XVI CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA
22 a 26 de outubro de 2007
EXTRAÇÃO DA LECTINA DA FOLHA DE MANDIOCA (Manihot esculenta Crantz)
E O EFEITO DE CÁTIONS DIVALENTES NA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE.
MARIA CRISTINA SILVA1;ANGELITA DURTE CORRÊA2; LUCIANA LOPES
SILVA PEREIRA1;CUSTÓDIO DONIZETI DOS SANTOS2.
RESUMO
Lectinas são proteínas ligantes de carboidratos de origem não imune. Devido a esta
propriedade, as lectinas são capazes de aglutinar eritrócitos. Estas substâncias quando
ingeridas, interferem na absorção de nutrientes e provocam efeitos fisiológicos adversos no
organismo. O isolamento de proteínas tóxicas, como as lectinas, é interessante tanto pela sua
ação antinutricional, como pela sua aplicação nas áreas biológicas e médicas. Visando a
purificação da lectina presente na folha da mandioca, foram feitos testes de extração desta
proteína utilizando dois extratores, água e solução salina (NaCl 0,15 mol/L, pH 7,4), em
quatro tempos de extração, 15, 60, 120 e 180 minutos. O efeito de íons divalentes (Ca+2 e
Mn+2) na atividade hemaglutinante também foi avaliado, empregando diálise com EDTA 0,2
mol/L. Os métodos de extração foram avaliados determinando o rendimento protéico e
medindo a atividade hemaglutinante. A solução salina com um tempo de extração de 180
minutos proporcionou maior extratibilidade protéica. Entretanto, a água com um tempo de
extração de 15 minutos proporcionou maior atividade hemaglutinante, sendo esta condição de
extração a escolhida. A lectina da folha de mandioca não apresentou dependência de íons Ca+2
e Mn+2 para exercer a atividade hemaglutinante.
Palavras-chave: folha de mandioca, lectina, atividade hemaglutinante, cátions divalentes
ABSTRACT
Lectins are carbohydrate-binding proteins of non-immune origin. Due to this property the
lectins are capable to agglutinate erythrocytes. When ingested, these substances interfere in
the nutrients absorption and provoke adverse physiological effect in the organism. The
isolation of toxic proteins, as the lectins are interesting at such a way for its anti-nutritional
action, and for its application in the biological and medical areas. Aiming the purification of
the lectin present in the leaf of the cassava, tests of extraction of its protein were made, using
two extractors, water and salt solution (NaCl 0,15 mol/L pH 7.4) in four extraction time: 15,
60, 120 and 180 minutes. The effect of divalent ions (Ca+2 and Mn+2) in the hemagglutination
activity was evaluated, using dialysis with 0,2 mol/L EDTA. The extractions methods were
evaluated determining protein yield and measuring the hemagglutination activity. The salt
solution with a extraction time of 180 minutes provided the highest protein extratibility.
Meanwhile, water with a extraction time of 15 minutes provided the best hemagglutination
activity, being this condition of extraction the chosen one. The lectin of the cassava leaf did
not present dependence on ions Ca+2 and Mn+2 to exert the hemagglutination activity.
Key- words: cassava leaf, lectin, hemagglutination activity, divalent cations
1
Mestranda em Agroquímica, Departamento de Química, UFLA. [email protected];
[email protected].
2
Professores do Departamento de Química, UFLA. [email protected]; [email protected].
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INTRODUÇÃO
Muitos alimentos da dieta humana, além da porção nutritiva podem conter fatores
antinutricionais, capazes de provocar efeitos fisiológicos adversos no organismo, diminuir a
biodisponibilidade de nutrientes, ou ainda serem tóxicos.
A multimistura é uma alimentação alternativa de baixo custo, que visa suprir
deficiências nutricionais, principalmente em crianças desnutridas. Sua formulação varia de
acordo com a disponibilidade regional dos ingredientes, mas basicamente é composta de
alimentos não-convencionais na dieta habitual, entre eles os farelos, pó de casca de ovo,
folhas verde-escuras e sementes. No entanto, a biodisponibilidade de seus nutrientes e
presença de fatores antinutricionais têm gerado polêmica e oferecido restrições ao seu
emprego como tal (Vizeu et al., 2005). Um dos antinutrientes presentes na folha da mandioca
são as hemaglutininas, também denominadas lectinas.
