brasil e países do Cone Sul; já o
Biodema III foi mais correlacionado com o parasitismo da musculatura esquelética,
com poucas ou nenhuma associação com as formas cardíacas e digestivas. A
predominância da infecção por esse grupo ocorreu mais em países ao norte do Brasil,
países da América Central, incluindo parte do estado da Amazônia.
Em países como a Venezuela e países da América Central, a prevalência de
megaesôfago é extremamente baixa ou praticamente ausente (Brener, 1987). No
Brasil, cerca de 50 a 60% dos pacientes chagásicos crônicos apresentam a forma
indeterminada da doença, 20 a 30% apresentam a forma cardíaca, 8 a 10% apresentam
a forma digestiva. Menos de 2% apresentam as formas clínicas combinadas ou forma
mista da doença. Entretanto, a ocorrência da forma digestiva (megaesôfago e/ou
megacólon) parece ser predominante na região central (Luquetti et al., 1986; Dias,
1992).
Desse modo, a epidemiologia molecular é uma ferramenta importante no
intuito de evidenciar a variabilidade de T. cruzi em uma área endêmica, e vem sendo
utilizada no intuito de permitir um estudo integrado do parasito com aspectos clínicos
e epidemiológicos da doença observados na região em estudo na tentativa de detectar
correlações e estabelecer perfis cepa específicos, que possam orientar o prognóstico,
diagnóstico ou mesmo tratamento da doença de Chagas.
1.2 O Trypanosoma cruzi
O Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) é um protozoário hemoflagelado,
digenético, pertencente à ordem Kinetoplastida e a família Tripanosomatidae,
amplamente disperso no continente americano, do sul dos Estados Unidos ao norte da
Argentina. Diversos trabalhos demonstraram que o T. cruzi apresenta-se como uma
espécie heterogênea, constituída por várias sub-populações do parasito que circulam,
6
Introdução
tanto no ambiente doméstico como no silvestre, além de manter um íntimo contato
com os seres humanos, animais reservatórios e vetores (Zingales et al., 1998; Macedo
e Pena, 1998; Macedo et al., 2000; Miles et al., 2009; Yeo et al., 2011).
Concernente a organização estrutural e populacional em T. cruzi, essas são
complexas e seu conhecimento tem sido importante para compreender a intensa
variabilidade intra-específica observada nessa espécie tanto ao nível biológico como
genético.
1.2.1 Organização Genômica do T. cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta seu genoma organizado em uma região de DNA
nuclear e outra extranuclear caracterizada, no caso dos membros da ordem
Kinetoplastida, por uma mitocôndria única e alongada, constituindo o cinetoplasto
(Myler et al., 1993). Essa organela é composta de duas classes de moléculas de DNA
circulares denominadas maxicírculos e minicírculos, correspondentes a cerca de 23% a
30% de todo o DNA celular denominado DNA do cinetoplasto ou kDNA do T. cruzi
(Stuart et al., 1983; Degrave et al., 1988). Os minicírculos estão presentes em torno de
10.000 a 20.000 cópias por célula, que encontram-se concatenadas entre si, sendo
constituídos de quatro regiões conservadas intercaladas por quatro regiões variáveis.
As regiões conservadas contêm a região de replicação do DNA, enquanto as regiões
variáveis estão envolvidas com a produção de pequenos RNAs guias (gRNAs) que
participam da editoração dos mRNAS das enzimas mitocondriais. Os maxicírculos estão
presentes em cerca de 20 a 50 cópias por célula e contém os genes de proteínas
relacionadas com a respiração celular, bem como de RNAs ribossomais (Sanches 1984;
Westemberg et al., 2006).
Como todos eucariotos, o T. cruzi possui além do DNA mitocondrial, o DNA
nuclear, que em conjunto, mantém a homeostase celular. Seu conteúdo total pode
variar de 125 a 330 fentogramas por célula (McDaniel e Dvorak, 1993; Henriksson et
al., 1996). Em relação ao DNA nuclear, os tripanossomátideos apresentam diferenças
na cromatina em comparação com os mamíferos e outros grupos de organismos,
sendo as mesmas pouco compactadas e frágeis, tanto em nível físico como enzimático
(Toro et al., 1988; Galanti et al., 1998). Outra característica do DNA nuclear desse
7
Introdução
grupo é a organização das cromatinas em relação aos eucariotos superiores e a outros
protistas. Seus cromossomos, em número aproximado de 41 pares (Teixeira et al.,
2011), não condensam durante a divisão celular, e por vários anos, os pesquisadores
acreditavam que a falta da condensação dos cromossomos era devido a ausência
histonas aderidas às fitas de DNA. Estudos mais recentes confirmaram a presença
dessas proteínas nesses organismos, mas revelaram diferenças fundamentais na
estrutura da Histona H1, o que poderia explicar a baixa estabilidade estrutural das
cromatinas do T. cruzi (Toro et al., 1988).
Recentemente, o genoma nuclear completo da cepa CL Brener foi publicado na
literatura (El-Sayed et al., 2005) estimando-se que o tamanho do genoma diplóide gire
em torno de 106,4 e 110,7 megabases, contendo cerca de 22570 genes. Cerca de 50%
destes é composto por seqüências repetitivas (DNA satélite), apresentando cerca de
100.000 cópias; os minissatélites com aproximadamente 1000 cópias, e os
microssatélites que diferem no tamanho dos motivos de repetição (Hancock, 1999),
além de genes que codificam proteínas de superfície, retrotransposons e repetições
subteloméricas.
1.2.2 Variabilidade Biológica do T. cruzi
O T. cruzi é uma espécie que possui uma extensa variabilidade biológica, que já
foi observada em relação a sua morfologia (Andrade & Andrade, 1966; Andrade, 1985); a
taxa de crescimento e a virulência (Brener & Chiari, 1963; Brener, 1977) ao tropismo
tecidual (Vago et al., 2000), a suscetibilidade a drogas (Brener et al., 1976; Toledo et
al., 2003; Toledo et al., 2004b) e à composição antigênica (Krettli & Brener, 1982).
Carlos Chagas, em 1909, já descrevia algumas diferenças na biologia do
parasito. Este autor, observando a morfologia das formas tripomastigotas, sanguíneas
verificou a existência de formas largas e delgadas do parasito, achado que foi
posteriormente muito estudado por outros pesquisadores (Brener, 1965; Silva, 1959).
Foi então verificado que as formas delgadas predominam em cepas de alta virulência
com macrofagotropismo, desenvolvem parasitemia precoce e são mais suscetíveis aos
anticorpos circulantes. As formas largas por sua vez são miotrópicas, apresentam baixa
8
Introdução
virulência e maior resistência aos anticorpos do hospedeiro (Andrade, 1974; Brener,
1965; Brener, 1969).
Devido a variabilidade biológica da espécie, foi proposta por Andrade em 1974,
o primeiro critério de subdivisão das populações do T. cruzi em agrupamentos que
apresentavam padrões de comportamento biológicos semelhantes em camundongos,
baseado em parâmetros tais como: predomínio das formas largas ou delgadas, curva
de parasitemia, morfologia dos tripomastigotas sanguíneos, tropismo tecidual, taxa de
mortalidade, e lesões histopatológicas. Foram inicialmente definidos três grupos
denominados de Tipos I, II e III. Posteriormente, Andrade e Magalhães (1997),
avançando nesses estudos propuseram o termo biodema para esses grupos, que foram
assim caracterizados:
a) tipo I ou biodema I: seu protótipo é a cepa Y, sendo constituído por cepas
com predomínio das formas delgadas que se multiplicam rapidamente, originando
uma elevada parasitemia e, como conseqüência, a morte dos camundongos após o 7º
e 12º dia da infecção e macrofagotropismo na fase inicial da infecção.
b) tipo II ou biodema II: Possui como referência a cepa São Felipe, que se revela
com predomínio de formas largas e miocardiotropismo. Apresenta multiplicação
relativamente lenta, com picos de parasitemia irregulares entre o 12º e 20º dia de
infecção, podendo, nesse período, ocorrer elevado índice de mortalidade.
c) O tipo III ou biodema III: representado pela cepa Colombiana. Possui
predomínio das formas largas com lenta multiplicação, picos de parasitemia tardios
após o 20º e 30º dia de infecção; tropismo principalmente para a musculatura
esquelética e com baixo índice de mortalidade (Devera et al., 2003).
Essa heterogeneidade poderia contribuir para explicar diferenças regionais
quanto à variabilidade das manifestações clínicas, resposta ao tratamento, e até
mesmo à transmissibilidade do parasito.
1.2.3 Variabilidade Genética do Trypanosoma cruzi
A variabilidade dos isolados do T. cruzi pode ser observada tanto em nível
biológico (Andrade et al., 1985; Andrade et al., 1997) quanto em nível genético com
9
Introdução
base na análise do DNA e a expressão de proteínas (Miles et al., 2009; Zingales et al.,
2012).
Estudos pioneiros realizados por Toyé (1974), avaliando o perfil de isoenzimas
gerados por dois sistemas enzimático (ASAT - aspartato aminotransferase e ALAT alanina aminotransferase) demonstraram perfis de bandas diferenciados para os
grupos analisados, confirmando assim a existência da diversidade genética nesta
espécie. Posteriormente, diversos estudos foram realizados na tentativa de
demonstrar e comprovar esse pleomorfismo genético, utilizando esse mesmo
marcador, mas com número cada vez maior de loci avaliados. Estes estudos
permitiram evidenciar maior número de grupos genéticos distintos nessa espécie
(Miles et al., 1977 e 1978; Romanha et al., 1979 e 1982; Barnabé et al., 2000) - Tabela
I.
Com o advento da biologia molecular, diversos trabalhos foram realizados com
a utilização da técnica da reação em cadeia da Polimerarese (PCR) amplificando
diferentes alvos no genoma do T. cruzi, tanto em nível do genoma nuclear como do
mitocondrial a fim de classificar as subpopulações dessa espécie de acordo com sua
identidade genética. Um breve histórico sobre o desenvolvimento desses marcadores
é apresentando na Tabela I, iniciando com os estudos de RFLP-PCR realizados por
Morel et al. (1980), seguidos pelos clássicos trabalhos de genética de populações,
utilizando o RAPD e análises de isoenzimas, propostos por Tibayrenc et al. (1993) até o
estabelecimento do primeiro consenso taxonômico do T. cruzi (Anonymous, 1999).
Essa proposta foi uma tentativa de padronização da classificação da espécie, a fim de
facilitar a comunicação entre a comunidade científica e a correlação de resultados
(Anonymous, 1999). Desse modo, foram definidas três linhagens:
TcI: que incluia as cepas classificadas como Zimodema 1 (Miles et al., 1978), Tipo III
(Andrade, 1974) Ribodemas II/ III (Clark & Pung, 1994), Grupo 1(Tibayrenc, 1995) e
linhagem 2 (Souto et al., 1996).
TcII: que incluia as cepas classificadas como Zimodema 2 (Miles et al., 1978),
Zimodema A (Romanha et al., 1979), Tipo II (Andrade, 1974) e Ribodema I (Clark &
Pung, 1994);
10
Introdução
T. cruzi: que incluia as cepas caracterizadas como híbridas ou cuja caracterização fosse
inconclusiva devido a incongruência entre os marcadores, tais como o Zimodema 3
(Miles et al., 1978), Zimodema B (Romanha et al., 1979) Tipo 1 (Andrade, 1974) o
grupo 1/2 (Souto et al., 1996), genótipo 39 (Tibayrenc, 1995).
Entretanto, com o avanço das metodologias de análise multiloci para avaliação
da diversidade genética do parasito, outras subdivisões foram posteriormente
observadas no interior dessa espécie (Brisse et al., 2000; Freitas et al., 2006) . Nesse
contexto, Brisse et al. (2000) propuseram a subdivisão da espécie de T. cruzi em seis
sublinhagens incluindo a DTU I correspondente a linhagem I definida por Anonymous
et al.(1999); DTU IIb correspondente a linhagem II e às DTU(s) IIa, IIc, IId e IIe que
representariam aqueles isolados com classificação ainda inconclusiva quando
estabelecido o consenso de 1999. Por exemplo, a DTU IId e IIe seriam isolados que
apresentaram perfil híbridos e, as DTU(s) IIa e IIc equivalentes ao Zimodema 3 descrito
por Miles et al. (1977).
Com avanços nos estudos tentando correlacionar a genética do parasito com
suas propriedades biológicas fundamentais e aspectos epidemiológicos e clínicos da
doença, ficou evidenciado uma grande variação de propriedades entre membros de
das grandes linhagem do T. cruzi (Toledo et al., 2002; Toledo et al., 2003; Miles et al.,
2009), o que fez com que alguns autores sugerissem que provavelmente as subdivisões
menores apresentariam maior especificidade (Tibayrenc et al., 2003). Desse modo,
outro consenso taxonômico para o T. cruzi foi realizado em Buzios, RJ, durante um
encontro de Protozoologia, e uma nova classificação da espécie foi publicada (Zingales
et al. , 2009), conforme descrito na Tabela I.
Tabela I: Resumo da revisão bibliográfica da variabilidade genética do Trypanosoma cruzi
11
Introdução
Autores
Metodologias
Resultados e Classificação
Miles et al,. 1977 e
1978
Análises de isoenzimas
empregando oito locos
enzimático na avaliação
de isolados da Am e Ba,
Brasil.
Os autores concluíram que, os isolados que
apresentassem os mesmos perfis para cada sistema
enzimático seriam classificados em Zimodemas (Z1, Z2
e Z3). Os perfis Z1 e Z3 foram mais relacionados aos
parasitos obtidos do ciclo silvestre e o grupo Z2 mais
relacionados com o ciclo doméstico. Os mesmos
descreveram a predominância do grupo Z2 no Brasil e
Z3 em outros países do Cone Sul.
Romanha et
1979, 1982
al,.
Análises de isoenzimas
empregando oito locus
isoenzimáticos
na
avaliação de amostras
provenientes
de
hospedeiros silvestres e
pacientes
humanos
isolados de diversas
áreas endêmicas
do
Brasil.
Os autores propuseram a classificação dos isolados de
acordo com os perfis apresentados em quatro
Zimodemas: ZA, ZB, ZC e ZD. O zimodema Z2
proposto por Miles em (1978) apresentava forte
correlação com o Zimodema ZA de Romanha (1979 e
1982).
Tibayrenc e Ayala
1986;
Tibayrenc
e
Brenière, 1988
Análises de isoenzimas
empregando 15 locus
enzimáticos na avaliação
de isolados provenientes
de
vetores,
de
reservatórios
e
de
pacientes, de diversos
países da America Latina
e Estados Unidos.
Identificação de 43 grupos genéticos distintos
denominados de clonets naturais do T. cruzi, dos quais
quatro genótipos ocorrem em maior freqüência e
dispersão geográfica, perfazendo cerca de 53,7% das
amostras e, por isso, representariam os genótipos
principais do parasito: 19, 20, 39 e 32.
Morel et al., 1980
Análise Fragmentos de
restrição do KDNA –
RFLP dos minicírculos,
de cepas provenientes de
vetores
e
pacientes
humanos da América
Latina.
Encontraram padrões de bandas específico para grupos
distintos do parasito, que foram denominados como
Esquizodemas. A metodologia demonstrou um grande
número de subdivisões que dificultou a interpretação
dos resultados.
