XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Tolerância de fungos anaeróbios facultativos do rúmen frente a pressão da microbiota autóctone
ruminal e metabólitos ruminais1
Tolerance of facultative anaerobic rumen fungi against pressure ruminal indigenous microbiota
Ronaildo Fabino Neto2, Eduardo Robson Duarte3, Moisés Sena Pessoa 4, Norberto Mário Rodriguez5, Vera
Lúcia dos Santos6, Otaviano Souza Pires Neto7, Anna Carolynne Alvim Duque8 e Flávia Oliveira Abrão
Pessoa9
1
Parte da Tese de doutorado do último autor, financiada pelo CNPq.
Graduando em Zootecnia - Instituto Federal Goiano – Campus Ceres, GO, Brasil.
3
Docente do Instituto de Ciências Agrárias da UFMG. ICA - Montes Claros-MG, Brasil.
4
Doutorando da UFG, Goiânia – GO, Brasil. Bolsista FAPEG.
5
Docente da Escola de Veterinária da UFMG. Belo Horizonte -MG, Brasil.
6
Docente do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. ICB - Belo Horizonte -MG, Brasil.
7
Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, Escola de Vet. da UFMG, Belo Horizonte MG
8
Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia – Escola de Vet. da UFMG, Belo Horizonte MG
9
Docente do Instituto Federal Goiano – Campus Ceres. Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em
Zootecnia – Escola de Vet. da UFMG, Belo Horizonte - MG, Brasil. e-mail:
[email protected]
2
Resumo: Objetivou-se com o presente trabalho avaliar a persistência de fungos anaeróbios facultativos
frente a pressão da microbiota própria do rúmen e a metabólitos presentes no fluido ruminal. Dois fungos
filamentosos provenientes do rúmen de bovinos de corte criados em sistema extensivo foram previamente
isolados e avaliados nesse ensaio. Em triplicata, 0,5 mL de cada inóculo fúngico padronizado foi
adicionado em frascos contendo 4 mL de fluido ruminal e 2,5 mL de meio de cultura tampão.
Posteriormente, os frascos foram incubados em termoshaker com agitação orbital a 39°C. Um grupo
controle também foi avaliado com adição de 0,5 mL de solução salina estéril em substituição ao inóculo
padronizado nos frascos. Em triplicata, 0,5 mL de cada inóculo padronizado foi adicionado em frascos
contendo 4 mL de fluido ruminal e 2,5 mL de meio de cultura tampão. Após 18, 24, 48, 72 e 96 horas
foram retiradas alíquotas de 1 mL dos respectivos frascos, plaqueados em meio Ágar Sabouraud. Após
incubação, fungos com morfotipo semelhante aos inoculados foram repicados e identificados por biologia
molecular. Ambos os isolados AT13 e AF69 mantiveram-se viáveis até 96 horas de incubação, uma vez
que foram recuperados ao longo dos tempos avaliados fungos com a mesma descrição morfológica, e
foram confirmados por sequenciamento dos fragmentos do DNAr.
Palavras–chave: microbiota indígena, ruminantes, tolerância
Abstract: The objective of this study was to evaluate the persistence of facultative anaerobic fungi front
the pressure of the rumen microbiota itself and the metabolites present in rumen fluid. Two filamentous
fungi cut from the rumen of cattle reared in extensive system were previously isolated and evaluated in
this paper. In triplicate, 0.5 mL of each standard fungal inoculum was added to vials containing 4 ml of
rumen fluid and 2.5 ml buffered culture medium. Subsequently, the flasks were incubated in an orbital
shaking termoshaker at 39 ° C. A control group was also evaluated with the addition of 0.5 mL of sterile
saline to replace the standardized inoculum in the jars. In triplicate, 0.5 ml of each standardized inoculum
was added to vials containing 4 ml of rumen fluid and 2.5 ml buffered culture medium. After 18, 24, 48,
72 and 96 hours aliquots of 1 mL were removed from their flasks plated on Sabouraud agar. After
incubation, the fungi inoculated with similar morphotypes were picked and identified by molecular
biology. Both isolates AT13 and AF69 remained viable up to 96 hours of incubation, they were once
recovered evaluated over time with the same fungi morphological description, and were confirmed by
sequencing of the rDNA fragments.
Keywords: indigenous microbiota, ruminants, tolerance
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Introdução
Estruturas fúngicas podem ser observadas em todas as partes do trato digestório dos ruminantes,
desde as secreções salivares até as porções finais do intestino grosso, o que sugere estágios de resistência
no ciclo de vida desses micro-organismos (Davies et al., 1993). Os fungos anaeróbios do rúmen podem
assumir importância fundamental na digestão das forragens tropicais, pois produzem enzimas capazes de
acelerar a degradação da celulose e hemicelulose lignificadas (Cerdà, 2003).
Contudo, muito pouco se sabe sobre a população dos chamados fungos anaeróbios facultativos no
rúmen. Achados recentes apontam produção superior de enzimas que degradam a parede celular vegetal
por esses organismos (Almeida et al., 2014).
Dessa forma, objetivou-se com o presente trabalho avaliar a persistência de fungos anaeróbios
facultativos frente a pressão da microbiota própria do rúmen (autóctone) e a metabólitos presentes no
fluido ruminal.
Material e Métodos
Para verificar a viabilidade e a capacidade de multiplicação de fungos anaeróbios facultativos em
associação com a microbiota autóctone ruminal, realizou-se o teste de recuperação dos fungos ao longo
de diferentes tempos de incubação.