Hemaglutininas são glicoproteínas capazes de se ligar a mono ou oligossacarídeos
específica e reversivelmente, mas são destituídas de atividade catalítica e, diferentemente dos
anticorpos, não são produtos de uma resposta imune (Sharon & Lis, 2001). Devido a esta
propriedade de ligação a carboidratos, as hemaglutininas podem ligar-se a certos componentes
da membrana das células sangüíneas. São conhecidas por sua habilidade em aglutinar células,
especialmente células vermelhas sangüíneas chamadas de eritrócitos, provocando o fenômeno
da hemaglutinação (Reynoso-Camacho et al., 2003).
Algumas destas proteínas são classificadas como metaloproteína, pois necessitam de
cátions como Ca2+ e Mn2+ para exercer sua atividade hemaglutinante.
Estas substâncias, quando ingeridas na sua forma nativa provocam perda de peso, uma
vez que interferem na absorção de nutrientes, podendo ser letais quando injetadas em animais
experimentais. Podem ainda inibir algumas enzimas digestivas e induzir a diabetes
(Vasconcelos & Oliveira, 2004).
Os estudos de detecção de proteínas que exibem atividade tóxica para células e/ou
animais a exemplo das hemaglutininas, vem sendo intensificados, e são de grande
importância, devido não só a conseqüente interferência do ponto de vista antinutricional e/ou
letal, mas também pela crescente utilização destas proteínas em pesquisas nas áreas biológicas
e médicas. Estas proteínas possuem propriedades que permitem a sua utilização em estudos de
grupamento sangüíneo, no reconhecimento de alguns tipos de células cancerígenas, e como
agente mitogênico. Podendo citar ainda o seu potencial como inseticida natural.
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O objetivo neste trabalho foi selecionar um método de extração das proteínas da
farinha de folhas de mandioca que proporcionasse maior rendimento protéico e maior
atividade hemaglutinante e também avaliar o efeito dos íons Ca2+ e Mn2+ nesta atividade.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção da farinha de folhas de mandioca
Folhas maduras de mandioca (Manihot esculenta Crantz) cultivar Cacao, foram
colhidas, aos 12 meses de idade da planta. As folhas foram lavadas e secas em estufa
ventilada à temperatura de 30ºC a 35ºC. Os pecíolos foram retirados após 24 horas de
secagem e as folhas permaneceram na estufa por mais 24 horas. Em seguida, as folhas foram
passadas em moinho tipo Willy para obtenção da farinha.
Extração das proteínas
Para escolher o método de extração que proporcionasse maior quantidade de proteína e
maior atividade hemaglutinante, foram testados dois extratores, água destilada e solução
salina tamponada (NaCl 0,15 mol/L, pH = 7,4). A proporção de FFM e extrator foi de 1:20
(p/v). A mistura foi colocada sob agitação mecânica por quatro tempos de 15, 60, 120 e 180
minutos à temperatura ambiente. Após, a suspensão foi filtrada em tecido de organza e
centrifugada a 15.000 x g, por 15 minutos à 5ºC e o sobrenadante recolhido.
O resíduo obtido foi submetido a duas reextrações sucessivas nas mesmas condições e
os sobrenadantes (extrato) reunidos para determinação do teor protéico, atividade
hemaglutinante e o efeito dos íons Ca+2 e Mn+2.
Determinação de proteínas
A determinação de proteínas foi realizada segundo a metodologia descrita por Bradford
(1976), usando albumina sérica bovina como padrão.
Atividade hemaglutinante
A atividade hemaglutinante foi realizada segundo a metodologia descrita por Calderón
de la Barca et. al. (1985). Alíquotas de 100µL de amostra foram misturadas com igual volume
de solução salina tamponada e submetidas a uma série de diluições na base 2 (20, 21, 22, 23,
etc.). Em seguida, a amostra diluída foi incubada com 100µL de suspensão de hemácias a 2%,
preparada com sangue humano tipo A Rh positivo, em temperatura ambiente. Foram
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realizadas leituras da aglutinação das hemácias visualmente, após 60 e 90 minutos. Os
resultados foram expressos em número de unidades hemaglutinantes (UH), que é calculado a
partir do inverso do título da maior diluição que ainda apresentou aglutinação visível e em
atividade específica, obtida pelo cálculo de UH/mg de proteína.