Sturm et al., 1989
RFLP – PCR de cepas
provenientes
de
diferentes regiões da
America
Latina,
e
representantes de todos
os zimodemas.
Estudaram RFLP–PCR nos minicírculo e observaram
que a metodologia poderia ser realizada diretamente em
amostras biológicas sem a necessidade de sua
manipulação em cultura.
Análises de 10 primers
de RAPD (Random
Amplified
Polymorfic
DNA) e Isoenzimas em
24 isolados provenientes
do Brasil, Chile, Bolivia
e Venezuela.
Os autores mostraram correlação entre os resultados
obtidos por isoenzimas e RAPD. Essa paridade entre
os dois conjuntos de resultados confirma que os
Tibayrenc
al.,1993;
et
marcadores de RAPD são confiáveis marcadores
genéticos. O RAPD também é adequados para
reconstruir filogenias de diferentes espécies e
organismos, bem como investigar as sublinhagens
intraespecíficas.
12
Introdução
Steindel et al., 1993
Análises com 4 primers
de RAPD em 32 isolados
provenientes de diversos
países da América do
Sul.
Os perfis de RAPD de 18 cepas pertencentes ao
zimodema 1 (Z1), recolhidos de várias regiões da
América do Sul, exibiu um padrão consistente e
59% das bandas produzidas estavam presentes em
todas as cepas Z1. Um nível semelhante de
consistência foi verificado no número de bandas
compartilhadas entre 5 cepas Z2, 4 cepas ZB e ZC,
pertencentes a 2 linhagens. A análise fenética das 5
diferentes linhagens Z1, com base no
compartilhamento de banda mostrou que suas
inter-relações espelhou a sua origem geográfica. A
comparação dos perfis de RAPD de estirpes de
zimodemas diferentes mostrou que menos de 7%
de bandas das cepas em um zimodema estão
presentes nas cepas de outro zimodema.
Souto e Zingales.,
1993
Análise do polimorfimo
da região divergente do
Domínio
D7
da
subunidade 24Sα rDNA,
Os autores estudaram o gene que codifica o rRNA 24Sa
em diversos isolados de T. cruzi de diversos
hospedeiros da América Latina, demonstrando se tratar
de um alvo específico nessa espécie. Por meio da
técnica de PCR amplificaram e seqüenciaram dois
produtos distintos: um fragmento de 125pb e outro de
110pb, permitindo classificar o parasito em dois grupos
linhagens I e II, respectivamente . Posteriormente, o
aumento do número de amostras permitiu demonstrar a
existência de um terceiro grupo de cepas que
apresentavam os dois fragmentos (110 e 125 pb),
correspondentes à perfis híbridos, atualmente DTU V,
que foi então denominados grupo ½ (Souto et al.,
1996).
Clark & Pung, 1994
Análise do polimorfismo
da subunidade 18S do
rRNA por RFLP-PCR.
Ao estudar cepas provenientes de diversas áreas
endêmicas, classificaram-nas em três grupos
denominados Ribodemas I, II e III. As cepas
identificadas como Ribodema I correspondentes ao
grupo TcI e as cepas identificadas como Ribodema II e
III correspondentes ao grupo TcII proposto por Souto et
al., (1996).
13
Introdução
Souto et al., 1996
Análise do polimorfismo
da região inter-gênica. do
gene do mine-exon em
isolados provenientes de
diversos
hospedeiros
naturalmente infectados
da América Latina.
Os isolados apresentaram m produtos amplificados de
com 300pb e 350pb. Associados aos resultados para o
polimorfismo do gene 24Sα rDNA os autores
propuseram a classificação do T. cruzi em três grupos:
Grupo I que apresenta um fragmento de 125 pb para o
rRNA e 330pb para o mini-exon, Grupo II que
apresenta um fragmento de 110 pb para o rRNA e
350pb para o mini-exon e grupo 1/2 que apresenta
ambos os produtos de amplificação do rRNA e do
produto do grupo I do mini-exon.
Anonymous, 1999
1ª Reunião para unificar
a
classificação
da
espécie, sendo definidos
duas linhagens genéticas,
a fim de facilitar as
correlações entre os
diferentes estudos.
TcI: cepas classificadas como Zimodema 1 (Miles et
al., 1978), Tipo III (Andrade, 1974) Ribodemas II/ III
(Clark & Pung, 1994), Grupo 1(Tibayrenc, 1995) e
linhagem 2 (Souto et al., 1996).
TcII: cepas classificadas como Zimodema 2 (Miles et
al., 1978), Zimodema A (Romanha et al., 1979), Tipo II
(Andrade, 1974), Ribodema I (Clark & Pung, 1994);.
Cepas com classificação inconclusiva foram
denominadas somente T. cruzi incluindo aquelas com
perfil hibrido (Zimodema B de Romanha et al; Tipo 1
de Andrade, 1974; o grupo 1/2 de Souto et al., 1996; ,
genótipo 39 de Tibayrenc et al. 1993) ou com
incongruência entre marcadores como o Zimodema 3
(Miles et al., 1978)
Brisse et al.,2000ª
Análises
de
RAPD
empregando
20
iniciadores RAPD e 22
loci de isoenzimas.
Em
isolados
provenientes de diversos
países da América Latina
e Estados Unidos da
América.
Propuseram a existência de seis grupos de T. cruzi ou
DTU(s), que foi definida como uma coleção de cepas
geneticamente relacionadas e idênticas quando
careacterizadas por marcadores moleculares comuns:
DTU I, correspondente a linhagem proposta por
Anonymous (1999); DTU II, correspondente a linhagem
II; DTU III e IV correspondentes ao Zimodema III;
DTU V e VI correspondentes ao grupos híbridos.
Brisse et al.,2000b
Clonaram
regiões
amplificadas
(SCAR),
provenientes
da
amplificação
de
3
primers
de
RAPD.
Utilizaram 87 cepas do
T. cruzi, representantes
de todos os seis DTU(s)
provenientes de diversas
regiões da
América
latina.
A combinação dos três marcadores SCAR resultou
em padrões característicos que eram distintos nas
seis linhagens. Além disso, as linhagens do T. cruzi
foram distintas do Trypanosoma rangeli e T. cruzi
marinkellei. A excelente correspondência desses
novos marcadores de PCR com as linhagens
filogenéticas, aliada à sua sensibilidade, torna-os
ferramentas confiáveis para a identificação dos seis
DTU(s) e caracterização de isolados do T. cruzi.
14
Introdução
Freitas et al., 2006
Análise do polimorfimso
da subunidade II do gene
Citocromo oxidase por
RFLP
analisando
amostras representativas
das
seis
DTU(s)
estabalecidas por Brisse
et al. (2000).
Sugeriram a existência do TcIII. Haplogrupos
mitocondrial A, B e C, sendo que o haplótipo A tem
correspondência com o Z2 e rDNA tipo 2, o haplótipo B
comparados com os híbridos e Z3, e o haplótipo C
relacionado com Z2 e rDNA tipo 1. A DTU 2b
corresponde ao Zimodema 2 (Miles et al., 1977), as
DTU 2c ao Zimodema 3 (Miles et al., 1977).
Rozas et al., 2007
RFLP-PCR de 12 genes
constitutivos
do
protozoário e análise dos
resultados
para
genotipagem via MLP,
em 50 amostras isoladas
de humanos, hospedeiros
vertebrados
e
invertebrados de uma
importante
área
endêmica do Chile.
Os produtos de digestão dos 12 genes foram avaliados
utilizando o método de análise proposto pelos autores
MLP. A metodologia foi considerada eficiente na
identificação dos seis DTU(s) do protozoário, além de
ser capaz de fazer a genotipagem dos isolados
diretamente nos tecidos do hospedeiro. A identificação
dos DTU(s) segue um algoritmo (MLP), avaliando as
sucessivas reações de RFLP-PCR.
Zingales et al., 2009
Segundo
Consenso
Taxonômico em T. cruzi
Foi definido que a espécie T. cruzi é subdividida em
seis grupos denominados TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV
e TcVI de acordo com as análises moleculares e
biológicas avaliadas e citadas anteriormente. Desse
modo, TcI corresponderia ao linhagem TcI definido por
Anoymous et al (1999) e a DTU I de Brisse et al. (
2000); TcII a linhagem TcII de Anonymous et al (1999)
e a DTU Iib de Brisse et al., 2000; TcIII ao Z3/Z1 de
Miles et al. (1981) DTU IIc de Brisse et al. (2000) e
TcIII de Freitas et al. (2006); TcIV ao Z3 e DTU IIa;
TcV aos grupos Z2, rDNA ½ e DTU IId; TcVI ao
zimodema B e DTU IIe
1.2.4 Estrutura Populacional do Trypanosoma cruzi
Em um importante estudo sobre a variabilidade genética do T. cruzi, Tibayrenc
et al. (1986) pela análise dos perfis isoenzimáticos de amostras provenientes do ciclo
silvestre e do doméstico da Doença de Chagas, de diferentes regiões da América
Latina, demonstraram que o T. cruzi possui estrutura e evolução predominantemente
clonal. Os autores observaram que o número detectado de genótipos foi
extremamente inferior às combinações esperadas para os loci analisados,
evidenciando um grande desvio do equilíbrio da Lei de Hardy-Weinberg. Esses estudos
demonstraram a existência de 43 zimodemas na espécie e, que 16 deles possuíam
diferença em apenas um alelo. Posteriormente, foi demonstrado que alguns
zimodemas ou clonets (19, 20, 39 e 32) foram encontrados em diferentes espécies de
15
Introdução
vetores, reservatórios animais e em humanos repetidas vezes, em diferentes áreas
geográficas e em momentos distintos, sendo por estas razões, denominados genótipos
principais do T. cruzi (Tibayrenc e Brenière, 1988).
O modelo de evolução clonal pressupõe que as subpopulações do T. cruzi
podem ser consideradas como unidades genéticas estáveis ao longo do tempo e do
espaço e, que as trocas genéticas entre os mesmos são eventos raros (Bogliolo et al.,
1996; Machado & Ayala, 2001; Brisse et al., 2003; Sturm et al., 2003; Gaunt et al.,
2003; Westenberger et al., 2006). Por essa razão, a estrutura populacional da espécie
tem que ser avaliada pelas mínimas taxas de recombinação acumulativas ocorridas ao
longo do tempo, o que gera variabilidade genética intra-específica e influencia a
estrutura populacional da espécie.
Nesse contexto, atualmente está bem estabelecido que existe seis subdivisões
genéticas (DTU) no interior dessa espécie, que foram denominadas de TcI, TcII, TcIII,
TcIV, TcV e TcVI (Zingales et al., 2009), com provavelmente dois eventos de
hibridização envolvidos na formação dessas linhagens. As DTU TcI e TcII consistem em
linhagens filogenéticas ancestrais, únicas e relativamente homogêneas. No entanto,
estudos recentes têm demonstrado significativa variabilidade no interior de TcI
(Ramirez et al., 2011). O seqüenciamento gênico suporta a idéia de que as DTU(s) TcIII
e IV apresentam afinidade tanto com Tc I quanto TcII, indicando que eles
apresentaram características híbridas derivadas dessas duas DTU(s) geradas
provavelmente, devido de eventos de hibridização entre
essas linhagens
(Westenberger et al., 2006); enquanto as DTU(s) V e VI apresentam haplótipos
provenientes de TcII e TcIII (Westenberger et al., 2005; Subileau et al., 2009; Yeo et
al., 2011).
Entretanto, análises de genes mitocondriais (Freitas et al., 2006) sugeriram a
divisão desta espécie em três grupos ancestrais e não em dois como nos estudos
anteriores. Essas linhagens foram denominadas de a) T. cruzi I e (b) T. cruzi II (
correspondentes a TcI e TcII, respectivamente); (c) T. cruzi III (que corresponderia a
cepas da DTU TcIII). Os autores ainda propuseram que a origem dos representantes
híbridos atualmente observados seria decorrente de eventos de hibridização entre TcII
e TcIII, corroborando os dados de Westerbeng et al. (2005). Análises filogenéticas
16
Introdução
baseadas nos perfis de microssatélites também suportam a existência de dois eventos
de hibridização na origem dos subgrupos híbridos do T. cruzi (Venegas et al., 2009).
1.2.5 Correlações com propriedades biológicas do parasito, clínicas e eco
epidemiológicas da Doença de Chagas
O modelo clonal proposto por Tibayrenc e Ayala (1988) para T. cruzi pressupõe
que na espécie a reprodução sexuada ou recombinação genética são nulas ou
praticamente ausentes. Como o parasito se reproduz predominantemente por divisão
binária, seu genótipo seria transmitido em bloco a sua progênie, o que resultaria
provavelmente em implicações biológicas importantes. Desse modo, os genótipos
filogeneticamente próximos apresentariam propriedades biológicas e especificidades
eco epidemiológicas muito semelhantes entre si, enquanto os genótipos mais
distantes filogeneticamente apresentariam tais propriedades mais distintas. Essa
hipótese tem sido comprovada por diferentes autores que avaliaram diferentes
propriedades do parasito em cultura celular (Laurent et al., 1997; Revollo et al., 1998),
no hospedeiros invertebrados (Lana et al., 1998) e em hospedeiros vertebrados
(Laurent et al., 1997; Toledo et al., 2002; Toledo et al., 2003; Martins et al., 2006).
Os isolados pertencentes a DTU TcI apresentaram maior capacidade de
multiplicação e sobrevivência em cultura celular e acelular (Andrade, 1985; Andrade e
Magalhães, 1997; Toledo et al., 2002; Andrade et al., 2010), vetores (Dvorak, 1980;
Lana, et al., 1998), grande capacidade de infectar animais de experimentação
(Andrade, 1985; Andrade e Magalhães, 1997; Toledo et al., 2002; Martins et al., 2006),
e maior resistência a drogas tanto in vivo (Brener et al., 1976; Filardi e Brener, 1987;
Toledo et al., 2002) como in vitro (Revollo et al., 1998). Em contraste, os isolados
pertencentes a DTU TcII
apresentaram-se valores menores em relaçaõ a essas
variáveis, enquanto os isolados da DTU TcV apresentaram características
intermediárias (Laurent et al., 1997; Revollo et al., 1998; Toledo et al., 2002). Por outro
lado, estoques pertencentes a DTU TcII foram mais patogênicos quando comparados a
DTU TcII (Toledo et al., 2003).
Variações geográficas quanto à distribuição genética das DTU(s) já foram
publicadas por diferentes autores. No cone Sul, a DTU I parece ser predominante na
17
Introdução
região da Bacia Amazônica e casos humanos crônicos envolvendo essa linhagem são
extremamente raros, principalmente relacionados a manifestações clínicas graves dos
pacientes (Miles et al, 1981a; Zingales et al, 1999; Coura et al, 2002; Buscaglia e Di
Noia, 2003). Países como Equador, Guatemala, Honduras, Costa Rica e Nicarágua, já
registraram grande ocorrência dessa DTU em diversos hospedeiros em seus território.