Dois fungos (AT13 e AF69) provenientes do rúmen de bovinos de corte criados em sistema
extensivo foram previamente selecionados dentre 90 isolados fúngicos a partir de análises enzimáticas e
toxigênicas. Estes fungos foram cultivados em meio celulose e mantidos em estufa a 39°C por 7 dias, até
esporulação. Os esporos foram ressuspendidos em solução salina estéril acrescida de Tween 20, e
padronizados em escala de Mac Farland 3 para concentração de 10 10 esporos/mL. Concomitantemente, foi
realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro (530 nm) da solução, sendo ajustada a faixa de
leitura entre 0,35 e 0,55 Abs.
Em triplicata, 0,5 mL de cada inóculo padronizado foi adicionado em frascos contendo 4 mL de
fluido ruminal e 2,5 mL de meio de cultura tampão. Posteriormente, os frascos foram incubados em
termoshaker com agitação orbital a 39°C. O fluido ruminal foi obtido de um bovino fistulado alimentado
com Brachiaria decumbens como única fonte de volumoso. Um grupo controle também foi avaliado com
adição de 0,5 mL de solução salina estéril em substituição ao inóculo padronizado nos frascos.
Após 18, 24, 48, 72 e 96 horas foram retiradas alíquotas de 1 mL dos respectivos frascos e
realizadas diluições decimais e inóculos taqueados em meio Ágar Sabouraud. Swabs também foram
imersos em cada frasco e estriados em placas contendo o mesmo meio descrito anteriormente. Após
plaqueamento, as amostras seguiram para incubação em BOD (39°C) até desenvolvimento das colônias,
por até sete dias.
Posteriormente os isolados crescidos no meio de cultura que apresentaram morfotipologia
semelhante ao aditivo inoculado foram repicados para tubos contendo o mesmo meio para posterior
identificação por meio de biologia molecular. A identificação realizada foi a mesma descrita por Abrão et
al. (2014) para fungos filamentosos. Oito isolados semelhantes ao morfotipo AF69 e onze isolados
semelhantes ao morfotipo AT13 foram reisolados e identificados por essa técnica.
Resultados e Discussão
Ambos os isolados AT13 e AF69 mantiveram-se viáveis até 96 horas de incubação, uma vez que
foram recuperados ao longo dos tempos avaliados fungos com a mesma descrição morfológica, e foram
confirmados por sequenciamento dos fragmentos do DNAr.
Observou-se o predomínio do morfotipo inoculado respectivamente para em cada placa de
reisolamento. A identificação molecular dos isolados recuperados confirmou a mesma espécie inoculada
com identidade de 100% (Tab. 1).
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Tabela 1 - – Identificação por sequenciamento dos fragmentos do DNAr de fungos filamentosos
reisolados do rúmen de bovinos de corte criados em pastagens tropicais
Identificação
N° de
proposta
isolados
Aspergillus
8
Identidad
Query
Resultados BLAST [n° acc. GenBank] e
e
coverage
n° cepa da Culture Collections*
(%)
(%)
Cepas de referencia
100
100
Aspergillus fumigatus [KJ175459.1],
fumigatus
Aspergillus
terreus
ATCC 208997
11
100
100
Aspergillus terreus [KC762934.1], ATCC
MYA-4897
Os dois fungos selecionados apresentaram viabilidade sobre a pressão da microbióta autócne do
rúmen e presença de metabólitos ruminais. A média de colônias foi de 1010 /mL para ambas espécies ao
longo do tempo.
Conclusões
Fungos anaeróbios facultativos do rúmen sobrevivem e mantém estável sua multiplicação na
presença e pressão seletiva da microbiota autóctone ruminal de bovinos de corte.
Agradecimentos
Ao CNPq, pela bolsa concedida e financiamento da pesquisa. A Universidade Federal de Minas
Gerais, pelo incentivo. Ao Instituto Federal Goiano pelo apoio financeiro para participação neste evento.
Literatura citada
ABRÃO, F.O.; DUARTE, E.R.; ROSA, C.A.; FREITAS, C.E.S.; VIEIRA, E.A.; HUHGES, A.F.S.
Characterization of Fungi from Ruminal Fluid of Beef Cattle with Different Ages and Raised in Tropical
Lignified Pastures. Current Microbiology, v.69, n.2, p.1-13, 2014.
ALMEIDA, P.N.M.; FREITAS, C.E.S.; ABRÃO, F.O.; RIBEIRO, I.C.O.; VIEIRA, E.A.; GERASEEV,
L.C.; DUARTE, E. R. Atividade celulolítica de fungos isolados do rúmen de bovinos leiteiros
alimentados com forragens tropicais. Revista Caatinga, v.27, p.202-207, 2014.
CERDÀ, A. R. Fermentación Ruminal, Degradación Protéica y Sincronización Energía-Proteína en
Terneras en Cebo Intenso. Tese (Doutorado) em Produção Animal – Universitat Autónoma de Barcelona,
Espanha, 196 f., 2003.
DAVIES, D.R.; THEODOROU, M.K.; LAWRENCE, M.I.G.; TRINCI A.P. Distribution of anaerobic
fungi in the digestive tract of cattle and their survival in faeces. Journal of General Microbiology, v.139,
p.1395-1400, 1993.
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