Efeito de cátions divalentes na atividade hemaglutinante
Para a verificação do efeito dos cátions Ca+2 e Mn+2 sobre a atividade hemaglutinante,
o extrato obtido da extração protéica foi dialisado exaustivamente contra EDTA 0,2 mol/L por
48 horas, seguida de diálise contra NaCl 0,15 mol/L por 24 horas e usada para a determinação
da atividade hemaglutinante. Como controle utilizou-se o extrato não-dialisado contra EDTA.
Análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. O experimento foi em fatorial
(2x4), com três repetições. Uma vez que houve interação entre os fatores, foi feito o
desdobramento da interação e para o estudo das médias foram realizados teste de Tukey e
análise de regressão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Figura 1 é apresentado o rendimento protéico da FFM, com dois extratores,
solução salina e água, em função do tempo de extração. Quando a extração protéica foi realizada
com solução salina, o rendimento aumentou linearmente com o aumento do tempo de extração.
Com a água destilada como solução extratora, o rendimento variou de acordo com a equação
0,000007x2 – 0,0011x + 0,6442, ou seja, decresceu em um intervalo de extração
compreendido entre 15 e aproximadamente 79 minutos. A partir deste ponto o rendimento
rendimento protéico %
começou a aumentar com o aumento do tempo de extração.
y = 0,0014x + 0,5827
R2 = 0,9899
1
0,8
0,6
0,4
y = 0,000007x 2 - 0,0011x + 0,6442
R2 = 0,8557
0,2
0
0
50
100
150
200
tem po de extração (m in)
extrator salina
extrator água
FIGURA 1 - Rendimento protéico de dois extratores em função do tempo de extração.
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Na Tabela 1 estão apresentados os rendimentos médios da extração das proteínas
considerando-se os extratores utilizados.
TABELA 1 – Rendimentos médios de extração protéica (g/100g) da FFM.
Tempo de extração (minutos)
Extrator
15
60
120
180
Água destilada
0,64 a
0,59 a
0,63 a
0,68 a
Solução salina
0,60 a
0,66 b
0,76 b
0,82 b
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, à 5% de
probabilidade.
Em um tempo de extração de quinze minutos, não houve diferença significativa entre
os dois extratores utilizados. Para os demais tempos de extração, a solução salina
proporcionou maior extratibilidade proteíca. Diante dos resultados a solução salina e o tempo
de extração de 180 minutos proporcionou maior rendimento protéico.
As atividades hemaglutinantes obtidas para cada tratamento estão apresentadas na
Tabela 2. A água destilada com um tempo de extração de 15 minutos apresentou maior
atividade hemaglutinante. O decréscimo da atividade hemaglutinante com o aumento do
tempo de extração pode ser atribuído à desnaturação da proteína que leva a alteração da
conformação protéica.
As condições de extração escolhidas foram água destilada e 15 minutos de extração,
priorizando assim a maior atividade hemaglutinante.
A atividade hemaglutinante no extrato foi mantida após diálise contra EDTA,
sugerindo que a lectina da folha de mandioca não é dependente de cátions divalentes
TABELA 2 - Atividade hemaglutinante com dois extratores e vários tempos de extração.
Tempo
(minutos)
15
60
120
Extrator
Água destilada
Atividade hemaglutinante
Atividade específica
(UHb/mg proteína)
(UH/100 µL)
Proteína
(100µL)
10,67
8
749,8
Solução salinaa
10,00
4
400,0
Água destilada
9,83
4
406,92
c
Solução salina
11,00
ND
-
Água destilada
10,50
2
190,48
Solução salina
12,67
ND
-
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180
Água destilada
11,33
1
88,26
Solução salina
13,67
ND
-
a
NaCl 0,15mol/L pH 7,4.
Inverso do título da maior diluição na base 2, em número de unidades hemaglutinantes (UH).
c
Não detectou atividade hemaglutinante.
b
CONCLUSÕES
O método escolhido para a extração das proteínas da FFM, foi água destilada como
extrator em um tempo de 15 minutos. A lectina da folha de mandioca parece não apresentar
dependência de íons Ca2+ e Mn2+.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Chicago, v. 50, n. 6, p. 1700-1702, Nov./Dec. 1985.
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