Este tem sido o principal genótipo relacionado a infecção humana nessa região
geográfica ( Miles et al., 2009; Ramos et al., 2011). Recentemente, essa DTU tem sido
frequentemente associada a casos agudos graves resultantes de surtos de infecção
oral (Coura, 2006; Dias et al, 2008; Steindel et al., 2008) e a entrada de roedores
silvestres no ambiente domiciliar (Luquetti et al., 1986). Ocorrência interessante dessa
linhagem é a associação com a reativação da doença em pacientes imunossuprimidos,
com a co-infecção Chagas/HIV (Añez et al., 2004; Burgos et al., 2008). Outra
característica importante da DTU TcI é sua resistência aos fármacos disponíveis para
tratamento etiológico da Doença de Chagas experimental demonstrada em modelo
murino (Toledo et al., 2002). É importante ressaltar que o DTU TcI apresenta
substancial heterogeneidade genética intragrupo (Herrera et al, 2007). Estudos em
isolados provenientes do México (Bosseno et al, 2002), Colômbia (Herrera et al., 2007),
Venezuela e da Bolívia (Llewellyn et al., 2009b) sugerem quatro subdivisõe dentro
dessa DTU (Herrera et al, 2007; Falla et al, 2009), embora estes não tenham sido
mencionados no consenso taxonômico de 2009.
Por outro lado a DTU TcII é o principal agente da Doença de Chagas na região
do Cone Sul da América Latina, e estudos epidemiológicos tem indicado a associação
dessa DTU com mamíferos sinantrópicos e humanos (Zingales et al., 1998; Zingales et
al., 1999; Brèniere et al., 1998). Uma outra observação importante relacionada a essa
linhagem é sua associação a casos graves de doença de Chagas no Sul da América
Latina, especialmente na região central, sul e sudeste do Brasil, onde as manifestações
cardíacas, megacólon, e megaesôfago são quase exclusivamente ligados a ela (Freitas
et al., 2005; Yeo et al., 2005; Lages-Silva et al., 2006). Diversos estudos tem associado
também a DTU TcII a infecção em hospedeiros invertebrados e veterbrados nos ciclos
doméstico e silvestre em todo Brasil (Fernandes et al., 1998; Zingales et al., 1998;
Fernandes et al., 1999ª; Zingales et al., 1999; Brenière et al., 1998; Marcili et al., 2006;
18
Introdução
D’ávila et al., 2006; Steindel et al., 2008; Brito et al., 2008; D’ávila et al., 2009 e Abollis
et al., 2011), indicando a importância epidemiológica dessa linhagem. Outra
característica importante dessa DTU é a resistência ao tratamento etiológico. A DTU
TcII é considerada mais sensível ao tratamento experimental (Revollo et al., 1998;
Toledo et al., 2002) e em pacientes humanos (Coronado et al., 2006).
As DTU TcV e possivelmente TcVI estão envolvidas em infecções humanas na
região do Chaco e países vizinhos, como Bolívia, Chile, norte da Argentina, e sul Brasil
(Virreira et al, 2006b; Cardinal et al, 2008). Trabalhos indicam que o megacólon na
Bolívia está associada predominantemente com TcV e em menor grau, com T. cruzi II
(Virreira et al., 2006b). Notavelmente, o TcV está associado com a transmissão
congênita da Doença de Chagas na Argentina, Bolívia, e na região sul do Brasil (Virreira
et al., 2006a, 2007; Valadares, 2007).
Além das DTU(s) TcII e TcV, diferentes autores têm indicado TcVI como uma
importante linhagem associada com a doença de Chagas no sul da América do Sul
(Miles et al., 2009). No entanto, devido à sua genética, dependendo do método
escolhido para a genotipagem dos isolados, o TcVI não pode sempre ser distinguido de
TcII ou TcV (Campbell et al, 2004; Burgos et al, 2008; Lewis et al, 2009; Macedo e
Segatto, 2010). Assim, a específica contribuição da associação da DTU TcVI em
infecções humanas e hospedeiros vertebrados e invertebrados torna-se difícil de ser
avaliada de forma adequada.
Devido aos problemas relacionados com a genotipagem do T. cruzi alguns
trabalhos foram propostos com a finalidade de se chegar a caracterização rápida e
segura dos isolados nas seis DTU(s) desse parasito. Devido a natureza híbrida de alguns
desses grupos, os protocolos combinam diferentes metodologias. O primeiro deles foi
publicado por Brisse et al. (2001) e que propôs a identificação das seis DTU(s) pela
analise integrada do polimorfismo dos genes 24Sα rDNA (Souto et al., 1996),
juntamente com 18Sα rDNA (Clark e Pung 1994); o segundo foi proposto por Lewis et
al. (2009), que representa segundo os autores, uma metodologia simples e acurada,
capaz de identificar todos os genótipos do parasito, avaliando os resultados do RFLPPCR de dois genes - HSP60 e GPI (Sturm et al., 2003; Gaunt et al., 2003) juntamente
19
Introdução
com os padrões do 24Sα rDNA; o terceiro esquema propõe a classificação pela análise
em conjunto do 24Sα rDNA (Souto et al., 1996), SL-IR (Burgos et al., 2007) juntamente
com o RFLP do gene Citocromo Oxidase subunidade II (CoII) (Freitas et al., 2006) e
publicado primeiramente por D’ávilla et al. (2009).
Atualmente, grandes esforços têm se concentrados no intuito de investigar a
correlação entre a variabilidade genética do parasito e suas características biológicas,
epidemiológicas e clínicas fundamentais, incluindo ainda a resistência/susceptibilidade
ao tratamento etiológico, a fim de delinear perfis cepa-específicos, que poderão
orientar as medidas de controle, o manejo do paciente e/ou seu tratamento. Desse
modo, é fundamental conhecer a variabilidade genética e a estrutura populacional de
qualquer agente patogênico em uma determinada região, sobretudo em estudos
epidemiológicos, de evolução do parasito, de diagnóstico da doença e seu prognóstico,
ou mesmo na pesquisa básica.
1.3 A Doença de Chagas em Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG.
Em um inquérito sorológico realizado no Brasil sobre a prevalência da Doença
de Chagas em meados de 1975 a 1980 foi constatado que 4,22% da população rural
encontrava-se com sorologia positiva para o T. cruzi (Camargo et al., 1984). O estado
de Minas Gerais exibiu umas das maiores prevalência no país, sendo o Norte de Minas,
e especificamente o Vale do Jequitinhonha, uma das regiões mais afetadas pela
Doença, apresentando o município de Berilo uma prevalência de 35,5% de
positividade.
Posteriormente, Dias et al. (1985) realizaram um inquérito sorológico em Berilo
para averiguar a real situação da doença na população e, encontraram 35,1% de
positividade na sorologia para Doença de Chagasna população residente no município
naquele momento. Após a realização desse inquérito várias intervenções foram
realizadas no município objetivando o controle da transmissão vetorial por meio de
ações conjuntas entre a prefeitura e o Programa de Controle da Doença de Chagas no
Brasil (PCDCh).
20
Introdução
Em um novo inquérito realizado em 1988, Aguilar et al. avaliaram um grupo de
1150 pessoas, entre jovens e adultos, encontrando uma positividade de 12,69% nessa
amostra. A prevalência foi consideravelmente menor que a encontrada por Dias et al.
em 1985, o que indicava declínio da prevalência, mas que o controle ainda não fora
completamente efetivo. Neste mesmo estudo, os autores investigaram ainda alguns
aspectos da doença de Chagas em indivíduos infectados, observaram que a
mortalidade entre os pacientes soropositivos era de 1,9% ao ano, que a cardiopatia
afetava cerca de 2,6% dos pacientes e que existia uma progressiva evolução clínica nos
pacientes infectados pelo T. cruzi circulantes naquela região demonstrados
posteriormente por Montoya (1998). Uma nova avaliação vetorial realizada por Silveira
e Rezende (1994) e Fernandes et al. (1992) verificaram que o P. megistus foi sempre a
espécie mais frequentemente encontrada como vetor da doença de Chagas em Berilo,
nativa na região e muito presente no peridomicílio determinando a manutenção do
ciclo doméstico de T. cruzi e servindo como enlace com o ciclo silvestre.
Contudo, mesmo após o início das ações de controle vetorial na região e
implantação do PDCH e em Berilo houve várias interrupções em suas ações
decorrentes de problemas político e ou financeiros, especialmente na década de 80 e
início da década de 90. Somente no final da década de 90, a FUNASA intensificou o
combate aos triatomíneos vetores que culminou com a implantação da vigilância
epidemiológica e a criação dos PITs (postos de informação de Triatomíneos). Ficando a
região sob a supervisão da Gerência Regional de Saúde de Diamantina. Com o intuito
de avaliar o impacto do programa de controle, Montoya et al. (2003) realizaram um
novo inquérito sorológico no município. Os autores observaram uma prevalência de
positividade em 18% dos avaliados, e de apenas 0,17% entre os menores de 10 anos,
indicativa da efetividade da vigilância epidemiológica.
Em 2002, foi criado o Grupo de Pesquisa em Epidemiologia e Clínica da Doença
de Chagas no Vale do Jequitinhonha, que vem desenvolvendo um amplo trabalho em
dois municípios da região do Vale do Jequitinhonha, MG, que atualmente
correspondem ao município de Berilo liderado pela Universidade Federal de Ouro
Preto-MG em colaboração com pesquisadores de outras instituições brasileiras
(UFMG, Instituto René-Rachou – Fiocruz, MG e, Fiocruz - RJ). Esse grupo vem
sistematicamente avaliando vários aspectos relacionados à doença de Chagas na
21
Introdução
região, principalmente, nos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, que
constituía até 1997 um distrito de Berilo. Nesse contexto, Borges et al. (2006)
realizaram um inquérito sorológico em 1412 escolares de 7 a 14 anos na região e
encontram uma prevalência de 0,4% de positividade de doença de Chagas no
município, menor que a observada nos anos anteriores e fortemente indicativa da
eficácia da vigilância epidemiológica.
Em 2009, Machado-de-Assis et al. (2009) (em preparação) realizaram um
levantamento integral sobre a positividade de triatomíneos vetores nos domicílios e
peridomicílios na região de Berilo, visitando cerca de 5242 unidades domiciliares e
7807 anexos, capturando 391 triatomíneos. Após análise microscópica do conteúdo
intestinal dos insetos nenhum exemplar apresentou infecção pelo T. cruzi,
confirmando que a transmissão vetorial estava controlada na região, e que a vigilância
epidemiológica também estava funcionando efetivamente.
Entretanto, a constatação de ausência de transmissão vetorial não representa
que a região esteja isenta dos problemas relacionados à infecção chagásica pelo fato
da espécie citada ser nativa no município. Aguilar et al. (1988) já haviam demonstrado
que 52% dos pacientes analisados já apresentavam ECG alterados. No município
vizinho de Virgem da Lapa, Borges-pereira (1997) encontrou prevalências de alterações
eletrocardiográficas de 48,5% entre os chagásicos contra 17,2% dos não chagásicos.
Montoya et. al. (1998) ao avaliar a evolução da doença cardíaca nos pacientes do
município de Berilo verificaram que em dez anos foi detectada evolução progressiva
em cerca de 28% dos indivíduos soropositivos. Nossa equipe detectou cerca de mais de
1000 pacientes infectados pelo T. cruzi na faixa etária de 16 a 85 anos, que necessitam
de avaliação e assistência clínica. A avaliação clínica dos pacientes também tem
revelado uma elevada taxa e diversidade de formas clínicas, indicando um alto grau de
morbidade associado à doença de Chagas (dados não publicados), corroborando dados
de outros autores obtidos na região. Esses resultados indicam que além de existir um
grande contingente de indivíduos chagásicos, a evolução da doença é progressiva e
grave na região, o que leva a considerar o tratamento desse pacientes na fase crônica
da infecção como recomendado pela OPAS a partir de 1998, visando melhor
prognóstico da doença. Lana et al. (2009) ao avaliar clinica e laboratorialmente 28
pacientes dos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, tratados com
22
Introdução
Benzonidazol há nove anos, constataram que os indivíduos não curados quando
tratados na forma indeterminada da doença apresentaram uma evolução clínica mais
lenta em comparação com os pacientes não tratados, corroborando trabalhos prévios
de outras regiões, onde o tratamento na fase crônica da doença é importante e pode
trazer benefícios para o paciente.
Embora importantes resultados envolvendo os pacientes integrados ao Programa já
tenham sido alcançados, ainda faltam algumas questões a serem investigadas junto
aos pacientes do município de Berilo e José Gonçalves de Minas, incluindo a
diversidade genética do T. cruzi, a fim de conhecer quais as linhagens do parasito estão
circulando na região e, provavelmente, influenciando os aspectos clínicos e
epidemiológicos da doença de Chagas.
Oliveira-Silva (2009) na tentativa de conhecer o perfil genético e biológico das
amostras de T. cruzi isolados de seus pacientes, residentes na região, caracterizou
biológica e geneticamente parasitos isolados de seis crianças, resultantes do inquérito
sorológico em escolares de Borges et al. (2006), e suas respectivas mães,
demonstrando que a maioria foi classificada como pertencentes ao grupo TcII e,
apenas um isolado caracterizado como pertencente ao grupo TcVI. Martins et al. (2011
em preparação) ao caracterizar molecularmente alguns isolados de T. cruzi
provenientes de pacientes de Berilo e José Gonçalves de Minas também detectaram
somente amostras com perfil semelhante ao grupo de TcII. Entretanto, é necessário
considerar que a amostragem foi ainda limitada e deve ser aumentada a fim de
realmente determinar o perfil genético real do parasito circulante na região.
O aumento do número de isolados analisados empregando a nova classificação
para o T. cruzi nas seis subunidades genéticas (Zingales et al, 2009) permitirá que os
resultados sejam comparados com dados obtidos em outros países do Cone Sul, de
modo a contribuir na elucidação do perfil epidemiológico-molecular do T. cruzi no
Brasil e, verificar se esse é realmente distinto dos outros países do Cone Sul da
América Latina, onde tem se verificado predominantemente a presença dos grupos
híbridos no ciclo doméstico de transmissão do parasito.
23
Justificativa
Considerando que em países do Cone Sul, principalmente o Brasil, a Doença de Chagas
humana está intimamente relacionada com a infecção por parasitos da linhagem TcII, e
que a genética pode ser relacionada tanto ao prognóstico da infecção chagásica como
a epidemiologia molecular do parasito, o presente trabalho propõe caracterizar
molecularmente amostras de T. cruzi isoladas de pacientes chagásicos crônicos,
residentes no Vale do Jequitinhonha, uma importante área endêmica da Doença de
Chagas na década de 80, a fim de identificar qual ou quais os genótipos do protozoário
estão influenciando o perfil clínico, biológico e eco epidemiológico da Doença de
Chagas na região em estudo.
24
3.0 OBJETIVOS
Objetivos
3.1 Objetivo geral:
Avaliar a diversidade genética de cepas de T. cruzi isoladas de indivíduos
chagásicos dos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, por meio de diferentes
marcadores moleculares, a fim de caracterizar o perfil genético do parasito circulante
na região.
3.2 Objetivos específicos:

Identificar as linhagens de T. cruzi circulantes entre pacientes nos municípios
do Vale do Jequitinhonha;

Avaliar a existência de variabilidade genética intra-grupo de T. cruzi por meio
da técnica de RAPD;

Verificar se há correlações entre os diferentes marcadores genéticos utilizados.
26
4. MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
28
Material e Métodos
4.1 Caracterização da Área em Estudo
Os municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas estão localizados no estado
de Minas Gerais, Vale do Jequitinhonha, a uma distância média de 760 quilômetros de
Ouro Preto. Os mesmos estão alocados no domínio do cerrado com coordenadas
geográficas aproximadas de 16° 57’06’’S e 42°27’56’’W, com uma altitude de 401m. Os
dois municípios apresentam uma população de 18.798 habitantes, onde cerca de 24%
residem nas áreas urbanas e 76% são residentes nas zonas rurais, (IBGE, 2007). Esses
municípios apresentam clima tipicamente tropical, com as estações do ano com
poucas variações climáticas, onde os períodos de chuva são curtos e predomina o
clima seco com temperatura média anual de 24°C.
A principal atividade econômica dos municípios é a agricultura familiar de
subsistência, não existe nas localidades indústrias que produzem matéria prima, sendo
dependentes do abastecimento de produtos industrializados provenientes de outras
regiões. Devido à falta de emprego e o clima não ser favorável para agricultura e
pecuária, os municípios sofrem com a migração sazonal em algumas épocas do ano,
principalmente durante a colheita da cana-de-açúcar no estado de São Paulo.
Berilo e José Gonçalves de Minas
Altitude - 401m
Área - 1042 Km²
760Km de Ouro Preto
População – 18.789 habitantes
Nordeste do Estado de Minas Gerais
Vale do Jequitinhonha
Figura 1: Mapa do estado de Minas Gerais localizando a região do Vale do Jequitinhonha e
mostrando algumas informações dos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas.
.
29
Material e Métodos
4.2 Pacientes e Amostras de T.cruzi
As amostras de T. cruzi avaliadas neste trabalho foram isoladas de
pacientes na fase crônica da doença de Chagas, todos nascidos e residentes nos
municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais,
Brasil.
A inclusão dos pacientes no Programa de Doença de Chagas ocorreu após
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e a confirmação do
diagnóstico sorológico para infecção pelo T. cruzi, segundo as diretrizes da Organização
Mundial de Saúde, que recomenda o emprego de dois testes com princípios
diferentes. Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos do Centro de Pesquisas René Rachou e registrado sob o número de Processo
007/2002 (Anexo I).
4.2.1 Obtenção das amostras
Para o isolamento dos parasitos foi empregada a técnica de hemocultura
descrita por Chiari et al. (1989). Dependendo do paciente, foram realizadas até seis
coletas de sangue em ocasiões distintas de avaliação clínica. O volume de sangue em
cada coleta foi de 30 mL. O sangue coletado foi mantido em isopor resfriado com gelo
e processado o mais rapidamente possível sendo então centrifugado a 1.000g durante
10 minutos e o plasma descartado. Posteriormente, o sedimento foi lavado uma vez
com meio LIT [Liver infusion Tryptose (Camargo et al., 1964)] e, novamente
centrifugado nas mesmas condições anteriores. Após descartar o sobrenadante, a
camada de leucócitos e o sedimento de hemácias foram retirados e semeados
separadamente em tubos plásticos com tampa de rosca contendo 5mL de meio LIT.
Todos os tubos foram incubados a 28ºC, sendo agitados levemente duas vezes por
semana. Alíquotas de 10 µL da suspensão de cada tubo foram examinadas ao
microscópio, entre lâmina e lamínula, em aumento de 40X, no 30°, 60°, 90° e 120° dias
após a coleta para verificar positividade para formas flageladas do T. cruzi . A Tabela II
mostra a relação das amostras de T. cruzi avaliadas neste trabalho, bem como algumas
informações dos pacientes dos quais elas foram isoladas.
30
Material e Métodos
Além das amostras isoladas dos pacientes foram utilizados clones de referência
das seis DTU(s) do T. cruzi, gentilmente cedidos pelo Dr. Michel Tibayrenc (IRD,
França), os quais foram avaliados comparativamente aos isolados obtidos dos
pacientes em todo o processo de caracterização molecular: TcI (P209 cl1, 92101601P
cl1 e Cutia cl1), TcII (MAS cl1 e Tu18 cl2), TcIII (CM-17 e X-109/2), TcIV (CANIII cl1 e
92122102R), TcV (BUG2148 cl1 e SO3 cl5) e TcVI (P63 cl1 e Tula cl2).
Tabela II: Informações das amostras de Trypanosoma cruzi e dos pacientes dos quais foram isoladas.
Número da amostra
229
264
376
438
440
452
501
523
525
529
543
595
646
728
748
791
798
817
818
820
839
845
860
896
914
953
1100
1107
1205
1315
1337
1442
1635
1918
2014
2118
2119
Sexo
Feminino
Feminino
Masculino
Feminino
Masculino
Feminino
Feminino
Masculino
Feminino
Feminino
Masculino
Feminino
Feminino
Masculino
Feminino
Masculino
Feminino
Masculino
Feminino
Masculino
Feminino
Feminino
Masculino
Feminino
Feminino
Feminino
Feminino
Masculino
Masculino
Masculino
Feminino
Feminino
Feminino
Feminino
Masculino
Feminino
Feminino
Idade em anos
64
59
55
39
61
53
20
54
46
62
49
51
60
73
56
54
45
17
60
49
65
61
62
60
55
18
50
32
72
56
49
62
57
72
60
65
73
31
Municípios
BER
BER
BER
BER
BER
JGM
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
Material e Métodos
2408
2478
2491
2495
2497
2535
1536
1113
467
479
493
653
BER PSF060
Masculino
Feminino
Masculino
Feminino
Feminino
Feminino
Feminino
Feminino
Masculino
Feminino
Masculino
Feminino
Feminino
66
54
61
63
57
51
57
30
60
50
47
67
59
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER
BER = Berilo e JGM = José Gonçalves de Minas
4.3 Obtenção do sedimento celular de T. cruzi
Após positivação da hemocultura, os parasitos foram mantidos em crescimento
por adição sucessiva de meio LIT até a obtenção de aproximadamente 35,0 mL de
cultura. A cultura foi transferida para tubos cônicos e centrifugada a 3.500 rpm, a 4°C,
por 30 minutos. Após a centrifugação o sobrenadante foi desprezado cuidadosamente
por inversão e, ao sedimento foi adicionado 10 mL de solução salina tamponada estéril
(PBS) e a mistura submetida a nova centrifugação, nas mesmas condições descritas
anteriormente, por 15min. Após repetição desse procedimento, o sedimento foi
transferido para um tubo de microcentifugação de 1,5 mL previamente pesado. Nova
lavagem deste sedimento com PBS estéril foi feita, seguida de centrifugação a 10.000
rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi eliminado cuidadosamente, o tubo foi
novamente pesado, sendo a massa úmida armazenada a -70°C para posteriores
análises moleculares.
4.4 Extração de DNA
A extração do DNA foi processada após descongelamento e homogeneização
de cada massa úmida dos isolados. Para obtenção do DNA das amostras foi utilizado o
kit de extração WizardTM Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA)
seguindo as recomendações do fabricante.
A concentração de DNA foi determinada por espectrofotometria, sendo as
leituras realizadas a 260nm. A concentração foi calculada a partir da densidade óptica
32
Material e Métodos
(DO) considerando que uma unidade de DO é correspondente a 50g DNA/l. A
pureza da amostra foi avaliada pela razão entre as densidades das absorbâncias
observadas a 260 e 280nm. Para sua utilização nas análises moleculares, as amostras
de DNA foram diluídas na concentração de 3ng/µL. Durante a realização dessa etapa,
um controle dos reagentes e uma amostras livre de DNA, foram processados em
paralelo.
4.5 Classificação Genética das amostras isoladas dos pacientes
Pelo fato de atualmente, existir diversos marcadores moleculares disponíveis
para a caracterização das populações do T. cruzi da escolha de tais marcadores ou
alvos ainda não ser um consenso e de que, geralmente, a resolução segura dos
isolados do parasito em seus seis subgrupos requer a combinação de diferentes
metodologias, devido a existência dos grupos híbridos em T. cruzi (Zingales et al.,
2012) foi feita neste trabalho, a opção de trabalhar com a metodologia de Lewis et al.
(2009) que descreveram um ensaio tríplice que mostrou ser eficiente, rápido e de
baixo custo para esse objetivo, tendo como base o polimorfismo dos do domínio
divergente D7 do gene 24αrDNA - LSU rDNA (Souto et al., 1996) e do perfil de restrição
enzimática dos genes HSP60/ECORV e GPI/HhaI. Outro esquema empregado
fundamentou-se na combinação da análise do polimorfismo do gene Mitocondrial
Citocromo Oxidase subunidade II (Freitas et al., 2006), do espaçador intergênico SL-IL
do mini-exon do T. cruzi (Burgos et al., 2007) e LSUrDNA. Essas metodologias de
genotipagem estão descritas abaixo. Todas as reações foram carreadas empregando
controles positivos e negativos em todas as etapas para seu controle interno e de
contaminação cruzada.
4.5.1 Amplificação da região 3’ do gene 24sα rDNA - LSU rDNA
Todos as amostras de DNA foram submetidas a três amplificações consecutivas
através do realização da PCR do domínio divergente do gene D7 da subunidade 24Sα
do rDNA (LSU rDNA), empregando a metodologia descrita por Souto et al. (1996). A
reação foi processada em um volume final de 15µL contendo: 10mM Tris-HCl pH 9,0;
33
Material e Métodos
50mM KCl; 0,1 % Triton X-100 (Buffer B, Promega, USA); 3,5mM MgCl2 (Promega);
0,625U Taq DNA Polimerase (Promega), 0,2mM de cada dNTP; 0,25µM dos iniciadores
D71 (3'-AAGGTGCGTCGACAGTGTGG-5’) e D72 (5’-TTTTCAGAATGGCCGAACAGT-3’) e
3ng de DNA de cada amostra. A PCR foi realizada em um termociclador Biocycler
MJ96G. Foi utilizado o seguinte protocolo de amplificação: uma etapa de desnaturação
inicial a 94°C por 1 min, seguida de outra etapa com 30 ciclos contendo um passo de
desnaturação por 30 s, um de anelamento a 60°C por 30 s e um de extensão a 72°C por
30 s.
Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida a 6% corado pela prata (Santos et al., 1993) utilizando a cuba marca
MUPID/USA. Os resultados foram visualizados no transiluminador Vilbert Lourmat TFPM/WL e fotografados com o auxílio do analisador de imagens Vilbert Lourmat SS20.
4.5.2 RFLP–PCR (Restriction fragment length polymorphism) dos genes HSP60
(Proteína do choque térmico) e GPI (Glicose 6-Fosfato Isomerase)
O polimorfismo dos genes HSP60 (Proteína do choque térmico) e GPI (Glicose
6-fosfato isomerase) para as populações do T. cruzi foi avaliado segundo o protocolo
de Lewis et al. (2009). A amplificação desses genes foi realizada em um volume final de
20 µL contendo: 2 mM MgCl2; 0,625 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen,
USA); 0,1% Tampão Buffer PCR 10X (Invitrogen, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0); 40 mM NaCl;
2 mM Fosfato de Sódio; 0.1 mM EDTA 1 mM DTT, estabilizadores, 50% (v/v) glicerol);
0,2 mM de cada dNTP; 0,25 µM de cada iniciador e 6 ng de DNA. A seqüência dos
iniciadores empregado nas amplificações foram:
a) HSP60 - HSP60-1 50(f) 5’GTGGTATGGGTGACATGTAC3’ e HSP60-2 50(r)
5’CGAGCAGCAG AGCGAAACAT3’ descritos por Sturm et al., (2003);
b) GPI - SO1(f) 5’GGCATGTGAAGCTTTGAGGCCTTTTTCAG3’ e SO2(r) 5’TGT
AAGGGCCCAGTGAGAGCGTTCGTTGAATAGC3’, descritos por Gaunt et al.,
(2003).
34
Material e Métodos
A PCR foi realizada de acordo com o seguinte protocolo: uma etapa inicial de
desnaturação a 94°C por 3min; sucedida por 4 ciclos contendo um passo a 94°C por
30s, um a 64°C por 30s e um final a 72°C por 1min. Em seguida foram realizados 28
ciclos de amplificação contendo um passo a 4°C por 30s, um a 60°C por 30s e um a
72°C por 1min. Para finalizar foi realizada uma etapa de alongamento a 72°C por
10min. Após a amplificação, 8 µL dos produtos amplificados foi submetido a
eletroforese em gel de agarose 1,5% para confirmação do sucesso da amplificação.
A reação de digestão com as enzimas de restrição foram realizadas em um
volume final de 20 µL empregando: 10 µL dos produtos amplificados de cada gene,
0,25U/µL de cada enzima específica (HSP60 com ECORV e GPI com HhaI), 100ng/µL de
BSA 1X e , 1,5 µL de Tampão específico de cada enzima, ECORV (Uniscience, USA)
tampão 1X NeBuffer (50mMTris-HCl 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol,
pH 7.9) e HhaI (Uniscience, USA), tampão 1X NEBuffer 4 (20 mM Tris-acetato, 50 mM
de acetato de potássio, 10 mM de acetato de Magnésio e 1 mM Dithiothreitol pH 7.9).
Os produtos amplificados de cada gene foram adicionados ao mix contendo
todos os reagentes de corte juntamente com as específicas enzimas de restrição em
uma capela de fluxo laminar, devidamente descontaminada de DNA e irradiada com
luz ultravioleta por 20min. As amostras foram incubadas a 37°C por 4 horas e os
produtos de corte submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%, corados com
brometo de etídeo. Os produtos da PCR foram visualizados no transiluminador Vilbert
Lourmat TFP-M/WL e fotografados com o auxílio do analisador de imagens Vilbert
Lourmat SS20.
4.5.3 Caracterização pela PCR do gene Mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade II
(COX II)
Para a amplificação da região gênica que compreende um fragmento da
subunidade II da enzima mitoncondrial Citocromo Oxidase (COII), foi empregado o
protocolo descrito por D’ávilla et al. (2009). Os DNA’s das amostras de T. cruzi foram
submetidos a uma PCR composta de 10mM Tris-HCl pH 8,4, 50mM KCl, 0,1% Triton X100, 1,5mM MgCl2, (Tampão 10x, Invitrogen, Brasil ); 1U Taq DNA Polimerase Platinum
(Invitrogen, USA); 250M de cada dNTP; 0,3 M de cada um dos iniciadores TcMit10
35
Material e Métodos
(5’-CCATATATTGTTGCATTATT-3’) e TcMit21 (5’-TTGTAATAGGAGTCATGTTT-3’); 3ng de
DNA e quantidade de H2O Milli-Q estéril suficiente para 15L.
Os ciclos de amplificação da PCR consistiram de uma desnaturação inicial a 94C
por 5 min, seguido de 40 ciclos contendo um passo de desnaturação a 94C por 45s,
um anelamento a 45C por 45s e uma extensão dos iniciadores a 72C por 1 min. Os
produtos amplificados foram revelados em gel de agarose 1,5% corados pelo brometo
de etídeo. Os produtos da amplificação foram visualizados no transiluminador Vilbert
Lourmat TFP-M/WL para confirmação da amplificação de cada amostra, e os produtos
fotografados.
Posteriormente, 10L dos produtos amplificados foram submetidos à digestão
empregando-se a enzima de restrição AluI (Invitrogen, USA, 4 a 12U/µ), durante 16
horas a 37°C. O mix do corte com a enzima ALUI foi realizado utilizando 3µL de H 2O,
1,5 µl do tampão específico da enzima ALUI (Invitrogem, USA) contendo 100 mM TrisHCl, pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 0,5 µl da enzima de restrição
ALUI (Invitrogen, USA, 4 a 12 U/ µL), juntamente com 10 µL dos produtos amplificados
do gene da Citocromo oxidase, subunidade II. Os fragmentos gerados foram
visualizados em gel de poliacrilamida a 6% corado pela prata (Santos et al., 1993) e
analisados no Transiluminador Vilbert Lourmat TFP-M/WL, fotografados com o auxílio
do analisador de imagens Vilbert Lourmat SS20 .
4.5.4 Espaçador intergênico dos genes mini-exon de T. cruzi (SL-IR)
Para a amplificação da região intergênica dos genes de mini-exon foi utilizado o
protocolo descrito por Burgos et al. (2007). O DNA das amostras de T. cruzi foi
submetido a uma PCR contendo 20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, (Tampão PCR, 10x,
Invitrogem); 3 mM MgCl2; 250 mM de cada dNTP; 3μM de cada iniciador TcIII (5’CTCCCCAGTGTGGCCTGGG-3’) e UTCC (5’-CGTACCAATATAGTACAGAAACTG-3’); 1U Taq
DNA polimerase Platinum (Invitrogen, USA); 3ng de DNA total e quantidade de H2O
Milli-Q estéril suficiente para completar 15μL.
Os ciclos de amplificação da PCR consistiram de uma etapa inicial de
desnaturação a 94ºC por 3min, anelamento a 68° C por 1 min, extensão dos iniciadores
36
Material e Métodos
e extensão a 72ºC por 1 min. Nos ciclos subseqüentes o tempo de desnaturação foi
reduzido a 1 min e a cada três ciclos, a temperatura de anelamento foi diminuída para
66, 64, 62 e 60°C seqüencialmente. Na última temperatura, o número de ciclos foi
aumentado para 35, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 min.
A análise dos produtos amplificados foi realizada em gel de agarose 1,5%
corados pelo brometo de etídeo. Os mesmos foram visualizados no transiluminador
Vilbert Lourmat TFP-M/WL e fotografados com o auxílio do analisador Vilbert Lourmat
SS20.
4.6 Análise para Classificação dos isolados nas respectivas DTU(s)
A classificação dos isolados em suas respectivas DTU(s) foi inicialmente
realizada seguindo o tripé de análise proposto por Lewis et al. (2009), que combina os
resultados encontrados na avaliação do polimorfismo dos genes gene 24Sα rDNA
juntamente com os produtos de corte do RFLP-PCR dos genes da HSP60 e da GPI,
conforme indicado no esquema abaixo:
24Sα rDNA
110pb
sempre
125pb
110pb
sempre
sempre
2bandas
HSP60-ECORV
1banda
1banda
GPI-HhaI
2bandas
3bandas
Classificação
TcI
TcII
2bandas
TcIII
120pb
110pb ou
125pb
110pb + 125pb
1banda
3bandas
TcIV
3bandas
4bandas
TcV
3bandas
4bandas
TcVI
Figura 2: Tripé de classificação dos isolados de Trypanosoma cruzi em seus respectivos DTU(s)
proposto por Lewis et al. (2009).
Posteriormente as amostras foram submetidas a análise do polimorfismo do do
24Sα rDNA (Souto et al., 1996) juntamente como polimorfismo do gene da região
intergênica do mini-exon (Burgos et al., 2007) e da subunidade II da enzima
37
Material e Métodos
mitoncondrial Citocromo oxidase - COII (Freitas et al., 2006). Nesse caso, para o perfil
de RFLP de amostras pertencentes a linhagens de TcI é esperado um padrão de
bandas triplo com bandas de 30, 81 e 264bp (Haplótipo A); TcII, com bandas de 81 e
212bp (Haplótipo C) ,
e isolados pertencentes as linhagens T. cruzi III, TcIV, TV e TcVI
com bandas de 81 e 294 pb (Haplótipo B).
Na análise do polimorfismo da região intergênica do mine-exon (Burgos et al.,
2007) é possível distinguir as linhagens de TcIII e IV com um amplicon de
aproximadamente 200pb, das linhagens TcI, II, V e VI que apresentam um amplicon de
cerca de 150-157pb.
A Tabela III abaixo traz o perfil de bandas em pares de bases e ou números de
bandas, esperados para as seis DTU(s) do T. cruzi considerando todos os marcadores
empregados nesse estudo.
Tabela III: Critérios de classificação dos isolados de Trypanosoma cruzi nos DTU(s) TcI ao
TcVI, segundo Lewis et al. (2009) e D’ávilla et al. (2009).
identificação dos DTU’s os isolados necessitam apresentar necessariamente os perfis idênticos
RFLP-COXII
SL-IR
24sα
rDNA emRFLP
-HSP60
RFLP-GPI
aos clones de
referência
cada uma
das três metodologias.
DTU(s)
(Souto et al., 1996)
(Sturm et al., (2003)
(Westerberger et al.,
2005)
(Freitas et al., 2006)
(Burgos et al., 2007)
Fragmentos em pares de bases ou número de bandas apresentado
TcI
110pb
1banda
2bandas
Haplotipo A
~150/157pb
(262pb + 81pb +
30pb)
TcII
125pb
1banda
3 bandas
Haplótipo C
~150/157pb
(212pb + 81pb)
TcIII
110pb
2 bandas
2 bandas
Haplótipo B
200pb
(294pb + 81pb)
TcIV
~120pb
1banda
3 bandas
Haplótipo B
200pb
(294pb + 81pb)
TcV
TcVI
110pb +
125pb
3 bandas
125pb
3 bandas
4 bandas
Haplótipo B
~150/157pb
(294pb + 81pb)
4 bandas
Haplótipo B
(294pb + 81pb)
38
~150/157pb
Material e Métodos
5.0 RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA)
A técnica de RAPD foi realizada segundo a segundo o protocolo descrito a
seguir: Cada reação foi realizada em um volume final de 20µl contendo: 10 mM de
Tris-HCl (pH 9,0), 20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, (10X PCR Buffer, Invitrogen, USA);
1,5 mM MgCl2; 125 µM de cada dNTP, 1,0 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen,
USA); 6,4 pmoles de cada iniciador; 3ng de DNA. A amplificação foi realizada nas
seguintes condições: uma etapa inicial de desnaturação a 95°C por 5 minutos; seguida
de dois ciclos térmicos compostos por uma etapa de desnaturação a e 95°C por 30 seg,
anelamento a 30°C por 2 minutos e de alongamento 72°C por 1 minuto. Na sequência
foram realizados 33 ciclos com um de desnaturação a 95°C por 30seg, um de
anelamento a 40°C por 1min e um de extensão a 72°C por 1 minuto. Para finalizar foi
realizado uma etapa de extensão a 72°C por 5 minutos. Para a realização desta reação
foram utilizados dez oligonucleotídeos iniciadores propostos por Brisse et al. (2000b)
cujas seqüências estão descritas na Tabela IV .
Tabela IV - Primers utilizados na caracterização dos isolados de Trypanosoma cruzi, por RAPD
(Brisse et al., 2000b)
Primers utilizados
Nome
Sequência
N° de nucleotídeos
A10
5’ GTGATCGCAT 3’
10
A7
5’GAAACGGGTG 3’
10
A15
5’ TTCCGAACCC 3’
10
B15
5’GGAGGGTGTT 3’
10
B19
5’ACCCCCGAAG 3’
10
F13
5’ GGCTGCAGAA 3’
10
F15
5’ CCAGTACTCC 3’
10
N9
5’ TGCCGGCTTG 3’
10
N19
5’ GTCCGTACTG 3’
10
U7
5’ CCTGCTCATC 3’
10
Após a amplificação os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em
gel de agarose a 1,5%, a 100 Volts (30mA) por aproximadamente 40 minutos. A
39
Material e Métodos
visualização das bandas foi realizada empregando brometo de etídeo e analisadas com
auxílio do visualizador de imagens Vilbert Lourmat TFP-M/WL.
5.1 Análise dos resultados de RAPD
A análise dos perfis de bandas obtidas pela técnica de RAPD foi feita
visualmente pela análise individual de cada banda amplificada em número de 8 a 11
bandas por amostra. Os padrões observados foram inseridos manualmente no
computador e submetidos à análise de proporção de bandas compartilhadas entre as
populações do T. cruzi utilizando o programa Treecon (Van de Peer & De Wachter,
1994). O programa analisa os dados em comparações de pares em n(n-1)/2
fornecendo o número total de bandas e a proporção de bandas compartilhadas por
cada par e, no final, para todos os pares. Para construção do fenograma foi utilizada
como medida de distância genética o método da Média Aritmética não Ponderada –
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis, Sneath & Sokal, (1973). Os dados
obtidos foram submetidos ao teste de Bootstrap com 1000 reamostragens
(Felsenstein, 1985).
40
6.0 RESULTADOS
Resultados
As linhagens genéticas do T. cruzi presentes em pacientes infectados
provenientes dos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, região do Vale do
Jequitinhonha, Minas Gerais, foram determinadas por meio da análise combinada do
polimorfismo de diferentes alvos moleculares conforme descrita no item 4.6. Na
seqüência serão descritos os resultados obtidos para cada um desses marcadores.
6.1 Análises do polimorfismo do domínio divergente do gene D7 do 24Sα rDNA
(LSUrDNA)
Na avaliação do polimorfismo do gene D7 do 24Sα rDNA (LSUrDNA) os isolados
de T. cruzi dos pacientes apresentaram somente perfil de bandas de 125pb (rDNA tipo
I) para todos os 51 isolados avaliados neste trabalho, característicos das linhagens
genéticas de TcII ou TcVI (Figura 3).
Figura 3: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes
de pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, MG obtidos pela amplificação da região 3´do gene
24Sα rDNA.
PM – Peso molecular de 100pb, Br – controle negativo da reação, TcI – clone representativo de TcI
(P209 cl1, apresentando o perfil 110pb) , TcII – clone representativo do grupo TcII (MAS cl1, 125pb),
TcIV clone representante do grupo TcIV (CANIII, ~120pb), TcIII- clone representativo da linhagem
TcIII ( CM-17, 110pb), TcVI – clone representativo do grupo híbrido TcVI (Tulahuen cl2, 125pb) e TcV
– clone representativo do grupo TcV (Bug2148, de 110pb + 125pb); A1 – isolado 229, A2- isolado
452, A3 - isolado 748, A4 – isolado 798, A5- 1205, A6 – 1918, A7- 2535, A8- 2491, A9 264; A10 - 376;
A11 - 646 e A12 amostra 2118.
42
Resultados
6.2 Análise de polimorfismo do gene da Proteína do choque térmico (HSP60)
Após a amplificação utilizando primers específicos para o gene HSP60 foi
verificado que todos clones de referência e isolados apresentaram produtos
apresentando perfis de bandas de 432pb – 462pb, que foram a seguir submetidos a
digestão específica.
A análise do perfis de bandas apresentados pelos produtos de amplificação
após o corte com ECORV revelou variação no tamanho dos fragmentos entre as
amostras isoladas dos pacientes. Quarenta e seis isolados apresentaram perfil de
banda único (432 a 462pb) característico das linhagens de TcI, TcII e TcIV. Por outro
lado, seis amostras das 51 analisadas (452, 748, 1205, 1337, 2118 e 2119)
apresentaram perfis de bandas triplas para RFLP-PCR do gene HSP60 (fragmentos
triplos que estão entre 100 e 432pb) característico das linhagens de TcV ou TcVI
(Figura 4).
Figura 4: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi
provenientes de pacientes chagásicos da região do Vale do Jequitinhonha, MG, por meio da
análise do polirmorfismo do gene HSP60 submetidos a RFLP-PCR.
PM – Peso molecular de 100pb, A1- amostra 1918, A2- amostra PSF060, A3- amostra 438, A4amostra 543, A5- amostra 229, A6-amostra 2119. Br – controle negativo da reação de PCR; TcI a
TcVI amostras do perfil de corte dos clones de referência dos 6 grupos de T. cruzi ( TcI – P209
cl1, 1 banda de 432 a 462pb; TcII – MAS cl1 1 banda de 432 a 462pb; TcIII CM-17, perfil de
bandas duplas; TcIV CAN III cl1, banda única; TcV Bug2148, bandas triplas; TcVI Tulahuen cl2,
bandas triplas).
43
Resultados
6.3 Análise de polimorfismo do gene da Glicose-6-fosfato isomerase (GPI)
Após amplificação específica do fragmento do gene da glicose-6-fosfato
isomerase (GPI), foi encontrado um fragmento de 1264pb, conforme obtido por Lewis
et al. (2009). Após a confirmação da amplificação de cada produto, os mesmos foram
submetidos ao corte com a enzima de restrição HhaI e revelaram diferenças no perfis
de bandas observadas entre os isolados dos pacientes.
PM
BR A1 A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10 A11 A12 TcII TcV TcI TcIII TcVI TCIV
Figura 5: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes de
pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais, por meio da análise do polirmorfismo do
gene GPI/HhaI via RFLP-PCR.
PM – Peso molecular de 100pb, BR - controle negativo da reação, A1- amostra 2014, A2 – amostra
646, A4 – amostra 229, A5 – 440, A6 – 501, A7 – 523, A8 – 2478, A9 - PSF060, A10 – 1100, A11 – 820 e
A12 isolado 2535. TcII (clone TU18 cl1 representativo do DTU TcII), TcV (clone SO3 cl5, DTU TcV), TcI
(clone 92101601P cl1, DTU TcI), TcIII (Clone X109/2, DTU TcIII), TcIV (clone SO3 cl5, DTU TcIV) e TcVI
(clone Tulahuen, DTU TcVI).
Quarenta e três isolados apresentaram perfis de bandas triplas semelhantes ao
encontrado pelos clones representantes das linhagens TcII e TcIV, enquanto as oito
amostras restantes (229, 452, 748, 798, 1205, 1337, 2118 e 2119) apresentaram perfil
de bandas duplas característicos das linhagens de TcI e TcIII.
6.4 Análise de polimorfismo do gene Citocromo Oxidase II
Conforme descrito anteriormente, oito amostras analisadas previamente neste
estudo não fecharam a classificação da sua identidade genética baseado no ensaio
tríplice proposto por Lewis et al. (2009) e, portanto, tiveram que ser submetidas a
outros marcadores moleculares para permitir a identificação das linhagens do T. cruzi
às quais pertenciam as amostras isoladas dos pacientes. As amostras 229, 452, 748,
44
Resultados
798, 1205, 1337, 2118 e 2119 apresentaram o perfil de bandas duplas de 294pb, 81pb
(Figura 6), semelhante aos clones representativos do Haplótipo B (CM-17 e Tulahuen
cl2), pertencentes as linhagens de TcIII, IV e TcVI, respectivamente. O restante dos
isolados apresentaram perfis de 212pb + 81pb, característicos do haplogrupo
Mitocondrial C, típicos da linhagem TcII.
PM C1 C2 C3 C4 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 BR
294 pb
264 pb
212 pb
81pb
Figura 6: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes
de pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, MG, por meio da análise do polirmorfismo do
gene da subunidade II da Citocromo Oxidase (COII).
PM – padrão de peso molecular de 1kb, C1-perfil de bandas o clone Cutia cl1 (haplótipo
mitocondrial A - DTU TcI, Freitas et al., 2006), C2- clone Tu18 cl2 (haplótipo C – DTU TcII), C3 M6241 cl6 e C4 - Tulahuen cl2 (haplótipo mitocondrial B - DTU TcIII e DTU TcVI), A1 - amostra
2119, A2- amostra 1205, A3- amostra 376, A4- amostra 2118, A5- amostra 2408, A6 - amostra
Be56, A7- amostra 1337, A8- amostra 1918, A9- amostra 229, A10- amostra 748, A11- amostra
501, A12- amostra 2497 e A13- isolado 818, A14 – clone representativo do haplogrupo B
(9212210R – TcIV), BR – controle negativo livre de DNA. Entre os isolados nota-se somente a
presença dos haplótipos B e C.
6.5 Análise do polimorfismo do Espaçador Intergênico dos Genes Mini-exon de T.
cruzi (SL-IR)
Todas as amostras isoladas dos pacientes submetidas à amplificação do
fragmento de DNA do espaçador intergênico do Miniexon (SL-IR) do T. cruzi,
apresentaram perfil de bandas de aproximadamente 150 a 157pb que podem ser
característicos da linhagens TcI, II, V e VI (Burgos et al., 2007).
45
Resultados
PM
C1 C2 C3 C4 C5 C6 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 Br
Figura 7: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes
de pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, MG, por meio da análise do polirmorfismo do
espaçador intergênico do miniexon.
PM – padrão de peso molecular de 1KB; C1 - clone Cutia cl1(DTU TcI), C2 clone Tu18cl1 (DTU TcII),
C3 e C4 clones X109/2 (DTU TcIII) e 9212210R2 (DTU TcIV), C5 e C6 clones SO3cl5 e Tula cl2
representantes das DTU(s) TcV e TcVI respectivamente, A1: amostra 229; A2 - 452; A3 - 748; A4 798; A5 - 1205; A6 - 1337; A7 - 2118; A8 - 2119; A9 - 376; A10 - 2497, A11 - 493; A12 - 820; A13 1107; A14 - 2478; A15 - 1918; A16 - 2014; Br: controle negativo da reação. O espaçador
intergênico do Mini-exon (Freitas et al., 2006) é capaz de separar as DTU’s TcIII e TcIV, que
apresentam perfis de bandas de 200pb, das demais DTU’s TcI, TcII, TcV e TcVI, esses com
fragmentos de 150 a 157pb.
6.6 Identificação das DTU(s) do Trypanosoma cruzi
taxonômico (Zingales et al., 2009)
segundo o novo consenso
A Tabela V relaciona os resultados obtidos na análise do polimorfismo de
diferentes alvos gênicos para a caracterização molecular das amostras de T. cruzi
isoladas dos pacientes e dos clones de referência das seis DTU(s) dessa espécie,
segundo o critério proposto por Lewis et al. (2009). Esses resultados mostram que foi
possível identificar 84,31% (43) das amostras avaliadas nesse estudo como
pertencentes a linhagem TcII que apresentaram em conjunto: um fragmento de 125pb
para rDNA, 1 banda de 432 a 462pb no RFLP-HSP60/ECORV e 3 bandas com tamanhos
entre 200pb e 500pb no RFLP- GPI/HhaI. Entretanto, em oito amostras (15,68%),
isoladas dos pacientes de Berilo e José Gonçalves não foi possível determinar a
classificação final seguindo o tripé de análise proposto por esses autores.
As amostras 229, 452, 748, 798, 1205, 1337, 2118 e 2119 apresentaram
diferentes combinações de resultados daqueles previamente determinados para as
seis DTU(S) do T. cruzi por Lewis et al. (2009). Todas essas amostras apresentaram um
fragmento de 125pb na análise do polimorfismo da região 3’ do rDNA que seria
característico das linhagens TcII, TcIV e TcVI. Entretanto, as amostras 229 e 798
apresentaram um perfil de banda único no RFLP-PCR HSP60 e um perfil de banda dupla
no RFLP-PCR GPI/HhaI as quais somente poderiam ser identificadas como
46
Resultados
característicos a linhagem do TcI baseada no perfil desses dois marcadores. Por outro
lado, os isolados 452, 748, 1205, 1337, 2118 e 2119 apresentaram perfil de bandas
triplo para o gene HSP60/ECORV e bandas duplas para a GPI/HhaI respectivamente,
sem a possibilidade de classificação segundo a metodologia adotada.
Desse modo, nesse sistema de classificação não existe essas possibilidades de
combinação de resultados entre os marcadores, necessitando da investigação de
novos alvos gênicos para identificação final dessas amostras.
Atualmente muitos autores tem empregado a análise combinada do
polimorfismo da região do 24Sα rDNA, da subunidade II do gene da Citocromo Oxidase
(CoII) e do espaçador intergêncio do mini-exon (SL-IR) para acessar a variabilidade
genética em populações do T. cruzi (D’ávila et al,. 2009; Câmara et al., 2010; Andrade
et al., 2011, Zafra et al., 2011; Zingales et al., 2012). Os resultados esperados para as
seis diferentes DTU(s) estão descritos na Tabela V e fundamentados na mesma. As oito
amostras com resultados incongruentes no sistema proposto por Lewis et al. (2009)
foram todas classificadas como pertencentes a linhagem TcVI, seguindo a metodologia
de classificação proposta por D’ávilla et al., (2009). Estas apresentaram perfil de 125pb
no rDNA, aproximadamente 150pb no espaçador intergênico dos mini-exon e, após
digestão dos produtos amplificados do gene CoII com a enzima ALUI, apresentaram
perfil de bandas duplas (294pb, 81pb) podendo assim serem enquadradas como
pertencentes ao haplogrupo Mitocondrial B, e em uma análise conjunta das três
técnicas, ao isolados classificados como TcVI.
Vale ressaltar que todos os outros isolados foram classificados como TcII pelas
duas metodologias de classificação adotadas neste estudo (Lewis et al., 2009 e D’ávilla
et al., 2009). Na identificação dos DTU(s) segundo Lewis et al., (2009) as amostras
apresentaram perfis de 125pb para o LSU-rDNA + 1banda para o RFLP-PCR
HSP60/ECORV + 3 bandas para o RFLP-PCR GPI/HhaI, compatível com os clones de
referência pertencente ao DTU TcII (MAScl1). Para a genotipagem segundo D’ávilla et
al., (2009) os mesmos isolados apresentaram perfis de: 125pb para LSU-rDNA + perfis
característico do haplogrupo mitocondrial C (212pb + 81pb) + 150/157pb no SL-IR,
podendo assim afirmar a genotipagem dos 43 isolados como TcII.
47
Resultados
Tabela V - Identificação das amostras de Trypanosama cruzi isolados de pacientes dos Municípios de
Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha MG, segundo o novo consenso táxonômico
(Zingales et al., 2009).
Classificação segundo D’ávilla et al.,
2009
Classificação segundo Lewis et al., 2009
Amostra
24Sα
rDNA
(pb)
HSP60/ECOR GPI/HhaI
(N° de
bandas)
(N° de
bandas)
Classificação
24Sα
rDNA
(pb)
COII
SL-IR
Classificação
(haplogrupo)
(pb)
Final
P209 cl1
110
1banda
2bandas
TcI
110
A
150/157
TcI
MAS cl1
125
1banda
3bandas
TcII
125
C
150/157
TcII
CM-17
110
2bandas
2bandas
TcIII
110
B
200
TcIII
CANIII cl1
~120
1banda
3bandas
TcIV
125
B
200
TcIV
Bug2148 cl1 110+125
3bandas
4bandas
TcV
110+125
B
150/157
TcV
Tulahuencl2
125
3 bandas
4bandas
TcVI
125pb
B
150/157
TcVI
229
125pb
1banda
2bandas
??
125pb
B
150/157
TcVI
264
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
376
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
438
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
440
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
452
125pb
3bandas
2bandas
??
125pb
B
150/157
TcVI
501
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
523
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
525
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
529
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
543
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
595
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
646
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
728
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
748
125pb
3bandas
2bandas
??
125pb
B
150/157
TcVI
791
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
798
125pb
1banda
2bandas
??
125pb
B
150/157
TcVI
817
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
818
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
820
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
839
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
845
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
860
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
896
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
914
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
953
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
1100
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
1107
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
1205
125pb
3bandas
2bandas
??
125pb
B
150/157
TcVI
48
Resultados
1315
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
1337
125pb
3bandas
1442
125pb
1banda
2bandas
??
125pb
B
150/157
TcVI
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
1635
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
1918
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
2014
2118
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
125pb
3bandas
2bandas
??
125pb
B
150/157
TcVI
2119
125pb
3bandas
2bandas
??
125pb
B
150/157
TcVI
2408
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
2478
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
2491
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
2495
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
2497
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
2535
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
1536
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
1113
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
467
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
479
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
493
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
653
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
PSF 060
125pb
1banda
3bandas
TcII
125pb
C
150/157
TcII
6.7 RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA)
Os dados de RAPD foram usados para estimar a relação filogenética entre os
estoques de T. cruzi, uma matriz foi construída manualmente considerando a presença
e ausência de bandas obtidas após observação dos produtos da PCR provenientes da
amplificação, empregando 10 diferentes primers. Somente fragmentos demonstrando
nitidez foram selecionados. Após amplificação com esses primers, 4731 fragmentos
foram observados sendo detectados 2 diferentes genótipos. O tamanho de bandas
detectadas variou entre 100pb e 1400pb.
A Figura 8 abaixo representa os perfis de bandas encontrados obtidos para a
amplificação com dois primers N9 e B15 (Brisse et al., 2000b).
49
Resultados
Gel A
PM
C1
C2
C3 C4
C5
C6
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17
Gel B
PM C1 C2
C3 C4
C5 C6 A1 A2
A3 A4
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17
Figura 8: Perfis de RAPD em isolados de Trypanosoma cruzi obtidos de pacientes dos municípios de Berilo
e José Gonçalvez de Minas, região do Vale do Jequitinhonha, MG, submetidos a amplificação
empregando os primers N9 (Gel A) e B15 (Gel B).
PM – padrão de peso molecular de 100pb, C1 a C6 perfis de bandas apresentado pelos seis clones de
referência dos seis DTU’s do Trypanosoma cruzi, onde nos géis A e B, C1 representa os perfis do clone de
referência da DTU TcI, P209 cl1; C2: MAS cl1 (TcII), C3: CM-17 (TcIII), C4: CANIII (TcIV), C5: Bug2148 cl1
(TcV), C6: Tulahen cl2 (TcVI), respectivamente.
No gel A, a amostra A1, corresponde ao isolado 953, A2- 820, A3 - 458, A4 - 523, A5- 2014, A6 - 2478, A7
- 467, A8 - 1536, A9 - 818, A10 - 060/05, A11 - 845, A12 - 452, A13- 1315, A14 - 529, A15 - 1918, A16 2497 e A17 - 1107 respectivamente.
No gel B, A1 - corresponde a amostra 845, A2 - 264, A3 - 501, A4 - 953, A5 - 2478, A6 - 798, A7 - 2335,
A8 - 2491, A9 - 440, A10 - 1442, A11 - 376, A12 - 820, A13- 493, A14 - 2408, A15 - 748, A16 - 896 e A17
- 1315 respectivamente.
50
Resultados
O fenograma foi obtido usando o método de UPGMA (Média aritmética não
ponderada). Os estoques de T. cruzi se dividiram em dois ramos distintos, um
contendo o T. cruzi I e, o outro, as demais que apresentaram subdivisões claramente
definidas em T. cruzi II (Zingales et al., 2009) – Figura 9.
A inclusão dos clones de referência permitiu verificar que a grande maioria das
cepas apresentou similaridade com aqueles representantes da DTU II, mas esse grupo
apresentou a estruturação em dois ramos evidentes um contendo o clone de
referência MAS cl1, 728 e 1100 e, no outro, os demais isolados que apresentaram
certa variabilidade no interior do grupo. Oito isolados (229, 452, 748, 798, 1205, 1337,
2118 e 2119) se agruparam com o clone de referência pertencente a DTU VI.
51
Resultados
Figura 9: Fenograma obtido pelo método de UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis) de
todos os 51 isolados de Trypanosoma cruzi e respectivos clones representativo de cada DTU do
parasito, submetidos a analise do polimorfismo genético analisados no programa TREECON, e
Bootstrap com repetições de 1000 vezes.
P209 cl1, clone representativo do genótipo TcI; MAS cl1 - genótipo TcII; CM-17 – TcIII, CANIII cl1 –
TcIV; Bug2148 cl5 – TcV e Tula cl2 TcVI.
52
7.0 DISCUSSÃO
Discussão
A espécie T. cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, é constituída de
subpopulações heterogêneas que circulam tanto em ambiente silvestre como no
doméstico (Chagas, 1909; Brener, 1965; Silva, 1959; Andrade, 1974; Brener, 1969;
Devera et al., 2003, Macedo et al., 1992) e essa diversidade pode ser detectada tanto
em nível morfológico (Chagas, 1909; Brener & Chiari, 1963; Chiari e Brener, 1965)
como biológico (Andrade & Andrade, 1966; Andrade, 1985; Brener, 1965; Silva, 1959;
Andrade, 1974; Brener & Chiari, 1963; Brener, 1965; Brener, 1969; Andrade et al.,
1997) e genético (Macedo et al., 1992; Morel et al., 1980; Steindel et al., 1993;
Tibayrenc & Ayala, 1988), Em decorrência da intensa variabilidade observada nesta
espécie, vários trabalhos que avaliaram suas características genéticas foram realizados
na tentativa de agrupar as populações do parasito que apresentavam similaridade.
Em 1999, com a realização do primeiro Consenso Taxonômico para o T. cruzi a
espécie ficou dividida em duas linhagens principais, T. cruzi I e T. cruzi II (Anonymous,
1999), mas existiam ainda isolados que não se enquadravam em nenhum dos dois
grupos por apresentarem perfil híbrido ou incongruência entre marcadores. Desse
modo, a fim de melhor entender a variabilidade no interior dessa espécie e as relações
filogenéticas entre as subpopulações, novas abordagens fundamentadas no estudo de
outros alvos gênicos foram desenvolvidas e outras subdivisões significativas desta
espécie foram propostas (Brisse et al., 2000ª,b; Freitas et al., 2006, Westenberger et
al., 2006; Subileau et al., 2009).
Com objetivo de unificar as abordagens referentes à classificação dos isolados
do T. cruzi, em 2009 foi reconhecida oficialmente a divisão da espécie em seis DTU’s
(Discrete Typing units) como proposto por Zingales et al. (2009).
Entretanto, para acessar a identificação genética dos isolados de T. cruzi nas
suas respectivas DTU(s) é necessário o emprego de diferentes marcadores moleculares
para realizar com confiabilidade a genotipagem, empregando alvos no DNA nuclear e
mitocondrial do parasito. Nesse contexto, Lewis et al. (2009) propuseram um tripé de
análise
fundamentado na associação do perfil de bandas apresentado após a
amplificação do gene 24Sα rDNA
juntamente com os perfis
de fragmentos
amplificados dos genes HSP60 e GPI submetidos a RFLP-PCR com enzimas de restrição
54
Discussão
específica. A combinação dos resultados obtidos por esses três marcadores permitiram
segundo os autores, a identificação das seis linhagens de modo eficaz e acurado.
Nesse contexto, o presente estudo foi desenvolvido com intuito de identificar
as linhagens genéticas do T. cruzi isoladas de pacientes chagásicos crônicos residentes
no Vale do Jequitinhonha, MG, considerada uma região de intensa transmissão da
doença de Chagas na década de 80 (Dias et al., 1985) e, avaliar a variabilidade genética
no interior dessa população. Entretanto, a identidade dos isolados do T. cruzi obtidos
dos pacientes não pode ser completamente definida empregando o esquema de
identificação proposto por Lewis et al. (2009), uma vez que ocorreram divergências
nos resultados obtidos por esses marcadores em oito amostras avaliadas,
apresentando combinações distintas daquelas propostas pelos mesmos. É importante
enfatizar que nesses casos, as amostras dos clones de referências das seis linhagens do
parasito produziram os padrões esperados para os três marcadores.
Assim todas as 51 amostras avaliadas neste estudo apresentaram perfil de
bandas de 125pb pelo rDNA, que permitiria classificá-las como TcII ou TcVI (Zingales et
al., 2012); mas para os isolados 452, 748, 1205, 1337, 2118, 2119, 229 e 798 foi
encontrado padrões duplos de bandas para o fragmento do gene da GPI digerido com
a enzima HhaI, padrão típico das DTU(s) TcI e TcIII. Quando avaliados pelo perfil de
RFLP-PCR do gene da HSP60 foi observado que os isolados 452, 748, 1205, 1337, 2118
e 2119 apresentaram padrões triplo de bandas, característico das linhagens híbridas
(TcV e TcVI), enquanto as amostras 229 e 798 apresentaram padrão de banda único
(típicos de TcI, TcII e TcIV). As demais amostras (84,3%) foram classificadas como TcII
apresentando fragmento de 125pb para o rDNA, padrão de banda triplo para a
GPI/HhaI e simples para HSP60/ECORV.
Os resultados obtidos por Lewis et al. (2009) já apontavam variações em alguns
perfis dos clones avaliados em seu trabalho. O clone Saimiri3 cl1, por exemplo,
apresenta perfil de TcIV na metodologia de RAPD, entretanto, pelo tríplice ensaio
apresentou identificação inconclusiva, obtendo perfis mais próximos do grupo TcII
que qualquer outro genótipo. Outra questão que pode dificultar a identificação dos
isolados é a ocorrência de infecções mistas já documentadas em vetores, reservatórios
e casos humanos (Bosseno et al., 1996; Yeo et al., 2007). Quando ocorre a mistura de
55
Discussão
TcII com TcIII os autores detectaram perfis semelhantes a TcV e TcVI, o que poderia
resultar em identificação errônea dos isolados uma vez que as amostras aqui
estudadas não foram clonadas para esclarecer esta questão.
Os resultados obtidos para essas oito amostras sugerem que pode estar
ocorrendo algum processo de deleção ou inserção na seqüência de bases nitrogenadas
do gene GPI, o que estaria impedindo que a enzima cortar a seqüência do DNA no seu
ponto específico.
A análise isoenzimática desses isolados por quatro sistemas
enzimáticos (GPI, IDH, G6PD e GDH) evidenciou que somente na GPI foi observado um
perfil de bandas distintos do esperado para estoques pertecentes a DTU TcVI (dados
não mostrados), correspondente aquele esperado para as DTU (s) TcIII e TCIV, o que
poderia sugerir uma variação mais extensa nesse gene. Westenberg et al. (2005)
avaliando diversos genes deste protozoário não observaram variação no gene da GPI
entre estoques pertencentes a diferentes linhagens, mesmo utilizando várias enzimas
para digerir o produto amplificado. O mesmo ocorreu no trabalho de Gaunt et al.
(2003) quando avaliaram possíveis processos de hibridização ocorridos entre os grupos
do T. cruzi.
Em relação ao emprego do gene HSP60 como marcador não há muitas
publicações que o abordam, exceto a de Sturm et al. (2003), que assim como os
autores (Westenberg et al., 2005 e Sturm et al., 2003) também não detectaram
variações entre os representantes de uma mesma linhagem, quando avaliaram esse
gene empregando a metodologia de RFLP-PCR. Contudo, é importante ressaltar que os
autores (Sturm et al. 2003), utilizaram clones de referências previamente genotipados
e enzimas de restrição diferentes, o que poderia justificar a ausência de divergências
em suas análises como foi observado no presente estudo que trabalhou com amostras
provenientes de um importante área endêmica para doença de Chagas no Brasil.
Rimoldi et al. (2012) foram os primeiros autores que utilizaram o mesmo
critério de genotipagem proposto por Lewis et al. (2009). Eles identificaram 18
isolados provenientes de gatos domésticos e vetores de uma região endêmica de
doença de Chagas da Bahia, todos pertencentes ao grupo de TcII. Esses resultados
corroboram aqueles obtidos nesse estudo, indicando que essa metodologia é eficiente
na identificação da DTU II, mostrando que 43 isolados dos pacientes da região
56
Discussão
geográfica em estudo foram pertencentes a essa linhagem. Contudo, oito amostras
permaneceram com sua identificação inconclusiva, o que demonstra que pode haver
variações entre amostras provenientes de diferentes regiões geográficas e, que a
identificação deve ser feita com cautela fundamentada em um maior número de
marcadores.
Outro problema relacionado ao esquema proposto por Lewis et al. (2009) é
concernente a metodologia que visa amplificar a região 3’ da subunidade 24Sα do
rDNA (Souto et al., 1996), devido a possibilidade de divergências que pode influenciar
profundamente a identificação das amostras. Segundo os autores, os produtos
amplificados do rDNA podem apresentar perfis de bandas de 110pb, associados com a
linhagem TcI; 125pb relacionados com isolados pertencentes a linhagem TcII e perfil
duplo 110pb +125pb associados com os isolados que sofreram processos de
hibridização. Entretanto, Brisse et al. (2001) e Lewis et al. (2009) observaram a
possibilidade de alguns isolados híbridos (TcV) não apresentarem perfil de bandas
duplas, apresentando apenas o perfil de 125pb. Kawashita et al. (2001) também
averiguaram a ocorrência de amplicons de 117pb em isolados híbridos, banda esta
correspondente ao perfil intermediário (110pb e 125pb) em isolados pertencentes ao
grupo híbrido TcV. Em alguns casos (Kawashita et al., 2001) já foram também
registrados isolados pertecentes a DTU TcV, que apresentam um perfil duplo de 125pb
+ 140pb, ao invés de 110pb + 125pb. O perfil de 140pb já havia sido anteriormente
encontrado em algumas amostras isoladas e caracterizadas como pertencente ao DTU
II (IIb descrita por Brisse et al., 2000) e VI (IIe), mas até então nunca associado com a
DTU V.
Atualmente, para identificação dos isolados de T. cruzi tem sido adotado o
seguinte protocolo (Zingales et al., 2012): produtos amplificados do rDNA de 110pb
são associados a linhagem TcI e TcIII; de 125pb a TcII e TcVI; de 120pb associados as
linhagens de TcIV com variação para os isolados obtidos na América do Norte de 130pb
e de 110pb +125pb para os isolados pertencentes a DTU TcV. No presente estudo, é
importante mencionar que não ocorreram problemas relativos a amplificação do rDNA
nas amostras analisadas.
Segundo Burgos et al. (2007) quando ocorre incongruência na identificação de
isolados com provável perfil híbrido é importante fazer a caracterização do isolado por
57
Discussão
RFLP-PCR do gene da COII (Freitas et al. 2006) para se ter certeza do perfil da amostra.
Após corte dos produtos amplificados com a enzima ALUI a amostra apresentando
perfil relacionado com o haplogrupo mitocondrial B pode ser considerada como
pertencente às DTU(s) TCIII, TCIV, TcV ou TcVI. D´avilla et al. (2009) empregando essa
metodologia combinada à avaliação do polimorfimos do gene da região 3´do rDNA e
da região intergênica do gene do mini-exon do T. cruzi (SL-IR) também sugeriram um
esquema rápido, barato e eficaz para identificação das linhagens desse parasito.
No presente trabalho, as oito amostras isoladas dos pacientes chagásicos
crônicos (229, 452, 748, 798, 1205, 1337, 2118 e 2119) após RFLP da COII/ALU I
apresentaram perfil de bandas idêntico aos clones representativos do haplótipo
mitocondrial B (294pb + 81pb), que pode corresponder as DTU(s) híbridas V e VI e as
DTU(s) III e IV. A SL-IR identifica o grupo TcIII e TcIV que apresenta uma banda de
200pb. Todas as amostras analisadas neste trabalho amplificaram por essa
metodologia um fragmento de aproximadamente 150 a 157pb, excluindo a
possibilidade dos isolados serem identificados como TcIII ou TcIV, permitindo afirmar
que essas amostras são realmente híbridos pertencentes a DTU TcVI, devido também
aos resultados obtidos na análise do rDNA. O restante dos isolados teve confirmada a
genotipagem com TcII, corroborando a classificação segundo a metodologia de Lewis
et al. (2009).
Os resultados obtidos nesse estudo estão em acordo com vários trabalhos
publicados na literatura, que afirmam que a DTU TcII está mais associada com a
infecção humana e reservatórios naturais com distribuição geográfica entre os eixos
Norte e Sul do Brasil (Fernades et al., 1998; Zingales et al., 1998; Zingales et al., 1999;
Brenière et al., 1998; Barnabé et al., 2000; Barnabé et al., 2001, Di Noia et al., 2002;
Buscaglia & Di Noia, 2003; Zalloum et al., 2005,D’ávilla et al., 2006; Lages Silva et al.,
2006; Steindel et al., 2008; Brito et al., 2008; D’ávilla et al., 2009; Abollis et al., 2011).
Em uma recente revisão englobando a ecoepidemiologia das diferentes
DTU(s) do T. cruzi, Zingales et al. (2012) reafirmam que a DTU TcII é encontrada
predominantemente nas regiões sul e central da América do Sul. Essa DTU foi
encontrada tanto ao ciclo silvestre como ao doméstico da Doença de Chagas
(Fernandes et al, 1999; Zingales et al, 1999; ) e parece estar intimamente relacionada
58
Discussão
com as manifestações clínicas cardíacas e digestivas (megacólon e megaesôfago) nos
casos de infecção humana (Freitas et al, 2005; Yeo et al, 2005; Lages-Silva et al, 2006).
Câmara et al. (2010) confirmam a distribuição geográfica e o predomínio da DTU II
associada com a infecção humana e reservatórios domésticos no Brasil. Os autores
analisaram isolados provenientes de casos humanos crônicos e vetores no estado do
Rio Grande do Norte e mostraram que 91,7% dos casos humanos foram pertencentes
a DTU TcII , semelhante ao observado na região do Vale do Jequitinhonha-MG.
Mantilla et al. (2010) encontraram em amostras de tecidos de um mesmo caso
humano da Colômbia uma mistura das DTU(s) TcI e TcII. Semelhantemente Zafra et al.
(2011) que também analisaram tecidos de pacientes com a forma cardíaca grave da
doença de Chagas na Colômbia detectaram a presença da linhagem TcII. Em geral,
na região da Colômbia, assim como em vários países da bacia Amazônica, ocorre o
predomínio da infecção humana pelo DTU TcI e, essa linhagem, está mais relacionada
com a infecção aguda assintomática e/ou com raríssimas manifestações clínicas
crônicas (Miles et al, 1981a; Zingales et al, 1999; Coura et al, 2002). No entanto, a
infecção por essa linhagem tem causado mortes em algumas regiões da Venezuela,
Colômbia, México e parte do Brasil, onde a linhagem TcII é rara ou ausente (Miles et
al, 1981a; Añez et al, 2004; Zafra et al, 2008; Llewellyn et al, 2009b). Miles et al. (1981)
já haviam demonstrado a clara endemicidade dessa linhagem nos países que
compreendem essa região geográfica, principalmente, relacionado com o ciclo
silvestre da doença de Chagas. Isolados silvetres identificados como TcI tem sido
encontrado desde o Alabama nos Estados Unidos (Roellig et al., 2009) até o sul do
Chile (Apt et al., 1987) em várias situações, ocorrendo concomitantemente com outras
DTU(s) do parasito. Atualmente, dados recentes tem demonstrado também a presença
da DTU TcI associada ao ciclo doméstico mais ao norte da América do Sul e na América
Central. Já as linhagens TcIII e TcIV estão mais associadas ao ciclo silvestre no Brasil,
Venezuela e Argentina, e infecções humanas por essas linhagens são raras nessas
regiões (Llewellyn et al, 2009; Marcili et al, 2009; Cardinal et al, 2008).
A presença dos grupos híbridos representados pelas DTU(s) TcV e TcVI são
geralmente associadas a vetores e humanos no ciclo doméstico da infecção, sendo
rara o seu registro no ciclo natural do parasito em diversas regiões geográficas da
59
Discussão
América Latina (Solari et al., 1992; Brenière et al., 1998, Brenière et al., 2002). Segundo
alguns autores, nas regiões da Argentina e Chile a prevalência de TcVI é maior no
hospedeiro invertebrado do que em casos humanos (Coronado et al., 2006;Rozas et
al., 2007). Rozas et al. (2007) ao analisar isolados provenientes de diversos
hospedeiros no Chile observaram que o grupo TcVI estava mais relacionado com
infecção em vetores que em qualquer outro hospedeiro avaliado. Coronado et al.
(2006) também corroboraram esses resultados ao caracterizar isolados de pacientes
humanos e vetores do Chile, verificando também o predomínio do grupo TcVI em
amostras provenientes dos triatomíneos. Vasques-Prokopec et al. (2006) estudando a
dinâmica de distribuição de vetores infectados pelo T. cruzi na Argentina afirmaram
que a DTU Tc IIe (TcVI) é predominante em hospedeiros domésticos e silvestres e não
relacionados com casos humanos. Cardinal et al. (2006), estudando reservatórios
domiciliares, cães e gatos no noroeste da Argentina, comprovaram a existência de cães
domésticos infectados pelo TcVI nesta região.
Entretanto, contradizendo o predomínio quase que exclusivo da infecção do
DTU TcVI em triatomíneos e alguns mamíferos em certas regiões geográficas da
América Latina, dados crescentes tem envolvido a DTU TcVI como uma importante
linhagem envolvida em infecções humanas na região do Chaco e países vizinhos, como
Bolívia, Chile, norte da Argentina e sul do Brasil (Diosque et al, 2003; Virreira et al,
2006b; Valadares et al., 2007; Cardinal et al, 2008). Valadares et al. (2007) e Burgos et
al. (2007) demonstraram a presença dessa linhagem
em casos de transmissão
congênita na Argentina e no Brasil (no Rio Grande do Sul). Burgos et al. (2010)
avaliando amostras de biopsia do miocárdio e pele de pacientes com forma clínicas
graves da Doença de Chagas identificaram a DTU TcVI nesses tecidos. Schijman et al.
(2009) avaliaram pacientes humanos com co-infecção Chagas/HIV e encontraram
também populações do parasito pertencentes tanto ao grupo TcV como TcVI no
sangue periférico dos pacientes.
Solari et al. (1992) avaliaram a dinâmica de
distribuição dos isolados de T. cruzi em diversos hospedeiros, vertebrados,
invertebrados e casos humanos, em algumas regiões do Chile, demonstrando a
presença dos genótipos híbridos nas regiões estudadas, principalmente do genótipo 39
(TcV) dentre as amostras isoladas e analisadas. Semelhantemente, Brenière et al.
60
Discussão
(1998) e Brenière et al. (2002), estudando a importância epidemiológica do Triatoma
sordida como potencial vetor ativo da Doença de Chagas na Bolívia e a distribuição
das linhagens do T. cruzi em pacientes chagásicos crônicos, provenientes de uma
mesma região Boliviana observaram o predomínio da infecção nos invertebrados e
dos pacientes humanos também pelos genótipos híbridos na região, bem como a
existência de infecção mista entre as linhagens híbridas e a linhagem TcII.
Confirmando a existência do DTU TcVI em humanos no Brasil, Andrade et al.
(2011) caracterizaram 11 cepas isoladas de pacientes envolvidos com a transmissão
oral no estado de Santa Catarina e demonstraram a ocorrência de infecção mista de
TcII com TcVI em um dos pacientes. Em outras três amostras foram observadas uma
mistura de populações caracterizadas como TcI e TcII. Os autores empregaram a
metodologia descrita por D´Ávila et al. (2009), que além de se mostrar um ótimo
critério de identificação dos diferentes grupos genéticos, foi também capaz de
identificar as misturas, enfatizando a necessidade de abordagens metodológicas que
permitam a detecção de infecções mistas em amostras do parasito isoladas de
humanos, reservatórios e vetores.
No presente estudo, não foram detectadas misturas em nenhum dos 51
estoques de T. cruzi isolados de pacientes crônicos. Uma das possíveis explicações para
estes achados podem estar relacionada ao longo tempo de infecção dos pacientes da
região do Vale do Jequitinhonha, que podem ter servido como filtro biológico para
algumas subpopulações de outros grupos genéticos. No trabalho de Andrade et al.
(2011) a genotipagem foi feita de casos humanos obtidos por infecção oral recente,
provavelmente por altas cargas parasitárias provenientes dos triatomíneos triturados,
o que pode ter favorecido o encontro de infecções mistas nos isolados avaliados.
Como já demonstrado, no Brasil, o panorama da distribuição da diversidade
genética do T. cruzi, principalmente nas regiões centro, sul e suldeste, ocorre pelo
predomínio da DTU TcII, relacionada tanto com a infecção em hospedeiros
invertebrados, vertebrados e humanos associados principalmente com o ciclo
doméstico da Doença de Chagas, e relacionado com graves manifestações clínicas em
pacientes humanos. Por outro lado, outros dados mais recentes, demonstram o
61
Discussão
encontro de populações híbridas do parasito (TcVI) associado a infecção humana e
diversos hospedeiros no ciclo doméstico da doença de Chagas no Brasil (Macedo et
al., 2002; Steindel et al., 2003; Macedo et al., 2004, Zalloum et al., 2005; Lages Silva et
al., 2006, D’ávilla et al., 2006; Valadares et al., 2007; Burgos et al., 2007; D’ávilla et al.,
2009; Oliveira e Silva., 2009; Andrade et al., 2011.
Desse modo, nossos resultados estão de acordo com os dados documentados
na literatura que mostram que as linhagens TcII e TcVI são extremamente associadas a
infecção em humanos e vetores domiciliados em países como o Brasil e outros vizinhos
da América do Sul (Barnabé et al., 2000; Di Nóia et al., 2002; Lages Silva et al., 2002;
Freitas et al., 2005; Lages Silva et al., 2006; Rozas et al., 2007).
Para estudar a variabilidade no interior desses grupos foi empregada neste
trabalho a metodologia de RAPD, que tem sido muito utilizada no estudo das relações
filogenéticas entre isolados de diferentes hospedeiros e provenientes de diversas
regiões (Steindel et al., 1993; Tibayrenc et al., 1993; Gomes et al., 1998; Brisse et al.,
2000b).
A avaliação do perfil genético dos 51 isolados e clones de referência do T. cruzi
pelo RAPD demonstrou claramente a subdivisão dessa espécie em suas seis linhagens
genéticas e corroborou os resultados obtidos através da genotipagem para todos os
isolados, agrupando-os em conjunto com os clones de referência das DTU(s) II e VI.
Além disso, foi observada alguma estruturação entre os isolados dessas linhagens,
indicativa da existência de discreta variabilidade genética dentre os grupos. Macedo et
al. (2002) e Macedo et al. (2004) demonstraram uma tendência de diminuição da
variabilidade genética dos isolados quando comparadas parasitos isolados de
pacientes nas fases aguda e crônica da infecção avaliados pelas metodologias de RAPD
e de microssatélites. Esses resultados são compatíveis com a idéia de que os clones de
T. cruzi são capazes de estabelecer a infecção em diversos hospedeiros, que podem
manter uma relação com esse protozoário e servir de filtros para algumas subpopulações do parasito (Macedo e Pena, 1998; Macedo et al., 2002, 2004). No
presente trabalho foi observada grande semelhança entre os perfis de bandas
apresentados pelos isolados, empregando diferentes iniciadores. Talvez o longo tempo
de infecção desses pacientes possa ter propiciado a seleção de populações mais
62
Discussão
adaptadas aos mesmos ou as condições ecoepidemiológicas da região em estudo. Essa
hipótese justificaria a semelhança entre os isolados agrupados em um determinado
ramo do fenograma. Contudo, para comprová-la seria necessário o estudo em
reservatórios e vetores da região para melhor entendimento da ecoepidemiologia
desse parasito na região.
Steindel et al. (1993) avaliaram 32 amostras de T. cruzi isoladas de diversos
hospedeiros de algumas regiões do Brasil por RAPD e mostraram que 18 cepas eram
pertencentes ao zimodema I (ZI). Essas apresentavam um percentual significativo de
bandas compartilhadas (59% de similaridade) mesmo quando provenientes de
diferentes regiões. Apesar desse alto índice de similaridade, eles conseguiram observar
a estruturação desses isolados em grupos de acordo com a origem geográfica de cada
amostra. Na comparação entre os isolados pertencentes a grupos genéticos distintos,
os autores observaram a existência de uma baixíssima similaridade entre os perfis de
bandas, aproximadamente 7%. No presente estudo, os isolados de T. cruzi
identificados
como TcII,
obtidos de pacientes
na fase crônica da infecção,
demonstraram também um elevado grau de similaridade nos perfis de banda, porém
não foi possível detectar uma variabilidade genética intra-grupo significativa. É
importante esclarecer que Berilo e José Gonçalves de Minas são dois municípios que
até 1997 consituiam apenas um município, a distância entre eles é muito pequena
(8km), sem diferenças ecológicas importantes que pudesse justificar o isolamento de
subgrupos. A ausência de TcII em JGM é resultante de termos trabalhado com poucos
pacientes deste município dos quais apenas um isolado foi caracterizado como TcVI.
Outro trabalho de nossa equipe na região detectou em outros 14 isolados, sendo 8 de
Berilo e 6 de JGM, 12 como TcII e duas como TcVI, ambas de pacientes de Berilo
(Oliveira e Silva, 2009).
Zalloum et al. (2005) estudando cepas isoladas de pacientes chagásicos e de
reservatórios naturais no estado do Paraná com o uso do RAPD e SSR-PCR verificaram
correlação existente entre a DTU TcI com o ciclo silvestre da doença e a linhagem DTU
TcII com os casos humanos provenientes de diferentes regiões, com pouca
variabilidade detectada entre os isolados de um mesmo grupo genético.
Fernandes et al. (1997) estudaram a diversidade genética de isolados
provenientes do estado do Rio Grande do Sul
63
e observaram uma leve
Discussão
heterogeneidade entre as amostras avaliadas. Os autores observaram que a linhagem
T. cruzi II foi a que demonstrou perfis mais polimórficos entre os isolados (20% de
bandas compartilhadas). Cepas de T. cruzi isoladas de vetores e um caso humano
agudo da doença de Chagas obtidas no México foram caracterizadas por Hernadez et
al. (2011) e todas as 18 amostras foram caracterizadas como TcI. A predominância
desse genótipo nas Américas Central e do Norte, bem como na região norte do Brasil,
principalmente, na Amazônia, é um achado já bastante conhecido (Miles et al., 1981;
Zingales et al, 1999; Coura et al, 2002; Buscaglia e Di Noia, 2003; Añez et al, 2004;
Zafra et al, 2008; Lewellyn et al, 2009b). Contudo, um achado interessante desses
autores foi a capacidade do RAPD diferenciar as cepas em grupos específicos por área
endêmica, assim como correlacionar as cepas com os hospedeiros dos quais elas foram
isoladas.
Essa capacidade de diferenciação geográfica pela análise de perfis de RAPD já
havia sido observada anteriormente por Zalloum et al. (2005); Marin et al. (2009);
Marcili et al. (2009). Esses autores avaliaram isolados de TcI provenientes de
diferentes regiões geográficas da Colômbia e demonstraram uma clara divisão dos
isolados pertencentes a hospedeiros invertebrados em comparação com os isolados de
casos humanos provenientes de regiões diferenciadas.
Além disso, os autores
observaram nítida diferença genética entre os isolados provenientes de hospedeiros
primatas e triatomíneos arbóreos do ciclo silvestre, caracterizados como TcIV em
comparação com a mesma linhagem isoladas de casos humanos envolvidos com a
transmissão oral da doença de Chagas na Amazônia. Esses resultados são importantes
no entendimento da ecoepidemiologia do T. cruzi nas áreas endêmicas e demonstram
a necessidade de se conhecer as variações genéticas intra-grupo que possam revelar
associações mais estreitas referentes aos aspectos biológicos das cepas em relação aos
seus hospedeiros, a dinâmica de transmissão, forma clínica, etc.
D’ávilla et al. (2006) tentaram estabelecer correlação entre variabilidade
genética do T. cruzi e as formas clínicas da doença de Chagas. Foram avaliados 61
isolados provenientes de pacientes chagásicos crônicos de diferentes áreas endêmicas
de Minas Gerais, inclusive empregando a metodologia de RAPD, com utilização de três
iniciadores. Assim como outros trabalhos na literatura os autores não obtiveram
sucesso (Bosseno et al., 2002; Ãnez et al., 2004; Del Puerto et al., 2010; Burgos et al.,
64
Discussão
2010). Uma das hipóteses para justificar esse insucesso seria o baixo número de
iniciadores adotados.
Semelhantemente ao nosso estudo, as amostras desse trabalho demonstraram
considerável homogeneidade genética intra-grupo, o que indica a necessidade de
investigação de outros alvos para acessar a variabilidade intra-grupo. Contudo, os
autores empregaram também a metodologia de microssatélites que tem sido bastante
promissora em demonstrar diferenças individuais entre a maioria dos isolados de
T.cruzi, empregando pelo menos seis locos. Ainda assim, essa correlação não pode ser
estabelecida, o que sugere a necessidade de novos marcadores que possivelmente
estejam mais relacionados à patogenicidade. Em nosso estudo não foi possível associar
forma clínica versus genética do parasito, devido ao pequeno número de pacientes
avaliados clinicamente até o momento. Os resultados dessa associação poderiam
ajudar a responder qual ou quais os genótipos existentes na região poderiam estar
influenciando a manifestação clínica nos pacientes chagásicos crônicos, mas essa
questão ficará como perspectivas futuras do projeto. Contudo, dados preliminares já
demonstram que diferentes formas clínicas são observadas entre pacientes infectados
com
a mesma linhagem genética. Esses dados sugerem que será necessário o
emprego de metodologias que abordam além do genoma do T. cruzi, alvos
diferencialmente expressos (perfil metaproteômico) que possam servir como
marcadores de prognóstico da infecção chagásica.
Finalmente os resultados obtidos neste estudo estão concernente com dados
da literatura, que demonstram a predominância da infecção chagásica humana em
diversas regiões brasileiras pelo genótipo TcII e o crescente aparecimento da
associação entre o genótipo TcVI com a infecção humana no Brasil, que pode ter sido
mascarado em estudos anteriores devido a dificuldade dos marcadores empregados
no genoma do parasito em identificar essas amostras possivelmente genotipadas
como TcII erroneamente (Fernades et al., 1998; Zingales et al., 1998; Zingales et al.,
1999; Brenière et al., 1998; Barnabé et al., 2000; Barnabé et al., 2001; Lages Silva et al.,
2002, Di Noia et al., 2002; Buscaglia & Di Noia, 2003; Zalloum et al., 2005, Marcili et al.,
2006; D’ávilla et al., 2006; Lages Silva et al., 2006; Valadares et al., 2007; Burgos et al.,
65
Discussão
2007; Steindel et al., 2008; Britto et al., 2008; D’ávilla et al., 2009 e Corrales et al.,
2009, Abollis et al., 2011; Andrade et al., 2011 e Zingales et al., 2012).
66
8.0 CONCLUSÕES
Conclusões
 A genotipagem pelo critério de identificação segundo Lewis et al. (2009) se
mostrou insuficiente na detecção de todas as sublinhagens do Trypanosoma
cruzi dos isolados de pacientes chagásicos da região do Vale do Jequitinhonha e
apresentou divergências na caracterização molecular das oito amostras de
caráter híbrido da região.
 A tríplice metodologia de identificação genética de Lewis et al. (2009), se
mostrou de muito eficiente na classificação genética dos isolados pertencentes
a DTU TcII, conseguindo identificar 84,3% dos isolados avaliados no presente
estudo.
 Foi necessário o emprego de outro critério de genotipagem a fim de chegar a
identificação genética dos isolados de caráter híbrido pertecente a DTU TcVI. A
metodologia proposta por D’ávilla et al. (2009) demonstrou simplicidade de
execução e confiabilidade nos resultados obtidos nesta identificação.
 Foi observada predominância de isolados pertencentes a DTU TCII (84,3%) em
pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, municípios de Berilo e José
Gonçalves de Minas. Entretanto, oito isolados do parasito procedentes dessa
mesma região foram pertecentes a DTU TcVI, confirmando a presença dessa
linhagem no Brasil como já registrado por outros trabalhos na literatura.
 A metodologia de RAPD não apresentou boa eficiência na demonstração de
variabilidade genética intra-grupo, tanto nos isolados pertencentes ao DTU TcII
como nos isolados genotipados como TcVI. Para acessar a variabilidade
genética intra-grupo torna-se necessário o emprego de marcadores mais
eficientes, como os microssatélites.
 A técnica de RAPD utilizado nesse trabalho demonstrou boa correlação entre
os esquemas de genotipagem propostos por Lewis et al. (2009) e por D’ávilla et
68
Conclusões
al. (2009) uma vez que a metodologia foi capaz de diferenciar os isolados de
acordo com a proximidade genética entre eles, evidenciando a separação dos
isolados em agrupamentos relacionados com os clones de referência das DTU
(s) TcII e TcVI.
69
9.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Anexo
Anexo
10.0 ANEXO